DE19846077C2

DE19846077C2 - Trypanosomen-bindende Nukleinsäuren, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19846077C2
Application number: DE19846077A
Authority: DE
Inventors: Ulrich H Goeringer; Matthias Homann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: DE19846077A1

Description

Afrikanische Trypanosomen (Trypanosoma brucei und deren Subspezies) sind parasitär lebende, protozoische Organismen. Sie sind Verursacher unterschiedli cher parasitärer Erkrankungen, wobei sowohl die humanpathogenen Arten als auch die Tierseuchen auslösenden Spezies Gesundheitsprobleme von großen Ausmaßen darstellen. Vakzine zur Behandlung der Krankheiten sind nicht vor handen, und die verwendeten Therapeutika sind nur von bedingter Effizienz und zum Teil mit drastischen Nebenwirkungen verbunden. Gleichzeitig treten ver mehrt Resistenzen der Parasiten gegen die verwendeten Medikamente auf, so daß neue Ansätze zur Therapeutikaentwicklung gegen Trypanosomenerkrankungen dringend notwendig sind.

Im Verlauf ihres Lebenszyklus parasitieren afrikanische Trypanosomen in zwei unterschiedlichen Wirtsorganismen. Hierbei handelt es sich um Tsetse-Fliegen, die die Trypanosomen während einer Blutmahlzeit auf Säugetiere übertragen. Aufgrund der sehr unterschiedlichen physiologischen Bedingungen innerhalb der Fliegen im Vergleich zum Säugerwirt unterscheiden sich die Insektenformen der Trypanosomen sowohl morphologisch als auch in bezug auf ihren Stoffwechsel stark von den Blutstromformen.

Die sich frei im peripheren Blut bewegenden Trypanosomen sind in dieser Le benszyklusphase von einer dichtgepackten Schicht vornehmlich einer Proteinspe zies umgeben, dem sogenannten VSG-Protein (variant surface glycoprotein). Hierbei handelt es sich um ein Oberflächenglykoprotein, das als Homodimer in der Zellmembran verankert ist und die Funktion einer Schutzhülle übernimmt. Der N-Terminus des Proteins ragt in den extrazellulären Raum und ist primäres antigenes Ziel für die Immunantwort des Wirtsorganismus (siehe z. B. Cross, G. A. M. (1996), Bioessays 18, 283), Anti-VSG-Antikörper sind aufgrund ihrer Größe und der relativ dichten Packung der VSG-Moleküle auf der Zellmembran lediglich in der Lage, das exponierte, äußerste Ende des N-Terminus des Proteins zu erkennen. Circa 1000 unterschiedliche Varianten des Proteins sind im Genom des Parasiten kodiert, wobei zu einem bestimmten Zeitpunkt stets nur eine Vari ante exprimiert wird. Trotz relativ stark divergierender Primärsequenzen falten sich diese unterschiedlichen VSG-Moleküle zu quasi identischen Tertiärstruktu ren, die sich ausschließlich im hypervariablen, exponierten N-Terminus unter scheiden (siehe z. B. Blum, M. L. et al. (1993) Nature 362, 603; Cross, G. A. M. (1996) supra). Durch einen Vorgang, der als "antigene Variation" bezeichnet wird, ändern Trypanosomen ihren VSG-Mantel mit einer bestimmten Frequenz und präsentieren immer wieder neue der 1000 unterschiedlichen Varianten. Dies führt dazu, daß das Immunsystem konstant mit veränderten antigenen Oberflä chenvarianten des Parasiten konfrontiert wird und die Infektion letztlich einen chronischen Verlauf annimmt. Unbehandelt führt die Infektion zum Tod.

Der VSG-Mantel von Trypanosomen ist vornehmlich für relativ große Moleküle wie Immunoglobuline (ca. 150 kDa) eine nicht penetrierbare Barriere (Cross, G. A. M. (1975) Parasit. 67, 315). Kleinere Moleküle, wie z. B. die Protease Tryp sin mit einer molekularen Masse von 23 kDa, können jedoch in die VSG-Schicht zumindest partiell eindringen. Zusätzlich sind mehrere invariante Oberflächen proteine (ISG's) in den VSG-Mantel eingebettet (Overath P. et al. (1994) Parasit. Today 10, 53). Weitere, bisher uncharakterisierte Oberflächenmoleküle, Trans porterproteine oder Ionenkanäle, sind voraussichtlich ebenfalls vorhanden (siehe Fig. 1).

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, Substanzen bereitzustellen, die in der Therapie von Trypanosomen erfolgreich verwendet werden können. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß trotz der Hypervariabilität der VSG-Schutzschicht von Blutstromform-Trypanosomen Nukleinsäuren an Trypa nosomen binden können.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur Identifi zierung einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäure, bei dem

a) in einem ersten Schritt eine Nukleinsäure mit Trypanosomen, vorzugswei se Blutstromform-Trypanosomen, in Kontakt gebracht wird, und
b) in einem zweiten Schritt die Bindung der Nukleinsäure an Trypanosomen überprüft wird.

Nukleinsäuren, die spezifisch Liganden binden, werden auch als Aptamere be zeichnet. Vorzugsweise sind die Nukleinsäuren in einer Bibliothek aus verschie denen Nukleinsäuren, insbesondere in einer kombinatorischen Bibliothek, enthal ten. Im allgemeinen ist die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, welche vorzugs weise entweder bereits während der Synthese oder nach erfolgter Nukleinsäure synthese modifiziert werden kann. DNA wird üblicherweise nach allgemein be kannten Verfahren chemisch beispielsweise mit Hilfe eines DNA-Synthesizers hergestellt. RNA kann entweder chemisch oder durch Transkription von DNA in RNA nach bekanntem Verfahren hergestellt werden.

Unmodifizierte Oligonukleotide werden im allgemeinen bei Inkubation im Serum durch die darin vorkommenden Nukleasen abgebaut. Der Abbau erfolgt hierbei hauptsächlich durch 3'-Exonukleasen, die DNA und RNA vom 3'-Ende her ab bauen. Neben dem Abbau durch 3'-Exonukleasen können die Nukleinsäuren auch durch Endonukleasen hydrolysiert werden, die bevorzugt an den Pyrimidinresten angreifen.

Zur Stabilisierung von Nukleinsäuren gegen Nukleasenabbau eignen sich z. B. Modifikationen der Phosphodiesterbrücke, des Zuckerbausteins oder der Basen.

Beispiele von geeigneten Modifikationen finden sich in Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews 90, 543-584, Nr. 4; Uhlmann, E. (1998) Chemie in unserer Zeit 32, 150-160, Nr. 3; Osborne, S. E. et al. (1997) Current Opinion in Chemical Biology 1, 5-9 oder Gold, L. (1995) J. Biol. Chem. 270, 13581-13584, Nr. 23.

Besonders geeignete modifizierte Nukleinsäuren sind 2'-Amino deoxypyrimidin/purin-RNA, 5'-(1-Alkinyl)-2'-deoxypyrimidin/purin-RNA, vor zugsweise 5-(1-Pentinyl)-2'-deoxypyrimidin/purin-RNA und/oder 5-(1-Hexinyl)- 2'-deoxypyrimidin/purin-RNA, 2'-Alkyloxy-pyrimidin/purin-RNA, vor zugsweise 2'-(C_nH_2n+1)Oxy-pyrimidin-RNA mit n eine ganze Zahl von 1 bis 8, vorzugsweise von 1 bis 4, insbesondere von 1 bis 3, vor allem 2'-Methyloxy- pyrimidin-RNA, 2'-Fluor-deoxypyrimidin/purin-RNA, 5-Iod-pyrimidin- RNA, Phosphorthioat-RNA, Phosphordithioat-RNA, Methylphosphonat-RNA, 3'- Thioformacetal-RNA, Methylen(methylimino)-RNA, Methylencarboxamid-RNA und/oder eine Nukleinsäure, enthaltend 5-Propinyl-thymidin, 7-Desaza-7- propinyl-Guanin und/oder N,N-Ethano-5-methyl-cytosin.

Zur Identifizierung der an Trypanosomen gebundenen Nukleinsäure ist es auch vorteilhaft, daß diese markiert ist. Beispiele geeigneter Markierungen ist die ra dioaktive Markierung oder eine Markierung mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstof fes, beispielsweise Fluorescein. Verschiedene Markierungen und Markierungsver fahren finden sich beispielsweise auch in Matthews, J. A. & Kricka, L. J. (1988) Analytical Biochemistry 169, 1-25.

Die Bindung der Nukleinsäure an Trypanosomen läßt sich auch dadurch überprü fen, daß Trypanosomen-gebundene Nukleinsäuren von nicht gebundenen Nu kleinsäuren in einem dritten Schritt (c) beispielsweise mit Hilfe eines Zentrifuga tionsschrittes abgetrennt werden. Eine gleichwertige Trennung läßt sich auch im Zellsortierer erreichen, vorzugsweise wenn die Nukleinsäure fluoreszenzmarkiert ist.

Um die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure in im wesentlichen reiner Form zu erhalten, werden die Nukleinsäure-gebundenen Trypanosomen beispielsweise mit Phenol behandelt und die Nukleinsäure beispielsweise mittels Alkohol ausgefällt. Zudem ist es vorteilhaft, wenn die o. g. Verfahrensschritte (a) und (b), sowie vor zugsweise Schritt (c) ein oder mehrmals wiederholt werden.

Das beschriebene Verfahren eignet sich auch zur Herstellung einer Trypanoso men-bindenden Nukleinsäure, bei dem

a) in einem ersten Schritt eine Bibliothek aus verschiedenen Nukleinsäuren hergestellt wird,
b) in einem zweiten Schritt die Nukleinsäurebibliothek mit Trypanosomen, vorzugsweise Blutstromform-Trypanosomen in Kontakt gebracht wird,
c) in einem dritten Schritt Trypanosomen mit gebundener Nukleinsäure iso liert werden,
d) in einem vierten Schritt die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure isoliert wird,
e) vorzugsweise in einem fünften Schritt die isolierte Trypanosomen- bindende Nukleinsäure amplifiziert wird und
f) insbesondere die Schritte (b) bis (e) mehrmals, vorzugsweise ca. 12 mal wiederholt werden.

Üblicherweise enthält die Bibliothek aus verschiedenen Nukleinsäuren Nuklein säuren mit einem randomisierten Bereich von ca. 25 bis ≧ 100, vorzugsweise von ca. 30 bis ca. 60, insbesondere von ca. 40 Nukleotiden, da diese Nukleotidlängen grundsätzlich zur Ausbildung von Sekundärstrukturen, wie z. B. Haarnadelschlei fen, Ausbuchtungen mit Helices, Pseudoknoten oder G-Quartette, geeignet sind.

Geeignete Nukleinsäure-Bibliotheken enthalten im allgemeinen ca. 10¹⁴ bis ca. 10¹⁵, vorzugsweise ca. 2 × 10¹⁵ unterschiedliche Nukleinsäuren. Auch bei diesem Verfahren ist es vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren entweder vor ihrer Synthese oder nach erfolgter Nukleinsäuresynthese, wie oben bereits näher beschrieben, modifiziert werden. Die Herstellung von geeigneten Nukleinsäurebibliotheken erfolgt, wie oben bereits erläutert, entweder chemisch beispielsweise an einem DNA-Synthesizer im Falle von DNA oder chemisch bzw. über eine Transkription einer DNA-Bibliothek in RNA im Falle der Synthese einer RNA-Bibliothek.

Das folgende Verfahren eignet sich beispielsweise besonders vorteilhaft zur Her stellung bzw. Identifizierung von einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäure:

Als Nukleinsäuremolekülbibliothek wird vorzugsweise eine chemisch syntheti sierte, einzelsträngige DNA-Bibliothek verwendet, die in ihrem zentralen Mole külbereich beispielsweise 40 randomisierte Nukleotidpositionen enthält. Diese relativ kurze randomisierte Sequenz wird im allgemeinen intentionell so gewählt, um eine ausreichende Sequenz- und damit Strukturvariabilität zur Wechselwir kung mit der Oberfläche der Trypanosomen zu gewährleisten. Gleichzeitig sollte vorzugsweise die finale Molekularmasse der Aptamere klein genug gehalten wer den, um eine Penetration des VSG-Mantels zumindest prinzipiell zu ermöglichen. Eventuell flankierende Sequenzen zur randomisierten Sequenz enthalten vor zugsweise die Bindungsstellen von PCR ("polymerase chain reaction")-"Primer"- Molekülen sowie beispielsweise eine T7-Promotorregion zur Überführung der DNA-Moleküle in einer Ribonukleinsäurebibliothek durch in vitro Transkription (siehe z. B. Conrad, R. C. et al., (1996) Meth. Enzym. 267, 336). Die RNA- Synthese erfolgt beispielsweise unter Verwendung von α-(³²P)-UTP als radioakti vem "tracer", so daß der Anteil zellgebundener RNA-Moleküle durch eine Radio aktivitätsmessung sehr einfach ermittelt werden kann. Die Komplexität der RNA- Bibliothek wird beispielsweise mit 2 × 10¹⁵ unterschiedlichen Molekülen abge schätzt. Die Bindung der RNA-Molekülbibliothek an Blutstromform- Trypanosomen wird vorzugsweise unter definierten Milieubedingungen durchge führt, wobei zellgebundene RNAs von nicht gebundenen Molekülen beispielswei se durch Zentrifugation voneinander getrennt werden. Alternativ können zellge bundene Nukleinsäuren über Nitrocellulosefilter von nicht-gebundenen Nuklein säuren abgetrennt werden. Als Trypanosomen finden beispielsweise die unter axenischen Zellkulturbedingungen propagierten Trypanosoma brucei Stämme MITat 1.2 und MITat 1.4 Verwendung. Beide Stämme exprimieren stabil aus schließlich eine VSG-Variante. Gebundene RNAs werden vorzugsweise nach mehreren Waschschritten beispielsweise durch Extraktion mit Phenol isoliert und nach Alkoholpräzipitation in den nächsten Amplifikations/Selektionszyklus ein geschleust (siehe Fig. 2). Nach beispielsweise 12 derartigen Selex-Runden wird im allgemeinen ein Wert von 20% Bindung der eingesetzten RNA Moleküle an die Trypanosomenzellen gemessen und die in der Population enthaltenen RNAs in ihren Primärsequenzen bestimmt.

Überraschenderweise wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere Trypanosomen-bindende Nukleinsäuren hergestellt bzw. identifiziert, die sich aufgrund ihrer Primärstrukturmerkmale in drei Familien einteilen lassen (siehe Fig. 3A-C). Sekundärstrukturberechnungen für die Nukleinsäuren der Familie I und II ergaben eine unterbrochene "Haarnadelschleifenstruktur (Familie I siehe Fig. 3D) bzw. im Falle der Familie II sog. G-Quartett-Faltungen (siehe Fig. 3E). Für die Nukleinsäuren der Familie III konnte kein Sekundärstrukturmodell errechnet werden. Alle beschriebenen Nukleinsäuren liegen in ihren relativen Bindungseffi zienzen an die Oberfläche von Blutstromform-Trypanosomen signifikant über der initialen RNA-Bibliothek. Die Nukleinsäuren mit der stärksten Bindung zeigen eine ca. 270-fache Stimulation der Interaktion mit der Trypanosomenoberfläche, wohingegen die Nukleinsäuren mit der schwächsten Bindung immer noch ca. 20- fach über der initialen RNA-Bibliothek (Pool 1) liegen. Hieraus folgt, daß das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut geeignet ist, um verschiedene hochaf fine Trypanosomen-bindende Nukleinsäuren insbesondere in Form von RNA her zustellen bzw. zu isolieren. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf eine Nukleinsäure mit einer Sequenz gemäß Fig. 3 sowie Varianten davon. Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung sind Modifikatio nen, wie oben bereits näher beschrieben, einschließlich Markierungen sowie die entsprechenden RNA-Sequenzen davon.

Eine quantitative Charakterisierung der Bindung beispielsweise unter Verwen dung von der Nukleinsäure SEQ ID NO(2-16) (Familie I; relative Bindungseffizi enz 270 ± 82) ergab eine Dissoziationskonstante (K_d) der Interaktion mit der Oberfläche von Blutstromform-Trypanosomen von 60 ± 17 nM, was einer hochaffinen Wechselwirkung entspricht. Überraschenderweise wurde als Binde partner an der Oberfläche der Trypanosomen ein singuläres Peptid mit einer appa renten Molekularmasse von ca. 42 kDa identifiziert. Die Kopienzahl dieses Pep tids wurde mit 7,4 × 10⁴ ± 1,7 × 10⁴ Moleküle bestimmt, d. h. auf molekularer Ebene greift die Wechselwirkung der genannten Nukleinsäure auf eine spezifische RNA-Protein-Interaktion zurück. Die Assoziation an dieses Polypeptid war spezi fisch für Blutstromform-Trypanosomen und trat bei Insektenstadien-spezifischen Trypanosomen nicht auf. Die Assoziationsratenkonstante (k_ass) wurde mit 4,3 × 10⁴ M^-1s^-1 ermittelt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Isolierung eines Trypanosomen-spezifischen Peptids, wobei

a) in einem ersten Schritt eine erfindungsgemäße Trypanosomen-bindende Nukleinsäure mit Trypanosomen, vorzugsweise Blutstromform- Trypanosomen, in Kontakt gebracht wird, und
b) in einem zweiten Schritt das Trypanosomen-spezifische Peptid, welches eine Trypanosomen-bindende Nukleinsäure gemäß Schritt (a) bindet, iso liert wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Trypanosomen- spezifisches Peptid, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierbar ist. Vorzugsweise ist das Trypanosomen-spezifische Peptid ein Blutstromform- Trypanosomen-spezifisches Peptid, das insbesondere die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure SEQ ID NO(2-16) binden kann. Ein bevorzugtes Beispiel eines Trypanosomen-spezifischen Peptids ist ein Trypanosomen-spezifisches Peptid, das die genannte Trypanosomen-bindende Nukleinsäure mit einer Assoziations ratenkonstante (k_ass) von ca. 4,3 × 10⁴ M^-1s^-1 binden kann. Das bezeichnete bevor zugte Peptid hat eine apparente Molekularmasse von ca. 42 kDa.

Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Trypanosomen-bindenden Nu kleinsäure ist, daß sie spezifisch und hochaffin an Trypanosomen, insbesondere an die Oberfläche der Blutstromformen afrikanischer Trypanosomen (Trypanosoma brucei) binden. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure interagiert vorzugsweise mit invarianten Strukturmerkmalen der Zelloberfläche und eröffnet somit die Mög lichkeit, den als "antigene Variation" bezeichneten Wechsel des VSG- Oberflächenproteins zu umgehen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auch auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Trypanosomen-bindenden Nukleinsäu re oder Teilbereiche davon oder eines erfindungsgemäßen Trypanosomen- bindenden Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung zur Therapie, Prävention bzw. Diagnose der Naganaerkrankung, der Schlafkrankheit, der Beschälkrankheit und/oder der Surraerkrankung. So wird beispielsweise die Naganaseuche der Pferde und vor nehmlich der Rinder von dem Erreger Trypanosoma brucei, der auch Esel, Hunde, Katzen und Nager befällt, ausgelöst. Die Schlafkrankheit des Menschen wird vor allem in West- und Zentralafrika durch den Erreger Trypanosoma gambiense und in Ostafrika durch den Erreger Trypanosoma rhodesiense ausgelöst. Die Beschäl seuche der Pferde wird durch den Erreger Trypanosoma equiperdum ausgelöst. Die Surra der Pferde und Kamele wird in Nordafrika, südliches Asien, Süd- und Mittelamerika durch den Erreger Trypanosoma evansi verursacht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine pharma zeutische Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung, enthaltend eine erfindungsgemäße Trypanosomen-bindende Nukleinsäure oder ein erfin dungsgemäßes Trypanosomen-bindendes Peptid und ggf. geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe, wie z. B. Stabilisatoren, Nuklease- und/oder Proteaseinhibitoren. Bei spielsweise ist eine erfindungsgemäße Trypanosomen-bindende Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Trypanosomen-bindendes Peptid für die Herstellung eines Therapeutikums von Blutstromform-Trypanosomen abgeleitet.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind an die erfindungsgemäße Trypano somen-bindende Nukleinsäure ein oder mehrere Antigene gekoppelt, die eine Immunantwort auslösen können, und somit die Immunantwort des Wirtes indirekt auf den Parasiten lenken können. Geeignete Antigene sind beispielsweise die Haptene 2,4-Dinitrophenyl (DNP), Coumarin, Dansyl, 3-Hydroxy-4-Jodphenyl, 3- Hydroxyphenyl oder kurze synthetische Peptide, wie z. B. Deka-Alanin oder He xa-Histidin, insbesondere in Form ihrer D-Peptide zur Erhöhung der Stabilität. Vorzugsweise ist das bzw. die Antigene kovalent an die Nukleinsäure gekoppelt. Die kovalente Kopplung kann am 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäure, aber auch innerhalb der Nukleinsäure erfolgen. Eine geeignete Kopplungsmethode ist bei spielsweise die Kopplung nach Daniel, S. G. et al. (1998) BioTechniques, 24, 484- 489. Hierbei wird ein Disulfid-enthaltendes Linkermolekül über eine Arylazid gruppe photochemisch an die RNA gekoppelt. Nach Reduktion der Disulfidgrup pe zum Thiol wird das beziehungsweise die Antigene als Maleimidderivate mit der SH-Gruppe kovalent verknüpft. Die Stöchiometrie kann über die eingesetzten Konzentrationen der Reaktionspartner reguliert werden und beträgt vorzugsweise eine Markierung pro RNA-Molekül.

Im Falle einer diagnostischen Zusammensetzung kann die Trypanosomen- bindende Nukleinsäure entweder direkt durch radioaktive oder nicht radioaktive Markierung, beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff identifiziert und/oder quantitativ gemessen werden. Ist die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure bei spielsweise an ein Antigen gekoppelt, so kann die Trypanosomen-bindende Nu kleinsäure auch indirekt über einen Antikörper gegen das Antigen, welcher bei spielsweise radioaktiv oder nicht radioaktiv, wie bereits oben näher beschrieben, markiert wurde, identifiziert und quantifiziert werden.

Auch das erfindungsgemäße Trypanosomen-bindende Peptid eignet sich als pharmazeutische Zusammensetzung, um beispielsweise eine Immunantwort des Wirtes auszulösen. Als diagnostische Zusammensetzung kann es beispielsweise dafür verwendet werden, um im Serum vorhandene Antikörper gegen den Parasi ten zu diagnostizieren. Hierzu wird das erfindungsgemäße Trypanosomen- bindende Peptid radioaktiv oder nicht radioaktiv nach allgemein bekannten Me thoden markiert. Das erfindungsgemäße Trypanosomen-bindende Peptid eignet sich auch zur Herstellung von monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörpern nach allgemein bekannten Verfahren (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344; Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293), die als Arzneimittel oder Diagnostikum eingesetzt werden können (sie he z. B. Lerner, R. A. (1984) Advances in Immunology 36, 1-44 oder Voller, A. et al. (1976) Bull. World Health Organ 53, 55-63).

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, oh ne sie zu beschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau der Membran von Trypanosoma brucei in Anlehnung an Overath, P. et al. (1994) Parasitology today, 10, 53-58. Die Abkürzungen bedeuten: VSG für variables Oberflächenglykoprotein, ISG für invariables Oberflächenglykoprotein, USS für unbekannte Oberflä chenstruktur, GPI für Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol.

Fig. 2 beschreibt schematisch die in vitro Selektion von RNA via SELEX gemäß Eaton et al. (1995) Current Biology 2, 633-638.

Fig. 3 zeigt die Klassifizierung der erfindungsgemäßen Trypanosomen- bindenden Nukleinsäuren in drei Familien (Familie I, Fig. 3A; Familie II, Fig. 3B und Familie III, Fig. 3C) sowie deren relativen Bindungsstärken und die berechneten Sekundärstrukturen zur Familie I (Fig. 3D) und Fa milie II (Fig. 3E).

Fig. 4 zeigt schematisch das indirekte Targeting von Trypanosomen über an die Oberfläche von Trypanosomen-bindende Nukleinsäuren Aptamere.

Beispiele 1. Trypanosomen

Blutstromformen des Trypanosoma brucei brucei Stamms 427 (MITat Serodem, Klonvarianten MITat 1.2 und MITat 1.4) sowie der Stämme ANTat 1.1 und ILTat 1.1 wurden in HMI-9 Medium angezogen. Vorab wurde das Medium mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum supplementiert. Insektenstadien Trypanosomen wuch sen in SDM-79 Medium.

2. Oligodeoxynukleotid- und RNA "pool"-Synthese

DNA-Oligonukleotide wurden chemisch synthetisiert unter Verwendung von O- cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramiditen. Die initiale DNA Bibliothek war ein 79-mer folgender Primärsequenz:
GAATTCAGTCGGACAGCG(N)₄₀GATGGACGAAT-ATCGTCTCCC. Sie enthielt eine zentrale Domäne mit 40 randomisierten Nukleotiden und wurde über "reversed phase" Flüssigkeitschromatographie aufgereinigt. Während 7 PCR Zy klen wurden 1,1 mg der Bibliothek in einem Gesamtvolumen von 60 ml zu 7,5 mg doppelsträngiger DNA amplifiziert. Als Primermoleküle fungierten die Oligo deoxynukleotide
A: GCGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGATATCTC und
B: GGTCGAGAATTCAGTCGGACAGCG.

In einem Reaktionsvolumen von 7,5 ml wurden 1,5 mg des PCR Produkts zu 2,5 mg RNA transkribiert und 1,1 mg in der ersten Selektionsrunde verwendet. Alle folgenden "RNA pools" wurden ausgehend von 50-150 µg PCR-generierter, dop pelsträngiger DNA in einem Volumen von 1-1,5 ml hergestellt. Die Reaktionen wurden mit 5 µCi[α-³²P] UTP (3000 Ci/mmol) in 20 mM Natriumphosphatpuf fer pH 7,9, 8 mM MgCl₂, 20 mM DTT und 4 mM Spermidine in Anwesenheit aller 4 NTPs (1 mM) und 100 U T7 RNA Polymerase durchgeführt. Die syntheti sierten RNAs wurden anschließend mit Phenol extrahiert, Ethanol gefällt und in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4, 2 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 20 mM Gluco se, 0,2 mM β-Mercaptoethanol resuspendiert. Ein finaler Reinigungsschritt er folgte in einer Gelausschlußchromatographie unter Verwendung von Sephadex G50 Kolonnen im gleichen Puffer. Vor jeder Selektionsrunde wurden die RNAs für 30 min bei 37°C prä-inkubiert.

3. In vitro Selektion

Trypanosomen wurden bei einer Zelldichte von 1-2 × 10⁶ Zellen/ml geerntet und extensiv in Bindepuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4, 2 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 20 mM Glucose, 0,2 mM β-Mercaptoethanol) gewaschen. RNA Bin dung erfolgte in einem finalen Volumen von 0,5-1,5 ml mit (³²P)-markierter "pool RNA" (10-20 µM) und entweder 5 × 10⁸ Zellen/ml (Selektionsrunden 1-7) oder 2 × 10⁸ Zellen/ml (Selektionsrunden 8-13). Nach einer 60-minütigen Inku bation bei 30°C wurden ungebundene und schwach assoziierte RNAs in 4 auf einanderfolgenden Waschschritten mit 2 ml Bindepuffer entfernt. Trypanosomen und gebundene RNAs wurden durch Zentrifugation konzentriert und die gebun denen RNA-Moleküle in zwei Phenolextraktionen, gefolgt von einer Ethanolprä zipitation, isoliert. Die RNAs wurden revers transkribiert (150 µL Reaktionsvo lumen, 10 µg Primer B, 100 U MoMuLV Reverse Transkriptase), durch PCR am plifiziert und die resultierende DNA Matrize erneut zu RNA transkribiert. Diese Moleküle wurden in die nächste Selektionsrunde eingeschleust. Die DNA Matri zen der 12. Selektionsrunden wurden mit HindIII und EcoRI restringiert und in pUC118 kloniert. Die Sequenzen von jeweils 53 Klonen aus beiden Selektionen wurden durch Strangabbruch-Sequenzierung ermittelt.

4. Bestimmung von Bindeparametern

Uniform (³²P)-markierte "pool RNAs" (5 nM, ca. 20.000 cpm) oder RNA Apta mere (3-5 nM, 10.000-50.000 cpm) wurden mit T. brucei Zellen in 100 µl Binde puffer bei Zelldichten von 1-3 × 10⁸ Zellen/ml inkubiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen gewaschen (4 × mit 2 ml Bindepuffer) durch Zentrifugation geerntet und die prozentuale Bindung von RNA an die Zel len durch Szintillationszählung ermittelt. Mittlere relative Bindeeffizienzen wur den aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt, wobei gegen die Bindeeffizi ens von "pool 1 RNA" normalisiert wurde. Gleichgewichtsdissoziationskonstan ten wurden aus Experimenten abgeleitet bei denen die prozentuale RNA-Bindung bei variierenden Trypanosomen-Zelldichten ermittelt wurde. K_d-Werte wurden über die Scatchard Gleichung erhalten: r/[A] = n/K_d - r/K_d wobei die Steigung der Geraden - 1/K_d repräsentiert; (A - ungebundene RNA), r = B/[Anzahl Zellen], B - gebundene RNA. Die Anzahl an Bindestellen auf der Trypanosomenoberflä che (n) wurde aus der Scatcharddarstellung über den Schnittpunkt der Geraden mit der Abszisse ermittelt.

Assoziationsraten wurden repräsentativ mit (³²P)-markiertem RNA Aptamer 2-16 (0,75 nM, ca. 50.000 cpm) und einer variablen Anzahl an T. brucei Zellen in 50 µl Bindepuffer bei 37°C ermittelt. Die Parasitenzelldichten variierten zwischen 2,5 × 10⁷/ml and 2 × 10⁸/ml, entsprechend berechneten Bindepartnerkonzentrationen von 3 nM bis 24 nM (unter der Annahme von 72.000 Bindestel len/Trypanosomenzelle). Unter Bedingungen eines großen Überschusses eines Bindepartners kann eine Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung (K_obs) über die Beziehung K_obs = ln 2/T_1/2 ermittelt werden. Das RNA Apta mer wurde bei 37°C präinkubiert und die Bindereaktion durch Zugabe der Zellen zur RNA-Lösung gestartet. Aliquots wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0,5 min-30 min) entnommen, 1 : 500 mit Bindepuffer verdünnt und sofort zentri fugiert. Der prozentuale Anteil von ungebundener und gebundener RNA wurde durch Szintillationzählung ermittelt und als Funktion der Zeit aufgetragen.

5. In vitro Transkription und radioaktive Markierung der 5'-Enden von RNA

RNA-Aptamere wurden von EcoRI-linearisierter Plasmid DNA mit Hilfe von T7 Polymerase transkribiert. Der Transkriptionspuffer enthielt 20 mM Natriumphos phatpuffer pH 7,9, 8 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 4 mM Spermidin sowie alle vier NTPs (1 mM). Für eine radioaktive Markierung von RNA wurden 5 µM UTP und 10-50 µCi α-(³²P)-UTP im Transkriptionsansatz verwendet. Nach 2 Stunden Reaktion wurde die DNA mit Hilfe von DNase I verdaut, die RNA wurde mit Phenol extrahiert und durch Gelfiltration auf Sephadex G50-Kolonnen von nicht inkorporierten NTPs abgetrennt. Für eine 5'-Endmarkierung wurden die RNAs zunächst mittels alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und dann mit Hilfe von T4-Polynucleotid-Kinase und γ-(³²P)-ATP radioaktiv markiert.

6. RNA Strukturanalyse

Enzymatische Zugänglichkeitsstudien wurden mit Cobra Venom RNase V1 (0.25 U/ml), RNase T1 (250 U/ml) und RNase A (10 mU/ml) durchgeführt. Die Spal tungsreaktionen wurden mit 300 ng RNA in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4, 2 mM MgCl₂, 5 mM KCl bei 25°C durchgeführt, wobei mit jedem Enzym eine Spaltungskinetik erstellt wurde. Die Reaktionen wurden durch 1 : 5 Verdün nung von Proben in eiskaltem Gel-Ladepuffer (50 mM Tris/HCl pH 8, 20 mM Na₂EDTA, 8 M Harnstoff) gestoppt. Für jede RNA wurde durch alkalische Hy drolyse eine Bandenleiter als Längenmarker hergestellt. Dazu wurden 100 ng RNA 12 min bei 94°C in 0,5 M NaHCO₃ inkubiert. Die Spaltprodukte wurden durch Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen auf 12% w/v Po lyacrylamidgelen analysiert.

Computergestützte RNA-Sekundärstrukturanalysen wurden mit Hilfe des MFOLD-Programms berechnet. Die Strukturen wurden für eine Temperatur von 37°C, ermittelt, was der optimalen Wachstumstemperatur von T.brucei Bluts tromformen entspricht.

UV-Schmelzkurven der RNA-Moleküle wurden mit Hilfe eines thermoelektrisch kontrollierten Spektrophotometers bei 260 nM in 50 mM Kalium-cacodylat pH 7,2, 150 mM KCl, 2,6 mM MgCl₂, 0,1 mM Na₂ EDTA aufgenommen. Die Schmelzkurven wurden durch Erhöhung der Temperatur mit einer Rate von 2°C/min zwischen 10 und 95°C bestimmt. Nach Auftragung von Absorption ge gen die Temperatur wurden T_m-Werte durch die erste Ableitung der Schmelzkur ven errechnet. Vor der Messung wurde die RNAs denaturiert (5 min 95°C) und durch langsames Abkühlen (2°C/min) auf 23°C wieder renaturiert. Molare Ex tinktionskoeffizienten (ε260, L mol^-1cm^-1) wurden mit Hilfe von Tabellenwerten für Di- und Mononukleotide errechnet.

CD-Spektren der RNA Aptamere (150 ng/µL) wurden bei 37°C in Natriumphos phatpuffer, 2 mM MgCl₂, 5 mM KCl von 300 nM bis 195 nM aufgenommen. Für jedes Aptamer wurden 8 Spektren mit einer Datenpunktdichte von 0,2 nM gemes sen und gemittelt. Die mittlere molare Elliptizität wurde pro Mol Nukleotid- Monomer berechnet.

7. UV-Quervernetzung von RNA Aptameren mit lebenden Trypanosomen

Radioaktiv markierte RNA Aptamere (5-10 nM) wurden bei 37°C mit lebenden T. brucei Zellen (2-8 × 10⁸/mL) für 20 min in Bindungspuffer inkubiert. Danach wurden die Zellen auf Eis für 10 min mit UV-Licht bestrahlt (Energie-Dosis: 0,12 J/cm²). Nach einer Hitzedenaturierung für 5 min bei 95°C wurden die Proben mit einem Gemisch aus RNase A, RNase T1 und DNase I verdaut und mit Hilfe von diskontinuierlicher SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt, getrocknet, und die (³²P)-markierte Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäu re, dadurch gekennzeichnet, daß

a) in einem ersten Schritt eine Nukleinsäure mit Trypanosomen in Kontakt gebracht wird, und
b) in einem zweiten Schritt die Bindung der Nukleinsäure an Trypanosomen überprüft wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trypanoso men Blutstromform-Trypanosomen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu kleinsäure in einer Bibliothek aus verschiedenen Nukleinsäuren enthalten ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu kleinsäure modifiziert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung ausgewählt ist aus einer radioaktiven Markierung oder einer Fluoreszenz farbstoffmarkierung.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Nukleinsäuren an die Trypanosomen mit Hilfe eines Zen trifugationsschrittes oder über eine Markierung der Nukleinsäure überprüft wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß in einem dritten Schritt (c) die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuren von den Trypanosomen getrennt und anschließend die Schritte (a) und (b) sowie vorzugsweise Schritt (c) ein oder mehrmals wie derholt werden.

10. Verfahren zur Herstellung einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß

a) in einem ersten Schritt eine Bibliothek aus verschiedenen Nukleinsäuren hergestellt wird,
b) in einem zweiten Schritt die Nukleinsäure-Bibliothek mit Trypanosomen in Kontakt gebracht wird,
c) in einem dritten Schritt Trypanosomen mit gebundener Nukleinsäure isoliert werden,
d) in einem vierten Schritt die Trypanosomen-bindende Nukleinsäure iso liert wird,
e) ggf. in einem fünften Schritt die isolierte Trypanosomen- bindende Nukleinsäure amplifiziert wird, und
f) ggf. die Schritte (b) bis (e) ein oder mehrmals wiederholt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trypano somen Blutstromform-Trypanosomen sind.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure einen randomisierten Bereich von 25 bis 100 Nukleotiden enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklein säure einen randomisierten Bereich von 30 bis 60 Nukleotiden enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklein säure einen randomisierten Bereich von 40 Nukleotiden enthält.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Bibliothek 10¹⁴ bis 10¹⁵ unterschiedliche Nukleinsäuren enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklein säure-Bibliothek 2 × 10¹⁵ unterschiedliche Nukleinsäuren enthält.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-16, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 4-7 ist.

18. Trypanosomen-bindende Nukleinsäure mit einer der folgenden Sequenzen,
sowie deren Modifikationen zur Stabilisierung gegen Nukleaseabbau ein schließlich Markierungen sowie entsprechende RNA-Sequenzen.

19. Trypanosomen-bindende Nukleinsäure mit einer der folgenden Sequenzen,
sowie deren Modifikationen zur Stabilisierung gegen Nukleaseabbau ein schließlich Markierung sowie entsprechende RNA-Sequenzen davon.

20. Verfahren zur Isolierung eines Trypanosomen-spezifischen Peptids, da durch gekennzeichnet, daß

a) in einem ersten Schritt eine Trypanosomen-bindende Nukleinsäure gemäß Anspruch 18 oder 19 mit Trypanosomen, in Kontakt ge bracht wird, und
b) in einem zweiten Schritt das Trypanosomen-spezifische Peptid, welches eine Trypanosomen-bindende Nukleinsäure gemäß Schritt (a) bindet, isoliert wird.

21. Trypanosomen-spezifisches Peptid isolierbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine apparente Mo lekularmasse von ca. 42 kDa besitzt.

22. Trypanosomen-spezifisches Peptid nach Anspruch 21, dadurch gekenn zeichnet, daß das Trypanosomen-spezifische Peptid ein Blutstromform- Trypanosomen-spezifisches Peptid ist.

23. Trypanosomen-spezifisches Peptid nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Trypanosomen-spezifische Peptid die Trypano somen-bindende Nukleinsäure SEQ ID NO (2-16) bindet.

24. Trypanosomen-spezifisches Peptid nach Anspruch 23, dadurch gekenn zeichnet, daß das Trypanosomen-spezifische Peptid die Trypanosomen- bindende Nukleinsäure SEQ ID NO (2-16) mit einer Assoziationsraten konstante (k_ass) von 4,3 × 10⁴ M^-1s^-1 bindet.

25. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trypanosomen-spezifisches Peptid gemäß einem der Ansprüche 21-24 verwendet wird.

26. Verwendung einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäure oder Teilberei che davon gemäß einem der Ansprüche 18-19, zur Therapie, Prävention bzw. Diagnose der Naganaerkrankung, der Schlafkrankheit, der Beschäl krankheit und/oder der Surraerkrankung.

27. Verwendung eines Trypanosomen-bindenden Peptids gemäß einem der Ansprüche 21-24, zur Therapie, Prävention bzw. Diagnose der Naganaer krankung, der Schlafkrankheit, der Beschälkrankheit und/oder der Surra erkrankung.

28. Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 25, zur Therapie, Prä vention bzw. Diagnose der Naganaerkrankung, der Schlafkrankheit, der Beschälkrankheit und/oder der Surraerkrankung.

29. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Trypanosomen- bindende Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18-19 sowie gegebe nenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Trypanosomen- bindendes Peptid gemäß einem der Ansprüche 21-24 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Antikörper gemäß Anspruch 25 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

32. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend eine Trypanosomen-bindende Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18-19 sowie gegebenenfalls ge eignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

33. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend ein Trypanosomen-bindendes Peptid gemäß einem der Ansprüche 21-24 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

34. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend einen Antikörper gemäß An spruch 25 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.

35. Verwendung einer Trypanosomen-bindenden Nukleinsäure nach Anspruch 18 oder 19 zur Kopplung an eines oder mehrere Antigene oder an für Try panosomen toxische Substanzen.