JPS5951800A - α−アミラ−ゼの活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は航規な基質、すなわちオリコサツカライド誘導
体を基質として使用することを％徴とするα−アミラー
ゼ活性の測定方法に関するものである。

試料、特にヒト生体内の唾液、胚敵、血故、尿中のα−
アミラーゼ活性は医学上のお断において重要である。例
えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液、尿中
のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を
示す。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまでに
種々の方法が発表されているが、主に、アミロクラスチ
ック法、クロモゲニック法、サッカロケニック法の３群
に分類することができる。

アミロクラスチック法のうちではキャラウェイ法が最も
広く使用されてきたが、共存タンパクがデンプンとヨー
ドの呈色を阻害するため、又反応時間が短いため再現性
が悪い等の問題点がある。

クロモゲニック法は一般にブルースターチ法と呼ばれ、
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い鋳巣反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応系が不均一
であること、緊雑な操作が必要であり自動分析る。

サッカロケニック法では“メモジー法が代表的であるが
、試料中のクルコースにより高埴を示す、操作が累雑で
ある等の問題かある。

このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方法（こは
各々に個有の欠点があるか、さらに共通して、基質に使
用しているデンプンの品質により測定値にバラツキか生
じる、又α−アミラーセ反応を具に化学量論的反応とし
て測定できないという欠点がある。

デンプンは広く知られるようにアミロースと呼ばれるα
−１，４結合による直鎖状のクルカンとアミロペクチン
と呼ばれるα−１，６結合による分岐を有するグルカン
の混合物である。

アミロースとアミロペクチンの混合比率、分子量、分岐
度、分岐構造は原料他物の種類、収捜時期、産地音によ
り異なり、不均一な混合物である。

不均一なデンプンを基質に使用する場合は、化学量論的
反応とはならす、α−アミラーゼの動力学を検知するこ
とはできない。

α−アミラーゼの動力学的横細はグルコース鎖が４１固
から７１固までのオリコサツカライトの使用によってな
される。

最近、デンプンの代わりに、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等のオリゴサツカライドを基質に用いる方法（特開
昭５０−５６９９８号公報、特開昭５３−３７０９６号
公報）、又はＰ−ニトロフェノール等の色原体を還元末
端に結合したオリゴサツカライドを用いる方法（特開昭
５４−！５１８９２号公報）等、均一で構造の明確な基
質を用いる方法が発表されている。

これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−クル
コシダーゼ（Ｅ、０．３．２．１゜２０、α−Ｄ−グル
コシドグルコヒドロラーゼ）又はグルコアミラーゼ（ｇ
、０．３．２．１゜３．１．４−α−Ｄ　−クルカング
ルコヒドロラーセ）を必要とする。

これらの共役ｅ！＋；Ｊ、・Ｃ〜１，４−クリコンド帖
８を巾−する°糖鎖の非還元性木端からα−１゜４−ク
リコシド結合を加水分ｐ％するエキソタイプの耐糸であ
り、α−アミラーセ反応ζこ関係なく４：質を分層して
しまう欠点を肩°する。この結果、測定用試液が不安定
であり、試楽旨恢埴ん）極めて商く測定確度を者しく悲
くしていた。さらに測定に充分なりルコアミラーセ、あ
るいはα−クルコシダーゼを１更用できす、正ａｍ　１
．を測定法の組立が困難であった。

本発明者らはかかる欠点な有するクルコース鎖が４〜７
個のオリコサツカライトに対し、これらのオリゴ糖の非
還元末端クルコースの６位の一級アルコールーＣＨｙＯ
Ｈを−０１１ｚ’ＮＨ１口こ１醒　　　　　　　：喚し
た基質を合成した。この基を尋人すること　　　　　　
　　：により、不希買）ＩＩ２ひに、α−アミラーセ作
用の結果生成する、−０Ｈ，ＮＨ［（基を有する生成物
を分光尤度的に構出することが可能であり、また本牽賀
（以下修飾オリコ糖という。修１１ｊ基とは−Ｃｌ−１
２Ｎ　ＨＩＮ又は−Ｎ　１−１−　Ｒ１をいい、従って
・１じ触オリゴ糖は一〇Ｈ２ＮＨＲ又は−ＮＨ−Ｒで１
じ飾されていて必要な場合は１１□Ｎ−Ｒ修飾オリゴ糖
（例えはアミノピリジン１ｉ飾オリコ糖）という。）が
α−アミラーゼの親和性に凌れで８つ艮好な４％となる
こと、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質
とならないことを見見し本発明を光取するに至った。

すなわち本発明は、α−アミラーゼ゛油１牛を１１１１
１１１定するに際し、クルコースが４〜７個からなる直
鎖状オリゴサツカライドの非還元末端クルコースの６位
の一級アルコール（ＣＨ２０Ｈ）　が一般式−ＣＲ２Ｎ
　ＨＲ，で表わされる基で置侯された。下記構造式Ｕ＋
Ｖ有するオリゴサツカライド誘導体を基質として使用す
ることを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法であ
る。

（式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｎは２〜５
の整数であり、Ｒは、クルコースか４〜７個からなる直
鎖状オリコサツカライドの非還元末端グルコースの６位
に一級アルコール（ＯＨｚ　ＯＨ）を有していてこれが
一般式−ＣｉＨ２ＮＨＩ（で表わされる基で置決される
と構造式（１）を有するオリゴサツカライド誘導体とな
るアルコール（ＯＨｈＯＨ）が酸化されて相当するアル
デヒド（−〇ＨＯ）となった酸化多糖体のアルデヒド（
−０ＨＯ）と反応してシッフ塩基を形成するアミン基を
有する有機残基な表わす。）以下、本発明について例を
挙げて詳細に説明する。

先ず、本発明に使用する修飾オリゴ糖について述べると
、デキストリンを原料とし、ジメチルスルホキシドとＮ
、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドでデキストリ
ンのグルコース単位の第１級アルコールを部分的に酸化
する。例えば、グルコース基約３０個に１個の割合で酸
化する。本反応はＪｏｎｅｓ、　Ｇ、ｌ−１らの方法（
Ｍｅｊｈｎｄ　　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ。

Ｖ１３１５−３２２頁（１９７２）　Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：］による。

酸酸反応はシュウ酸を加えて停止させ、次いで２−アミ
ノピリジンなどの本発明に係る有機アミン、シアン水素
化ホウ素ナトリウムを加え９５℃に加熱し約２０分反応
させる、反応混合物に水を加え、生じる沈澱を炉別して
除き、この−Ｆ５液に塩酸を加えｐＨをいったん約１．
０とじシアン水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、ｐ
Ｈを中性にし、この液をＢｉｏｇｅｌ　　ｐ　−２を充
填したカラムを使用しゲル涙過し高分子（修飾デキスｌ
−ＩＪン）画分を集める。

この修飾デキストリンにＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｊｉｌ
ｉｓ由来の級化タイプのα−アミラーゼを約ｐ　Ｈ５，
５の緩衝敵中、３７℃で約３０分反応援、反応敵な７０
℃以上の温度で、２０〜６０分加熱し、α−アミラーゼ
を失活させる。

加熱処理後、反応液を約２０℃程度まで冷却させ、故の
ｐＨを６〜８の中性に調整後、α−グルコシダーゼ又は
グルコアミラーゼを加え３７℃で２０〜５０時間作用さ
せ、α−アミラーゼの作用により生成した修飾オリゴ糖
をうる。

この反応を一般化し一般式を次に示す。

Ｇｎ　−Ｇ　−Ｇｍ（Ｇｔを含有する混合物）■ ｎ−Ｇ十Ｇ−０ｍ（＋ｔ−Ｇ） （式中、Ｇはグルコース単位を示し、Ｘはされる基を表
わす。また、ｌ、ｍ、ｎはＯあるいは正の整数を表わす
。） 次に、この混合物を濃縮し、Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−４を充
填したカラムを用い、カラムクロマトグラフィーで修飾
オリゴ糖、即ちピリシールアミノ基なとの−Ｎ　ＨＲ基
が非還元末端に入ったマルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオース、！ルトヘブタオースの
各分画を得ることができる。

即ち、本製法を要約すれば、デキストリンの第１級アル
コール（ＯＨｇＯＨ基）を酸化してアルデヒド基（−０
ＨＯ）とした後、２−アミノピリジンなどの本発明に係
る有機アミンを作用させシップの塩基とし、還元して修
飾デキストリンを得る。次いで酵素的加水分解により、
目的とする修飾オリゴ糖を得る。

本製法に於いて、原料の多糖体としてはα−１，４−グ
リコシド結合を有する長鎖の糖ならばいずれも使用でき
、デキストリンの他、デンプン、アミロース等も同様に
原料とじつる。

また、酸化多糖体から修飾多糖体を得る工程に於いては
、２−アミノピリジンの他にも酸化多糖体中のアルデヒ
ドとシッフ塩基を形成するアミン基を有する化合物（本
発明に係る有機アミン）ならいずれも有効に使用できる
が、２−アミンピリジンのほかに例えば３−アミノピリ
ジン、アニリン、２−ヒドロキシアニリン、アミノ安息
香酸、メチルアニリン等が挙げられる。

ぞれに対応する基で修飾されたオリゴ糖となる。

即ち、本発明に係る修飾オリゴ糖の例を挙げると、２−
アミンピリジン又は３−アミノピリジンなどのアミノピ
リジン修飾オリコ糖、アニリン修飾オリゴ糖、２−ヒド
ロキシアニリンなどのヒドロキシアニリン修飾オリコ糖
、アミノ安息香酸修飾オリゴ糖、メチルアニリンなどの
アーアミラーセを使用するが、種類は特に限定されず、
例えば動物の肝臓、微生物由来のアミラーゼを使用する
ことができる。前述のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ　Ｉ
　ｉｓ由来の教化タイプのアミラーゼはグルコース鎖１
０個程度のオリゴ糖の状態で反応が停止するかあるいは
遅くなるため、生成物をコントロールするのが容易であ
り有効に使用することができる。

本修飾オリゴ糖を使用、したα−アミラーゼの測定例と
して、開運液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＯ）法、分
元尤度法を挙げ、その測定原理と特徴を示すが、本１じ
飾基質の使用範囲を限定するものではない。

〔１〕　　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法 ピリシールアミノ基が螢光を有する（励起波長３２０ｎ
ｍ、螢光波長４００　ｎｍ）ことに右目、これを利用し
、本４ｖ６飾基ノ貫を用いα−アミラーゼ反応させた後
、生成した非還元末端グルコースにピリシールアミノ基
が入った短鎖（クルコース基が２または３個）の修飾オ
リゴ糖を含む液をＨＰＬＯにかけ、その流出ピークを同
様に操作した活性値既知の標準検体の流出ピークと比較
することによりα−アミラーゼ活性を求めることができ
る。

ＨＰ　Ｌ　Ｃに於いて、カラム、溶出液は特に限定され
ないが、カラムはＴＳＫ−ＧｅｌＬＳ　　４１０，５μ
ｍ　、　Ｃ１８（ＴｏｙｏｓｏｄａＣｏ　）、溶出敵は
０．１％　ｎ−ブタノールを含む０．１Ｍ酢酸が効果的
に使用することができる。

不発明の診飾オリゴ抛を）Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｏ法によるα−
アミラーゼ活性測定用基質として用いることにより以下
の（イ）〜（ホ）の利点を有する測定法の組立てが可能
になる。

（イ）値篩オリコ糖は水に易浴で、α−アミラーゼとの
反応性か高い。

（ロ）本発明の方法では、単一の化合＄２１を請負とす
ることから、反応の化学量−が成立し、α−アミラーゼ
の動力学を恨知することかできる。

ぐ→　不法ではα−アミラーゼ反応に就く共役酵素系を
１更用しない為、α−アミラーゼの動力学を倹ナロする
ことが容易である。

に）不法ではα−アミラーゼ４文応′Ｃ生成するピリシ
ールアミノ基又はその１也の修罰１基を竹するクルコー
ス単位２または３１固のオリコ糖を分離した上測定する
ため、血中に既存のグルコース弄の影響を受けない。

（ホ）ケイ元尤度法で検知を行うため尚感度測足が可能
であり、敬重検体で測定できる。

〔２〕　　分光光度法 グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエキソタイ
プの酵素であるため本修飾基質を基質とできない。これ
に対しα−アミラーゼはオリゴサツカライドの任意のα
−１，４グリコシド結合を加水分解するエンド型酵素で
あり、本修飾基質を基質とできるため、α−アミラーゼ
の酵素作用によって修飾基質が刀■水分解されて非還元
末端が新たに生成する。

この新たに生成した非還元末端に対してα−タルコシダ
ーゼ又はグルコアミラーゼが作用してグルコースが生成
し、生成したグルコース量を測定することによりα−ア
ミラーゼ活性を知ることが出来る。

グルコースの定量方法は多数知られており、これらの方
法のいずれも使用できることは言うまでもない。

主なりルコースの定量方法を示す。

まずグルコースにグルコースオキシダーゼを作用させる
と酸化され、同時に過酸化水累が生じる。生成した過暇
化水系は共存するペルオキシダーゼを介して色原体τ定
量的に酸化し、生成した酸化型色原体の呈色を比色する
ことにより反応孜中のクルコース量を測定することがで
きる。以下に反応式を示す。

グルコースオキシダーゼ フ゛ドウ糖＋０２　＋Ｈ２０ Ｈ２０２＋グルコン酸 ペルオキシダーゼ゛ Ｈ２Ｏ２＋色原体 酸化型色原体＋ＨｚＯ また、グルコースはＡＴＰ存在下へキソキナーゼによっ
てグルコース−６−リン酸となる。生成したクルコース
−６−リン敵はＮＡＤ共存下、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素によって６−ホスホグルコノラクトンとなり
、一方ＮＡＤは還元されＮＡＤＨとなるのでこのＮＡＤ
Ｈの３４０　ｎｍ付近に於ける吸光度の増加を測定する
ことにより、反応欣中のグルコース量を測定することが
出来る。以下に反応式を示す。

グルコース グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ− −６−リン酸脱水酵素 ６−ホスホタルコノ ラクトン十Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ Ａ　Ｔ　Ｐ、　、アデノシン−５′−トリリン酸塩入Ｄ
Ｐ；アテノシン−５′−シリン酸塩ＮＡＤ；β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ，還元型−β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド 本修飾オリゴ糖を用いた分光光度法によるα−アミラー
セ活性測是法に於いて、α−アミラーゼと同時に又はこ
れに次いで共役酵素のグルコアミラーゼ、又はα−タル
コシダーゼを作用させ生成するグルコースを測定するが
、この方法では検体時に血清、尿などの生体砥料に共存
するグルコースの影響を受は正確な測定魁か青られない
可能性があり、α−アミラーゼの反応に先行して、既存
グルコースな消去することは本測定法を実施する上で有
効な手段となる。

消去の方法としてはグルコースオキシダーセーカタラー
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法（特開昭５７
−４７４９５号公報）、グルコースペルオキシダーゼＯ
こよる方法等、種々の方法があり、いずれの方法も自由
に組合せることが可能である。

また本修飾オリゴ糖を基質とし、α−アミラーゼを作用
させ生成するマルト−スを測定することによりα−アミ
ラーゼ活性を測定することができる。マルトースの測定
は、例えば特開昭５２−１１９２９６に記載の測定糸に
よる。

本発明の修触オリゴ楯を分光光度法によるα−アミラー
ゼ活性測定用基質として用いることにより以下の利点を
有する測定法の組立てができる。

げＪ　本修飾オリゴ糖は水に湯浴で、α−アミラーゼと
の反応性が萬い。

（ロ）本発明の方法では、単一の化合物を基質とするこ
とから、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動
力学を検知することができる。

（／１　　本発明に使用する修飾オリゴ糖はグルコアミ
ラーゼ（またはα−クルコシダーゼ）の基質とはならず
α−アミラーゼの特異基質である為、副反応が起らす、
試薬旨検値は極めて小さい。

に）　グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの充分量
が使用可能なため、α−アミラーゼ反応以降の反応が速
く、正確なレイトアッセイができる。

（ホ）測定用試液が安定である。

（へ）　自動分析装置への適応性が良い。

次に実施例を示し、さらに詳しく説明する。

実施例　１　修飾オリゴ糖の調製 ジメチルスルホキシド２５ＯＮにデキストリフ１０ｇと
Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド１５ｇを俗
解し、これにジクロル酢酸ｌ’ｍｌとジメチルスルホキ
シ１−１２．５　ｍｉの混合ｄりを〃口え、よく混合し
２０〜２５℃で４０分間反応させる。メタノール２５ｍ
ｇにシュウ酸（２水塩）６．３ｇを溶解した敵を加え、
反応を停止する。この反応混合級（こ２−アミノピリジ
ン浴数（２−アミノピリジン６０ｇ、水９　Ｑ　ｍｌ　
、酢酸２４ｍ１そしてシアン水系化ホウ素ナトリウム２
４ｇを混合した孜）を加え９５℃で２０分間加熱する。

力ロ熱反応援水１ｔを加え、沈滞を生じさせ、戸別する
。このろ液を６規定塩酸でｐＨ１，０とし、過剰のシア
ン水素化ホウ素すＩ・リウムを分解後、６規定アンモニ
ア、水でｐＨ７，０に調整し、真空で濃縮する。この濃
縮物の一部３５（Ｉｌｆをとり、水に溶解し、ゲル瀘過
する。カラムは１０ｍＭ重炭敵アンモニウムで平衡化し
たＢｉｏｇｅ　Ｉ　　Ｐ　　２　（Ｂｉｏ　　Ｒ’ａｄ
　　社製）を充填した直径２，６０、高さ１１３ｃｍの
ものを使用し、このカラムを２度通した。このカラム操
作を３回行い（濃縮物のチャージ量は各３ｓｏ＋ｖ）高
分子１分を集め偉績乾燥した。ここでの収量は約７００
■であり、０．１　Ｍ酢酸中での３１０　ｎｍの吸光度
から堡飾はグルコース単位で３．１％であった。１じ飾
化１１の測定はＨａｓｅ。

Ｓ、らの方ａ（Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　８５　、
２１７　。

（１９７９））によった。

この修飾デキストリン４７０■を水１５ｍＡに溶解し、
３３ｍＭ酢酸−酢酸カルシウム緩衝１（ｐＨ５，５，）
　９０ｍｌと混合し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ　　由来の液化タイプアミラーゼ５０単位
を加え３７℃で２５分間インキュベートする。その後、
１００℃で１５分間加熱しアミラーゼを不活化した後、
グルコアミラーゼ１５０単位を加え３７℃で２４時間イ
ンキュベートし、さらにグルコアミラーゼ１５０単位を
追加し、２４時間インキュベー１・を行・）。

この加水分解物を濃縮り１．２０　ｍＭ酢酸で平倶工化
したＢｉｏ　　ｇｅｔＰ　　４　（Ｂｉｏ　　Ｒａｄ社
Ｊ＃りを充填したカラムを用いクロマトを行う。

カラムは自゛径１．９ｃＩｎ簡さ２　］　２　ｃｍのも
のを１更川した。

・１し飾オリゴ糖のグルコース順４〜７個の各分画を東
め沫結乾慄した。

−）ｉ：質の梢製はＨＰ　ＬＣにＴ　Ｓ　Ｋ−（Ｊ’ｅ
ｔ　　Ｌ　５４１０５μｍ０１８を充填したラージカラ
ム（７Ｘ　３００　ｉｓ　）を使用し、浴出版に０．０
４５％ｎ−ブタノールを含む０．１Ｍ１ｉ［アンモニウ
ム坂衝赦（ｐＨ３，９）を使用し、　３．０　ｍｌ　／
　ｍ　ｉ　ｎ　　の流速で行った。

構造の確認 修飾オリゴ糖は水素化ホウ素改ナトリウムで還元したの
ち１．５Ｎ塩酸含有メタノール溶孜中で９０℃、４時間
加熱分解した後、次いでピリジン中でトリメチルシリル
化する。そしてツ７スクロマトグラフィーにより測だし
た。カラムはＯｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ　ＩｔＣ２％０
Ｖ−１７を０−１゜ティングした８０〜１００メツシユ
（０，５Ｘ３００α）を１更用し、１２０℃から１８５
℃までの昇＠（４℃／ｍ１ｎ）クロマトグラフィーで測
定した。同様に操作したマルトースを標準として、グル
コースとグルシトールの割合より各画分のクルコースの
個数り、２，３．４そして５を求め、これよりオリゴ糖
のグルコース鎖長３，４，５．６そして７を決めた。（
それぞれドＧ３、ＩＩ”Ｇ４、Ｆ’Ｇ５．ＦＧ６、ＦＧ
７と略号をつけた。） また各修飾オリゴ糖はグルコアミラーゼで加水分解され
ないところから非還元末端に修飾基（ピリシールアミン
基寺。）が入っていることが考えられる。そこで。

１”　０３〜７の各自分について、箱守法による光合メ
チル化〔生化学実験講座４、糖質の化学（下巻）Ｐ、５
０６、東京化学同人〕を行った後、酸で加水分解し、ガ
スクロマトグラフィーによりメチル−２，３，４，６−
チトラー〇−メチルグルコシドが全く生成していないこ
とを確認した。

さらにＦＧ３とＦ　Ｇ　５の画分をとり、０．１Ｍ酢酸
ナトリウム−１０ｍＭ酢酸カルシウム緩衝ｇ！Ｌｐ　Ｈ
５，５に浴解し、タカアミラーゼを〃口え３７℃で３時
間力ロ熱して加水分解した。そしてこの水解物をＨＰ　
Ｌ　Ｏ及びＴ　Ｌ　Ｏで調べｆこ結果ＦＧ５からはＩ”
　Ｇ　３とマルト−スを生成したか、Ｆ’Ｇ３はタカア
ミラーゼで加水分解を受けなかった。またＦＧ３を０．
３Ｎ堰酸に加え１００℃で３０分間加水分解したところ
、生成物（まマルトース、グルコースと２棟のケイ元を
有する化合物を得、マルトトリオースは生成しなかった
。

芙峡例　２ 試薬 ［１１試ｄダ１ 酢酸ナトリウムｌ　（１０ｍ　ｍｏｔ　　％酢酸カルシ
ウム　１０ｍｍｏｔ、実施例１で調製した非還元末端に
ピリシールアミ７基が入ったマルトペンタオース０．３
６　ｍ　ｍｏｔをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウ
ムでｐ　Ｈ５，５とし全量を１ｚとする。

測定操作 試敵１５００μｔに検体血液５μｔを加え、３７℃で１
５分間加温する。この反応液を尚速赦体クロマトグラフ
ィーにかけ、非還元末端グルコースにピリシールアミノ
基か入りグルコース３個の修飾オリゴ糖の生成量をピー
ク面積から求める。別にα−アミラーセ活性既知の標準
検体を用い上記と同様に操作し、検量関係を求め、この
検量線から検体のα−アミラーゼ活性を求める。

このときの標準検体の谷希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（ｓｏｍｏｇｙ＊単位／ｄｚ）と遊離したＦＧ３
の量（μＭ）との関係を第１図に示す。標準検体のα−
アミラーゼ活性は２００Ｓｏｍｏｇｙｉ単位である。

液体クロマトグラフィーのカラムはＴＳＫ−Ｇｅｌ　　
ＬＳ４１０．５μｍ％０１８’（４Ｘ３００關、Ｔｏｙ
ｏｓｏｄａ　　Ｃｏ、）、流出液は０１％ｎ−ブタノー
ルを含有の０．１Ｍ酢酸水溶液を使用、流出速度はｌ、
７ｍｌ／ｍｉｎで室温で行った。

実施例　３ 舐楽 ｉｌｌ　　試牧２ グツ　ド＃ｒ＃１（ｔ（Ｐ　Ｉ　Ｐ　８　Ｓ　　）　４
　ＬＪ　ｍ　ｍｏｌ。

グルコアミラーゼ５万単位、クルコースオキシダーゼ１
０万単位、ムタロターゼ２００単位、カタラーゼ５０万
単位、４−アミノアンチピリンＱ、　７　ｍ　ｍｏｔ、
塩化ナトリウム１５ｍｍｏｌ、塩化カルシウム５ｍｍｏ
ｔをとり、悄製氷に溶かして水酸化ナトリウムでｐ　Ｉ
−１６，９とし全量を１ｔとする。

（２）試赦３ グツド緩衝液（ＰＩＰＥＳ）４０ｍｍｏｔ。

ペルオキシダーゼ１５．０００単位、塩化ナトリウム１
５ｍｍｏｔ、塩化カルシウム５ｍｍｏ４実施例１で調製
した非還元末端にピリシールアミン基が入ったマルトペ
ンタオース３ｇ１窒化ナトリウム１５　ｍ　ｍｏｌ　、
フェノール１０ｍ　ｍ　ｏ　ｔをとり精製水に浴かして
水酸化すｌ−ＩＪウムでｐ　Ｈ６，９とし全量を１ｔと
する。

測定方法 試液２の２ｍｌに検体血清２０μｔを加え、３７℃で５
分間加温する。これに試液３の１Ｍを加え、３７℃で反
応させ５０５　ｎｍに於ける２分後から５分後までの３
分間の吸光度変化△ （Ｂ／分）を測定する。

別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同
様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体のα
−アミラーゼ活性を求める。

この時の検量線を第２図に示す。標準検体のα−アミラ
ーゼ活性は５００　Ｓｏｍｏｇｙ　ｉ　　単位である。

試薬１検の３分間当りの吸光度変化を、基質にピリシー
ルアミノ基が入ったマルトヘキサオースを使用した場合
とマルトヘキサオースを使用した場合とで比較し以下に
比較例として示す。

比較例　１ （１）　　試液　４ 実施例３の試ＷＬ２に同じ （２）試液　５ 実施例３の試液３に２ける非還元末端にピリシールアミ
ノ基が入ったマルトペンタオースの代わりに非還元末端
にピリシールアミ７基が入ったマルトヘキサオースを用
い、以下試液３に同じ。

ｔ３１　　試ｇ６ 実施例３の試′ｇ！ｉ、３における非還元末端にピリシ
ールアミノ基が入ったマルトペンタオースの代わりにマ
ルトヘキサオースを用い、以下状ｇ！Ｌ３に同じ。

測定方法 試液４の２ｒｎｌに精製水２０μｔを加え、３７℃で５
分間加温する。これに試液５のｌ　ｍｌを加え、３７℃
で反応させ５０５　ｎｍに於ける２分後から５分後まで
の３分間の吸光度変化（６Ｅ／分）を測定する。

又、試液５の代わりに試ｇ６を用い上記と同様に測定す
る。

結果を表１に表わす。

表　　　１

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２における検量線、第２図は実施例３
における検量線である。 手続補正書 特許庁長官　殿 ２、　発明の名称 ａ−アミラーゼの活性測定方法 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許線（東京）　　置　０３−２７０−８５７
１５　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の第１図。 ６　補正の内容 （１）明細書６頁１８行目に記載のｌ　−ＯＨ□Ｎ　Ｈ
Ｒ基を有する生成物」をｌ”　　ＣＨ２Ｎ　ＨＲ基を有
する生成物」と補正する。 （２）明細也７頁４そ」目に記載の「（例えばアミノピ
リジン修飾オリゴ糖）という。）」を１−（例えばアミ
ノピリジン修飾オリゴ糖という。）」と補正する。 （３）明細書１１頁４行目に記載の１アルデヒド基（−
ＣＨｏ）とした後、」を１アルデヒド（−ＣＨｏ）とし
た後、」と補正する。 （４）明細書２１頁６行目に記載のｌ”　ＣＪ　、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。 ８５．２１７．Ｊを「［Ｊ’、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８５．
２１７、」と補正する。 （５）図面の第１図を別紙の通り補正する。 以上 手続補正書（方却 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１６１４５７号 ２　発明の名称 α−アミラーゼの活性測定方法 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　　置　０３−２７０−８５７
１５　補正の対象 願書の特許出願人の欄。明細書の発明の詳細な説明の欄
及び図面の簡単な説明の欄。 ６、　補正の内容 （１１願書について、特許出願人の記名のあとに鮮明に
捺印致します。 別紙のとおシ。 （２）明細書２９頁１１行目から１２行目にかけて記載
の文章を削除し、削除した箇所に図面の簡単な説明とし
て次の文章を加入する。 「第１図は、冥施例２におけるα−アミラーゼ活性（Ｓ
ｏｍｏｇｙｉ単位／ミ）と遊離したＦｅ２の妬（８Ｍ　
／　ｍｉｎ　）との関係を表わす。 第２図は、実施例３におけるα−アミラーゼ活性（ＳＯ
ｍＯｇｙｉ単位／血）と５０５ｎｍにおける吸光度変化
（ΔＲｉ　／　ｆｌｌｌｎ）との関係を表わす。 （８）明細書２４頁１０行目に記載の１実験例　２」を
「実施例　２」と補正する。 手続補正書 １、事件の表示 ２、　発明の名称 ０（−７ミラー（＝二′′σ）挿ノを望うｙ（す３）ニ
一方法３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先特許ＨＪＡ　（東京）　　置　０３−２７０−１
１５７１５　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６　補正の内容 （１）明細書６頁２０行目から７頁４行目にかけて記載
の［（以下修飾オリゴ糖という。・・曲１ミノピリジン
修飾オリゴ糖という。）］を１（以下、修飾オリゴ糖と
いう。）」と補正する。 （２）　　明細書１２頁４行目から同頁９行目にかけて
記載の「２−アミノピリジン又は・・・・・・アルキル
アニリン修飾オリゴ糖」を［２−ビリンルアミノ基又は
３−ピリジルアミノ基などのピリジルアミノ基修飾オリ
ゴ糖、アニリノ基修飾オリゴ糖、２−ヒドロキシアニリ
ノ基などのヒドロキシアニリノ基修飾オリゴ糖、カルボ
キシフェニルアミノ基修飾オリゴ糖、メチルアニリノ基
などのアルキルアニリノ基修飾オリゴ糖」と補正する。 （３）　　明細書２３３頁２行目記載の「グルソトール
」を１−クリシトール」と補正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ＩＩ　　α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グル
   コースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツカライドの
   非還元末端グルコースの６位の一級アルコール（−０Ｈ
   ｚＯＨ）　　が一般式−０Ｈ２ＮＨＲで表わされる基で
   置換された下記構造式（１）を有するオリコサツカライ
   ド誘導体を１．ｆ’Ｊｔとして使用することを特徴とす
   るα−アミラーゼ活性の測定方法。 （式中、右端のクルコース単位は還元性基、ｎは２〜５
   の整数、であり、Ｒは、グルコースが４〜７個からなる
   直鎖状オリゴサツカライドの非還元末端グルコースの６
   位に一級アルコール（ＯＨｈ　ＯＨ）　　を有していて
   これが一般式−ＯＨ２Ｎ　Ｈｌ（で表わされる基でｉｔ
   侯されると構造式ｉｌ＋を有ちるオリゴサツカライド訪
   導体となるアルコール（−０Ｈ２０Ｈ）が酸化されて相
   当するアルデヒド（−ＣＨＯ）となった酸化多糖体のア
   ルデヒド（−０ｆ−１０）と反応してシッフ塩基を形成
   するアミン基を有する有機残基を表わす。） （２）　　構造式（１）を有するオリゴサツカライド訪
   纏体の、一般式−ＯＨ２Ｎ　ＨＥ％で表わされる基の１
   （の測定方法。