JPS6011724B2 - 不溶性担体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不溶性迫体の製造法に関する。

さらに詳しくは本発明は下記一般式（１）（上記一般式
（１）中でＲ，はジアルキルアミ／基、ヒドロキシ基、
アルコキシ茎、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基また
はァルキル基で置換されていてもよいナフチル基を表わ
し、Ｒ２はヒドロキシ基または一般式−ＮＨ（ＣＨ２）
ｎＮＨ２（式中ｎは１〜１０の整数を表わす。

）で表わされるのーアミノアルキルアミノ基を表わす。
）で表わされるＮ２−ナフタレンスルホニルアルギニン
誘導体と、Ｎ２−ナフタレンスルホニルアルギニン誘導
体の末端カルボキシ基またはのーアミノアルキルフミ／
基中の末端アミ／基と反応することのできる置換基を有
する親水性高分子を反応させて不落性担体を製造する方
法に関する。従来、プロテアーゼの分離精製に用いられ
る不溶性担体として、親水性高分子に酵素阻害能を有す
る化合物を配位結合させたものが知られている。

しかしながら、これらの不溶隆起体は他の多くの生体物
質に対し比較的高い非特異的親和性を有するものが多く
、単一に特定の酵素のみの精製に供することができない
。本発明者等は特定のプロテァーゼに特異的親和力を有
する化合物の探索とそれらの化合物と担体との組合せを
種々検討した結果、上記一股式（１）で表わされる新規
な化合物であるＮ２−ナフタレンスルホニルアルギニン
誘導体がトリプシンおよびトロンビンのプロテアーゼに
高い親和性を有することを見出し、さらにこのＮ２−ナ
フタレンスルホニルアルギニン誘導体（１）をアガロー
ス、セルロース、ポリアクリルアミド等の親水性高分子
に結合させたところ、この不溶性担体がトリプシン、ト
。

ンビンに対し高い分離精製能を持つことを見出し本発明
に到達した。すなわち本発明はトリプシン、トロンビン
のプロテァーゼに強い親和性を有する新規なＮ２−ナフ
タレンスルホニルアルギニン誘導体（１）とアガロース
、セルロース、ポリアクリルアミド等の親水性高分子を
適当な活性化剤または縮合剤の存在下反応させて、トリ
プシン、トロンビンに対し高い分離精製能を有する不溶
性担体を製造する方法に関する。

本発明を詳細に説明すると、本発明で原料として使用さ
れる新規な化合物であるＮ２−ナフタレンスルホニルア
ルギニン譲導体は上記−般式（１）で表わされるが、上
記一股式（１）中のＲ，の具体例としては、１−ナフチ
ル基；２−ナフチル基；ハロゲン原子（塩素、臭素等）
ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、Ｃ，一Ｃ，ｏのア
ルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ィソプロ
ピル基「ブチル基、ｔ−ブチル基等）、Ｃ，一Ｃ，ｏの
アルコキシ基（メトキシ基、ヱトキシ基、プロポキシ基
、ィソプロポキシ基、ブトキシ基、ィソブトキシ基等）
、もしくはＣ２−Ｃ２ｏのジアルキルアミノ基等（ジメ
チルアミノ基、ジェチルアミ／基等）で置換された１−
ナフチル基または２−ナフチル基等が挙げられる。

またＲ２としては、ヒドロキシ基、アミノメチルアミノ
基、２ーアミノェチルアミノ基、３ーアミ／プロピルア
ミノ基、４−アミノブチルアミノ基、５一アミノベンチ
ルアミノ基、６一アミノヘキシルアミノ基、７一アミノ
ヘブチルアミノ基等が挙げられる。

もう一つの原料である親水性高分子としては、セルロー
ス、アガロース、架橋デキストラン等の多糖類、架橋ポ
リァクリルァミド、ポリアミノポリスチレン、アミノ酸
共重合物等が挙げられる。

Ｎ２−ナフタレンスルホニルアルギニン誘導体（１）と
親水性高分子を結合させる方法は、Ｎ２−ナフタレンス
ルホニルアルギニン譲導体および親水性高分子の種類に
より異なるがいづれも常法に従って行なわれる。以下に
いくつかの例を挙げて説明する。

｛１｝ 多糖類を臭化シアンで活性化した後化合物（１
）の末端アミノ基と反応させる方法結合させようとする
化合物（１）を多糖類と同容量の冷緩衝液（たとえば０
．１Ｍ炭酸水素ナトリウム）に溶解しこの溶液を臭化シ
アンで活性化した多糖類に加え擬梓する。

化合物（１）の使用量は多糖類１心当り０．０５〜２ｈ
ｍｏｌ程度であり、使用される緩衝液の舟は８〜１０が
好ましい。

反応温度は４〜２０午○、好ましくは４〜８℃であり、
反応時間は４〜２餌時間、好ましくは１２〜２畑時間で
ある。

反応終了後多量の水で洗浄し、ついで３％ＤＭＦで洗浄
する。

上記反応は以下の反応式で表わされる。

‘２ｌ 多糖類とポリメチレンジァミン、ごーアミノカ
プロン酸等との反応生成物と化合物（１）を反応させる
方法上記反応は１ーェチル−３一（３ージメチルアミノ
プロピル）カルポジィミド等の水溶性カルボジィミドな
どの縮合剤の存在下行われる。

具体的には臭化シアンで活性化した多糖類とポリメチレ
ンジアミン、ごーアミノカプロン酸等の懸濁液に多糖類
１の‘当り０．０５〜２ｈｍｏｌの化合物（１）を加え
がＨＣそでＰＨ４〜５に調節し、これに化合物（１）と
当量もしくは少過剰の縮合剤をＩＮＨＣそでｐＨ約４．
７に調節しながら加え、２０〜３０ｏｏで１５〜２餌時
間反応させる。【３｝ポリアクリルアミドゲルを用いる
方法ポリアクリルアミドをたとえばエチレンジアミンと
反応させてアミノェチル誘導体とし、これと化合物（１
）の末端カルポキシ基を縮合剤を用いて反応させるか、
あるいはポリアクリルアミドをヒドラジンと反応させて
後、亜硝酸を作用させて酸アジドとし、これと化合物（
１）の末端アミノ基を反応させる。具体的には常法によ
りポリアクリルアミドを酸アジド誘導体とし、これに０
．２ＭのＮをＣ０３水溶液に溶解した化合物（１）の溶
液を加え（ポリアクリルアミド１の‘に対し０．０５〜
２ｈｍｏｌ）、山ＭのＮａＯＨでｐＨ９．４に調整し、
４〜８℃で５〜１独特間程度反応させる。

次いで２ＭのＮ凡Ｃ夕および小州比ＯＨのなかにこれを
懸濁させ、３〜５時間放置し、水洗して使用に供す。な
お、上記した反応で市販品の臭化シアン活性化アガロー
ス、アミノアルキルアガロース、アミノアルキルセルロ
ース、ポリアクリルアミドヒドラジド誘導体等を原料と
して用いることもできる。

すなわち臭化シアン活性化アガロースは上記｛１’，｛
２ーの反応に、アミノアルキルアガロース、アミゾアル
キルセルロースは上記■の反応に、ポリアクリルアミド
ヒドラジド誘導体は上記脚の反応にそれぞれ原料として
用いられる。

なお本発明で原料として使用されるＮ２ーナフタレンス
ルホニルアルギニン誘導体（１）の製造法について以下
に説明する。

‘１’一股式（１）中でＲ２がヒドロキシ基の場合アル
ギニンまたはその酸付加温とナフタレンスルホニルハロ
ゲニドの反応で得られる。

反応は通常塩基の存在下行われる。塩基は反応で生成す
るハロゲン化水素を捕捉し、反応を促進する。

塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸
カリウム等の一般的な無機塩基を挙げることができる。

塩基はアルギニンに対し当モル以上使用される。アルギ
ニンの酸付加塩を使用する場合、アルギニンの酸付加塩
をアルギニンに変えるに十分な量の塩基を用いることが
好ましい。ナフタレンスルホニルハロゲニドは通常当モ
ルのアルギニンまたは酸付加塩と反応させる。

反応は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては水：塩化
メチレソ、クロロホルムなどの塩素系溶媒：ベンゼン、
トルェンなどの芳香族系溶媒：エチルエーテル、ジオキ
サン、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒または
、２以上のこれら溶媒の混合物が用いられる。反応温度
は一般には０℃から溶媒の沸点までの温度から選ばれる
。反応時間は通常１時間から１虫時間の範囲から選ばれ
る。【２１ 一般式（１）中でＲ２が−ＮＨ（Ｃ比）ｎ
ＮＨ２の場合Ｎ２ーナフタレンスルホニルアルギニンエ
ステルまたはその酸付加塩とポリメチレンジアミンの反
応により製造される。

ポリメチレンジアミンはＮ２−ナフタレンスルホニルア
ルギニンェステルに対し当量以上使用される。

反応速度を高め、平衡的に有利に反応を進めるためには
ポリメチレンジアミンは過剰使用することが望ましく、
通常Ｎ２ーナフタレンスルホニルアルギニンェステルに
対し２〜ＩＭ音モル好ましくは３〜５倍モル使用される
。原料としてＮ２ーナフタレンスルホニルアルギニンェ
ステルの酸付加塩を使用する場合には、一般に添加する
ポリメチレンジアミンが酸付加塩に変化するので、生成
する酸付加塩に相当するポリメチレンジアミンを過剰に
使用する必要がある。触媒として塩基性化合物を使用す
ることができる。

具体的にはナトリウムメトキシド等のアルカリ金属原子
のアルコキシド、ピリジン等の第三級アミン等が用いら
れる。これらの触媒を使用すれば、反応速度が上昇する
のでポリメチレンジアミンの使用量を低減し、反応条件
を緩和することができる。ポリメチレンジアミンを大過
剰使用するとポリメチレンジアミンはＮ２ーナフタレン
スルホニルアルギニンェステルまたはその酸付加塩を溶
解するので、無溶媒でも反応は進行するが、必要に応じ
てメタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール
類：エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン
等のエーテル類；ベンゼン、トルェン、ジクロヘキサン
等の炭化水素類；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチ
レン等のハロゲン化炭化水素類および水等の溶媒を使用
することができる。

一般に反応はＮ２ーナフタレンスルホニルアルギニンエ
ステルまたはその酸付加塩と過剰のポリメチレンジアミ
ンを混合蝿拝して均一溶液となし、これを室温で放置し
て行われる。しかし反応速度を高めるためには、反応液
をポリメチレンジアミンあるいは溶媒の沸点までの温度
に加熱するとができる。反応時間は反応温度、ポリメチ
レンジアミンの塩基性、ポリメチレンジアミンの使用量
等によって異なるが、数時間から数日間の範囲から、好
ましくは５時間から１餌時間の範囲から選ばれる。

反応終了後析出した生成物を炉取して水洗し、これを適
当な溶媒たとえば含水メタノール等から再結晶して精製
することができる。

反応生成物が析出しない場合には過剰のポリメチレンジ
アミンおよび／または使用した溶媒を留去し、残燈を水
洗してから、適当な溶媒を用いて再結晶を行い精製する
。上述のようにして得られた不溶性坦体を不純なトリプ
シン、トロンビンと接触させ、これらを特異的に配位掩
捉させて、これらの酵素から不純物を分離しついで適当
な流出液により捕捉状態から離脱させることにより、酵
素を精製することができる。

以下試験例によりその効果を説明する。

試験例 １ トロンビンの精製 下記の実施例１で得たセファローズ蟹をカラム（０．７
× ６肌）に充填し、０．９ＭＫＣそ−０．０９ＭＴｒ
ｉｓ−日Ｃそ（ｐＨ８．０）で平衡化した後トロンビン
（持田製薬製）２００雌（８００山ｍｉｔ）を１の‘の
同緩衝液に溶かしカラムに負荷した。

実験は全て４℃で行った。カラムに吸着しない蛋白を同
緩衝液で溶出し去り、吸着したトロンビンを溶出するた
めに溶出液を同緩衝液に０．０８ＭＴＡＭＥ（Ｎ２一（
ｐートリルスルホニル）一Ｌーアルギニンメチルェステ
ル）を加えた溶液に切り換え溶出を続けた。溶出液を切
り換えると同時に親和性カラムをセフアデツクスＧ一２
５のカラム（１伽×２３伽）に連続して溶出液をセフア
デックスＧ−２５のカラムに通過させ、ＴＡＭＥにより
溶出するトロンビンとＴＡＭ旧を分離を行った。トロン
ビン活性をＴＡＭＥ加水分解で、蛋白濃度をラウリー法
（功ｗひ法）により牛血清ァルブミンを標準液としてそ
れぞれ測定した結果１針部こ精製されたトロンビン６．
７の９が得られた。トロンビン活性としての回収率は６
２％を示した。実施例 ２ 下記実施例２で得たセファローズ蟹を用い、トロンビン
の溶出液としての０．８ＭＫＣムー０．００８ＭＴｒｉ
ｓ一日Ｃ〆（ｐＨ８．０）一０．０１ＭＴＡＭＥを用い
て室温で行った以外は、試験例１と同様の操作で、２６
柵の粗トロンビンから１野部こ精製されたトロンピン０
．６６の夕が４９％の回収率で得られた。

次に参考例および実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実
施例に限定されるものではない。参考例 １Ｎ２一（６
ーメトキシナフタレンスルホニル）アルギニンの合成ア
ルギニソ２０．４夕を１０％−炭酸カリウム溶液１８０
の‘に溶かす。

これに６ーメトキシナフタレンスルホニルクロリド２５
夕をエーテル２００叫及びベンゼン８０の‘の混合溶媒
に溶かした溶液を加え、室温で２独特間擬伴する。析出
した結晶を炉過し水でよく洗浄する。これを５０％エタ
ノール溶液から再結晶する。収量 ２２．７夕（５９％
） 融点 ２５９〜２６２．５こ０ 元素分析三Ｃ，７日２２０５Ｎ４ＳとしてＣ 日 Ｎ 計算値（％） ５１．７５ ５．６３ １４．２１
実験値（％） ５１．５８ ５．７９ １３．９９
参考例 ２Ｎ２−ダンシル−Ｎ−（５−アミノベンシル
）アルギニンアミドの合成Ｎ２ーダンシルアルギニンメ
チルェステル塩酸塩２のこペンタメチレンジアミン５夕
を加え溶解し、室温で１畑時間放置する。

反応後エーテル１００の‘を加えよく洗浄する。

得られた粉末状物質を４叫のメタノールに溶かし、シリ
カゲルカラムクロマトグラフイー（２肌×６０ｃｍ；Ｗ
ａｋｏ−ＧＩＣ−２００）で精製する。クロロホルム５
そで溶出する部分を除き、次いでクロロホルムーメタノ
ールリハ）で溶出する部分を集める。溶媒を減圧で留去
し、残澄をエーテルでよく洗浄して粉末状物質を得る。
シリカゲル薄層クロマトグラフィーで単一なスポットを
与える。（展開溶媒クロロホルムーメタノール（１／９
０）収量 １．３夕（６０％）元素分析： Ｃ２３日３
７Ｎ７０３ＳとしてＣ 日 Ｎ計算値（％） ５６．１
９ ７．５９ １９．９５実験値（％） ５５．８
９ ７．４３ １９．７６上記参考例に従って各種
Ｎ２ーナフタレンスルホニルアルギニン誘導体を合成し
た。

結果を表に示す。表 表 実施例 １ 臭化シアン活性化セファロ−ズの（生化学工業（株）製
）３夕を１０‐３Ｍ塩酸１〆、次いで水１そでよく洗浄
する。

参考例２で合成したＮ２ーダンシル−Ｎ−（５ーアミノ
ベンチル）アルギニンアミド５００の９を１０泌の０．
１Ｍ重炭酸ソーダ溶液に溶かし、この溶液を上記セファ
ローズ碑に加え、４℃で１２時間放置する。

反応後グラスフィルターを用いて炉過し、水３Ｚ及び３
％ジメチルホルムアミド溶液１そでよく洗浄する。これ
を湿潤状態で冷所保存する。実施例 ２ 臭化シアン活性化セファローズの（生化学工業（株）製
）５夕を実施例１で述べたように１０‐３Ｍ塩酸及び水
でよく洗浄しておく。

ご−アミノカプロン酸２夕を０．１Ｍ重炭酸ソーダ溶液
１５叫に溶かしこの溶液をセファローズ燈に加え、４℃
で１幼時間放置する。水でよく洗浄した後この膨潤ゲル
に水５０叫を加える。

これに２００雌のＮ２ーダンシルーＮ‐（５ーアミノベ
ンチル）アルギニンアミドを加え、ＩＮ塩酸でｐＨ４．
７に調節する。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジィミド３００の９を水５泌に溶かす
。

この溶液をＩＮ塩酸でｐＨ４．７に調節しながら先に調
製したセファローズ砥の膨潤ゲル液に加える。室温で２
畑時間放置し、水１ぞ、次いで３％ジメチルホルムアミ
ド溶液１そで洗浄する。これを湿潤状態で袷所保存する
。実施例 ３ ァミノェチルセファローズ砥（生化学工業（株）製）１
５の‘を２０の【の水に加え、これにＮ２−ダンシルア
ルギニン２００の９を１０の【のジメチルホルムアミド
ーこ溶かした溶液に加え、ＩＮ塩酸で府４．７に調節す
る。

これに３００の９の１ーェチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドを５泌の水に溶かした溶
液を加える。室温で２岬時間放置しグラスフィルターを
用いて炉過し、水１夕、次いで５０％ジメチルホルムア
ミド溶液でよく洗浄する。これを湿潤状態で冷所保存す
る。実施例 ４ アミノヘキシルセルローズ（メルク社製）１５の‘を水
３０の‘に加える。

これにＮ２ーダンシルアルギニン１５０の９をジメチル
ホルムアミド１０の‘に溶かした溶液を加える。ＩＮ塩
酸でｐＨ４．７に調節する。以下実施例３に述べたよう
に１−エチル一３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルポジイミドを用いて縮合する。これを湿潤状態で冷所
保存する。実施例 ５ ポリアクリルアミドヒドラジド誘導体２５の‘を５０の
Ｚの０．洲塩酸に懸濁し、氷水で冷却下５泌の１．０Ｍ
亜硝酸ソーダを燈拝しながら加える。

次いで５００ｍ９のＮ２−ダンシルーＮ−（５ーアミノ
ベンチル）アルギニンアミドを０．２Ｍ炭酸ソーダ１０
の‘に溶かした溶液を加え、さらに４ＭＮａＯＨ水溶液
でｐＨ９．４に調節する。４００５時間放置した後水で
よく洗浄し、次いでａＭ塩化アンモニウム及びＩＭのア
ンモニア水に懸濁し、母８．８に調節し、５時間放置す
る。

グラスフィルターを用いて炉過し、水でよく洗浄する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式（I） ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記一般式（I）中でＲ＿１はジアルキルアミノ基
   、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ
   基、シアノ基またはアルキル基で置換されていてもよい
   ナフチル基を表わし、Ｒ＿２はヒドロキシ基または一般
   式−ＮＨ（ＣＨ＿２）ｎＮＨ＿２（式中ｎは１〜１０の
   整数を表わす。 ）で表わされるω−アミノアルキルアミノ基を表わす。
   ）で表わされるＮ＾２−ナフタレンスルホニルアルギニ
   ン誘導体と、Ｎ＾２−ナフタレンスルホニルアルギニン
   誘導体の末端カルボキシ基またはω−アミノアルキルア
   ミノ基中の末端アミノ基と反応することのできる置換基
   を有する親水性高分子を反応させることを特徴とする不
   溶性担体の製造法。