JPS60133899A - 寄生原虫用ヌクレオチドハイブリダイゼ−シヨン検査法 - Google Patents
寄生原虫用ヌクレオチドハイブリダイゼ−シヨン検査法Info
- Publication number
- JPS60133899A JPS60133899A JP59169178A JP16917884A JPS60133899A JP S60133899 A JPS60133899 A JP S60133899A JP 59169178 A JP59169178 A JP 59169178A JP 16917884 A JP16917884 A JP 16917884A JP S60133899 A JPS60133899 A JP S60133899A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は種特異性の反復性の核ＤＮＡで作られている
ハイブリダイゼーション試薬を利用した寄生原虫のため
の生物学的試料の核酸のＩ・イブリダイゼーション検査
法に関する。この検査法の高い感度は血液や他の組織標
本の分析にとって適したものにしている。
ハイブリダイゼーション試薬を利用した寄生原虫のため
の生物学的試料の核酸のＩ・イブリダイゼーション検査
法に関する。この検査法の高い感度は血液や他の組織標
本の分析にとって適したものにしている。
背 景
高等動物の血流や組織に侵入し、そこで寄生的に生存す
る原生動物は宿主に重い病気を起すことがある。事実、
何世紀も人類を悩棟せた病気の多くは原生動物性の寄生
物によるものである。例えばアフリカの眠）病は一般に
吸血昆虫のツエツエ７々工にかまれることで伝播するれ
る。この属のもう一つの株であるＴｒｙｐａｎｏｉｏｍ
ａｂｒ＋１ｃ＠ｌ ｂｒｕｏｅｉは家畜に感染する。ウ
マ ウシブタに感染し死に至らしめる。カラアザールは
砂蝿によって伝播するＬｓｌｇｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏ
ｖａｎｉによって起されるひどい病気である。シャガス
病は熱帯地方に広く伝播しているが’ｌ’、 ｅｒｕｚ
ｉの感染が起っている。
る原生動物は宿主に重い病気を起すことがある。事実、
何世紀も人類を悩棟せた病気の多くは原生動物性の寄生
物によるものである。例えばアフリカの眠）病は一般に
吸血昆虫のツエツエ７々工にかまれることで伝播するれ
る。この属のもう一つの株であるＴｒｙｐａｎｏｉｏｍ
ａｂｒ＋１ｃ＠ｌ ｂｒｕｏｅｉは家畜に感染する。ウ
マ ウシブタに感染し死に至らしめる。カラアザールは
砂蝿によって伝播するＬｓｌｇｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏ
ｖａｎｉによって起されるひどい病気である。シャガス
病は熱帯地方に広く伝播しているが’ｌ’、 ｅｒｕｚ
ｉの感染が起っている。
これらの病気の診断のために鋭敏で迅速な検査法が必要
とされる。現在性われている方法は患者側々の寄生虫を
分離し、培養しているが時間がかがシ、時には信頼性に
欠ける（ ０ｈａｎｅｓ ＋Ｍ、Ｌ、＋ ｅｔ ａｌ、
Ａｎｎ、 Ｔｒｏｐ、 Ｍ＠ｄ、 Ｐａｒａｍｉｔｏ
ｌ。
とされる。現在性われている方法は患者側々の寄生虫を
分離し、培養しているが時間がかがシ、時には信頼性に
欠ける（ ０ｈａｎｅｓ ＋Ｍ、Ｌ、＋ ｅｔ ａｌ、
Ａｎｎ、 Ｔｒｏｐ、 Ｍ＠ｄ、 Ｐａｒａｍｉｔｏ
ｌ。
６８ Ｉ３０７ （１９７４） ｉＭａｒｔｉｎ、 ”
ｍｌ ａｔ ａｌ、＋Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｙ ２３
−；６００（１９７８）；Ｍｉｌｅｓ。
ｍｌ ａｔ ａｌ、＋Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｙ ２３
−；６００（１９７８）；Ｍｉｌｅｓ。
Ｍ、 Ａ、、 ａｔ ａｉｒ Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，Ｂｏ
ｏ、 Ｔｒｏｐ、 Ｍ＠ｄ。
ｏ、 Ｔｒｏｐ、 Ｍ＠ｄ。
Ｈｙｇ、 ７４． ２４３（１９７９）ｉＬａｉｎｓｏ
ｎ、 Ｒｏ。
ｎ、 Ｒｏ。
Ｔｒａｎｓ、 Ｒ，Ｓｅａ、Ｔｒｏｐ、 Ｍｓｄ、ＨＦ
ｇ、＋ ７５ ＋ ５３０（１９８１） ） 。Ｌｓｌ
ｇｈｍａｎｉａ株による感染による病変部を直接検鏡に
よって寄生虫を検査するがこの方法はよシ深刻なタイプ
の病気を起こす株の同定まではできない。さらにトリパ
ノゾーマ属のような他の株は病変部にはそれら自体みら
れないし、従って敏感な血清学的な検査が必要である。
ｇ、＋ ７５ ＋ ５３０（１９８１） ） 。Ｌｓｌ
ｇｈｍａｎｉａ株による感染による病変部を直接検鏡に
よって寄生虫を検査するがこの方法はよシ深刻なタイプ
の病気を起こす株の同定まではできない。さらにトリパ
ノゾーマ属のような他の株は病変部にはそれら自体みら
れないし、従って敏感な血清学的な検査が必要である。
よシ高い信頼性をもった方法は大量に使うためにむずか
しい（蛍光免疫法）し他の微生物と交叉反応を示す（補
体固定法１凝集法）０それに加えて輸血の目的で血液が
集められるとき感染の高い地域で大きな健康問題が発生
している。血液は寄生虫のキャリヤーであるので、感染
した人からとった血液は知らぬうちに健全な人に移され
るだろう。特にシャガス病はその病気が風土病となって
いる国々の血液銀行にとって大きな問題となっておシ、
輸血によって感染が広まっていく多くの報告例がある。
しい（蛍光免疫法）し他の微生物と交叉反応を示す（補
体固定法１凝集法）０それに加えて輸血の目的で血液が
集められるとき感染の高い地域で大きな健康問題が発生
している。血液は寄生虫のキャリヤーであるので、感染
した人からとった血液は知らぬうちに健全な人に移され
るだろう。特にシャガス病はその病気が風土病となって
いる国々の血液銀行にとって大きな問題となっておシ、
輸血によって感染が広まっていく多くの報告例がある。
これら寄生原虫の現在性われている検査法は血液中の寄
生虫を検出するのに特異性はなく感度もない。
生虫を検出するのに特異性はなく感度もない。
そこで輸血に使われる血液を検査するために使えない。
家畜動物のこれら寄生原虫による農業における経済的損
害は莫大である。例えばＴｒｉｐａｎｏｓｏｍａｅｂｒ
ｕｅｅｌの感染はもし発病の初期に処置されなければ、
その家畜は死に至る。感染に対する感度のよい診断検査
法は現使存在せず多くの動物が失われている６さらに人
にも動物にも薬物療法の効果を今は追うことができず、
従ってこの病気に不必要な治療がしばしば存在する。
害は莫大である。例えばＴｒｉｐａｎｏｓｏｍａｅｂｒ
ｕｅｅｌの感染はもし発病の初期に処置されなければ、
その家畜は死に至る。感染に対する感度のよい診断検査
法は現使存在せず多くの動物が失われている６さらに人
にも動物にも薬物療法の効果を今は追うことができず、
従ってこの病気に不必要な治療がしばしば存在する。
Ｗｌｒｔｈ 、！：Ｐｒａｔｔ （Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔ
’ｌ、 Ａａａｄ、 Ｓｅｌ。
’ｌ、 Ａａａｄ、 Ｓｅｌ。
ＵＳＡ ７９ ６９９９（１９８３））はＬｅｉｓｈｍ
ａｎ１ｍ寄生虫の検出に寄生虫の動原核ＤＮＡに対する
検出剤を使ってのハイブリダイゼーション検査法につい
て述べている。この方法は皮膚の病変部の寄生虫を生体
組成切片標本当Ｊ１００Ｏ〜１００００ケのレベルの感
度で検出する。この標本は感染した皮膚の一部にニトロ
セルロース膜を接触して移しとることによって集められ
た。
ａｎ１ｍ寄生虫の検出に寄生虫の動原核ＤＮＡに対する
検出剤を使ってのハイブリダイゼーション検査法につい
て述べている。この方法は皮膚の病変部の寄生虫を生体
組成切片標本当Ｊ１００Ｏ〜１００００ケのレベルの感
度で検出する。この標本は感染した皮膚の一部にニトロ
セルロース膜を接触して移しとることによって集められ
た。
しかし、この方法は少数の寄生虫を検出するだけの感度
はなく寄生虫それ自体から精製されねばならない検出剤
を頼シにしている。それには実験室で大量にこの生物を
生育させる必要がある。その上、この方法はトリパノゾ
ーマが動原核をもつ唯一の寄生虫であるので、トリパノ
ゾーマ以外の寄生虫にまで広げられない。
はなく寄生虫それ自体から精製されねばならない検出剤
を頼シにしている。それには実験室で大量にこの生物を
生育させる必要がある。その上、この方法はトリパノゾ
ーマが動原核をもつ唯一の寄生虫であるので、トリパノ
ゾーマ以外の寄生虫にまで広げられない。
よシ敏感な検査法がＬ＊ｉｇｈｍａｎ１ｍやその他の寄
生原虫に対してめられているが、それらは高感度で特異
性があシ、従って感染の初期の診断に有効で重篤な病気
を起こすと思われる寄生虫の種類を同定して薬物療法を
評価したり、血液銀行の試料を検査する援けとなるもの
である。
生原虫に対してめられているが、それらは高感度で特異
性があシ、従って感染の初期の診断に有効で重篤な病気
を起こすと思われる寄生虫の種類を同定して薬物療法を
評価したり、血液銀行の試料を検査する援けとなるもの
である。
染色体を溝成する二重鎖ＤＮＡの相補的な性質は細胞の
復製や遺伝情報の転写や翻訳に基本的役割をもっている
。実験室ではＤＮＡの相補的な紐は容易に解離でき、そ
して適当な陽イオン濃度、温度、ＤＮＡａ度や断片の大
きさ等の条件下で容易に再会合しうる。このＤＮＡの相
補的な性質は遺伝的材料の高感度検査法の基本である。
復製や遺伝情報の転写や翻訳に基本的役割をもっている
。実験室ではＤＮＡの相補的な紐は容易に解離でき、そ
して適当な陽イオン濃度、温度、ＤＮＡａ度や断片の大
きさ等の条件下で容易に再会合しうる。このＤＮＡの相
補的な性質は遺伝的材料の高感度検査法の基本である。
例えば５ｏｕｔｈ＠ｒｎ転写法は相補的なりＮＡ鎖であ
るところのハイブリダイゼーシヨン検出試薬を使ってい
る。それと関連のあるＮｏｒｔｈｅｒｎ転写法は相補的
なＲＮＡ試薬と結合するＤＮＡの性質を利用している。
るところのハイブリダイゼーシヨン検出試薬を使ってい
る。それと関連のあるＮｏｒｔｈｅｒｎ転写法は相補的
なＲＮＡ試薬と結合するＤＮＡの性質を利用している。
放射性元素かピオチンをつけたＲＮＡかＤＮＡ！使う検
出装置が開発されている（ Ｇａｒｄｎｅｔ 、 Ｌ、
Ｂ１ｏｔ＊ａｈｎｉｑｕｅｓＭａｒｅｈ Ｖｏｌｕｍｅ
３８ （１９８３） ；Ｌａｕｇｅｒ 、 Ｐ、Ｒ，
。
出装置が開発されている（ Ｇａｒｄｎｅｔ 、 Ｌ、
Ｂ１ｏｔ＊ａｈｎｉｑｕｅｓＭａｒｅｈ Ｖｏｌｕｍｅ
３８ （１９８３） ；Ｌａｕｇｅｒ 、 Ｐ、Ｒ，
。
ａｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ １．Ａｏａｄ、８
ｃｌ、Ｕ８Ａ、。
ｃｌ、Ｕ８Ａ、。
７８．６６３３（１９８１））。
転写法の再現性と信頼性は一般に相補的な鎖がお互いを
認識する精度によっている。しかしながら、染色体の一
杢一本は数多くのヌクレオチド対を含んでいる。例えば
子ウシの染色体は３．２Ｘ１０”のヌクレオチド対をも
っている（ Ｍｏ０ａｒｔｈｙ＋ Ｂ、 Ｊ、＋ Ｐｒ
ｏｇｒ、 Ｎｕｅｌｅｉａ −ＡｃｉｄＲｅｓ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、 ４ 、 １２９（１９６５））。一
つの鎖がその相補鎖を見つけ結合する確率は小さいもの
と思われる。しかしながら驚くべきことに、ある生物の
染色体ではＤＮＡがくフ返し配列をしていて、それが染
色体全体の大きな割合を占めるとみなされることが見出
された（ Ｂｒ１ｔｔｅｎ。
認識する精度によっている。しかしながら、染色体の一
杢一本は数多くのヌクレオチド対を含んでいる。例えば
子ウシの染色体は３．２Ｘ１０”のヌクレオチド対をも
っている（ Ｍｏ０ａｒｔｈｙ＋ Ｂ、 Ｊ、＋ Ｐｒ
ｏｇｒ、 Ｎｕｅｌｅｉａ −ＡｃｉｄＲｅｓ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、 ４ 、 １２９（１９６５））。一
つの鎖がその相補鎖を見つけ結合する確率は小さいもの
と思われる。しかしながら驚くべきことに、ある生物の
染色体ではＤＮＡがくフ返し配列をしていて、それが染
色体全体の大きな割合を占めるとみなされることが見出
された（ Ｂｒ１ｔｔｅｎ。
Ｒ，Ｊ、 ｅｔ ａｌ、、 ０ａｒｎ＠ｇｉ＠Ｉｎ５ｔ
、 Ｗａｓｈ、 ＹｅａｒＢｏｏｋ＋６６、ｙ３（ｔｅ
６７）；１ｂｔｄ ６５，７３（１９６６））。
、 Ｗａｓｈ、 ＹｅａｒＢｏｏｋ＋６６、ｙ３（ｔｅ
６７）；１ｂｔｄ ６５，７３（１９６６））。
例えばマウスの染色体の１０％は短かいヌクレオチド配
列の百方のコピーから成っている（ Ｗａｒｌｎｇ、
Ｍ、 ａｔ ａｌ、、 ５ａｌｉｎｅｅｒ １５４．７
９１（１９６６））。他の多くの種属でもくシ返しＤＮ
Ａ要素を含んでいる（ Ｂｒ１ｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ、
、 ５ｃｉｅｎｃｅ１６１，５２９（１９６Ｂ））。
列の百方のコピーから成っている（ Ｗａｒｌｎｇ、
Ｍ、 ａｔ ａｌ、、 ５ａｌｉｎｅｅｒ １５４．７
９１（１９６６））。他の多くの種属でもくシ返しＤＮ
Ａ要素を含んでいる（ Ｂｒ１ｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ、
、 ５ｃｉｅｎｃｅ１６１，５２９（１９６Ｂ））。
転写ハイブリダイゼーション法がＤＮＡ配列を検出する
ので、次にもしくシ返し配列を認識する検査薬が得られ
れば検査法の感度と特異性が高められる。その上もしこ
のくシ返し配列が種に特異的であればそれを認識する検
査薬も特異的である。そのような種特異的なくシ返しの
核Ｉ）ＮＡ要素を含む寄生原虫がめられている。
ので、次にもしくシ返し配列を認識する検査薬が得られ
れば検査法の感度と特異性が高められる。その上もしこ
のくシ返し配列が種に特異的であればそれを認識する検
査薬も特異的である。そのような種特異的なくシ返しの
核Ｉ）ＮＡ要素を含む寄生原虫がめられている。
要 約
この発明は哺乳動物の宿主からとった血液や他の標本中
の寄生原虫の検出法を提供している。
の寄生原虫の検出法を提供している。
この方法は寄生虫のくり返しのある核ＤＮＡ断片の核酸
のハイブリダイゼーションから成っている。この目的の
ために適当なベクターで種特異的なくり返しのある核の
要素をクローニングすることによってノーイゾリダイゼ
ーションの検出剤が調製される。この検出剤の感度をカ
スケードハイブリダイゼーションを可能にするために、
それをさらにクローニングすることによって増している
。この検査法はＬＩｉａｈｍａｎｌａ属や’ｌ’ｙｙｐ
ａｎｏｓｏｍｌ属のようなぶつうＫみられるトリパノゾ
ーマの病気を起す原虫寄生物の検出に対してマラリアを
起こす原虫や他の哺乳動物の寄生微生物の検出と同様に
特異性が高く感度も高い。
のハイブリダイゼーションから成っている。この目的の
ために適当なベクターで種特異的なくり返しのある核の
要素をクローニングすることによってノーイゾリダイゼ
ーションの検出剤が調製される。この検出剤の感度をカ
スケードハイブリダイゼーションを可能にするために、
それをさらにクローニングすることによって増している
。この検査法はＬＩｉａｈｍａｎｌａ属や’ｌ’ｙｙｐ
ａｎｏｓｏｍｌ属のようなぶつうＫみられるトリパノゾ
ーマの病気を起す原虫寄生物の検出に対してマラリアを
起こす原虫や他の哺乳動物の寄生微生物の検出と同様に
特異性が高く感度も高い。
明 細
我々は原虫寄生物が種特異的なくシ返しの核ＤＮＡ断片
金もつことを発見した。
金もつことを発見した。
この発明は、これらの種特異的なくシ返しの核ＤＮＡ断
片からつくられるハイブリダイゼーション検出剤による
核酸のハイブリダイゼーションから成る原虫寄生物の検
出法を提供している。
片からつくられるハイブリダイゼーション検出剤による
核酸のハイブリダイゼーションから成る原虫寄生物の検
出法を提供している。
この発明は次の添付図によってよシ十分に理解されよう
。
。
第１図はＴ、 ｃｒｕ＋ｃｉのくシ返し断片の特異性を
説明している。
説明している。
第２図はＴ、 ｅｒｕｚｉに感染したヒトの血液中の寄
生虫の検出を説明している。
生虫の検出を説明している。
第３図はアガロースゲル電気泳動によるクローン化され
たＰ、 ｆｏｌｃｉｐａｒｕｍのＤＮＡ挿入部の分析を
説明している。
たＰ、 ｆｏｌｃｉｐａｒｕｍのＤＮＡ挿入部の分析を
説明している。
第４図はクローンのｐＰＦＲ−１とｐＰＦＲ−５からの
くシ返しＤＮＡのヌクレオチド配列を説明している。
くシ返しＤＮＡのヌクレオチド配列を説明している。
第５図は点転写ハイゾリダイゼーション法を使った血液
試料からのＰ、 ｆａｌｅｔｐａｒｕｍ （Ｄ Ｄ Ｎ
Ａの検出を説明している。
試料からのＰ、 ｆａｌｅｔｐａｒｕｍ （Ｄ Ｄ Ｎ
Ａの検出を説明している。
ＤＮＡハイブリダイゼーション検出試薬の利用性この発
明で明らかにされた原虫寄生虫に特異的な反復性の核Ｄ
ＮＡ断片を含むクローンはロックフェラー大学（１２３
０Ｙｏｒｋ Ａｖｅｎｕｅ 。
明で明らかにされた原虫寄生虫に特異的な反復性の核Ｄ
ＮＡ断片を含むクローンはロックフェラー大学（１２３
０Ｙｏｒｋ Ａｖｅｎｕｅ 。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００２１
）に寄託されているｏ Ｔ、 ｃｒｕｓｔとＰ’、 ｆ
ｉｌｅｌｐａｒｕｍに特異的な反復性根ＤＮＡ断片を含
むこの発明に適したクローンも−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ ０ｕｌｔｕｒｅ ０ｏｌｌ＊ｅｔｉｏｎ。
）に寄託されているｏ Ｔ、 ｃｒｕｓｔとＰ’、 ｆ
ｉｌｅｌｐａｒｕｍに特異的な反復性根ＤＮＡ断片を含
むこの発明に適したクローンも−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ ０ｕｌｔｕｒｅ ０ｏｌｌ＊ｅｔｉｏｎ。
Ｂｅｔｈｅｓｄｉ、 Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され次の
寄託番号をもっている。
寄託番号をもっている。
クローン番号 人Ｔｏｏ番号
ｐＴｏ−Ｎ几Ｅｌ ４００７８
ｐＴ０ ｍｕｌｔｉ−ＮＢＪ ４０Ｇ？？ｐＰＦＲ＝１
３９６１９ ｐＰＦ几−５３９６１８ 寄託は発表を可能にする目的だけのためで、この発明の
概念を寄託した特定の材料に限るつもシはない。
３９６１９ ｐＰＦ几−５３９６１８ 寄託は発表を可能にする目的だけのためで、この発明の
概念を寄託した特定の材料に限るつもシはない。
反復性の核ＤＮＡ断片は寄生原虫から次のような方法で
分離した。
分離した。
（、） 寄生虫のＤＮＡを超音波処理によって平均の大
きさ１５００〜２０００塩基対にまで小さく切シ、それ
からアルカリで変性した。
きさ１５００〜２０００塩基対にまで小さく切シ、それ
からアルカリで変性した。
（ｂ）ＤＮＮ人波液中和し、−重の＠をＯａｔ ２．０
に再生した（ Ｂａ１ｔｏｎ ｅｔ ａｌ、ｙ ０ａｒ
ｎ＠ｇｉｅ Ｉｎｍｔ。
に再生した（ Ｂａ１ｔｏｎ ｅｔ ａｌ、ｙ ０ａｒ
ｎ＠ｇｉｅ Ｉｎｍｔ。
Ｗａｓｈ、 Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ＋ ６５ ＋７８ （
１９６１５））。
１９６１５））。
（ｅ） 短時間に再生した（Ｏｏｔ ２．０）ＤＮ人画
分を残存している一重鎖ＤＮＡを分解するためＳ１ヌク
レアーゼで処理した。
分を残存している一重鎖ＤＮＡを分解するためＳ１ヌク
レアーゼで処理した。
（ｄ） 反復性のＤＮＦをに１１ｎｏｖの ＤＮＡポリ
メラーゼｌで処理することで末端の揃った平滑末端とし
、それからＢａｍＨｌ リンカ−に結合した（ Ｄｅｉ
ｎｉｎｇ舎ｒ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ
、 Ｂ１ｏ１＋１５１．１７（１９８１））。このＤＮ
Ａは適当なベクター（ｐＴＪｏ １３またはｐＢＲ３２
２）に結合され、反復性のｎＮＡｌ１片のライブラリー
とするために使われる。このライブラリーは多くのレプ
リカとして貯えられる（フィルター当、Ｑ １０００コ
ロニーを含ムニトロセルロースフィルター）０ （ｅ） 同じ寄生虫からのＤＮＡ検出剤は寄生虫ＤＮＡ
の全体のニック トランスレーション（２）Ｋよって作
られた。他の検出剤は他の寄生虫または興味のあるを椎
動物の宿主からとったＤＮＮ全全部ニックトランスレー
ジョン法で調製した。全ＤＮＡは最初の寄生虫からのク
ローンとの交差反応でスクリーニングされるべきである
。
メラーゼｌで処理することで末端の揃った平滑末端とし
、それからＢａｍＨｌ リンカ−に結合した（ Ｄｅｉ
ｎｉｎｇ舎ｒ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ
、 Ｂ１ｏ１＋１５１．１７（１９８１））。このＤＮ
Ａは適当なベクター（ｐＴＪｏ １３またはｐＢＲ３２
２）に結合され、反復性のｎＮＡｌ１片のライブラリー
とするために使われる。このライブラリーは多くのレプ
リカとして貯えられる（フィルター当、Ｑ １０００コ
ロニーを含ムニトロセルロースフィルター）０ （ｅ） 同じ寄生虫からのＤＮＡ検出剤は寄生虫ＤＮＡ
の全体のニック トランスレーション（２）Ｋよって作
られた。他の検出剤は他の寄生虫または興味のあるを椎
動物の宿主からとったＤＮＮ全全部ニックトランスレー
ジョン法で調製した。全ＤＮＡは最初の寄生虫からのク
ローンとの交差反応でスクリーニングされるべきである
。
（ｆ） 反復性ＤＮ人クローンを含む同一の２イブシリ
−レプリカ（５００〜１０Ｏ０コロニー／フイルター）
は次のよりにハイブリッドされた。
−レプリカ（５００〜１０Ｏ０コロニー／フイルター）
は次のよりにハイブリッドされた。
すなわち
□全く同じ寄生虫からの全ＤＮＡで標識をつけたもので
短時間（１時間）のハ イブリダイゼーションを最大の反復性 をもったクローンを同定するため用い る。
短時間（１時間）のハ イブリダイゼーションを最大の反復性 をもったクローンを同定するため用い る。
□関心のある他の寄生虫またはを椎動物の宿主からの標
識化したＤＮＡ”’Ｃ”最高の感度を得るためにハイブ
リダイゼー ションを完全に行わせる（２４時間）。
識化したＤＮＡ”’Ｃ”最高の感度を得るためにハイブ
リダイゼー ションを完全に行わせる（２４時間）。
（ｇ）はじめの寄生虫で最大のハイブリダイゼーション
の信号を与えるクローンが選択された。
の信号を与えるクローンが選択された。
しかしこれらは交差反応は全く示さない。
缶）最終的に得られる検出剤がカスケードハイブリダイ
ゼーションを可能にさせるためにもし必要なら同種の反
復性ＤＮＡを別に添加するかまたは他の遺伝子からの反
復性のＤＮＡを混合することによってクローンを修飾す
る。
ゼーションを可能にさせるためにもし必要なら同種の反
復性ＤＮＡを別に添加するかまたは他の遺伝子からの反
復性のＤＮＡを混合することによってクローンを修飾す
る。
０）混合した検出剤はまた核および／または動原核の反
復性ＤＮＡ断片が縦に並んだ直線性の検査法を含ませる
ために作られる。
復性ＤＮＡ断片が縦に並んだ直線性の検査法を含ませる
ために作られる。
（ｊ） この検出剤はＴ、 ｃｒｕｚｌ ’ｐ Ｐ、
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにりいて述べられたものと同じハ
イブリダイゼーション検査法で検査された。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにりいて述べられたものと同じハ
イブリダイゼーション検査法で検査された。
以上に概論した方法はＬｅｉｓｅｈｍａｎｉａ ｂｒａ
ａｌｌｉｅｎｓｉｓ ＴＬ、 ｔｒｏｐｉｏＬ Ｌ、
ｍ５ｘｌｃａｎａ＋ Ｌ、 ｄｏｎｏｖａｎｉ、 Ｔ、
ｃｒｕｚｉ＋Ｔ、 ｂｒｕｅｓｉ ｂｒｔ＋ｏ＠ｉ＋
Ｔ、 ｂｒｕａｅｉ ｇａｍｂｌｅｎｍｓ。
ａｌｌｉｅｎｓｉｓ ＴＬ、 ｔｒｏｐｉｏＬ Ｌ、
ｍ５ｘｌｃａｎａ＋ Ｌ、 ｄｏｎｏｖａｎｉ、 Ｔ、
ｃｒｕｚｉ＋Ｔ、 ｂｒｕｅｓｉ ｂｒｔ＋ｏ＠ｉ＋
Ｔ、 ｂｒｕａｅｉ ｇａｍｂｌｅｎｍｓ。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｔｎ ｆａｌｅｉｐａｒｕｍの寄生
虫に適用されるし、また他の寄生庫虫にも同様適用でき
るだろう。
虫に適用されるし、また他の寄生庫虫にも同様適用でき
るだろう。
開用の中の他の原虫寄生物や関連した属の反復性ＤＮＡ
断片に同じような方法で単離される。
断片に同じような方法で単離される。
実施例はＬｅｌａｈｍａｎｉａ ｍやＴｒｙｐａｎｏｓ
ｏｍａ属のトリパノゾーマ性の寄生虫の他にＰｌａｓｍ
ｏｄｌ Ｆ４、Ｂａｂｅｓｉａ属の生物も含んでいるが
、それらに限定されない。例えばＬｅｉｓｃｈｍａｎ１
ｍ寄生虫はり。
ｏｍａ属のトリパノゾーマ性の寄生虫の他にＰｌａｓｍ
ｏｄｌ Ｆ４、Ｂａｂｅｓｉａ属の生物も含んでいるが
、それらに限定されない。例えばＬｅｉｓｃｈｍａｎ１
ｍ寄生虫はり。
ｄｏｎｏｖａｎｉ、 Ｌ、 ｂｒａｓｔｌｌｅｎｓｉｓ
、 Ｌ、 ｔｒｏｐｉｃｍ、 Ｌ。
、 Ｌ、 ｔｒｏｐｉｃｍ、 Ｌ。
ｍ５ｘｌｃａｎａを含むｏＴｒｙｐａｎｏ＠ｏｍａ属は
５ａｌｉｖａｒｉａｎ−マはＴ、 ｃｒｕ漠ｌを含んで
いる。
５ａｌｉｖａｒｉａｎ−マはＴ、 ｃｒｕ漠ｌを含んで
いる。
Ｗｕｏｈｅｒｅｒｌａ ＢａｎｅｙｏｆｔｉとＢｒｕｇ
ｌａ ｍａｌａｙｌが属しているフイラリア性の寄生虫
やヒトのマンリアを起こす寄生虫Ｐ、 ｍａｌａｒｌａ
＋ Ｐ、 ｖｉｖａｘも含まれる。哺乳動物によく見つ
けられる血液寄生虫や糞からのアメーノ々からとったＤ
ＮＡも上記の方法またはこの分野で公知の他の方法で分
離され、本発明の検査法におけるハイブリダイゼーショ
ン検出剤として使われる。
ｌａ ｍａｌａｙｌが属しているフイラリア性の寄生虫
やヒトのマンリアを起こす寄生虫Ｐ、 ｍａｌａｒｌａ
＋ Ｐ、 ｖｉｖａｘも含まれる。哺乳動物によく見つ
けられる血液寄生虫や糞からのアメーノ々からとったＤ
ＮＡも上記の方法またはこの分野で公知の他の方法で分
離され、本発明の検査法におけるハイブリダイゼーショ
ン検出剤として使われる。
Ｔ、 ｃｒｕｓｔから分離した反復性根ＤＮＡ断片はヌ
クレオチド配列について分析され、次のとおシであるこ
とがわかった。
クレオチド配列について分析され、次のとおシであるこ
とがわかった。
０ＴＯＴＴＧＯＯＯＡＯＡＯＧＧＧＴＧ中ＧＯＡＯＴＯ
ＧＧＯＴＩＬＧＡＴＯＧＴＴＴＴＯＧＡＧ申ｏｄσＧ
６１Ｔ Ｇ ＯＡ Ｔ ０ＡＯＡＯＧＴＴＧ’Ｉ’０１
ＧＴＯＯＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＯＯＧＡＴＴＧＴＧ
ＡＡＴＧＧＴＧＧＯＬＡＡＴＯＧＧＡＡＡＯＡＯＴ ０
ＴＯＴＧＴＯＡＡＴＡＴＯＴＧＴＴＴＧＯＧＴＧＴＴＯ
ＡＣＡ０ＡＯＴＧＧＡＣＡ０ＣＡＬＡＡＣＡＡＯＯＣＴ
ＧＡＡＣＴＡＴ００ＧＯ′ＬｒＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡ
ＴＴＴＣｄＬＯＧＡＧこのＤＮＡ断片は微細な変異をみ
せている。
ＧＧＯＴＩＬＧＡＴＯＧＴＴＴＴＯＧＡＧ申ｏｄσＧ
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ＧＡＡＣＴＡＴ００ＧＯ′ＬｒＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡ
ＴＴＴＣｄＬＯＧＡＧこのＤＮＡ断片は微細な変異をみ
せている。
しかしながら、この配列が個々の場所で５〜２０％違っ
ている七いえどもそれはなおＴ、 ｅｒｕｚｌにとって
種物異的なハイブリダイゼーション検出剤であシうる。
ている七いえどもそれはなおＴ、 ｅｒｕｚｌにとって
種物異的なハイブリダイゼーション検出剤であシうる。
本発明のハイブリダイゼーション検出剤は、これらの変
異を含んでいることが理解されるべきである。
異を含んでいることが理解されるべきである。
Ｐ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｄ Ｎ Ａの６ケの別々
のクローンをベクターとしてシラスミドｐＵＯ１３を使
って分離した。ｐＰＦＲ−１からｐＰＦＲ−６と命名さ
れたクローンは大兄２８０から１２００塩基対（ＢＰ）
までの大きさの挿入部を含んでいる。
のクローンをベクターとしてシラスミドｐＵＯ１３を使
って分離した。ｐＰＦＲ−１からｐＰＦＲ−６と命名さ
れたクローンは大兄２８０から１２００塩基対（ＢＰ）
までの大きさの挿入部を含んでいる。
クローン化された挿入部は第１図にアガロースゲルにお
ける染色されたＤＮＡのノ々ンドとして示されている。
ける染色されたＤＮＡのノ々ンドとして示されている。
第１表はクローン化した挿入部の各々の大兄の大きさを
示している。その表はまたクローン３ ｒ ４ ＋ ５
が同じ配列群に属していることを示している◇クローン
１，２．６は全てお互いに異っているし０群とも累って
いる。
示している。その表はまたクローン３ ｒ ４ ＋ ５
が同じ配列群に属していることを示している◇クローン
１，２．６は全てお互いに異っているし０群とも累って
いる。
０群のクローンが多いことは、それらがＰ。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ の主要なくル返し断片を示すこ
とを示唆している。
とを示唆している。
クローンのｐＰＦＲりとｐＰＦＲ−５のＤＮＡは配列決
定された。第２図はｐＰＦＲ−１の基本的なくシ返し単
位が５１ｂｐ配列であｐｌ一方ｐＰＦ几−５ではくシ返
し単位が２１ｂｐであることを示している。くり返し単
位はわずかに不完全すなわち配列における微小なちがい
による多様性を示している。
定された。第２図はｐＰＦＲ−１の基本的なくシ返し単
位が５１ｂｐ配列であｐｌ一方ｐＰＦ几−５ではくシ返
し単位が２１ｂｐであることを示している。くり返し単
位はわずかに不完全すなわち配列における微小なちがい
による多様性を示している。
第１表
ｐＩ’ＰＲ−１１２０ＯＡ
ｐＰＦＲ−２８００Ｂ
ｐＰＦ几−３２８００
ｐ ＰＦＲ−４３２００
ｐＰＦＲ−５３４００
＊配列群の関係は６つの挿入部の全てからのＤＮＡを含
む８ｏｕｔｈｅｒｎ転写で夫々のクローンからの標識化
したＤＮＡのハイブリダイゼーションによって決められ
た。
む８ｏｕｔｈｅｒｎ転写で夫々のクローンからの標識化
したＤＮＡのハイブリダイゼーションによって決められ
た。
ＤＮＡの配列はこの学問分野ではよく知られている方法
で、化学的にか生物学的に合成される。この配列に相補
的なりＮＡと同じまたは相補的配列をもった几ＮＡは同
様にして合成される。
で、化学的にか生物学的に合成される。この配列に相補
的なりＮＡと同じまたは相補的配列をもった几ＮＡは同
様にして合成される。
反復性の部分のくル返しまたはその部分のさらに断片の
くり返しからなるＤＮＡ配列もつくられる。第３の可能
性は異った部分（ａ、ｂ、ｅ・・・）がａ−ａ−ａ・・
・・・・ｂ−ｂ−ｂ・川・・ｃ−ｅ−ｃ・・・・・・の
ように縦列に反復する形で混合した断片のクローンを形
成することである。同様にマルチ−ａ１マルチ−ｂ１マ
ルチ−Ｃのクローンが別個に形成され一つなぐ反応のと
きに混ぜられる。
くり返しからなるＤＮＡ配列もつくられる。第３の可能
性は異った部分（ａ、ｂ、ｅ・・・）がａ−ａ−ａ・・
・・・・ｂ−ｂ−ｂ・川・・ｃ−ｅ−ｃ・・・・・・の
ように縦列に反復する形で混合した断片のクローンを形
成することである。同様にマルチ−ａ１マルチ−ｂ１マ
ルチ−Ｃのクローンが別個に形成され一つなぐ反応のと
きに混ぜられる。
放射性元素、特にＮｐをつけられたシビオチン化した場
合にははじめに分離した株のハイブリダイゼーション検
査法では天然のまたは合成の反復性ＤＮＡやＲＮＡが有
効である。これらの反復性のＤＮＡ断片は構成的な遺伝
子ではなく、タンパクのような既知の構成的産物をコー
ドしているものでもないようである。
合にははじめに分離した株のハイブリダイゼーション検
査法では天然のまたは合成の反復性ＤＮＡやＲＮＡが有
効である。これらの反復性のＤＮＡ断片は構成的な遺伝
子ではなく、タンパクのような既知の構成的産物をコー
ドしているものでもないようである。
寄生原虫のためのハイブリダイゼーション検出剤は適当
なベクターで種物異的な核の反復性断片をり四−ニング
し、適当な標識でラベルすることによって調製される。
なベクターで種物異的な核の反復性断片をり四−ニング
し、適当な標識でラベルすることによって調製される。
ＤＮＡ断片が挿入され復製されるベクターが適切である
。そのようなベクターには、例えばＥ、ｅｏｌｉのシラ
スミド、フィラメント状のファージ、ラムドイドパクテ
リオ７アージ、コスミドや酵母のシャトルベクターなど
が含まれる。
。そのようなベクターには、例えばＥ、ｅｏｌｉのシラ
スミド、フィラメント状のファージ、ラムドイドパクテ
リオ７アージ、コスミドや酵母のシャトルベクターなど
が含まれる。
この分野で知られる他のベクターも使われる。
特にシラスミドｐＵｏ１３が望ましい。
ＤＮＡハイツリダイゼーション検査法の目的のためにク
ローンは放射性元素またはビオチンのような発色団で標
識される。そのクローンは例えば”Ｐ−ｄｅＴＰの存在
でＤＮＡポリメラーゼでニツクトジンスレーションする
ことによって＠＊ｐで標識されよう（Ｂｏｔｅｈａｎ、
Ｍ、ｌ ａｔ ａｌｌ出出。
ローンは放射性元素またはビオチンのような発色団で標
識される。そのクローンは例えば”Ｐ−ｄｅＴＰの存在
でＤＮＡポリメラーゼでニツクトジンスレーションする
ことによって＠＊ｐで標識されよう（Ｂｏｔｅｈａｎ、
Ｍ、ｌ ａｔ ａｌｌ出出。
別の方法ではＲＮＡノ−イゾリダイゼーションを利用す
る検査法で、反復性のＤＮＡに相補的なＲＮＡを結合し
て調製される。
る検査法で、反復性のＤＮＡに相補的なＲＮＡを結合し
て調製される。
適当ナプロそ一ター配列が関心の、ｉるＤＮＡと結合さ
れ、標準的カクローニング技術を使ってＨ，ｃｏｉｌの
ような適当な宿主において複製されよう。このＤＮＡは
それからＥ、 ｃｏｉｌから分離され、放射性標識また
はビオチン化されたＲＮＡ１産出するために几ＮＡポリ
メラーゼと１ｎマｉ ｔｒｏでインキュベートされる。
れ、標準的カクローニング技術を使ってＨ，ｃｏｉｌの
ような適当な宿主において複製されよう。このＤＮＡは
それからＥ、 ｃｏｉｌから分離され、放射性標識また
はビオチン化されたＲＮＡ１産出するために几ＮＡポリ
メラーゼと１ｎマｉ ｔｒｏでインキュベートされる。
例えばＧｒ＠ｅｔｈ、 Ｍ、 ａｔ ｉｆ、（０嗜１１
３２．６８１（１９８３））の方法がくシ返しのある核
ＤＮＡに相補的なビオチン化几ＮＡまたは放射活性をも
ったＲＮＡを産出するために使われよう。
３２．６８１（１９８３））の方法がくシ返しのある核
ＤＮＡに相補的なビオチン化几ＮＡまたは放射活性をも
ったＲＮＡを産出するために使われよう。
種４異的な核の反復性ＤＮＡｔ−含むノ・イブリダイゼ
ーション検出剤はさらに最終的にできる検出剤がＤＮＡ
／ＤＮ人ハイクリダイゼーションにおいてカスケードハ
イブリダイゼーションを可能にするために余分の反復性
ＤＮＡを付加することによって修正されよう。カスケー
ドハイブリダイゼーションの信号によって多重に連結し
ｆｃＤＮＡのネットワークを形作るために、この検査法
の感度は著しく増加した。カスケード信号をもったハイ
ブリダイゼーション検出剤はハイブリダイゼーションの
信号が増幅されるので、１ケの寄生虫はどに相当するＤ
ＮＡを検出しうる。この感度の増大はこの試験法を感染
の初期の診断や血液銀行における検定に適したものにし
ているし、またすでに起こった感染に向けられる薬物療
法を追跡するのに有用である。
ーション検出剤はさらに最終的にできる検出剤がＤＮＡ
／ＤＮ人ハイクリダイゼーションにおいてカスケードハ
イブリダイゼーションを可能にするために余分の反復性
ＤＮＡを付加することによって修正されよう。カスケー
ドハイブリダイゼーションの信号によって多重に連結し
ｆｃＤＮＡのネットワークを形作るために、この検査法
の感度は著しく増加した。カスケード信号をもったハイ
ブリダイゼーション検出剤はハイブリダイゼーションの
信号が増幅されるので、１ケの寄生虫はどに相当するＤ
ＮＡを検出しうる。この感度の増大はこの試験法を感染
の初期の診断や血液銀行における検定に適したものにし
ているし、またすでに起こった感染に向けられる薬物療
法を追跡するのに有用である。
核酸のハイブリダイゼーション検査法
寄生原虫に対する検査は寄生虫を含むと思われ石生物試
料について行われる。例えば血液、生体組織片あるいは
汚れや洗濯物から得られる病変部の物質などが検査に適
し之試料である。
料について行われる。例えば血液、生体組織片あるいは
汚れや洗濯物から得られる病変部の物質などが検査に適
し之試料である。
それが高感度であるために、この発明における方法は標
本当シエクの寄生虫が検出されるような血液に適用でき
る。
本当シエクの寄生虫が検出されるような血液に適用でき
る。
本発明の方法では生体組織片標本または生体液からフェ
ノール抽出で分離される寄生虫のＤ Ｎ Ａ （Ｌｉｚ
ａｒｄ１＋ Ｐ、 ａｔ ｍｌ、＋ Ｍ＠ｔｈｏｄｓｉ
ｎＢｎｍｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ、 ９６ ＠生体膜″
Ｂｄｓ、 Ｓ。
ノール抽出で分離される寄生虫のＤ Ｎ Ａ （Ｌｉｚ
ａｒｄ１＋ Ｐ、 ａｔ ｍｌ、＋ Ｍ＠ｔｈｏｄｓｉ
ｎＢｎｍｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ、 ９６ ＠生体膜″
Ｂｄｓ、 Ｓ。
Ｆ１＊１ｓｈｅｒ ａｎｄ Ｂ、 Ｆ１ｅｉｓｈ＠ｒ
ｉ Ａｃａｄｅｔｎｉｅ Ｐｒ＊ｓｓ＋Ｎ、Ｙ、）やア
ルカリで効率よく可溶化されるような小さな組織切片や
生体液、寄生虫の培養試料などは点滴−転写法でニトロ
セルロースか遺伝子スクリーンのような類似の固体支持
体にスポットされる（ Ｋａｆａｔｏｓ ａｔ ａｌ、
Ｎｕｅｌｅｉｃ ＡｏｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、 ７．
１５４１（１９７９））。ＤＮＡを結合させた後ニトロ
セルロースまたは他の固体の支持体を放射性の検出剤と
その検出剤と結合したＤＮＡの間の反応に適した条件下
で接触させる。例、ｔばニトロセルロースはノ・イブリ
ダイゼーション溶液（Ｋａｆａｔｏｓ・・ｔ ａｌ・・
前出）の存在下に約４６Ｃの適当な温度で約４ないし２
０時間反応される。そのニトロセルロースを液から取り
出し、洗ってそして放射性の検出剤が用いられたときは
Ｘ線フィルムと強化スクリーンを使ってラジオオートグ
ラフィーで露出させる０信号は約４〜２４時間露出した
後、フィルムに暗いスポットとして観察される。検出剤
がビオチン化されている場合にはニトロセルロースはア
ビジン−酵素システムにさらされ、寄生虫のＤＮＡｆｅ
示す色のついたスポットが与られる。
ｉ Ａｃａｄｅｔｎｉｅ Ｐｒ＊ｓｓ＋Ｎ、Ｙ、）やア
ルカリで効率よく可溶化されるような小さな組織切片や
生体液、寄生虫の培養試料などは点滴−転写法でニトロ
セルロースか遺伝子スクリーンのような類似の固体支持
体にスポットされる（ Ｋａｆａｔｏｓ ａｔ ａｌ、
Ｎｕｅｌｅｉｃ ＡｏｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、 ７．
１５４１（１９７９））。ＤＮＡを結合させた後ニトロ
セルロースまたは他の固体の支持体を放射性の検出剤と
その検出剤と結合したＤＮＡの間の反応に適した条件下
で接触させる。例、ｔばニトロセルロースはノ・イブリ
ダイゼーション溶液（Ｋａｆａｔｏｓ・・ｔ ａｌ・・
前出）の存在下に約４６Ｃの適当な温度で約４ないし２
０時間反応される。そのニトロセルロースを液から取り
出し、洗ってそして放射性の検出剤が用いられたときは
Ｘ線フィルムと強化スクリーンを使ってラジオオートグ
ラフィーで露出させる０信号は約４〜２４時間露出した
後、フィルムに暗いスポットとして観察される。検出剤
がビオチン化されている場合にはニトロセルロースはア
ビジン−酵素システムにさらされ、寄生虫のＤＮＡｆｅ
示す色のついたスポットが与られる。
検査法の特異性は他の寄生原虫を検出剤に接触させるこ
とによってテストされる。既知の寄生虫のＤＮＡをもっ
た対照の試料を比較に同時に走らせる。
とによってテストされる。既知の寄生虫のＤＮＡをもっ
た対照の試料を比較に同時に走らせる。
本発明は次のような例で説明されるがそれに限定される
ものではない。
ものではない。
実施例１
この例はＴ、 ａｒｕｚｉからの反復性根ＤＮＡ断片の
単離と同定を説明している。’Ｉ’、 ａｒｕｚｉの・
ｐｉｍａｍｔｉｇｏｔｅのＤＮＡをいろいろな制限酵素
で切断した。８８Ｔ１による消化は約２００塩基対の密
着したＡンドを作シ出し、それは寄生虫全体のＤＮＡの
７ないし１０％になった。８８Ｔ■の切断部位に結合し
た１９５塩基対の領域を断片は含んでいるが、くシ返し
の配列の実際の長さはそれよフいくらか長いだろう。放
射性のくシ返し検出剤を使った８ｏｕｔｈ＠ｒｎ転写分
析では少くともくシ返し断片のあるものは直列に並んだ
領域にあることが示された０このくり返しの断片はＴ、
ｃｒｕｅｌの染色体では約１０００００回くシ返して
いるので、寄生虫のＤＮＡの２コグ２ムの断片を検出で
きるハイブリダイゼーション検査法を基礎がここに出さ
れている。
単離と同定を説明している。’Ｉ’、 ａｒｕｚｉの・
ｐｉｍａｍｔｉｇｏｔｅのＤＮＡをいろいろな制限酵素
で切断した。８８Ｔ１による消化は約２００塩基対の密
着したＡンドを作シ出し、それは寄生虫全体のＤＮＡの
７ないし１０％になった。８８Ｔ■の切断部位に結合し
た１９５塩基対の領域を断片は含んでいるが、くシ返し
の配列の実際の長さはそれよフいくらか長いだろう。放
射性のくシ返し検出剤を使った８ｏｕｔｈ＠ｒｎ転写分
析では少くともくシ返し断片のあるものは直列に並んだ
領域にあることが示された０このくり返しの断片はＴ、
ｃｒｕｅｌの染色体では約１０００００回くシ返して
いるので、寄生虫のＤＮＡの２コグ２ムの断片を検出で
きるハイブリダイゼーション検査法を基礎がここに出さ
れている。
配列はＤＮＡの予期される温度安定性（Ｔｍ ）をひき
出すために使える。９０．４０というＴｍは動原核のＤ
ＮＡがもつと低いＴｍをもっていることが知られている
ので、このＤＮＡが核起原のものであると同定される。
出すために使える。９０．４０というＴｍは動原核のＤ
ＮＡがもつと低いＴｍをもっていることが知られている
ので、このＤＮＡが核起原のものであると同定される。
実施例２
この例はＤＮＡ／ＤＮＡハイゾリダイゼーションにおい
てカスケードハイブリダイゼーションの信号を産出する
ことのできるハイブリダイゼーション検出剤の調製と特
異性を説明している。
てカスケードハイブリダイゼーションの信号を産出する
ことのできるハイブリダイゼーション検出剤の調製と特
異性を説明している。
Ｔ、 ｃｒｕｓｔからとったくシ返しの核ＤＮＡ断片（
例１）は１．５％アガｐ−スゲルによる消化溶媒から分
離した後単離し、プラスミドｐＵ０１３の中にクローン
化した（ Ｖｔ・ｉｒａ＋ Ｊ−ｒ＠ｔ ａｌ、＋Ｇｏ
ｎｅ １９．（１９８３））ｏクローンはｐＴＯＮＲＥ
（Ｔ、 ＣＲＵＸＳの核のくシ返し断片のプラスミド）
と命名された。他のクローンは一つではなくていくつか
の断片のコぎ−が含まれるよう作られた。これら新しい
クローンはｐＴＯ−ｍｕｌｔｉＮＲＥと名づけられカス
ケードハイブリダイゼーションによって約４０倍増幅さ
れるハイブリダイゼーション信号を作υ出すことができ
る。
例１）は１．５％アガｐ−スゲルによる消化溶媒から分
離した後単離し、プラスミドｐＵ０１３の中にクローン
化した（ Ｖｔ・ｉｒａ＋ Ｊ−ｒ＠ｔ ａｌ、＋Ｇｏ
ｎｅ １９．（１９８３））ｏクローンはｐＴＯＮＲＥ
（Ｔ、 ＣＲＵＸＳの核のくシ返し断片のプラスミド）
と命名された。他のクローンは一つではなくていくつか
の断片のコぎ−が含まれるよう作られた。これら新しい
クローンはｐＴＯ−ｍｕｌｔｉＮＲＥと名づけられカス
ケードハイブリダイゼーションによって約４０倍増幅さ
れるハイブリダイゼーション信号を作υ出すことができ
る。
ハイブリダイゼーションの検出剤は”Ｐ−ｄｃＴＰの存
在下ＤＮＡポリメ２−ゼによるニックトランスレーショ
ンによってｐＴＯＮＲＢをｓｉするによって組立てられ
（Ｂｏｔｅｈａｎ、 Ｍ、、 ａｔ ａｌ、上述）マイ
クログラム当フ１ｏ”ｏｐＭＯ比活性を示す。
在下ＤＮＡポリメ２−ゼによるニックトランスレーショ
ンによってｐＴＯＮＲＢをｓｉするによって組立てられ
（Ｂｏｔｅｈａｎ、 Ｍ、、 ａｔ ａｌ、上述）マイ
クログラム当フ１ｏ”ｏｐＭＯ比活性を示す。
このＴ、 ａｒｕｚｉ検出剤は検査した８つのＴ、 ａ
ｒｕｚｉ株の全てとハイブリッドした。マウスやヒトの
ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは陰性であった。
ｒｕｚｉ株の全てとハイブリッドした。マウスやヒトの
ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは陰性であった。
第１図はＴ、 ｃｒｕｓｔのハイブリダイゼーション検
出剤の特異性を説明している。その検出剤はエピマステ
ィボートのＴ、 ａｒｕｚｉを検出したかに対しては陰
性であった。
出剤の特異性を説明している。その検出剤はエピマステ
ィボートのＴ、 ａｒｕｚｉを検出したかに対しては陰
性であった。
実施例３
この例はＴ、 ｅｒｕｚｉについての血液の検査を説明
している。
している。
Ｔ、 ｏｒｕｚｉのＤＮＡ（フェノール抽出によって−
Ｃピマステイゴートから分離された）の点滴転写法（Ｋ
ａｆａｔｏａ＋ ｅｔ ａｌ、前記）を使ってニトロセ
ルロース上にスポットされた。この技法は引用した文献
によく記述されているが、簡単に言えばアルカリ中でＤ
ＮＡｔ−変性し、中和し、そして高濃度の塩（ＮａＯＪ
）の存在でニトロセルロース上にスポットすることを包
含している。Ｔ。
Ｃピマステイゴートから分離された）の点滴転写法（Ｋ
ａｆａｔｏａ＋ ｅｔ ａｌ、前記）を使ってニトロセ
ルロース上にスポットされた。この技法は引用した文献
によく記述されているが、簡単に言えばアルカリ中でＤ
ＮＡｔ−変性し、中和し、そして高濃度の塩（ＮａＯＪ
）の存在でニトロセルロース上にスポットすることを包
含している。Ｔ。
ｃｒａ％ｌのＤＮＡはＯ，Ｏｌｎｇ（３０ケの生物に相
当する）から１０ｎｇ（３０，０００ケの生物）までの
量で一連の標準量を準備するためにスポットされた。２
種類の実験用の試料もニトロセルロース上にスポットさ
れうる。（ａ）生体組織片または生体液からフェノール
抽出で得られるいかなる種類のＤ Ｎ Ａ 、 （ｂ）
アルカリで効率的に可溶化される（予めフェノール抽出
なしに）いかなる少量の組織標本生体液あるいは寄生虫
の培養試料。結合されるべき試料は直径約５閣のスイッ
トをニトロセルロースの上に一列に並べるＢ×１２枠の
ハイシリドツト（Ｈｙｂｒｙ −ｄｏｔ ）装置（８ｃ
ｈｌ＊１ｃｈｓｒ ａｎｄ ８ａｈｕｅｌｌ、 Ｉｎｃ
、、 Ｋｅ＠ｒｓ＊、 Ｎ＠ｗＲａｍｐ壽ｈｉｒｓ）を
使って好便に処理された。ＤＮＡの結合のあとニトロセ
ルロースを２時間加熱乾燥し、それからハイブリダイゼ
ーション液（３）ヲ含むプラスチックの袋に入れた。放
射性の検出剤ＰＴＯＮＲＥＩ （例２から得られた）を
加え袋をシールし、そして４〜２０時間適当な温度（４
６Ｃ）でインキエペートした。それからニドμセル四−
スを袋からとシ出し、数回低塩濃度のドデシル硫酸ソー
ダ溶液で洗った。最後にＸ線フィルムと強化スクリーン
で２ジオオートゲ２フイー的に露出した。４〜２４時間
露出した後フィルムに黒にスポットとして信号が観察さ
れた。
当する）から１０ｎｇ（３０，０００ケの生物）までの
量で一連の標準量を準備するためにスポットされた。２
種類の実験用の試料もニトロセルロース上にスポットさ
れうる。（ａ）生体組織片または生体液からフェノール
抽出で得られるいかなる種類のＤ Ｎ Ａ 、 （ｂ）
アルカリで効率的に可溶化される（予めフェノール抽出
なしに）いかなる少量の組織標本生体液あるいは寄生虫
の培養試料。結合されるべき試料は直径約５閣のスイッ
トをニトロセルロースの上に一列に並べるＢ×１２枠の
ハイシリドツト（Ｈｙｂｒｙ −ｄｏｔ ）装置（８ｃ
ｈｌ＊１ｃｈｓｒ ａｎｄ ８ａｈｕｅｌｌ、 Ｉｎｃ
、、 Ｋｅ＠ｒｓ＊、 Ｎ＠ｗＲａｍｐ壽ｈｉｒｓ）を
使って好便に処理された。ＤＮＡの結合のあとニトロセ
ルロースを２時間加熱乾燥し、それからハイブリダイゼ
ーション液（３）ヲ含むプラスチックの袋に入れた。放
射性の検出剤ＰＴＯＮＲＥＩ （例２から得られた）を
加え袋をシールし、そして４〜２０時間適当な温度（４
６Ｃ）でインキエペートした。それからニドμセル四−
スを袋からとシ出し、数回低塩濃度のドデシル硫酸ソー
ダ溶液で洗った。最後にＸ線フィルムと強化スクリーン
で２ジオオートゲ２フイー的に露出した。４〜２４時間
露出した後フィルムに黒にスポットとして信号が観察さ
れた。
ｐＴｏ−ＮＲＥプ２スミドによる検査法は約３０ケの寄
生虫に相当するＤＮＡを検出した。ｐ’ｒｏ−マルチＮ
几Ｅ−ｊ′、７スミドはハイブリダイゼーションの信号
がカスヶードハイゾリダイゼーション（多重に連結した
ＤＮＡネットワークの形成）によって約４０倍に増幅さ
れるので、１ケの寄生虫に相当するＤＮＡｔ−検出する
。
生虫に相当するＤＮＡを検出した。ｐ’ｒｏ−マルチＮ
几Ｅ−ｊ′、７スミドはハイブリダイゼーションの信号
がカスヶードハイゾリダイゼーション（多重に連結した
ＤＮＡネットワークの形成）によって約４０倍に増幅さ
れるので、１ケの寄生虫に相当するＤＮＡｔ−検出する
。
ｐＴＯＮ几Ｅ検査法は種特異性である。異ったＴ、 ｅ
ｒｕｚｉ株での検査ではテストした全ての株に陽性であ
った。この方法の感度は０．３ ｃｃの血液のパックグ
ラウンドで１ケのＴ、 ｅｒｕｚｉ ｋ検出するに十分
であることがわかった。Ｔ、 ｅｒｕｚｉに感染してい
ると思われる５人の患者の血液の検査の結果が第２図に
説明されている。５人の患者とも全て陽性のハイブリダ
イゼーションを示したが一方健常人の血液は陰性の結果
を与えた。
ｒｕｚｉ株での検査ではテストした全ての株に陽性であ
った。この方法の感度は０．３ ｃｃの血液のパックグ
ラウンドで１ケのＴ、 ｅｒｕｚｉ ｋ検出するに十分
であることがわかった。Ｔ、 ｅｒｕｚｉに感染してい
ると思われる５人の患者の血液の検査の結果が第２図に
説明されている。５人の患者とも全て陽性のハイブリダ
イゼーションを示したが一方健常人の血液は陰性の結果
を与えた。
いて血液を検査するために使われる。血液、生体組織標
本や生体液がいがなる寄生原虫に対して実施例３の方法
によって検査されよう。
本や生体液がいがなる寄生原虫に対して実施例３の方法
によって検査されよう。
実施例８
この例は種特異的な反復性核ＤＮＡに相補的なビ、ｔｒ
−ｙ化した几ＮＡまたは放射性のＲＮＡを作シ出す方法
を説明している。
−ｙ化した几ＮＡまたは放射性のＲＮＡを作シ出す方法
を説明している。
サルモネラ菌のファージ８Ｐ６のプロそ一ター配列を含
むＤＮＡの一部を問題としているＤＮＡクローンと融合
する。この新しいＤＮＡの作成は標準的なりローニング
技法を使ってＥ、 ｅｏｌｉＯ中で複製されうる。それ
からこのＤＮＡはＢ、 ｃｏｉｌがら分離され、ＲＮＡ
ポリメラーゼ（サルモネ２のファージＳＰ６がら得た）
とｉｎ ｖｌｔｒｏで反応され、放射性のあるいはビオ
チン化したＲＮＡを作るために使われる。
むＤＮＡの一部を問題としているＤＮＡクローンと融合
する。この新しいＤＮＡの作成は標準的なりローニング
技法を使ってＥ、 ｅｏｌｉＯ中で複製されうる。それ
からこのＤＮＡはＢ、 ｃｏｉｌがら分離され、ＲＮＡ
ポリメラーゼ（サルモネ２のファージＳＰ６がら得た）
とｉｎ ｖｌｔｒｏで反応され、放射性のあるいはビオ
チン化したＲＮＡを作るために使われる。
実施例９
この実施例は特定の寄生原虫からのくシ返しのある核Ｄ
ＮＡ断片の種＄Ｍ性が確立される方法を説明している。
ＮＡ断片の種＄Ｍ性が確立される方法を説明している。
１、 全ＤＮＡが問題としている寄生原虫から分離され
ニックトランスレーションによって標識された。他の寄
生虫からのＤＮＡまたはを椎動物の宿主からのＤＮＡが
同様にして分離され標識化された。
ニックトランスレーションによって標識された。他の寄
生虫からのＤＮＡまたはを椎動物の宿主からのＤＮＡが
同様にして分離され標識化された。
２、 寄生原虫からの〈シ返しのあるＤＮＡ断片が適当
なシフターの中でクローン化され、ＤＮＡの場所が明ら
かにされるようなライブラリーレプリカ全作るためにニ
トロセルロース膜の上に固定された。最初のレプリカは
同じ寄生虫からとった放射活性で標識したＤＮＡで結合
された。第２のレプリカは他の寄生虫またはを椎動物の
宿主からの標識化したＤＮＡと結合された。
なシフターの中でクローン化され、ＤＮＡの場所が明ら
かにされるようなライブラリーレプリカ全作るためにニ
トロセルロース膜の上に固定された。最初のレプリカは
同じ寄生虫からとった放射活性で標識したＤＮＡで結合
された。第２のレプリカは他の寄生虫またはを椎動物の
宿主からの標識化したＤＮＡと結合された。
３、 ハイブリダイズされたレプリカは標識されたＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーションに対応する放射活性の場
所があられれてくるに十分な時間フィルムに対して露出
された。
Ａとのハイブリダイゼーションに対応する放射活性の場
所があられれてくるに十分な時間フィルムに対して露出
された。
４、 露出されたフィルムはレプリカにおいてクローン
のある場所に一致して重ね合わされ、揃えられた。
のある場所に一致して重ね合わされ、揃えられた。
５、 多くの場所で両方のレプリカで発色がみられ種の
間で交叉反応を示した。しかしある場所は問題とする寄
生虫を含むレプリカのみで発色を示した。これが種特異
的ＤＮＡを示した。
間で交叉反応を示した。しかしある場所は問題とする寄
生虫を含むレプリカのみで発色を示した。これが種特異
的ＤＮＡを示した。
６、 問題の寄生虫と最大のハイツリダイゼーション信
号を与えるが他の寄生虫や宿主とは反応しない種特異性
クローンを選択し、この寄生虫に対するハイゾリダイゼ
ーション検出剤として使った。
号を与えるが他の寄生虫や宿主とは反応しない種特異性
クローンを選択し、この寄生虫に対するハイゾリダイゼ
ーション検出剤として使った。
実施例１０
この実施例は血液中のＰ、 ｆａｌｃｉｐｍｒｕｍを検
出するためのＤＮ人ハイブリダイゼーション検出剤の使
用を説明している。
出するためのＤＮ人ハイブリダイゼーション検出剤の使
用を説明している。
り四−ンのｐＰＦＲ−１とｐＰＦＲ＝５が血液中にＰ、
ｆａｌｅｉｐａｒｕｍの存在を検出するためにハイブ
リダイゼーション検査法に使われた。２つのＤＮＡの混
合物がニックトランスレーションで標識され感染をうけ
た人とうけていない人の血液からフェノールで抽出され
たＤＮＡを含んだニド四セルロース膜とハイブリダイズ
された。
ｆａｌｅｉｐａｒｕｍの存在を検出するためにハイブ
リダイゼーション検査法に使われた。２つのＤＮＡの混
合物がニックトランスレーションで標識され感染をうけ
た人とうけていない人の血液からフェノールで抽出され
たＤＮＡを含んだニド四セルロース膜とハイブリダイズ
された。
量のわかったＰ、 ｆａｌｅｌｐａｒｕｍ Ｄ Ｎ Ａ
が定量のために対照として使われた。第５図がこれらの
実験の結果を説明している。
が定量のために対照として使われた。第５図がこれらの
実験の結果を説明している。
ＤＮＡの標準はこの検査法の感度がＰ、ｆａｌｃｌｐａ
ｒｕｍのＤＮＡの約１ ｎＨに相当することを示してい
る。
ｒｕｍのＤＮＡの約１ ｎＨに相当することを示してい
る。
適切に最適条件を選ぶことによってこの検査法は０．１
ｎＨのＤＮＡを検出できるがそれは３．３×１０ａケの
寄生虫のＤＮＡ含量に相当する。もし寄生虫が肝臓から
出てきて赤血球に入ってからこの試験が行われるならば
その感度は感染した患者の血液の寄生虫を検出するのに
十分である。
ｎＨのＤＮＡを検出できるがそれは３．３×１０ａケの
寄生虫のＤＮＡ含量に相当する。もし寄生虫が肝臓から
出てきて赤血球に入ってからこの試験が行われるならば
その感度は感染した患者の血液の寄生虫を検出するのに
十分である。
典型的な血液寄生虫症はヒトでは非常に初期の段階で４
Ｘ１０”りの寄生虫／ゴから急性期の４×１０”ケの寄
生虫／ｄにまでになる。ｄ当Ｊ） ５０００ケの寄生虫
のレベルはハイブリダイゼーション検査法によって容易
に検出されようが、従来の血液の鏡検によって検出する
ことは本質的に不可能であろう（このレベルは１０６ケ
の赤血球当シ１ケの感染した赤血球に大兄相当する）。
Ｘ１０”りの寄生虫／ゴから急性期の４×１０”ケの寄
生虫／ｄにまでになる。ｄ当Ｊ） ５０００ケの寄生虫
のレベルはハイブリダイゼーション検査法によって容易
に検出されようが、従来の血液の鏡検によって検出する
ことは本質的に不可能であろう（このレベルは１０６ケ
の赤血球当シ１ケの感染した赤血球に大兄相当する）。
光学顕微鏡による寄生虫症の計数と比べるとこの検査法
は約５００倍高い感度を提供しておシ、熟練した観察者
を必要としない。この方法は特に抗Ｐ、 ｆｉｌｅｌｐ
ａｒｕｍ薬物療法をテストするのに適している。それは
まだ予後のワクチン接種試験における寄生虫症の測定に
理想的に適している。
は約５００倍高い感度を提供しておシ、熟練した観察者
を必要としない。この方法は特に抗Ｐ、 ｆｉｌｅｌｐ
ａｒｕｍ薬物療法をテストするのに適している。それは
まだ予後のワクチン接種試験における寄生虫症の測定に
理想的に適している。
我々はこれら２つの寄生虫の各々から得たクローンライ
ブラリーのコピーを含むニトロセルロースのフィルター
ｔ−（相補的に）結合した。
ブラリーのコピーを含むニトロセルロースのフィルター
ｔ−（相補的に）結合した。
実施例９に述べた方法を使って我々は種物異的なくり返
しの断片クローンを分離した。これらクローンは以後の
テストのために凍結された。
しの断片クローンを分離した。これらクローンは以後の
テストのために凍結された。
我々の所有するクローンは８１ｏｏｆ ａｔ ａｌ、に
よって記述され（８１ｏｏｆ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｓｉｄ８Ｂｅｓ、１１．３８８９（１９８
３））後に５ｌｏｏｆＤＮＡと命名され、参考品にもと
９入れられたものと同一のＤＮＡｅ含む一つのクローン
を含んでいる。
よって記述され（８１ｏｏｆ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｓｉｄ８Ｂｅｓ、１１．３８８９（１９８
３））後に５ｌｏｏｆＤＮＡと命名され、参考品にもと
９入れられたものと同一のＤＮＡｅ含む一つのクローン
を含んでいる。
第１図はＴ、 ａｒｕｚｉのぐシ返し断片の特異性を説
明している図である。 Ａｓ ・Ｂｓ Ｔ、 ｅｒｕｚｌ Ｙ株血流型孕１０６
ケの菌体数＊ Ａ６−、 Ｈ６Ｔ、 ａｒｕｚｉペルー株 血流型ｇＭ
ｌ Ｑ ’りの菌体数＊ ０ｒＤａ Ｔ、 ｃｒｕｚｌ ツラフエン株（７） ｘ
ｉ −ｃｒステイゴ−） ａ ３Ｘ１０’ケの菌体数 ０６”Ｈ６Ｔ、 ｃｒｕｚｉブラジル株のエビマスティ
ボートｔ＝ ３Ｘ１０”ケの菌体数ＥＢ ｍ Ｆ３ Ｌ
、 ｄｏｎｏｖａｎｉ ５０ ｎｇのＤＮＡＦｒ４・Ｆ
４ Ｌ、 ｔｒｏｐｌｅａ ５０ｎｇのＤＮＡＥ５−Ｆ
ｓ Ｌ、 ｂｒａｚｉｌｉｅｎ＋！ｉｇ ５０ ｎｇの
ＤＮＡＥ６°Ｆ６ Ｌ、 ｍ＠ｘｉｅａｎａ ５０ ｎ
ｇのＤＮＡＧ１からＧ５へ Ｔ、ｅｒｕｚｌのＤＮＡ
５０μｇ、１０μｇ＋１ｎｇ＋ｏ、１ｎｇ、Ｏ，Ｏ１ｎ
ｇＨ２Ｔ、 ｏｖａｎ＠ｉ ＦＭ １．５ Ｘ １０’
ケの血流型Ｈａ Ｔ、 ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍＧｌｌ、
５Ｘ１０’ケの血流型 Ｈ４Ｔ、 ｂｒｕａａ（ｂｒｕｅｅｉ Ｑｉｌ、５Ｘ１
０’ケの血流型 Ｈ，Ｔ、 ｌｅｗｉｓｉ ａｔ１．５×ｌ ０１ケの血
流型Ｈ６Ｔ、 ａｏｎｇｏｌ＊ｎｉｏ Ｑｌｌ、５Ｘ１
０’ケの血流型 ＊全血の転写 第２図はＴ、 ｅｒｕｔｌに感染したヒトの血液中の寄
生虫の検出を説明している図である。 Ａ−１から５へ Ｔ、 ｃｒｕｇｉのＤＮＡ ５０ｎｇ
。 １０．１．Ｏ，１ｎｇ Ｂ−２，３正常なヒトからとった全血液３００λ ０１から０５へ 急性のシャガス病患者からとった血液
３００λ １−Ａ、に、（パラナから）ブラジル ２−Ｂ、Ｂ、（車名不明）ブラジル ３−８．Ｐ、Ｏ，（ゴイアス）ブラジル４−Ｍ、；ｒ、
ａ、（ミナスゲライス）ブラジル第３図はアガ四−ス
ゲル電気泳動によるクローン化されたＰ、 ｆｏｌｅｉ
ｐａｒｕｍのＤＮＡ挿入部の分析を説明している図であ
る。 クローン化した挿入部を遊離させるためにプラスミドの
ＤＮＡを制限酵素ＢｃｏＲＩとＨｌｎｄ １で切断した
。それからＤＮＡを３％アガ四−スで夫々ｐＰＦＲ−２
、ｐＰＦＲ−３、ｐＰＦＲ−４５ｐＰＦ几−５、ｐＰＦ
Ｒ−６ｔ−分画した。レーン７はＨａ＠ｌで切断したφ
ＸＤＮＡ （マーカーとなるＤＮＡ断片） 第４図はクローンのｐＰＦＲ−１とｐＰＦＲ−５からの
くり返しＤＮＡのヌクレオチド配列を説明している図で
ある。 ｐＰＦＲ−１にクローン化された挿入部は約１２００ｂ
ｐ の長さである。我々はそれぞれの末端の約２００
ｂｐの配列をきめ、殆んど完全な５１ｂｐのく夛返しを
みつけた（矢印をみよ）。 挿入部は約３４０ ｂｐの長さであシ、その中に挿入部
の一端に相当するｌ ２９ ｂｐの領域を示している。 第５図は点転写ハイゾリダイゼーション法を使った血液
試料からのＰ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＤＮＡの検出
を説明している図である。 下に銘記した材料からとったＤＮＡｔ＝）ロセルロース
に結合し放射性のクローン化したＤＮＡ（二ツクトラン
スレークヨンによって標識化したｐＰＦＲ−１とｐＰＦ
Ｒ−５のＤＮＡの混合したもの）とハイゾリッド結合し
た。結合しなかった標識ＤＮＡを洗った後ニトロセルロ
ースをＸ線フィルムに接触させ２つの強化スクリーンを
使って１６時間露出した。 Ａ１からＡ４ ヘＰ、 ｆｉｌｅｉｐａｒｕｍのＤＮＡ
１０ｎｇ、ｌｎｇ、０．１ｎｇ、Ｏ，ＯｌｎｇＢｌ
正常なヒトの血液からのＤＮＡ Ｂ２ １ｎｇのＰ、
ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ Ｄ Ｎ Ａを混合した正常なヒ
トの血液からのＤＮＡ、０１から０４とＤｌからＤ４、
Ｐ、 ｆａｌｃｌｐａｒｕｍを含む血液の培養液１０μ
ノからのＤＮＡ、点の強度は寄生虫症の計数とよい相関
を示している。 図面の７９化（内容に変更なし） ２３４５６ ＦｌＧ、 １ ＦＩＧ、 ２ ！２ ４５６７ ＦＩＧ、 ３ ｌ ２ ３ ４ 手続補正書は式） ■、 事件の表示 昭和５９年特許願第１６９１７８号 ２、発明の名称 寄生原虫用ヌクレオチドハイブリ ダイゼーション検査法 ３゜ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 アメリカ合衆国、 １００２］ ニュー ヨー
ク。 ニュー ヨーク、ヨーク アヴエニュ １２３０番地 名 称 ザ ロックフェラー ユニバーシティ代表者
ロドニイー ダブリュー、ニコルス４、代理人 ６、 補正の対象 （１） 明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２） 図
面全回 ７、 補正の内容 （１） 明細書第４５頁第１０行、第４６頁第１６行、
第４７頁第９行及び第４８頁第９行の「説明している図
」の記載をそれぞれ「説明しているＸ線写真Ｊと補正す
る。 （２）別添の通り図面の浄書（内容に変更なし。）を提
出する。 ８、 添付書類の目録 図 面 １通
明している図である。 Ａｓ ・Ｂｓ Ｔ、 ｅｒｕｚｌ Ｙ株血流型孕１０６
ケの菌体数＊ Ａ６−、 Ｈ６Ｔ、 ａｒｕｚｉペルー株 血流型ｇＭ
ｌ Ｑ ’りの菌体数＊ ０ｒＤａ Ｔ、 ｃｒｕｚｌ ツラフエン株（７） ｘ
ｉ −ｃｒステイゴ−） ａ ３Ｘ１０’ケの菌体数 ０６”Ｈ６Ｔ、 ｃｒｕｚｉブラジル株のエビマスティ
ボートｔ＝ ３Ｘ１０”ケの菌体数ＥＢ ｍ Ｆ３ Ｌ
、 ｄｏｎｏｖａｎｉ ５０ ｎｇのＤＮＡＦｒ４・Ｆ
４ Ｌ、 ｔｒｏｐｌｅａ ５０ｎｇのＤＮＡＥ５−Ｆ
ｓ Ｌ、 ｂｒａｚｉｌｉｅｎ＋！ｉｇ ５０ ｎｇの
ＤＮＡＥ６°Ｆ６ Ｌ、 ｍ＠ｘｉｅａｎａ ５０ ｎ
ｇのＤＮＡＧ１からＧ５へ Ｔ、ｅｒｕｚｌのＤＮＡ
５０μｇ、１０μｇ＋１ｎｇ＋ｏ、１ｎｇ、Ｏ，Ｏ１ｎ
ｇＨ２Ｔ、 ｏｖａｎ＠ｉ ＦＭ １．５ Ｘ １０’
ケの血流型Ｈａ Ｔ、 ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍＧｌｌ、
５Ｘ１０’ケの血流型 Ｈ４Ｔ、 ｂｒｕａａ（ｂｒｕｅｅｉ Ｑｉｌ、５Ｘ１
０’ケの血流型 Ｈ，Ｔ、 ｌｅｗｉｓｉ ａｔ１．５×ｌ ０１ケの血
流型Ｈ６Ｔ、 ａｏｎｇｏｌ＊ｎｉｏ Ｑｌｌ、５Ｘ１
０’ケの血流型 ＊全血の転写 第２図はＴ、 ｅｒｕｔｌに感染したヒトの血液中の寄
生虫の検出を説明している図である。 Ａ−１から５へ Ｔ、 ｃｒｕｇｉのＤＮＡ ５０ｎｇ
。 １０．１．Ｏ，１ｎｇ Ｂ−２，３正常なヒトからとった全血液３００λ ０１から０５へ 急性のシャガス病患者からとった血液
３００λ １−Ａ、に、（パラナから）ブラジル ２−Ｂ、Ｂ、（車名不明）ブラジル ３−８．Ｐ、Ｏ，（ゴイアス）ブラジル４−Ｍ、；ｒ、
ａ、（ミナスゲライス）ブラジル第３図はアガ四−ス
ゲル電気泳動によるクローン化されたＰ、 ｆｏｌｅｉ
ｐａｒｕｍのＤＮＡ挿入部の分析を説明している図であ
る。 クローン化した挿入部を遊離させるためにプラスミドの
ＤＮＡを制限酵素ＢｃｏＲＩとＨｌｎｄ １で切断した
。それからＤＮＡを３％アガ四−スで夫々ｐＰＦＲ−２
、ｐＰＦＲ−３、ｐＰＦＲ−４５ｐＰＦ几−５、ｐＰＦ
Ｒ−６ｔ−分画した。レーン７はＨａ＠ｌで切断したφ
ＸＤＮＡ （マーカーとなるＤＮＡ断片） 第４図はクローンのｐＰＦＲ−１とｐＰＦＲ−５からの
くり返しＤＮＡのヌクレオチド配列を説明している図で
ある。 ｐＰＦＲ−１にクローン化された挿入部は約１２００ｂ
ｐ の長さである。我々はそれぞれの末端の約２００
ｂｐの配列をきめ、殆んど完全な５１ｂｐのく夛返しを
みつけた（矢印をみよ）。 挿入部は約３４０ ｂｐの長さであシ、その中に挿入部
の一端に相当するｌ ２９ ｂｐの領域を示している。 第５図は点転写ハイゾリダイゼーション法を使った血液
試料からのＰ、 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＤＮＡの検出
を説明している図である。 下に銘記した材料からとったＤＮＡｔ＝）ロセルロース
に結合し放射性のクローン化したＤＮＡ（二ツクトラン
スレークヨンによって標識化したｐＰＦＲ−１とｐＰＦ
Ｒ−５のＤＮＡの混合したもの）とハイゾリッド結合し
た。結合しなかった標識ＤＮＡを洗った後ニトロセルロ
ースをＸ線フィルムに接触させ２つの強化スクリーンを
使って１６時間露出した。 Ａ１からＡ４ ヘＰ、 ｆｉｌｅｉｐａｒｕｍのＤＮＡ
１０ｎｇ、ｌｎｇ、０．１ｎｇ、Ｏ，ＯｌｎｇＢｌ
正常なヒトの血液からのＤＮＡ Ｂ２ １ｎｇのＰ、
ｆａｌｃｔｐａｒｕｍ Ｄ Ｎ Ａを混合した正常なヒ
トの血液からのＤＮＡ、０１から０４とＤｌからＤ４、
Ｐ、 ｆａｌｃｌｐａｒｕｍを含む血液の培養液１０μ
ノからのＤＮＡ、点の強度は寄生虫症の計数とよい相関
を示している。 図面の７９化（内容に変更なし） ２３４５６ ＦｌＧ、 １ ＦＩＧ、 ２ ！２ ４５６７ ＦＩＧ、 ３ ｌ ２ ３ ４ 手続補正書は式） ■、 事件の表示 昭和５９年特許願第１６９１７８号 ２、発明の名称 寄生原虫用ヌクレオチドハイブリ ダイゼーション検査法 ３゜ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 アメリカ合衆国、 １００２］ ニュー ヨー
ク。 ニュー ヨーク、ヨーク アヴエニュ １２３０番地 名 称 ザ ロックフェラー ユニバーシティ代表者
ロドニイー ダブリュー、ニコルス４、代理人 ６、 補正の対象 （１） 明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２） 図
面全回 ７、 補正の内容 （１） 明細書第４５頁第１０行、第４６頁第１６行、
第４７頁第９行及び第４８頁第９行の「説明している図
」の記載をそれぞれ「説明しているＸ線写真Ｊと補正す
る。 （２）別添の通り図面の浄書（内容に変更なし。）を提
出する。 ８、 添付書類の目録 図 面 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １゜ 生物試料を寄生原虫のもつ種物異的な反復性の核
ＤＮＡを認識する標識をつけたハイブリダイゼーション
検出剤と接触し上述の寄生虫に結合した上述の標識化検
出剤を検出することを含む上述のを推動物からの生物試
料中の上述の寄生原虫を検出する方法。 ２、 上述のハイブリダイゼーション検出剤が上述の種
物異的な反復性の核ＤＮＡの全てまだは一部に対応する
あるいは相補的なヌクレオチド配列をもつＤＮＡまたは
ＲＮＡを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、 上述のハイブリダイゼーション検出剤が上述の寄
生虫から分離されたＤＮＡである特許請求の範囲第２項
記載の方法。 ４、上述のハイブリダイゼーション検出剤が化学的に合
成される特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、 上述のハイブリダイゼーション検出剤がその構成
しているヌクレオチドから適当な酵素の存在で上述のヌ
クレオチドの間で適当な反応条件下で合成される特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ６、上述のハイブリダイゼーション検出剤が適当なベク
ターにおいて上述の種物異的な反復性の核ＤＮＡの全て
または一部に対応するあるいは相補的なヌクレオチド配
置をもっているＤＮＡまたは几ＮＡを含む特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ７、 上述のベクターがＢ、 ６ｏ１１のゾ２スミド、
フィラメント状のファージ、ラムドイド ノマクテリオ
ファージ、サルモネラのファージ、酵母からなる群から
選ばれる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、 上述のベクターがサルモネラの５Ｐ６７アージの
プロモーターを含んでいる特許請求の範囲第７項記載の
方法。 ９４ 上述のＥ、 ｏ０１ムプラスミドがＰＵＯ１３で
ある特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、上述のハイブリダイゼーション検出剤がカスケー
ドハイゾリグイゼーションを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の方法。 １１、上述のハイブリダイゼーション検出剤がＴ、 ＠
ｒｕｚｉの核染色体のほぼ２００塩基対の核ＤＮＡｆｉ
−認識することができるＴ、 ｃｒｕ＋ｃｉの検出のだ
めの特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、上述のハイブリダイゼーション検出剤が適当なベ
クター中の上述のＤＮＡまたはＲＮＡを含む特許請求の
範囲第１１項記載の方法。 １３、上述のベクターがＥ、 ｃｏｉｌのプラスミドで
ある特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、上述のベクターがＰＵＯ１３である特許請求の範
囲第１３項記載の方法。 １５、上述のハイブリタ”イゼーション検出剤がＰｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｅｉｐａｒｕｍの核染色体の中
の約２００塩基対の核ＤＮＡ断片を認識することのでき
るＰｌａｓｍｏｄｌｕｍ ｆａｌｅｌｐａｒｕｍ の検
出のための特許請求の範囲第１項記載の方法。 １６、上述のハイブリダイゼーション検出剤が上述の適
当なベクターの中のＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる特
許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、上述のベクターがｌｉｊ、 ｃｏｉｌのプラスミ
ドである特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８、上述のベクターがＰＵＯ１３である特ｆｆ１ｌ求
の範囲ｆｉｇ１７項記載の方法。 １９、上述のハイブリダイゼーション検出剤が８ｉｏｏ
ｆのＤＮＡｔ−認識できるＴ、 ｂｒｕｅｅｉｇａｍｂ
ｉｅｎｓ・の検出のための特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ２０、寄生原虫の種物異的な反復性の核ＤＮＡを８識す
るハイブリダイゼーション検出剤。 ２１、放射性元素または発色基で標識された特許請求の
範囲第２０項記載のハイブリダイゼーション検出剤。 ２２、上述の発色基がビオチンである特許請求の範囲第
２１項記載のハイブリダイゼーション検出剤。 ２３、ヌクレオチド配列が上述の寄生虫の種特異性の反
復性の核ＤＮＡの全てまたは一部に対応するＤＮＡを含
む特許請求の範囲第２０項記載のハイブリダイゼーショ
ン検出剤。 ２４４ 上述のＤＮＡが上述の寄生虫から分離した特許
請求の範囲第２３項記載のハイブリダイゼーション検出
剤。 ２５、上述のＤＮＡが化学的に合成される特許請求の範
囲１１ｇ２：１１項記載のハイブリダイゼーション検出
剤。 ２６、上述のＤＮＡが適当な酵素の存在で適当なヌクレ
オチドの間での反応に適した条件下で上述のヌクレオチ
ドから合成される特許請求の範囲第２３項記載のハイブ
リダイゼーション検出剤。 ２７、上述の寄生虫のもつ種物異的な反復性の核ＤＮＡ
の全部または一部の相補的配列をもっＤＮＡまたはＲＮ
Ａを含む特許請求の範囲第２０項記載のハイブリダイゼ
ーション検出剤。 ２８、 適当なベクターのもつ上述の種物異的な反復性
の核ＤＮＡの全部または一部に対応するまたは相補的な
ヌクレオチド配列をもつＤＮＡまたはＲＮＡを含む特許
請求の範囲第２０項記載のハイブリダイゼーション検出
剤。 ２９、上述のベクターがＥ、 ｃｏｉｌ ニア”）スミ
ド、アイ２メント状のファージ、２ムドイドパクテリオ
フアージ、サルモネラ菌の７アージおよび酵母から選ば
れる特許請求の範囲第２８項記載のハイブリダイゼーシ
ョン検出剤。 ３０、上述のベクターがサルモネラの８Ｐ６７アージプ
ロモーター金含む特許請求の範囲第２９項記載のハイブ
リダイゼーション検出剤。 ３１、上述のプラスミドがＰＵＯ１３である特許請求の
範囲第２９項記載のハイブリダイゼーション検出剤。 ３２、上述のＤＮＡｔたは相補的なりＮ人或いはＲＮＡ
が上述のベクターの中で縦列に並んでいる特許請求の範
囲第３１項記載のノ・イブリダイゼーション検出剤。 ３３．上述のベクターにおいて上述のＤＮＡまたは相補
的なＤＮＡ或いはＲＮＡの反復性の断片を含む特許詰求
の範囲第２８項記載の７１イゾリダイゼーション検出剤
。 ３４． 上述の配列をした核の断片の全てまたは一部に
相補的なＰｌａｓｍｏｄｌｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
のＤＮＡまたは几ＮＡの約３４０または１２００ｂｐの
配列をした核のＤＮＡ断片をもつＤＮＡを含むＰｌａａ
ｍｏｄｌｕｍ ｆａｌ＋ｉｐａｒｕｍ のためのハイブ
リダイゼーション検出剤。 ３５． 適当なベクターにある特許請求の範囲第３４項
記載のハイブリダイゼーション検出剤。 ３６． 上述のベクターがＢ， ａｏ１１ゾラスミドで
ある特許請求の範囲第３５項記載のノ・イブリダイゼー
ション検出剤。 ３７． ｐＴＯＮＲＥとｐＴ０−マルチＮＲＢを含む特
許請求の範囲第３５項記載のハイゾリダイゼ−ション検
出剤。 ３８． 上述の核のＤＮＡ断片が次の配列をもつ特許請
求の範囲第３４項記載のハイゾリダイゼ一ション検出剤
ロ ＣＴ０ＴＴＧＣ０ＣＡＣＡＣＧＧＧＴＧ６ＬＴＧｏＡ０
Ｔ０ａ Ｇ ０ ＴＴＧＡ Ｔ Ｏ ａ Ｔ Ｔ Ｔ
Ｔ ０ Ｇ Ａ Ｇ ＯＩＧ Ｇ山Ｇ ＯＬＴ ｏＯＡ
ＴＯＡＣＡＣＧＴＴＧＴＯ′ｌＧＴ００ＡＡＡＴＴＴＴ
ＴＧＴＴＴＯＯＧＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡ
ＡＴＯＧＧＡＡＡＯＡＯＴＯＴＯＴＧＴＯＡＡＴＡＴＯ
ＴＧＴＴＴＧＯＧＴＧＴＴＯＡＯ人ＯＡＯ’Ｉ’ＧＧＡ
ＯＡＯ０入：ｌＡ ＡＯＡＡＯＯＯＴＧＡＡＯＴＡＴＯ
ＯＧ６’ＬＴＧＯＴＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＯＧ′ｌＯ
ＧＡＧ ３９． 上述の配列が夫々の塩基対で約５ないし２０％
の小さな変異を示す特許請求の範囲第３８項記載のハイ
ゾリダイゼーショ冫検出剤。 ４０． 約３４０または１ ２ ０ ０ ｂｐの配列を
した核の断片の全てまたは一部に相補的なＰｌａｓｍｏ
ｄｌｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ のＤＮＡまたはＲＮＡ
の上述の核ＤＮＡ断片の配列の全てまたは一部をもつＤ
ＮＡｔ−含むＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｔａｌ ａｒ
ｕｍ−のための特許請求の範囲第２０項記載のハイブリ
ダイゼーション検出剤。 ４１． 適当なベクターにある特許請求の範囲第４０項
記載のハイツリダイゼーション検出剤。 ４２．上述のベクターがＢ． ｃｏｉｌのプラスミドで
ある特許請求の範囲第４１項記載のハイゾリダイゼーシ
ョン検出剤。 ４３． ｐ Ｐ Ｆ Ｒ − １とｐＰＦＲ−６を含む
特許請求の範囲第４１項記載のハイブリダイゼーション
検出剤。 ４４． 上述の核ＤＮＡの断片が次のような配列をもつ
特許請求の範囲第４０項記載のハイブリダイゼーション
検出剤。 ＴＧＴＯＯＴＯＯＡＧＡＯＴＴＴＴＯＴＡＯＯＡＯＴＯ
ＧＴＡＧＡＧＴＴＴＴＯ九ＧＧＴＡＯ’ｒＧＴＧＡＡＯ
ＴＧＡＯＯＴＯＯ人ＧＡＯＴＧＡＴＯＴＯＴ人ＯＡＡＴ
ＯＯＧＴＡＧＡＧＴＴＴＯＴＶＧＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡ
ＡＣＴＧＴ００ＴＯＯ人Ｇ人０ＴＴＴＴＯＴＡＯＯＡＯ
ＴＯＧＴＡＧＡＧＴＴＴＯ西ＧＧＴＡＯＴＧＴＧＡＡＯ
ＴＧＡＯＯＴ００ＡＧＡＯＴＧＡＴＯＴＯＴＡＯＡＡＴ
ＯＯＧＴＡＧＡＧＴＴＡＯいらＧＧＴＡＯＴＧ’ｌ’Ｇ
ＡＡＯＴＧＡＯＯＴ０４５． 上述の核のＤＮＡ断片が
次の配列をもつ特許請求の範囲第４０項記戦のハイブリ
ダイゼ一ション検出剤。 ＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡ／ＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＴ
ＡＧＧＧＴＴＴＡ／ＧＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＧ
ＴＴＴχ■ ＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴ
ＴＴＡＧＧＴＴＴＡ″ＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＴＡＧ
ＧＴＴＶ ＴＡＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＯＯ
９１ ４６． 次のヌクレオチド配列をもうＤＮＡＯＴＯＴＴ
ＧＯＯＯＡＯＡＯＧＧＧＴＧδけＧＯＡＯＴＯＧＧＯ匂
Ａ’ｌ’ＯＧＴＴ’ｌ’ＴＯＧＡＧδいＧδけＧウＧＯ
ＡＴＣＡＣＡ０ＧＴＴＧＴ６回Ｔｏｏ人人ＡＴＴＴＴＴ
ＧＴＴＴＯＯＧＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＬＡＡ
ＴＣＩＧＧＡＡＡＯＡＯＴＯＴＯＴＧＴＯＡＡＴＡＴＯ
ＴＧＴＴＴＧＯＧＴＧＴＴＯＡＯＡＯＡＯＴＧＧＡＯＡ
ＯＯ小人ＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＯＣＧＯＬＴＧ
０ＴＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＯ中ＧＡＧ またはそれからの断片。 ４７、Ｔ、ａｒｕｚｉから分離した特許請求の範囲第４
６項記載のＤＮＡ。 ４８、 １ｎ ｖｉｔｒｏで化学的または生化学的に合
成された特許請求の範囲第４６項記載のＤ Ｎ Ａ 。 ４９、特許請求の範囲第４６項記載のＤＮＡに相補的な
りＮＡまたはＲＮ Ａ 。 ５０、適当なベクターの中にある特許請求の範囲第４６
項記載のＤＮＡ０ ５１、次のヌクレオチド配列をもつＤＮＡＴＧＴＯＯＴ
ＯＯＡＧＡＯＴＴＴＴＯＴＡＯＯＡＯＴＯＧ■ ＴＡＧＡＧＴＴＴＴＯＴＧＧＧＴＡＯＴＧＴＧ人ＡＯＴ
ＧＡＯＯＴＯＯＡＧＡＯＴＧＡＴＯＴＯＴＡＯＡＡＴＯ
ＯＧ■ ＴＡＧＡＧＴＴＴＯＴＧＧＧＴＡＯＴＧＴＧＡＡＯＴＧ
Ｔｏ ０ＴＯＯＡＧＡＯＴＴＴＴＯＴＡＯＯＡＯＴＯＧ
ＴＡＧＡＧＴＴＴＯＴＧＧＧＴＡＯＴＧＴＧＡＡＯＴＧ
ＡＯＯＴ００ＡＧＡＯＴＧＡＴＯＴＯＴＡＯＡＡＴＯＯ
ＧＴＡＧＡまたはそれからの断片。 許請求の範囲第５１項記載のＤＮＡ０ ５３、ｉｎマ１ｔｒｏで化学的または生化学的に合成さ
れる特許請求の範囲第５１項記載のＤＮＡ０５４、特許
請求の範囲第５１項記載のＤＮＡに相補的なりＮＡｔた
はＲＮ Ａ、 。 ５５、適当なベクターの中にある特許請求の範囲第５１
項記載のＤＮＡ０ ５６、次の配列をもつＤＮＡ ■ ＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＧＧＧＴＴＯＡＧＧ（）ＴＴＴ
ＡＧ■ ＴＡ（’ＪＧＴＴＴＡＧＧＧＴＴＯＡ、ＧＧＧＴＴＴＡ
ＧＧＴＴ■ ＴＡＧＧＧＴＴＯＡＧＧＧＴＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＯＯ
またはそれからの断片。 請求の範囲第５６項記載のＤＮＡ０ ５８、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的または生化学的に合成
されるＤＮＡ０ ５９、特許請求の範囲第５６項記載のＤＮＡに相補的な
りＮＡまたはＲＮＡ０ ６０、適当なベクターの中にある特許請求の範囲第５６
項記載のＤ Ｎ Ａ 。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52281183A | 1983-08-12 | 1983-08-12 | |
| US522811 | 1995-09-01 | ||
| US584646 | 1996-01-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60133899A true JPS60133899A (ja) | 1985-07-17 |
Family
ID=24082461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59169178A Pending JPS60133899A (ja) | 1983-08-12 | 1984-08-13 | 寄生原虫用ヌクレオチドハイブリダイゼ−シヨン検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60133899A (ja) |
-
1984
- 1984-08-13 JP JP59169178A patent/JPS60133899A/ja active Pending
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