JPS5988089A - 固定化ラクタ−ゼの保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化ラクターゼの保存方法に係り、より詳し
くはアスペルギルス優オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉ　］　
ｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　）起源のラクターゼを共有結合
または吸着で担体に固定化した固定化ラクターゼをプロ
ピレングリコール４〜８５％水溶波あるいはグリセ９２
１０〜７５％水溶液に浸漬し、０℃より高く５０℃以下
で保存することを特許とする固定化ラクターゼの保存法
に関する。

ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）は乳糖（ラクトー
ス）をＤ−グルコースとＤ−ガラクトースに加水分解す
る酸素であり、工業的には全脂乳やスキムミルク等のミ
ルク類、酸性ホエー、スィートホエー、還元ホエー、ホ
エーパーミニイトや脱塩脱蛋白ホエー等のホエー類さら
に乳糖液にいたる乳糖含有液中の乳糖の加水分解に利用
される。

酪 酸素を経済的かつ効率的に利用し、大規模この様な観点
からラクターゼに関してもいくつかの優れた固定化ラク
ターゼおよびその製造技術が開示されており、固定化ラ
クターゼを用いて乳糖含有液中の乳糖を充填塔（カラム
）内で連続的に加水分解する方法も提案されている。

しかしながら固定化ラクターゼも使用時間の経過ととも
に活性の低下（失活）が起ることはさけられず、活性の
高い高温で用いる程活性の低下速度も速くなる。従って
失活がかなり進んだ段階でカラム内の固定化ラクターゼ
を入替る必要がある。その場合前もって固定化ラクター
ゼを製造しておき、活性の低下を起さない様に、また微
生物が生育しないように保存しておければ、固定化ラク
ターゼの入替えもしくはカラムの切替えもしくはカラ特
開昭５９−８８０８９　（２） ムの切替えごとに固定化ラクターゼを新たに製造する時
間的損失がなくなる。

従って固定化ラクターゼを長時間安定に活性の低下が起
きずしかも微生物が生育することなく保存することが望
まれる。しかもその様な保存状態が特殊な条件下なく、
ごく容易に達成されることが工業的には肝要である。

そこで本発明者らは、固定化ラクターゼの保存法、とり
わけ長時間安定に保存でき、活性の低下が起きず、しか
も生菌数が増加しない方法について鋭意研究の結果、本
発明を完成するに至ったのである。

現在までの保存方法としては、固定化ラクターゼを水ま
たは綾衝水溶液に浸漬して保存する方法と固定化ラクタ
ーゼを脱水乾燥して保存する方法がある。このうち前者
の方法は長時間保存すると、水中に微生物が生育し、腐
敗を色、起しその結果活性も低下する場合が多く好まし
くない。とりわけ中性付近のｐＨを有する緩衝水溶液中
では微生物の生育が速い。また後者の方法では、条件を
限定すれば、活性の低下はおこらない（たとえは含水率
を４０％以上５７％以下の範囲に限定すると活性はほと
んど低下せず１年以上保存できる。）が、乾燥が過ぎれ
ばただちに活性が低下する。

さらには、上記のような限定条件下では半乾燥状態であ
るため、前者の方法に比較すれば微生物は生育しにくい
が長時間保存すれは、やはり腐敗する可能性がある。ま
た含水率が４０％以上５７％以下になるように半乾燥状
態を作り出すのはそれ程容易なことではない。

そこで、固定化ラクターゼを製造後、微生物の生育を防
ぐために、殺菌あるいは静菌効果のある薬剤の水溶液に
浸漬して保存する方糖含有水溶液は、そのものが食品で
あるか、あるいは加水分解物を食品に加工あるいは、添
加するものが普通である。従って、使用薬剤はたとえ、
微量であれ、食品に混入しても（５） 安全であるものが好ましい。プロピレングリコールとグ
リセリンは食品添加物として認められている上に、殺菌
あるいは静菌効果を有している。アスペルギルス・オリ
ーゼ起源のラクターゼを固定化した本発明特定固定化ラ
クターゼは、酵母起源あるいは細菌起源ノ輸＋ｌｓ＃ の固定化ラクターゼと異なり、プロｌレンゲリコール４
〜８５％水溶液あるいはグリセ９２１０〜７５％水溶液
に浸漬しても活性の低下なく、また微生物も生育せずに
安定に保存できることを見いだした。プロピレングリコ
ールあるいはグリセリンのような食品添加物として認め
られているものを使用して保存することは、固定化ラク
ターゼの工業的利用の際にたとえ、生先付着したプロピ
レングリコールあるいはグリセリンが存在しても安全で
ある。

すなわち、アスペルギルヌ譬オリーゼ起源のラクターゼ
が共有結合または吸着によって担体に固定化された固定
化ラクターゼを保存（６） する方法においてプロピレングリコール４〜８５％水溶
液あるいはグリセ９２１０〜７５％水溶液に該固定化ラ
クターゼを浸漬し、０”ＣＪ−り寓〈５０℃以下で長時
間安定せで、活性の低下が起きず、微生物が生育せずに
保存できることを見いだした。

プロピレンク゛リーコール４％未満あるいはグリセリン
１０％未満の濃度の水溶液に固定化ラクターゼを浸漬し
保存した場合には、微生物が生育しや１く、また、プロ
ピレングリフＣ コール３５％あるいはグリセリン耘テ％より高濃度の水
溶液に固定化ラクターゼを浸漬すると活性の低下がみら
れる、本発明は以上のような知見をもとになされたもの
である。

次に本発明の詳細な説明すると次のとおりである。

担体に共有結合または吸着によって固定化する方法によ
る固定化ラクターゼが挙げられるがその好ましい態様と
してはアスペルギルス・オリーゼ起源のラクターゼをイ
オン交換基として少なくとも（１）アミノ基もしくは／
および置換アミノ基ならびにカルボキシメチル基を有す
るマクロ多孔性フェノールホルマリン系両性イオン交換
樹脂、（特開昭５４−１１９０９４号公報参照）　（１
１アミノ基もしくは／および置換アミノ基を有するマク
ロ多孔性フェノールホルマリン系弱塩基性イオン交換樹
脂から選はれたマクロ多孔性イオン交換樹脂を担体とて
これに共有結合または吸着によって固定化ラクターゼ（
’ｔ！開昭５６−２６１８９号公報、特ｙｕ昭５６−５
１９８４号公報、特開昭５６−１４０８９０号公報参照
）が挙げられる。

マクロ多孔性はｌｔｄ／Ｉ／以上の表面積を有するもの
を意味する。５　ｍ’　／　ｙ以上ならばなお好ましい
。このなかでより一層好ましい舞具体的態様としては、
イオン交換基としてポリエチレンポリアミン基とカルボ
キシメチル基を有するマクロ多孔性フェノールホルマリ
ン系両性イオン交換樹脂を担体として、この担体にアス
ペルギルス暮オリーゼ起源のラクターゼを吸着させ、次
いでグルタルアルデヒド処理を行い共有結合によって該
ラクターゼを該担体暑こ固定化した固定化ラクターゼが
挙げられる。

上記以外の固定化ラクターゼとして不溶性多糖類もしく
はその誘導体、多孔性シリカ、官能基として水酸基のみ
を有する樹脂あるいはマクロ多孔性ポリスチレン系弱塩
茎性イオン交換樹脂を担体として固定化した固定化ラク
ターゼが挙げられる。蛋白質もしくは／および多糖類を
包括架橋凝集資材として多官能性架橋剤を用いて固定化
した固定化ラクターゼも例示される。

共有結合または吸着によって担体に固定化する方法は通
當一般に固定化酸素の製造に用いられる方法が例示され
る。共有結合または（９） ノ基、水酸基またはグアニル基と反応する共有結合剤ま
たは多官能性架橋剤によって担体に共有結合する方法が
特に好ましい。吸着の場合は強固に吸着されるのが好ま
しい。

アスペルギルスｅオリーゼ起源のラクターゼは公知であ
り市販されているものも二、三ある。そのなかで特にｐ
Ｈ４，５，８０℃におい素が工業的利用に適している。

本発明Ｃ↓乙のような固定化ラクターゼをプロピレング
リコール４〜３５％あるいはグリセリン１０〜７５％の
水溶液に浸漬し、保存するのである。本発明の趣旨から
プロピレングリコールあるいは、グリセ・ノンは、食品
添加物公定書の基準に合致したものを用いるのが好まし
く、濃度調節のための水はフィルターによって７かした
除菌水あるいはメートクレープで滅菌した水を使用する
のが好ましい。

このような水溶液に浸漬した固定化ラフター（１０） ゼの保存温度は５０℃以下を選ぶべきである。

１ケ月以上の長期間保存する場合は熱失活をさけるため
に４０℃以下の保存温度を選ぶことが好ましい。保存温
度は低い程安定であり、長時間の保存に耐えるが凍結さ
せると固定化ラクターゼが破砕される。従って０℃より
高い温度で保存すべきである。結局保存温度としては、
０℃より高く５０℃以下、より好ましくは０℃より高く
４０℃以下ということになる。

保存時において開放系にしておくと長時間の間に、水分
が蒸発し、浸漬液の濃度が高くなり活性の低下をおこし
たり空気中の雑菌がはいったりする。従って、封をした
保存容器に保存すべきである。

以上の様にして得られた本発明特定の固定化ラクターゼ
を試料ビンに入れ、蓋をビニルテープで密封をして４．
５℃および空調設備のない屋内に１〜８ケ月間保存した
が活性の低下はともに数３以内であり、また、生菌数も
増加しなかった。本発明の有効性は明らかであった。

次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが本
発明の趣旨を越えない限り以下の実施例によって限定さ
れるものではない。

なお、実施例中に記載されている固定化ラクターゼの活
性測定は次の方法で行ったものである。

００５Ｍ濃度の酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）に溶かした
１　８．８　（Ｗ／Ｖ　’）％濃度の乳糖溶液８０　ｍ
ｅにＯｌないし０，２５−程度の固定化ラクターゼを浸
漬し、８０℃で１５分間往復振’＆（１００ｒｐｍ以上
、振巾８．５Ｃ以上）しながら反応させ、生成したグル
コース量をグルコースオキシダーゼ−パーオキシダーゼ
−色素系を用いて定量する。この条件において化ラクタ
ーゼの乾燥重量は次の様に測定する。

すなわち、反応終了後固定化ラクターゼをデ別し、５０
℃で８時間以上減圧乾燥した後１゜５時間以上室温（１
８〜２５℃）のデシケータ−中に放置後型量測定を行い
、恒量に達していることを確認した後この値を固定化ラ
クターゼの乾燥重量とする。固定化ラクターゼの活性は
ダラム乾燥重量当りの単位（ＩＬＵ／ｙ−ＩＭＬ）で表
示する。

また、生菌数の測定は、固定化ラクターゼｌ−をはかり
とり、滅菌したガラスフィルター上に移して滅菌本釣２
００ｄで洗浄後、試験管に移し、滅菌水１０ｄを加えて
、ミキサーで攪拌し、試験管中の水の生菌数を衛生試験
法にしたか−、て測定し、固定化ラクターゼｌ−あたり
に換算する。

実施例１ イオン交換基としてポリエチレンポリアミン基とカルボ
キシメチル基を有する比表面積８２　ｍ’　／　ｙのマ
クロ多孔性フェノールホルマリン系両性イオン交換樹脂
を担体としこの担（１３） 体にアスペルギルス・オリーゼ起源のラクターゼ（新日
本化学工業製、ｐ　Ｈ４，５，３０℃における乳糖草質
に対するＫｍ　＝　０．０１　ｍｏ　Ｉｅ／／　）固定
化ラクターゼがある。この固定化ラクタゼを滅菌水で洗
浄後、ＪＩＳ規格８０メツシュの金網の上で水切りした
。洗浄後の活性は１．４９０　ＩＬＵ／Ｐ−ＩＭＬ、、
生菌数は１００ケ／−−−ＩＭＬ以下であった。この固
定化ラクターゼの一部を試料びんに入れ、８０％グリセ
リン水溶液に浸漬し、ふたにビニールテープで封をし、
空調設備のない室内（温度５℃ないし８２℃の間）に８
ケ月保存した。８ケ月後活性と生菌数を測定したところ
、それぞれ１．４８０　Ｉ　ＬＵ／９−Ｉ　ＭＬと１０
０ケ／ｍ−ＩＭＬ以下であった。また一方、同様に固定
化ラクターゼを８０％グリセリン水溶液のかわりに、滅
菌水に浸漬し、８ケ月間同様に保存した。

８ケ月後の活性は１．４００１ＬＵ／ｆ−ＩＭＬ、生（
１４） 菌数は５．０ＸｌＯ’ケ／、１−ＩＭＬであった。

実施例２ 実施例１と同じ担体に実施例１と同じラクターゼを共有
結合で固定化し、イオン交換水で十分洗浄（このときの
活性６５０ＩＬＵ／ｙ−ＩＭＬ、生菌数２．８Ｘ１０５
ケ／、ｔ−ＩＭＬ）後、水切りし、小分けして試料ビン
に入れ、５０％グリセリン水溶液に浸漬して室温（１８
〜２８℃）および４．５℃に１ケ月保存後の活性は共に
６５０１ＬＵ／ノ−ＩＭＬ、生菌数は１００ケ／ｍ−Ｉ
ＭＬ以下であった。

実施例８−６および比較参考例１−８ 脱塩水で洗浄後の活性が１．７８０１　ＬＵ／ｙ　−Ｉ
ＭＬで、生菌数が４×１０３ケ／ｍｅ−ＩＭＬである以
外は実施例１と同一の固定化した固定化ラクターゼがあ
る。これを水切りして滅菌水で洗浄後、小分けし、試料
ビンに入れ表の通りの溶液に浸漬後ふたをし、ビニルテ
ープで封をして温度調節のしていない室内（５℃ないし
３２℃）に保存し、１ケ月後の活性−生菌数を測定した
。結果はまとめて表に示した。

表 手続補正書（自発） 特許庁長官　　若　杉　和　夫　　殿 ■、事件の表示 昭和３Ｔ年　特許願第　ｒ’？ｒ３γθ　号２、発明の
名称 同定化ラクターゼの保存法 ３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　　大阪市東区北浜５丁目１５番地６、補正の内
容 （１１特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。

（２）　　明細書の下記の箇所を下記のとおり補正する
。

特許請求の範囲 （１）　　アスペルギルス・オリーゼ起源のラクターゼ
が共有結合または吸着によって担体に固定化された固定
化ラクターゼを保存する方法６とおいて、プロピレング
リコール４〜８５％。

水溶液あるいはグリセ９２１０〜７５％水溶液１こ、該
固定化ラクターゼを浸漬し、０℃より高＜５０℃以下で
保存することを特徴とする固定化ラクターゼの保存法。

（２）　　ラクターゼか固定化された担体がマクロ多孔
性イオン交換樹脂であってイオン交換基として少なくと
もケ）アミノ酸もしくは／および置換アミノ基ならびに
カルボキシメチル基を有するフェノールホルマリン系両
性イオン交換基脂または（イ）アミノ基もしくは／およ
び置換アミノ基を有するフェノールホルマリン系弱塩基
性イオン交換樹脂である特許請求の範囲＄　（１１項に
記載、の方、法。

−１完−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｌｌ　　アスペルギルス・オリーゼ配属のラクターゼ
   が共有結合または吸着によって担体に固定化された固定
   化ラクターゼを保存する方法において、プロピレングリ
   コール４〜８５％、水溶液あるいはグリセリン１０〜２
   ５％水溶液に、該固定化ラクターゼを浸漬し、０℃より
   高く５０℃以下で保存することを特徴とする固定化ラク
   ターゼの保存法。 基として少なくとも（１）アミノ酸もしくは／および置
   換アミノ基ならびにカルボキシメチル基を有するフェノ
   ールホルマリン系両性イオン交換樹脂または（イ）アミ
   ノ基もしくは／および置換アミノ基を有するツユノール
   ホルマリン系弱塩基性イオン交換樹脂である特許請求の
   範囲第（＋）項に記載の方法。