JPS5939288A - カリクレインおよびエラスタ−ゼの製造法 - Google Patents
カリクレインおよびエラスタ−ゼの製造法Info
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- JPS5939288A JPS5939288A JP14624282A JP14624282A JPS5939288A JP S5939288 A JPS5939288 A JP S5939288A JP 14624282 A JP14624282 A JP 14624282A JP 14624282 A JP14624282 A JP 14624282A JP S5939288 A JPS5939288 A JP S5939288A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、豚の膵臓より、カリクレインとエラスターゼ
の両者をそれぞれに効率良く採取する方法を提供するも
のである。
の両者をそれぞれに効率良く採取する方法を提供するも
のである。
カリクレインとエラスターゼとは、従来、ともに豚の膵
臓から採取されているが従来の採取法ではいずれか一方
を採取することを目的とし、両者を効率良く、同原料か
ら、同時に採取する方法は知られていない。
臓から採取されているが従来の採取法ではいずれか一方
を採取することを目的とし、両者を効率良く、同原料か
ら、同時に採取する方法は知られていない。
本発明は同一の原料から、カリクレインとエラスターゼ
の両方をそれぞれ効率良く採取する方法を提供するもの
である。
の両方をそれぞれ効率良く採取する方法を提供するもの
である。
以下に、本発明の詳細な説明する。
本発明方法は、豚の膵臓を原料として、まず、その原料
を精製水中で加温攪拌するが、この原料となる材料は、
脂肪および結締組織を可及的に取除いておくことが好ま
しい。通常は例えば、アセトンによる脱脂脱水乾燥粉末
の形態で使用される。上記の加温攪拌は、室温例えば、
１５〜３０℃で行われる。攪拌時間は加温する温度との
関連で、変化するが、約２０時間程度を目安にする。得
られる液状生成物は、いわゆるどろどろした抽出液であ
るが、その状態はこのままで濾過又は遠心分離を行うこ
とは、はとんど不可能である。この液状生成物のｐＨを
４．０±０．２に調整する。この場合の調整は、塩酸、
酢酸など適切な酸を選択使用して行う。ｐＨの調整を行
つたこの液状生成物に対し、水と混和し得る有機溶媒を
加え、これと混和させる。この有機溶媒はたとえば、ア
セトン、メタノールなどであり、添加する量は１５ｖ／
ｖ％〜３０ｖ／ｖ％程度を目安とする。次いでこの液状
生成物を濾過すると、澄明な抽出ろ液が得られる。次に
この炉液のｐＨを７０±０．２に調整し、これに精製水
を加えて希釈することにより、その電気伝導度を０．８
ｍＵ／ｃｍ以下にする。通常は、この場合の精製水の添
加量は、上記炉液が約１０倍量程度になる如き量である
。こうして得られた液にジエチルアミノエチル基を有す
るアニオン交換体の粉末を加え、攪拌し、懸濁液を調製
する。このジエチルアミノエチル基を有するアニオン交
換体の例は、ＤＥＡＥ−セルロースである。この粉末の
添加量は、通常は、もとの膵臓原料１ｇあたり０．０２
ｇの割合を目安とする。攪拌は、通常約２時間程度を目
安とすればよい。次に、こうして、得られた懸濁液をカ
ラムに入れ、酢酸アンモニウム水溶液を用いて溶離を行
うが、それに先立ち、希酢酸アンモニウム水溶液でカラ
ム内容物を洗い、その洗液が紫外線吸収で測定してＡ２
８０訓／ｍｌが０，１以下となるまで、この処理を行う
。この洗液（以下エラスターゼ含有洗液という）から後
述する操作により、エラスターゼが取得される。
を精製水中で加温攪拌するが、この原料となる材料は、
脂肪および結締組織を可及的に取除いておくことが好ま
しい。通常は例えば、アセトンによる脱脂脱水乾燥粉末
の形態で使用される。上記の加温攪拌は、室温例えば、
１５〜３０℃で行われる。攪拌時間は加温する温度との
関連で、変化するが、約２０時間程度を目安にする。得
られる液状生成物は、いわゆるどろどろした抽出液であ
るが、その状態はこのままで濾過又は遠心分離を行うこ
とは、はとんど不可能である。この液状生成物のｐＨを
４．０±０．２に調整する。この場合の調整は、塩酸、
酢酸など適切な酸を選択使用して行う。ｐＨの調整を行
つたこの液状生成物に対し、水と混和し得る有機溶媒を
加え、これと混和させる。この有機溶媒はたとえば、ア
セトン、メタノールなどであり、添加する量は１５ｖ／
ｖ％〜３０ｖ／ｖ％程度を目安とする。次いでこの液状
生成物を濾過すると、澄明な抽出ろ液が得られる。次に
この炉液のｐＨを７０±０．２に調整し、これに精製水
を加えて希釈することにより、その電気伝導度を０．８
ｍＵ／ｃｍ以下にする。通常は、この場合の精製水の添
加量は、上記炉液が約１０倍量程度になる如き量である
。こうして得られた液にジエチルアミノエチル基を有す
るアニオン交換体の粉末を加え、攪拌し、懸濁液を調製
する。このジエチルアミノエチル基を有するアニオン交
換体の例は、ＤＥＡＥ−セルロースである。この粉末の
添加量は、通常は、もとの膵臓原料１ｇあたり０．０２
ｇの割合を目安とする。攪拌は、通常約２時間程度を目
安とすればよい。次に、こうして、得られた懸濁液をカ
ラムに入れ、酢酸アンモニウム水溶液を用いて溶離を行
うが、それに先立ち、希酢酸アンモニウム水溶液でカラ
ム内容物を洗い、その洗液が紫外線吸収で測定してＡ２
８０訓／ｍｌが０，１以下となるまで、この処理を行う
。この洗液（以下エラスターゼ含有洗液という）から後
述する操作により、エラスターゼが取得される。
この処理を行つた後の前記のカラム内のアニオン交換体
を０．６±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液で、溶離
する。
を０．６±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液で、溶離
する。
得られた画分を氷冷し、これに、固体の硫酸アンモニウ
ムを加えて塩析し、その約４０％飽和度において生じた
沈殿を除き、それにさらに、７５±５％飽和度に達する
まで、硫酸アンモニウムを加えて静置する。次に、生成
した沈殿を取り、これを０．３±０，２Ｍ酢酸アンモニ
ウム水溶液（ｐＨ６，０程度）に溶解して、０．３±０
．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に透析し、得られた液を
強塩基性３級アミノ基を有するアニオン交換体カラムで
カラム処理する。そのアニオン交換体の例は、ＱＡＥ−
セフアデツクスＡ−５０である。次にそのカラムを０．
３±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液を用いて洗うが
、この処理はその洗液が、紫外線吸収で測定してＡ２８
０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の吸光度とほぼ同程度とな
るまで行う。次いでこのカラムを約０．６Ｍ酢酸アンモ
ニウム水溶液（ｐＨ６，０）を用いて処理し、このカラ
ムに吸着されているカリクレインを溶離する。
ムを加えて塩析し、その約４０％飽和度において生じた
沈殿を除き、それにさらに、７５±５％飽和度に達する
まで、硫酸アンモニウムを加えて静置する。次に、生成
した沈殿を取り、これを０．３±０，２Ｍ酢酸アンモニ
ウム水溶液（ｐＨ６，０程度）に溶解して、０．３±０
．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に透析し、得られた液を
強塩基性３級アミノ基を有するアニオン交換体カラムで
カラム処理する。そのアニオン交換体の例は、ＱＡＥ−
セフアデツクスＡ−５０である。次にそのカラムを０．
３±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液を用いて洗うが
、この処理はその洗液が、紫外線吸収で測定してＡ２８
０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の吸光度とほぼ同程度とな
るまで行う。次いでこのカラムを約０．６Ｍ酢酸アンモ
ニウム水溶液（ｐＨ６，０）を用いて処理し、このカラ
ムに吸着されているカリクレインを溶離する。
一方、前述したエラスターゼ含有洗液は、これにカルボ
キシメチル基を有するカチオン交換体の粉末を加えて攪
拌し、懸濁液を調製する。
キシメチル基を有するカチオン交換体の粉末を加えて攪
拌し、懸濁液を調製する。
このカチオン交換体の例はカルボキシメチルセルロース
である。この攪拌操作は通常約２時間程度を目安とする
。この懸濁液をカラムに入れ、その内容物を希リン酸塩
水溶液（例えば、０．０２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ６，８
±０．２）で洗うがこの処理は、その洗液が、紫外線吸
収で測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが０．１以下になるま
で行う。次に、このカラムを約０．５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ６，８）を用いて溶離する。
である。この攪拌操作は通常約２時間程度を目安とする
。この懸濁液をカラムに入れ、その内容物を希リン酸塩
水溶液（例えば、０．０２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ６，８
±０．２）で洗うがこの処理は、その洗液が、紫外線吸
収で測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが０．１以下になるま
で行う。次に、このカラムを約０．５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ６，８）を用いて溶離する。
得られた画分を氷冷し、これに固体の硫酸アンモニウム
を加えて塩析して約５０％飽和度において生じた沈殿を
取得する。得られた沈殿物を約０．０２Ｍリン酸塩水溶
液（ｐＨ６，８）に溶解し、約０．０２Ｍリン酸塩水溶
液に透析して得られた液を、カルボキシメチル基を有す
るカチオン交換体カラムで処理する。このカチオン交換
体の例はＣＭ−セフアデツクスＣ−５０である。このカ
ラムは、あらかじめ、上記のリン酸塩水溶液を用いて平
衡化しておく。
を加えて塩析して約５０％飽和度において生じた沈殿を
取得する。得られた沈殿物を約０．０２Ｍリン酸塩水溶
液（ｐＨ６，８）に溶解し、約０．０２Ｍリン酸塩水溶
液に透析して得られた液を、カルボキシメチル基を有す
るカチオン交換体カラムで処理する。このカチオン交換
体の例はＣＭ−セフアデツクスＣ−５０である。このカ
ラムは、あらかじめ、上記のリン酸塩水溶液を用いて平
衡化しておく。
上記の処理後のカラムを次いで約０．０２Ｍリン酸塩水
溶液を用いて洗うが、この処理は、洗液が紫外線吸収で
測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の吸光度と
ほぼ同程度となるまで行う。次に、このカラムを０．０
２〜０．５Ｍの連続的直線蜜度勾配で、リン酸塩緩衝液
を用いて溶離する。得られた画分を００２Ｍ酢酸アンモ
ニウム水溶液（ｐＨ６０）を用いて透析した後、凍結乾
燥する。上記の透析操作は、通常は約１２時間程度行う
。
溶液を用いて洗うが、この処理は、洗液が紫外線吸収で
測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の吸光度と
ほぼ同程度となるまで行う。次に、このカラムを０．０
２〜０．５Ｍの連続的直線蜜度勾配で、リン酸塩緩衝液
を用いて溶離する。得られた画分を００２Ｍ酢酸アンモ
ニウム水溶液（ｐＨ６０）を用いて透析した後、凍結乾
燥する。上記の透析操作は、通常は約１２時間程度行う
。
以上詳述した如き本発明の方法により、豚の膵臓を原料
としてカリクレインとエラスターゼの両者を同一の原料
から、ともに効率良く採取することができるが、本発明
方法の各工程め途中における画分をとりその画分中に含
有されているカリクレインおよびエラスターゼの各活性
を測定することにより、本発明方法が如何に効率良く、
この両者を採取する方法であるかが判明する。
としてカリクレインとエラスターゼの両者を同一の原料
から、ともに効率良く採取することができるが、本発明
方法の各工程め途中における画分をとりその画分中に含
有されているカリクレインおよびエラスターゼの各活性
を測定することにより、本発明方法が如何に効率良く、
この両者を採取する方法であるかが判明する。
その測定試験の結果の一例を表１および表２に示すが、
各表中において画分■、＠、（９，０、■、■、■、■
、■として表示されている各画分は、以下に示す本発明
方法の各工程中において得られた溶液に対応する記号で
記入されているものを意味する。
各表中において画分■、＠、（９，０、■、■、■、■
、■として表示されている各画分は、以下に示す本発明
方法の各工程中において得られた溶液に対応する記号で
記入されているものを意味する。
（ａ）原料を精製水中で加温攪拌し、
（ｂ）上記（ａ）により得られる液状生成物のｐＨを４
。０±０２に調整し、これに水と混和し得る有機溶媒を
混和した後、濾過し、 （ｃ）上記（ｂ）で得られたろ液（画分イ）のｐＨを７
．０±０２に調整し、これに精製水を加え、希釈するこ
とにより、その液の電気伝導度を０．８±０．３ｍＵ／
ｃｍ以下にし、 （ｄ）上記（ｃ）で得られた液に、ジエチルアミノエチ
ル基を有するアニオン交換体の粉末を加えて攪拌懸濁し
、 （ｅ）上記（ｄ）で得られた懸濁液をカラムに入れ、そ
の内容物を希酢酸アンモニウム水溶液を用いて、その水
溶液による洗液が紫外線吸収で測定してＡ２８０ｎｍ／
ｍｌが０．１以下となるまで洗い、この洗液を回収し、 （ｆｌ）上記の（ｅ）の処理を行つた後のアニオン交換
体を０．６±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液で溶離
して得られた（画分＠）を氷冷下に固体の硫酸アンモニ
ウムを加えて塩析して、その約４０％飽和度において生
じた沈殿を除き、それに、さらに７５±５％飽和度に達
するまで硫酸アンモニウムを加えて静置し、生成した沈
殿を取得し、 （ｇｌ）上記（ｆｌ）で得られた沈殿を０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に溶解して、（画分Ｏ）０．
６±０．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に透析し、（ｈｌ
）上記（ｇｌ）で得られた液（画分＠）を強塩基性３級
アミノ基を有するアニオン交換体カラム処理し、 （ｊｌ）上記（ｈｌ）で用いたカラムを０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いて洗い、その水溶液に
よる洗液が上記の水溶液の吸光度とほぼ同程度となるま
で洗つた後、約０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用い
てこのカラムに吸着されているカリクレインを溶離し、
（画分■）一方、 （ｆ２）前記（θ）の操作で得られた洗液に、カルボキ
シメチル基を有するカチオン交換体の粉末を加えて、攪
拌懸濁し、 （ｇ２）上記（ｆ２）で得られた懸濁液をカラムに入れ
その内容物を希リン酸塩水溶液を用いて、その水溶液に
よる洗液が紫外線吸収で測定して、Ａ２８０ｎｍ／ｍｌ
が０．１以下になるまで洗つた後、約０、５Ｍリン酸塩
緩衝液を用いて溶離し、（ｈ２）上記（ｇ２）で得られ
た画分（■）を氷冷下に固体の硫酸アンモニウムを加え
て塩析し、約５０％飽和度において生じた沈殿を取得し
、（Ｊ２）上記（ｈ２）で得られた沈殿を約０．０２Ｍ
リン酸塩水溶液に溶解して（画分０）約０．０２Ｍリン
酸塩水溶液に透析し、 （ｋ２）上記（Ｊ２）で得られた液（画分■）をカルボ
キシメチル基を有するカチオン交換体カラムで処理し、 （ｌ２）上記（ｋ２）の処理後のカラムを約０．０２Ｍ
リン酸塩水溶液を用いて、その水溶液による洗液が紫外
線吸収で測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の
吸光度とほぼ同程度となるまで洗つた後、０．０２〜０
．５Ｍの連続的直線密度勾配で、リン酸塩緩衝液を用い
てカラムに吸着されているエラスターゼを溶離する（画
分■）。
。０±０２に調整し、これに水と混和し得る有機溶媒を
混和した後、濾過し、 （ｃ）上記（ｂ）で得られたろ液（画分イ）のｐＨを７
．０±０２に調整し、これに精製水を加え、希釈するこ
とにより、その液の電気伝導度を０．８±０．３ｍＵ／
ｃｍ以下にし、 （ｄ）上記（ｃ）で得られた液に、ジエチルアミノエチ
ル基を有するアニオン交換体の粉末を加えて攪拌懸濁し
、 （ｅ）上記（ｄ）で得られた懸濁液をカラムに入れ、そ
の内容物を希酢酸アンモニウム水溶液を用いて、その水
溶液による洗液が紫外線吸収で測定してＡ２８０ｎｍ／
ｍｌが０．１以下となるまで洗い、この洗液を回収し、 （ｆｌ）上記の（ｅ）の処理を行つた後のアニオン交換
体を０．６±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液で溶離
して得られた（画分＠）を氷冷下に固体の硫酸アンモニ
ウムを加えて塩析して、その約４０％飽和度において生
じた沈殿を除き、それに、さらに７５±５％飽和度に達
するまで硫酸アンモニウムを加えて静置し、生成した沈
殿を取得し、 （ｇｌ）上記（ｆｌ）で得られた沈殿を０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に溶解して、（画分Ｏ）０．
６±０．２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に透析し、（ｈｌ
）上記（ｇｌ）で得られた液（画分＠）を強塩基性３級
アミノ基を有するアニオン交換体カラム処理し、 （ｊｌ）上記（ｈｌ）で用いたカラムを０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いて洗い、その水溶液に
よる洗液が上記の水溶液の吸光度とほぼ同程度となるま
で洗つた後、約０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用い
てこのカラムに吸着されているカリクレインを溶離し、
（画分■）一方、 （ｆ２）前記（θ）の操作で得られた洗液に、カルボキ
シメチル基を有するカチオン交換体の粉末を加えて、攪
拌懸濁し、 （ｇ２）上記（ｆ２）で得られた懸濁液をカラムに入れ
その内容物を希リン酸塩水溶液を用いて、その水溶液に
よる洗液が紫外線吸収で測定して、Ａ２８０ｎｍ／ｍｌ
が０．１以下になるまで洗つた後、約０、５Ｍリン酸塩
緩衝液を用いて溶離し、（ｈ２）上記（ｇ２）で得られ
た画分（■）を氷冷下に固体の硫酸アンモニウムを加え
て塩析し、約５０％飽和度において生じた沈殿を取得し
、（Ｊ２）上記（ｈ２）で得られた沈殿を約０．０２Ｍ
リン酸塩水溶液に溶解して（画分０）約０．０２Ｍリン
酸塩水溶液に透析し、 （ｋ２）上記（Ｊ２）で得られた液（画分■）をカルボ
キシメチル基を有するカチオン交換体カラムで処理し、 （ｌ２）上記（ｋ２）の処理後のカラムを約０．０２Ｍ
リン酸塩水溶液を用いて、その水溶液による洗液が紫外
線吸収で測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の
吸光度とほぼ同程度となるまで洗つた後、０．０２〜０
．５Ｍの連続的直線密度勾配で、リン酸塩緩衝液を用い
てカラムに吸着されているエラスターゼを溶離する（画
分■）。
註１）Ａ２８０／ｍｌは紫外線吸収で測定したＡ２８０
ｎｍ／ｍｌの値であり、含有タンパク質量のインデツク
スとして示されている。
ｎｍ／ｍｌの値であり、含有タンパク質量のインデツク
スとして示されている。
註２）ＥＵ／ｍｌは含有カリクレインの活性がエステラ
ーゼ単位で測定した値として示されている。
ーゼ単位で測定した値として示されている。
註３）ＥＵ／Ａ２８０は、上記の註２）のＥＵ／ｍｌの
数値を註１）のＡ２８０／ｍｌの数値で除した値であり
、単位タンパク質、量あたりのカリクレイン活性がエス
テラーゼ単位で表わした数値として示されている。
数値を註１）のＡ２８０／ｍｌの数値で除した値であり
、単位タンパク質、量あたりのカリクレイン活性がエス
テラーゼ単位で表わした数値として示されている。
註４）ＥＵ／原料ｇは、原料１２あたりから得られるカ
リクレインの活性がエステラーゼ単位で表わした数値と
して示されている。
リクレインの活性がエステラーゼ単位で表わした数値と
して示されている。
註５）ＫＵ／ｄは、含有カリクレインの活性がカリクレ
インの生物学的単位（ＫＵ）で測定した値として示され
ている。
インの生物学的単位（ＫＵ）で測定した値として示され
ている。
註／ｌ）ＫＵ／Ａ２８０は、上記註５）のＫＵ／ｍｌの
数値を註１）のＡ２８０／ｍｌの数値で除した値であり
、単位タンパク質、量あたりのカリクレイン活性がカリ
クレインの生物学的単位で表わした数値として示されて
いる。
数値を註１）のＡ２８０／ｍｌの数値で除した値であり
、単位タンパク質、量あたりのカリクレイン活性がカリ
クレインの生物学的単位で表わした数値として示されて
いる。
註７）ＫＵ／原料ｇは、原料１ｇあたりから得られるカ
リクレインの活性がカリクレインの生物学的単位（ＫＵ
）で表わした数値として示されている。
リクレインの活性がカリクレインの生物学的単位（ＫＵ
）で表わした数値として示されている。
表１にみられるように、
ＥＵ／Ａ２８０の欄に示された数値により、画分■から
最終取得物に至るまでに、画分＠、ＯｌＯ，■とカリク
レイン含量が次第に上つてくることが判る。また、ＥＵ
／原料ｇの欄に示された数値により原料に含有されてい
るカリクレインが通常、精製過程中に起こることが不可
避の逸失を大きくすることなく、最終取得物まで保持さ
れていることが判る。これらのことはＫＵ／Ａ２８０お
よびＫＵ／原料ｇの各欄の数字によつても同様に明らか
に示されている。
最終取得物に至るまでに、画分＠、ＯｌＯ，■とカリク
レイン含量が次第に上つてくることが判る。また、ＥＵ
／原料ｇの欄に示された数値により原料に含有されてい
るカリクレインが通常、精製過程中に起こることが不可
避の逸失を大きくすることなく、最終取得物まで保持さ
れていることが判る。これらのことはＫＵ／Ａ２８０お
よびＫＵ／原料ｇの各欄の数字によつても同様に明らか
に示されている。
註８）前述の註１）と同義。
註９）ＡＵ／Ａ２８０は、前記註３）の場合と同じよう
に、単位タンパク質、量あたりのエラスターゼ活性が、
エラスターゼ単位で表わした数値として示されている。
に、単位タンパク質、量あたりのエラスターゼ活性が、
エラスターゼ単位で表わした数値として示されている。
註１０）ＡＵ／原料ｇは前記註４）の場合と同じように
原料１ｇあたりから得られるエラスターゼがエラスター
ゼ単位で表わした数値として示されている。
原料１ｇあたりから得られるエラスターゼがエラスター
ゼ単位で表わした数値として示されている。
註１１）ＥＵ／原料ｇは原料１ｇあたりから随伴するカ
リクレインの量をエステラーゼ単位で表わした数値とし
て示されている。
リクレインの量をエステラーゼ単位で表わした数値とし
て示されている。
表２にみられるように、
Ａｎ／Ａ２８０の欄に示された数値により、画分■から
最終取得物に至るまでに、画分■、■、■、■とエラス
ターゼ含量が次第に上つてくることが判る。また、ＡＵ
／原料ｇの欄に示された数値により、原料に含有されて
いるエラスターゼの逸失が、前記工程の（ｆ２）〜（ｌ
２）の過程でほとんど抑制されて、高含量が維持されて
いることが判る。また、エステラーゼ取得に伴つて随伴
するカリクレインは最終的には検出されないことが示さ
れている。
最終取得物に至るまでに、画分■、■、■、■とエラス
ターゼ含量が次第に上つてくることが判る。また、ＡＵ
／原料ｇの欄に示された数値により、原料に含有されて
いるエラスターゼの逸失が、前記工程の（ｆ２）〜（ｌ
２）の過程でほとんど抑制されて、高含量が維持されて
いることが判る。また、エステラーゼ取得に伴つて随伴
するカリクレインは最終的には検出されないことが示さ
れている。
なお、前記各表に示したカリクレイン活性を示す単位Ｅ
ＵおよびＫＵについては、その方法は、「医薬品開発基
礎講座Ｖ、８」（地人書館発行）９４５〜９８６頁およ
びＣｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ。
ＵおよびＫＵについては、その方法は、「医薬品開発基
礎講座Ｖ、８」（地人書館発行）９４５〜９８６頁およ
びＣｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ。
Ｂｕｌｌ、２２（５）９７５〜９８３頁１９７４記載の
方法によるものであり、エラスターゼ活性を示す単位Ａ
Ｕは、サクシニルトリーＬ−アラニンパラニトロアニリ
ドを２５℃で１分間に加水分解し得るμモル数をもつて
、エラスターゼのＩＡＵとするものである（「医学のあ
ゆみ」１１０（１２）６７９〜６８１頁および同１０４
（３）１７０〜１７２頁参照）。
方法によるものであり、エラスターゼ活性を示す単位Ａ
Ｕは、サクシニルトリーＬ−アラニンパラニトロアニリ
ドを２５℃で１分間に加水分解し得るμモル数をもつて
、エラスターゼのＩＡＵとするものである（「医学のあ
ゆみ」１１０（１２）６７９〜６８１頁および同１０４
（３）１７０〜１７２頁参照）。
特許出願人守屋寛
特許出願人昭光通商株式会社
手続補正書（方式）
昭和３７年ン２月７７日
特許庁長官若杉和夫殿
１、事件の表示
昭和５７年特許願第１１Ｉ６ユダコ号
２、発明の名称
カリクレインおよびエラスターゼの製造法３、補正をす
る者 事件との関係特許出願人 住所東京都港区西新橋３丁目ｇ番３号 名称昭光通商株式会社 （ほか７名） ４、代理人 住所東京都千代田区麹町３丁目コ番地 相互第一ピル 電話（２乙ｓ）ｑ乙ダヮ 昭和３７年／７月７２日 （発送日：昭和３７年／７月３０日） ６、補正の対象明細書（／ダ頁、７７頁）７、補正の内
容 明細書（／１貫、／り頁）の浄書（内容に変更なし）。
る者 事件との関係特許出願人 住所東京都港区西新橋３丁目ｇ番３号 名称昭光通商株式会社 （ほか７名） ４、代理人 住所東京都千代田区麹町３丁目コ番地 相互第一ピル 電話（２乙ｓ）ｑ乙ダヮ 昭和３７年／７月７２日 （発送日：昭和３７年／７月３０日） ６、補正の対象明細書（／ダ頁、７７頁）７、補正の内
容 明細書（／１貫、／り頁）の浄書（内容に変更なし）。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）豚の膵臓を原料として使用し、 （ａ）原料を精製水中で加温攪拌し、 （ｂ）上記（ａ）により得られる液状生成物のｐＨを４
．０±０．２に調整し、これに水と混和し得る有機溶媒
を混和した後、濾過し、 （ｃ）上記（ｂ）で得られたろ液のｐＨを７０±０．２
に調整し、これに精製水を加え、希釈することにより、
その液の電気伝導度を０．８±０．３ｍＵ／ｃｍ以下に
し、 （ｄ）上記（ｃ）で得られた液に、ジエチルアミノエチ
ル基を有するアニオン交換体の粉末を加えて攪拌懸濁し
、 （ｅ）上記（ｄ）で得られた懸濁液をカラムに入れ、そ
の内容物を希酢酸アンモニウム水溶液を用いて、その水
溶液による洗液が紫外線吸収で測定してＡ２８０Ｈｍ／
ｍｌが０．１以下となるまで洗い、この洗液を回収し、 （ｆｌ）上記の（ｅ）の処理を行つた後のアニオン交換
体を０．６±０．２Ｍの酢酸アンモニウム水溶液で溶離
して得られた画分を氷冷下に固体の硫酸アンモニウムを
加えて塩析して、その約４０％飽和度において生じた沈
殿を除き、それに、さらに７５±５％飽和度に達するま
で硫酸アンモニウムを加えて静置し、生成した沈殿を取
得し、 （ｇｌ）上記（ｆｌ）で得られた沈殿を０．３±０，２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に溶解して、０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液に透析し、（ｈｌ）上記（ｇ
ｌ）で得られた液を強塩基性３級アミノ基を有するアニ
オン交換体カラム処理し、 （ｊ１）上記（ｈｌ）で用いたカラムを０．３±０．２
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いて洗い、その水溶液に
よる洗液が上記の水溶液の吸光度とほぼ同程度となるま
で洗つた後、約０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用い
てこのカラムに吸着されているカリクレインを溶離し、
一方、 （ｆ２）前記（ｅ）の操作で得られた洗液に、カルボキ
シメチル基を有するカチオン交換体の粉末を加えて、攪
拌懸濁し、 （ｇ２）上記（ｆ２）で得られた懸濁液をカラムに入れ
、その内容物を希リン酸塩水溶液を用いて、その水溶液
による洗液が紫外線吸収で測定して、Ａ２８０ｎｍ／ｍ
ｌが０．１以下になるまで洗つた後、約０．５Ｍリン酸
塩緩衝液を用いて溶離し、 （ｈ２）上記（ｇ２）で得られた画分を氷冷下に固体の
硫酸アンモニウムを加えて塩析し、約５０％飽和度にお
いて生じた沈殿を取得し、（ｊ２）上記（ｈ２）で得ら
れた沈殿を約０．０２Ｍリン酸塩水溶液に溶解して約０
．０２Ｍリン酸塩水溶液に透析し、 （ｋ２）上記（Ｊ２）で得られた液をカルボキシメチル
基を有するカチオン交換体カラムで処理し、 （ｌ）上記（ｋ２）の処理後のカラムを約０．０２Ｍリ
ン酸塩水溶液を用いて、その水溶液による洗液が紫外線
吸収で測定してＡ２８０ｎｍ／ｍｌが上記の水溶液の吸
光度とほぼ同程度となるまで、洗つた後、０．０２〜０
．５Ｍの連続的直線密度勾配で、リン酸塩緩衝液を用い
てカラムに吸着されているエラスターゼを溶離すること
からなることを特徴とするカリクレインとエラスターゼ
の製造方法。 ２）原料として、豚の膵臓をアセトンにより脱脂脱水し
て得られる乾燥粉末を用いることを特徴とする特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 ３）前記（ｂ）における有機溶媒として、アセトンもし
くはメタノールを１５ないし３０ｖ／ｖ％の量で用いる
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14624282A JPS6041595B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | カリクレインおよびエラスタ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14624282A JPS6041595B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | カリクレインおよびエラスタ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5939288A true JPS5939288A (ja) | 1984-03-03 |
| JPS6041595B2 JPS6041595B2 (ja) | 1985-09-18 |
Family
ID=15403307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14624282A Expired JPS6041595B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | カリクレインおよびエラスタ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6041595B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7537228B2 (en) | 2003-07-22 | 2009-05-26 | Nihon University | Monocycle |
| CN108642031A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-10-12 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种弹性蛋白酶及其提取方法 |
-
1982
- 1982-08-25 JP JP14624282A patent/JPS6041595B2/ja not_active Expired
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7537228B2 (en) | 2003-07-22 | 2009-05-26 | Nihon University | Monocycle |
| CN108642031A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-10-12 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种弹性蛋白酶及其提取方法 |
| CN108642031B (zh) * | 2018-07-02 | 2022-01-07 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种弹性蛋白酶及其提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6041595B2 (ja) | 1985-09-18 |
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