JPS58898A - 過酸化水素の定量方法 - Google Patents
過酸化水素の定量方法Info
- Publication number
- JPS58898A JPS58898A JP9601081A JP9601081A JPS58898A JP S58898 A JPS58898 A JP S58898A JP 9601081 A JP9601081 A JP 9601081A JP 9601081 A JP9601081 A JP 9601081A JP S58898 A JPS58898 A JP S58898A
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- JP
- Japan
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- hydrogen peroxide
- peroxidase
- aminoantipyrine
- absorbance
- solution
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、パーオキシダーゼの存在下に、4−アミノア
/チピリンと置換アニリン化合物を用いる過酸化水素の
定量方法に関する。
/チピリンと置換アニリン化合物を用いる過酸化水素の
定量方法に関する。
就中、体液中の尿酸、グルコース、コレステロール、コ
リンエステラーゼ、トランスアミナーゼ、遊離脂肪酸、
トリグリセライド等を測定する方法において、酸化酵素
を直接的に、或いは反応過程において作用させ、同時に
生成した過酸化水素を定量することによシ目的物を測定
する方法が用いられている。
リンエステラーゼ、トランスアミナーゼ、遊離脂肪酸、
トリグリセライド等を測定する方法において、酸化酵素
を直接的に、或いは反応過程において作用させ、同時に
生成した過酸化水素を定量することによシ目的物を測定
する方法が用いられている。
かかる過酸化水素の定量方法は、パーオキシダーゼ存在
下の酸化縮合反応で生成する着色体を光学的に定量する
ものである。
下の酸化縮合反応で生成する着色体を光学的に定量する
ものである。
従来、酸化縮合反応には主に4−アミノアンチピリンと
の縮合対象物としてフェノール及びその誘導体、或いは
N1N−ジエチルアニリン、NνN−ジメチルアニリン
等のアニリン誘導体が用いられている。
の縮合対象物としてフェノール及びその誘導体、或いは
N1N−ジエチルアニリン、NνN−ジメチルアニリン
等のアニリン誘導体が用いられている。
しか1〜ながら、それらの縮合対象物を用いる場合の水
溶性が不充分であること■微量成分の定量には感度が低
いこと■呈色後の安定性がpHによ一ノで異なること■
使用する酸化酵素の至適pHと発色剤の至適pi−1が
異なること■試料中のヘモグロビン、ビリルビン、アス
コルビン酸等の実雑物の影響を受けやすいこと等の欠点
を有しているため、より優れた発色剤が求められている
。
溶性が不充分であること■微量成分の定量には感度が低
いこと■呈色後の安定性がpHによ一ノで異なること■
使用する酸化酵素の至適pHと発色剤の至適pi−1が
異なること■試料中のヘモグロビン、ビリルビン、アス
コルビン酸等の実雑物の影響を受けやすいこと等の欠点
を有しているため、より優れた発色剤が求められている
。
本発明者らは、これらの欠点に鑑み鋭意研究した結果、
4−アミノアンチピリンに対して一般式(’1)で表わ
される置換アニリン化合物を用いた場合、上記欠点を著
しく改良することを見出し、本発明を完成した。
4−アミノアンチピリンに対して一般式(’1)で表わ
される置換アニリン化合物を用いた場合、上記欠点を著
しく改良することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明はパーオキシダーゼの存在下に、4−アミ
ノアンチピリ/と一般式(1)(式中、R1はH,CH
8、c2H6又はOCH,、R2は■、 CII8又は
CzHs、R8はCH2CH2COOH。
ノアンチピリ/と一般式(1)(式中、R1はH,CH
8、c2H6又はOCH,、R2は■、 CII8又は
CzHs、R8はCH2CH2COOH。
CI(((:1−(8)(コll2C00)1%CH2
C’H(OH)CH20)1%CH2CH(CHs)C
OOH又はC(12CFI2CH2C0011を示す)
で表わされる化合物とから成る着色性化合物に変化する
組合わせ試薬を用いることを特徴とする過酸化水素の定
量方法である。
C’H(OH)CH20)1%CH2CH(CHs)C
OOH又はC(12CFI2CH2C0011を示す)
で表わされる化合物とから成る着色性化合物に変化する
組合わせ試薬を用いることを特徴とする過酸化水素の定
量方法である。
一般式(1)で表わされる化合物はアニリン及びその誘
導体のアミ7基を導入することにより得られ、その若干
の例について具体的に化合物名を示すと以下のとおりで
ある。
導体のアミ7基を導入することにより得られ、その若干
の例について具体的に化合物名を示すと以下のとおりで
ある。
N−(2−カルボキシエチル)−N〜エチル=3−メチ
ルアニリン、N−(2−カルボキシエチル)−3−メチ
ルアニリン、N−(2−カルボキシエチル)−N−エチ
ルアニリン、N−(2−’カルボキシエチル)−N−メ
チルアニリ本発明の置換アニリン化合物(1)は過酸化
水素、パーオキシダーゼ存在下で4−アミノアンチピリ
ンと次式に示されるようにして酸化縮合し、λ=580
〜560nm近辺に極大吸収をもつキノン型色素(1)
を形成する。
ルアニリン、N−(2−カルボキシエチル)−3−メチ
ルアニリン、N−(2−カルボキシエチル)−N−エチ
ルアニリン、N−(2−’カルボキシエチル)−N−メ
チルアニリ本発明の置換アニリン化合物(1)は過酸化
水素、パーオキシダーゼ存在下で4−アミノアンチピリ
ンと次式に示されるようにして酸化縮合し、λ=580
〜560nm近辺に極大吸収をもつキノン型色素(1)
を形成する。
(It)
本発明によれば、4−アミノアンチピリンとフ・ノール
とからなる発色、或いは4−アミノアンチピリンとN
p N−ジメチルアニリンとd−らなる発色に対し、感
度の面で約1.5〜2.5倍、また発色後の安定性の面
で酸性側及びアルカ1ノ側のpHで良好な結果が得られ
る。(表1参照)更に、本発明の置換アニリン化合物は
分子内に親水基を有するため極めて水溶性が良く試薬の
調製を簡便に行なうことができる。
とからなる発色、或いは4−アミノアンチピリンとN
p N−ジメチルアニリンとd−らなる発色に対し、感
度の面で約1.5〜2.5倍、また発色後の安定性の面
で酸性側及びアルカ1ノ側のpHで良好な結果が得られ
る。(表1参照)更に、本発明の置換アニリン化合物は
分子内に親水基を有するため極めて水溶性が良く試薬の
調製を簡便に行なうことができる。
※化合物のはN−(2−カルボキシエチル)−N−エチ
ル−3−メチルアニリン、化合物■はN−(2−カルボ
キシエチル) −N−エチルアニリン、化合物■はN−
エチル−N−(2゜3−ジヒドロキ7プロピル)−3−
メチルアニリンである。
ル−3−メチルアニリン、化合物■はN−(2−カルボ
キシエチル) −N−エチルアニリン、化合物■はN−
エチル−N−(2゜3−ジヒドロキ7プロピル)−3−
メチルアニリンである。
表中、各発色剤の欄に記載された数値はそれぞJlの極
大吸収波長での吸光度を表わし、カッコ内の数値は発色
後の安定性を発色時から25゛C水溶中に60分経過後
の残存率(@で各々表わしたものであるっこれら種々の
発色剤のpHにおける感度及び発色後の安定性に関する
実験方法は次のとおりである。
大吸収波長での吸光度を表わし、カッコ内の数値は発色
後の安定性を発色時から25゛C水溶中に60分経過後
の残存率(@で各々表わしたものであるっこれら種々の
発色剤のpHにおける感度及び発色後の安定性に関する
実験方法は次のとおりである。
各々のpHのテオレルーステンハーゲン緩衝液2.3m
/ K4.5mM 4−アミノアンチピリンを含む20
U/rr+lパ一オキンダーゼ水溶液02m1と60m
Mフェノール水溶液又は12mMN9N−ジメチルアニ
リン水溶液又は12mMの本発明発色剤水溶液をQ5m
l加える。
/ K4.5mM 4−アミノアンチピリンを含む20
U/rr+lパ一オキンダーゼ水溶液02m1と60m
Mフェノール水溶液又は12mMN9N−ジメチルアニ
リン水溶液又は12mMの本発明発色剤水溶液をQ5m
l加える。
試料は0.90mM (81mg/d l )過酸化水
素水溶液Q 05m1lを加え、37゛05分間インキ
ュページ日ン後、約5分間放置し日立139型分光光度
計で比色した。尚、N t N−ジメチルアニリンは難
溶性のため、エタノール6V/V%、ツイー78000
5%含有した液で溶解した。
素水溶液Q 05m1lを加え、37゛05分間インキ
ュページ日ン後、約5分間放置し日立139型分光光度
計で比色した。尚、N t N−ジメチルアニリンは難
溶性のため、エタノール6V/V%、ツイー78000
5%含有した液で溶解した。
本発明は上述したような点から、種々の酸化酵素を用い
て過酸化水素を生成せしめ、これを容易に定量すること
がで角る。即ち、本兇明の発色pHは酸性側及びアルカ
リ側において良好であるばかりでなく、特に使用する酸
化酵素至適pHがp 的〜8近辺にある場合は極めて優
れた結果が得られる。
て過酸化水素を生成せしめ、これを容易に定量すること
がで角る。即ち、本兇明の発色pHは酸性側及びアルカ
リ側において良好であるばかりでなく、特に使用する酸
化酵素至適pHがp 的〜8近辺にある場合は極めて優
れた結果が得られる。
例えば、ウリカーゼを使用する尿酸の、定量、グルコー
スオキシダーゼを使用するグルコースの定量、コレステ
ロールオキシグーゼを使用するコレステロールの定量、
ピルビン酸オキシダーゼを使用するトランスアミナーゼ
の定量、a−グリセロリン酸オキシダーゼを使用するト
リグリセライドの定量などの場合は、各々の使用する酸
化酵素の至適pHが約6〜&50間に存在するため、そ
の範囲で本発明でのべた着色性化合物に変化する組合わ
せの試薬の発色pHを選°定す(1)試薬の調製 Φ 尿酸測定液 ウリ力 ゼ140TU、パーオキシダーゼ1.a o
。
スオキシダーゼを使用するグルコースの定量、コレステ
ロールオキシグーゼを使用するコレステロールの定量、
ピルビン酸オキシダーゼを使用するトランスアミナーゼ
の定量、a−グリセロリン酸オキシダーゼを使用するト
リグリセライドの定量などの場合は、各々の使用する酸
化酵素の至適pHが約6〜&50間に存在するため、そ
の範囲で本発明でのべた着色性化合物に変化する組合わ
せの試薬の発色pHを選°定す(1)試薬の調製 Φ 尿酸測定液 ウリ力 ゼ140TU、パーオキシダーゼ1.a o
。
II+14 アミノアンチピリ761mg、N−(2
カルボキノエチル)−N=エチル−3−メチルアニリン
塩酸塩(149g、エチレンジアミン四酢酸−ナトリウ
ム037g、トライトン−x 1002yをI)II(
12に調製した11Mリン酸二水素カリウム 水酸化カ
リウム緩衝液に溶解し、全量L000m/とする。
カルボキノエチル)−N=エチル−3−メチルアニリン
塩酸塩(149g、エチレンジアミン四酢酸−ナトリウ
ム037g、トライトン−x 1002yをI)II(
12に調製した11Mリン酸二水素カリウム 水酸化カ
リウム緩衝液に溶解し、全量L000m/とする。
@) 尿酸標準液
尿酸15m19、炭酸リチウム15mfiを蒸留水に溶
解し、全量燵剥m lとする。
解し、全量燵剥m lとする。
(2)試験方法
試験管に血清50plを取り、これに調製した■の測定
fifaOml加え、混合後37゛Cで5分間加温し発
色させる。同時に蒸留水(試薬):、ランク用)及び標
準液を用いて同様の操作を行なう。
fifaOml加え、混合後37゛Cで5分間加温し発
色させる。同時に蒸留水(試薬):、ランク用)及び標
準液を用いて同様の操作を行なう。
発色後、波長550nrlで吸光度を測定し下記の式よ
り尿酸値を求める。
り尿酸値を求める。
0、D=吸光度
実施例2
(1) 試薬の調製
■ グルコース測定液
グルコースオキシダーゼ8a000IU 、パーオキシ
ダーゼ700IU、ムタロターゼ100IU、4−アミ
ノアンチピリン82mJ 、N −(2−カルボキシエ
チル)−N−エチル−3−メチルアニリン塩酸塩α49
I、アジ化ナトリウム02gをpH69に調製した01
Mリン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、全量
1,000mJとする。
ダーゼ700IU、ムタロターゼ100IU、4−アミ
ノアンチピリン82mJ 、N −(2−カルボキシエ
チル)−N−エチル−3−メチルアニリン塩酸塩α49
I、アジ化ナトリウム02gをpH69に調製した01
Mリン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、全量
1,000mJとする。
@ グルコース標準液
グルコース200m1l、安息香酸250tlを蒸留水
で溶解し、全量100m1とする。
で溶解し、全量100m1とする。
(2)試験方法
試験管に血清20plを取り、実施例1の(2)の試験
方法と同様に行ない、発色後、波長550nmで吸光度
を測定し、下記の式よりグルコースの値を求める。
方法と同様に行ない、発色後、波長550nmで吸光度
を測定し、下記の式よりグルコースの値を求める。
0.D−吸光度
実施例3
fil 試薬の調製
■ コレステロール測定液
コレステロールエステラーゼ180IU、コレステロー
ルオキシダーゼ160 I U、パーオキシダーゼ2,
800IU、 4−7 ミ/ アンチピリン65mg、
N−(2−カルボキシエチル) −N−エチル−キシエ
チレンデシルエーテル2gをpH7に調製し◎ 標準液 ン コレステロール200rrllイ?7’ロノ(ノールに
溶解し、全量100m/とする。
ルオキシダーゼ160 I U、パーオキシダーゼ2,
800IU、 4−7 ミ/ アンチピリン65mg、
N−(2−カルボキシエチル) −N−エチル−キシエ
チレンデシルエーテル2gをpH7に調製し◎ 標準液 ン コレステロール200rrllイ?7’ロノ(ノールに
溶解し、全量100m/とする。
(2) 試験方法
試験管に血清20μlを取り、実施例1の(2)の試験
方法と同様の操作を行ない37°010分間加温し、発
色後、波長550nmで吸光度を測定し、下記の式より
コレステロール値を求める。
方法と同様の操作を行ない37°010分間加温し、発
色後、波長550nmで吸光度を測定し、下記の式より
コレステロール値を求める。
0、D=吸光度
実施例4
(1)試薬の調製
■ トランスアミナーゼ測定液(GOT用、GPT用
涜1淀液)ピルビン酸オキシダーゼ8,0OOIU、オ
キ゛ザロ酢酸脱炭酸酵素a000IU (GOTの場合
のみ)、パーオキシダーゼ2,0OOIU、 L−アラ
ニン178y (GPTの場合のみ)、L−アスパラギ
ン酸ナトリウム2α1(GOTの場合のみ)、a−ケト
ゲルタール酸二ナトリウム1.9 F 、塩化チアミン
ピロリン酸018g、リン酸二水素カリウム02g、4
−アミノアンチピリンQ29、N−(2−カルボキシエ
チル)−N−エチル−3−メチルアニリンα611、塩
化マグネシウム六水塩IIをpH69に調製し* 40
mM )リス−N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−
Nl−2−エタンスルホン酸緩衝液に溶解し、全量1,
000rrlとする。
涜1淀液)ピルビン酸オキシダーゼ8,0OOIU、オ
キ゛ザロ酢酸脱炭酸酵素a000IU (GOTの場合
のみ)、パーオキシダーゼ2,0OOIU、 L−アラ
ニン178y (GPTの場合のみ)、L−アスパラギ
ン酸ナトリウム2α1(GOTの場合のみ)、a−ケト
ゲルタール酸二ナトリウム1.9 F 、塩化チアミン
ピロリン酸018g、リン酸二水素カリウム02g、4
−アミノアンチピリンQ29、N−(2−カルボキシエ
チル)−N−エチル−3−メチルアニリンα611、塩
化マグネシウム六水塩IIをpH69に調製し* 40
mM )リス−N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−
Nl−2−エタンスルホン酸緩衝液に溶解し、全量1,
000rrlとする。
@ 反応停止液
1a4.?シーウ酸ナトリウムを蒸留水で溶解(pH4
,9、) L、全量1,000m1とする。
,9、) L、全量1,000m1とする。
θ 標準液
ピルビン酸リチウム−水塩α49# (GOT200、
GPT120カルメン単位相当)、リン酸二水素カリウ
ムFL4g、リン酸水素二ナトリウム12水塩21.5
gを蒸留水で溶解し、全量1,000m/とする。
GPT120カルメン単位相当)、リン酸二水素カリウ
ムFL4g、リン酸水素二ナトリウム12水塩21.5
gを蒸留水で溶解し、全量1,000m/とする。
(2) 試験方法
試験管に検体用、標準液用、試薬ブランク用として、そ
れぞれに■の測定液1mlを取り、37Cで2〜3分間
予備加温する。次いで検体用には血清20μl、標準液
用には標準液20μ!、試薬ブランク用には水20μl
(水は省略してもよい)加え、混合後、37°Cで20
分間加温し発色ぎせるっ更に書々に反応停止液2m/を
加えてから波長550nmで吸光度を測定し、下記の式
よりトランスアミナーゼ(GOT又はGPT)値を求め
る。
れぞれに■の測定液1mlを取り、37Cで2〜3分間
予備加温する。次いで検体用には血清20μl、標準液
用には標準液20μ!、試薬ブランク用には水20μl
(水は省略してもよい)加え、混合後、37°Cで20
分間加温し発色ぎせるっ更に書々に反応停止液2m/を
加えてから波長550nmで吸光度を測定し、下記の式
よりトランスアミナーゼ(GOT又はGPT)値を求め
る。
0、D=吸光度
実施9例5
(1)試薬の調製
■ トリグリセ−ライド測定液
リポプロティンリパーゼ180,0OOIU、グリセロ
ールキナーゼ100IU、α−グリセロリン酸オキシダ
ーゼ2,200IU、パーオキシダーゼ1,700IU
、 4−アミノアンチピリン150mg、アデノシント
リリン酸二ナトリウム480mg、塩化マグネシウム六
水塩4g、トライトンX−1004g、N−(2−1ル
ポキシエチル)−N−エチル−3−メチルアニリン塩酸
塩240mgを50mM1リスヒドロキシメチルアミノ
メタン−塩酸緩衝液(pH76)で全量1,000m/
になるように溶解する。
ールキナーゼ100IU、α−グリセロリン酸オキシダ
ーゼ2,200IU、パーオキシダーゼ1,700IU
、 4−アミノアンチピリン150mg、アデノシント
リリン酸二ナトリウム480mg、塩化マグネシウム六
水塩4g、トライトンX−1004g、N−(2−1ル
ポキシエチル)−N−エチル−3−メチルアニリン塩酸
塩240mgを50mM1リスヒドロキシメチルアミノ
メタン−塩酸緩衝液(pH76)で全量1,000m/
になるように溶解する。
0゛・ 標準液
グリセリン(102,6#を蒸留水に溶解し、全量10
0m lとする。
0m lとする。
(2)試験方法
試験管に血清20μmfc取り、実施例1の(2)の試
験方法と同様の操作を行ない37°Cで15分間加温し
、発色後、波長550nmで吸光度を測定し、下記の式
よりトリグリセライド値を求める。
験方法と同様の操作を行ない37°Cで15分間加温し
、発色後、波長550nmで吸光度を測定し、下記の式
よりトリグリセライド値を求める。
トリグリセライド値(mg/di)
標準液0.D−試薬ブランク0.D
O、I)二吸光度
以上の実施例によって得られる感度及び呈色後の安定性
は下表のとおりである。
は下表のとおりである。
表2
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 パーオキシダーゼの存在下に、4−アミノアンチピリン
と次の一般式(1) (式中、R1はH,CH8、C2F■5又は0CH8、
R2ば11、CH,又はC2H5、′FL8はCH2C
H2C00N−LCH(CH3)CH2COOH,CH
2CH(OH)CH20H。 CH2CH(CH8)COOH又はCH2CH2CH2
C00Hを示す)で表わされる化合物とから成る着色性
化合物に変化する組合わせ試薬を用いることを特徴とす
る過酸化水素の定量方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9601081A JPS58898A (ja) | 1981-06-23 | 1981-06-23 | 過酸化水素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9601081A JPS58898A (ja) | 1981-06-23 | 1981-06-23 | 過酸化水素の定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58898A true JPS58898A (ja) | 1983-01-06 |
JPH0215198B2 JPH0215198B2 (ja) | 1990-04-11 |
Family
ID=14153210
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9601081A Granted JPS58898A (ja) | 1981-06-23 | 1981-06-23 | 過酸化水素の定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58898A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58141797A (ja) * | 1982-02-17 | 1983-08-23 | Hitachi Ltd | 複数項目分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5520471A (en) * | 1978-08-01 | 1980-02-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Hydrogen peroxide quantifying method |
JPS5615237A (en) * | 1979-06-29 | 1981-02-14 | Interox Sa | Manufacture of carboxyl compound |
-
1981
- 1981-06-23 JP JP9601081A patent/JPS58898A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5520471A (en) * | 1978-08-01 | 1980-02-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Hydrogen peroxide quantifying method |
JPS5615237A (en) * | 1979-06-29 | 1981-02-14 | Interox Sa | Manufacture of carboxyl compound |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58141797A (ja) * | 1982-02-17 | 1983-08-23 | Hitachi Ltd | 複数項目分析方法 |
JPS627840B2 (ja) * | 1982-02-17 | 1987-02-19 | Hitachi Ltd |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0215198B2 (ja) | 1990-04-11 |
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