JPS58898A

JPS58898A - 過酸化水素の定量方法

Info

Publication number: JPS58898A
Application number: JP9601081A
Authority: JP
Inventors: Takao Uchida; 高雄内田; Nobuo Hisae; 久江　信雄
Original assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK; Shino Test Corp
Current assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK; Shino Test Corp
Priority date: 1981-06-23
Filing date: 1981-06-23
Publication date: 1983-01-06
Also published as: JPH0215198B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、パーオキシダーゼの存在下に、４−アミノア
／チピリンと置換アニリン化合物を用いる過酸化水素の
定量方法に関する。

就中、体液中の尿酸、グルコース、コレステロール、コ
リンエステラーゼ、トランスアミナーゼ、遊離脂肪酸、
トリグリセライド等を測定する方法において、酸化酵素
を直接的に、或いは反応過程において作用させ、同時に
生成した過酸化水素を定量することによシ目的物を測定
する方法が用いられている。

かかる過酸化水素の定量方法は、パーオキシダーゼ存在
下の酸化縮合反応で生成する着色体を光学的に定量する
ものである。

従来、酸化縮合反応には主に４−アミノアンチピリンと
の縮合対象物としてフェノール及びその誘導体、或いは
Ｎ１Ｎ−ジエチルアニリン、ＮνＮ−ジメチルアニリン
等のアニリン誘導体が用いられている。

しか１〜ながら、それらの縮合対象物を用いる場合の水
溶性が不充分であること■微量成分の定量には感度が低
いこと■呈色後の安定性がｐＨによ一ノで異なること■
使用する酸化酵素の至適ｐＨと発色剤の至適ｐｉ−１が
異なること■試料中のヘモグロビン、ビリルビン、アス
コルビン酸等の実雑物の影響を受けやすいこと等の欠点
を有しているため、より優れた発色剤が求められている
。

本発明者らは、これらの欠点に鑑み鋭意研究した結果、
４−アミノアンチピリンに対して一般式（’１）で表わ
される置換アニリン化合物を用いた場合、上記欠点を著
しく改良することを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明はパーオキシダーゼの存在下に、４−アミ
ノアンチピリ／と一般式（１）（式中、Ｒ１はＨ，ＣＨ
８、ｃ２Ｈ６又はＯＣＨ，、Ｒ２は■、　ＣＩＩ８又は
ＣｚＨｓ、Ｒ８はＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ。

ＣＩ（（（：１−（８）（コｌｌ２Ｃ００）１％ＣＨ２
Ｃ’Ｈ（ＯＨ）ＣＨ２０）１％ＣＨ２ＣＨ（ＣＨｓ）Ｃ
ＯＯＨ又はＣ（１２ＣＦＩ２ＣＨ２Ｃ００１１を示す）
で表わされる化合物とから成る着色性化合物に変化する
組合わせ試薬を用いることを特徴とする過酸化水素の定
量方法である。

一般式（１）で表わされる化合物はアニリン及びその誘
導体のアミ７基を導入することにより得られ、その若干
の例について具体的に化合物名を示すと以下のとおりで
ある。

Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ〜エチル＝３−メチ
ルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−３−メチ
ルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチ
ルアニリン、Ｎ−（２−’カルボキシエチル）−Ｎ−メ
チルアニリ本発明の置換アニリン化合物（１）は過酸化
水素、パーオキシダーゼ存在下で４−アミノアンチピリ
ンと次式に示されるようにして酸化縮合し、λ＝５８０
〜５６０ｎｍ近辺に極大吸収をもつキノン型色素（１）
を形成する。

（Ｉｔ）本発明によれば、４−アミノアンチピリンとフ・ノール
とからなる発色、或いは４−アミノアンチピリンとＮ　
ｐ　Ｎ−ジメチルアニリンとｄ−らなる発色に対し、感
度の面で約１．５〜２．５倍、また発色後の安定性の面
で酸性側及びアルカ１ノ側のｐＨで良好な結果が得られ
る。（表１参照）更に、本発明の置換アニリン化合物は
分子内に親水基を有するため極めて水溶性が良く試薬の
調製を簡便に行なうことができる。

※化合物のはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチ
ル−３−メチルアニリン、化合物■はＮ−（２−カルボ
キシエチル）　−Ｎ−エチルアニリン、化合物■はＮ−
エチル−Ｎ−（２゜３−ジヒドロキ７プロピル）−３−
メチルアニリンである。

表中、各発色剤の欄に記載された数値はそれぞＪｌの極
大吸収波長での吸光度を表わし、カッコ内の数値は発色
後の安定性を発色時から２５゛Ｃ水溶中に６０分経過後
の残存率（＠で各々表わしたものであるっこれら種々の
発色剤のｐＨにおける感度及び発色後の安定性に関する
実験方法は次のとおりである。

〔実験方法〕

各々のｐＨのテオレルーステンハーゲン緩衝液２．３ｍ
／　Ｋ４．５ｍＭ　４−アミノアンチピリンを含む２０
Ｕ／ｒｒ＋ｌパ一オキンダーゼ水溶液０２ｍ１と６０ｍ
Ｍフェノール水溶液又は１２ｍＭＮ９Ｎ−ジメチルアニ
リン水溶液又は１２ｍＭの本発明発色剤水溶液をＱ５ｍ
ｌ加える。

試料は０．９０ｍＭ　（８１ｍｇ／ｄ　ｌ　）過酸化水
素水溶液Ｑ　０５ｍ１ｌを加え、３７゛０５分間インキ
ュページ日ン後、約５分間放置し日立１３９型分光光度
計で比色した。尚、Ｎ　ｔ　Ｎ−ジメチルアニリンは難
溶性のため、エタノール６Ｖ／Ｖ％、ツイー７８０００
５％含有した液で溶解した。

本発明は上述したような点から、種々の酸化酵素を用い
て過酸化水素を生成せしめ、これを容易に定量すること
がで角る。即ち、本兇明の発色ｐＨは酸性側及びアルカ
リ側において良好であるばかりでなく、特に使用する酸
化酵素至適ｐＨがｐ　的〜８近辺にある場合は極めて優
れた結果が得られる。

例えば、ウリカーゼを使用する尿酸の、定量、グルコー
スオキシダーゼを使用するグルコースの定量、コレステ
ロールオキシグーゼを使用するコレステロールの定量、
ピルビン酸オキシダーゼを使用するトランスアミナーゼ
の定量、ａ−グリセロリン酸オキシダーゼを使用するト
リグリセライドの定量などの場合は、各々の使用する酸
化酵素の至適ｐＨが約６〜＆５０間に存在するため、そ
の範囲で本発明でのべた着色性化合物に変化する組合わ
せの試薬の発色ｐＨを選°定す（１）試薬の調製 Φ　尿酸測定液ウリ力　ゼ１４０ＴＵ、パーオキシダーゼ１．ａ　ｏ　
。

ＩＩ＋１４　　アミノアンチピリ７６１ｍｇ、Ｎ−（２
カルボキノエチル）−Ｎ＝エチル−３−メチルアニリン
塩酸塩（１４９ｇ、エチレンジアミン四酢酸−ナトリウ
ム０３７ｇ、トライトン−ｘ　１００２ｙをＩ）ＩＩ（
１２に調製した１１Ｍリン酸二水素カリウム　水酸化カ
リウム緩衝液に溶解し、全量Ｌ０００ｍ／とする。

＠）　尿酸標準液尿酸１５ｍ１９、炭酸リチウム１５ｍｆｉを蒸留水に溶
解し、全量燵剥ｍ　ｌとする。

（２）試験方法試験管に血清５０ｐｌを取り、これに調製した■の測定
ｆｉｆａＯｍｌ加え、混合後３７゛Ｃで５分間加温し発
色させる。同時に蒸留水（試薬）：、ランク用）及び標
準液を用いて同様の操作を行なう。

発色後、波長５５０ｎｒｌで吸光度を測定し下記の式よ
り尿酸値を求める。

０、Ｄ＝吸光度実施例２（１）　　試薬の調製 ■　グルコース測定液グルコースオキシダーゼ８ａ０００ＩＵ　、パーオキシ
ダーゼ７００ＩＵ、ムタロターゼ１００ＩＵ、４−アミ
ノアンチピリン８２ｍＪ　、Ｎ　−（２−カルボキシエ
チル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン塩酸塩α４９
Ｉ、アジ化ナトリウム０２ｇをｐＨ６９に調製した０１
Ｍリン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、全量
１，０００ｍＪとする。

＠　グルコース標準液グルコース２００ｍ１ｌ、安息香酸２５０ｔｌを蒸留水
で溶解し、全量１００ｍ１とする。

（２）試験方法試験管に血清２０ｐｌを取り、実施例１の（２）の試験
方法と同様に行ない、発色後、波長５５０ｎｍで吸光度
を測定し、下記の式よりグルコースの値を求める。

０．Ｄ−吸光度実施例３ｆｉｌ　　試薬の調製 ■　コレステロール測定液コレステロールエステラーゼ１８０ＩＵ、コレステロー
ルオキシダーゼ１６０　Ｉ　Ｕ、パーオキシダーゼ２，
８００ＩＵ、　４−７　ミ／　アンチピリン６５ｍｇ、
Ｎ−（２−カルボキシエチル）　−Ｎ−エチル−キシエ
チレンデシルエーテル２ｇをｐＨ７に調製し◎　標準液ンコレステロール２００ｒｒｌｌイ？７’ロノ（ノールに
溶解し、全量１００ｍ／とする。

（２）　　試験方法試験管に血清２０μｌを取り、実施例１の（２）の試験
方法と同様の操作を行ない３７°０１０分間加温し、発
色後、波長５５０ｎｍで吸光度を測定し、下記の式より
コレステロール値を求める。

０、Ｄ＝吸光度実施例４（１）試薬の調製 ■　　トランスアミナーゼ測定液（ＧＯＴ用、ＧＰＴ用
涜１淀液）ピルビン酸オキシダーゼ８，０ＯＯＩＵ、オ
キ゛ザロ酢酸脱炭酸酵素ａ０００ＩＵ　（ＧＯＴの場合
のみ）、パーオキシダーゼ２，０ＯＯＩＵ、　Ｌ−アラ
ニン１７８ｙ　（ＧＰＴの場合のみ）、Ｌ−アスパラギ
ン酸ナトリウム２α１（ＧＯＴの場合のみ）、ａ−ケト
ゲルタール酸二ナトリウム１．９　Ｆ　、塩化チアミン
ピロリン酸０１８ｇ、リン酸二水素カリウム０２ｇ、４
−アミノアンチピリンＱ２９、Ｎ−（２−カルボキシエ
チル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリンα６１１、塩
化マグネシウム六水塩ＩＩをｐＨ６９に調製し＊　４０
ｍＭ　）リス−Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎｌ−２−エタンスルホン酸緩衝液に溶解し、全量１，
０００ｒｒｌとする。

＠　反応停止液１ａ４．？シーウ酸ナトリウムを蒸留水で溶解（ｐＨ４
，９、）　Ｌ、全量１，０００ｍ１とする。

θ　標準液ピルビン酸リチウム−水塩α４９＃　（ＧＯＴ２００、
ＧＰＴ１２０カルメン単位相当）、リン酸二水素カリウ
ムＦＬ４ｇ、リン酸水素二ナトリウム１２水塩２１．５
ｇを蒸留水で溶解し、全量１，０００ｍ／とする。

（２）　　試験方法試験管に検体用、標準液用、試薬ブランク用として、そ
れぞれに■の測定液１ｍｌを取り、３７Ｃで２〜３分間
予備加温する。次いで検体用には血清２０μｌ、標準液
用には標準液２０μ！、試薬ブランク用には水２０μｌ
（水は省略してもよい）加え、混合後、３７°Ｃで２０
分間加温し発色ぎせるっ更に書々に反応停止液２ｍ／を
加えてから波長５５０ｎｍで吸光度を測定し、下記の式
よりトランスアミナーゼ（ＧＯＴ又はＧＰＴ）値を求め
る。

０、Ｄ＝吸光度実施９例５（１）試薬の調製 ■　トリグリセ−ライド測定液リポプロティンリパーゼ１８０，０ＯＯＩＵ、グリセロ
ールキナーゼ１００ＩＵ、α−グリセロリン酸オキシダ
ーゼ２，２００ＩＵ、パーオキシダーゼ１，７００ＩＵ
、　４−アミノアンチピリン１５０ｍｇ、アデノシント
リリン酸二ナトリウム４８０ｍｇ、塩化マグネシウム六
水塩４ｇ、トライトンＸ−１００４ｇ、Ｎ−（２−１ル
ポキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン塩酸
塩２４０ｍｇを５０ｍＭ１リスヒドロキシメチルアミノ
メタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７６）で全量１，０００ｍ／
になるように溶解する。

０゛・　　標準液グリセリン（１０２，６＃を蒸留水に溶解し、全量１０
０ｍ　ｌとする。

（２）試験方法試験管に血清２０μｍｆｃ取り、実施例１の（２）の試
験方法と同様の操作を行ない３７°Ｃで１５分間加温し
、発色後、波長５５０ｎｍで吸光度を測定し、下記の式
よりトリグリセライド値を求める。

トリグリセライド値（ｍｇ／ｄｉ）標準液０．Ｄ−試薬ブランク０．ＤＯ、Ｉ）二吸光度以上の実施例によって得られる感度及び呈色後の安定性
は下表のとおりである。

表２

Claims

【特許請求の範囲】パーオキシダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリン
と次の一般式（１）（式中、Ｒ１はＨ，ＣＨ８、Ｃ２Ｆ■５又は０ＣＨ８、
Ｒ２ば１１、ＣＨ，又はＣ２Ｈ５、′ＦＬ８はＣＨ２Ｃ
Ｈ２Ｃ００Ｎ−ＬＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯＯＨ，ＣＨ
２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２０Ｈ。ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ８）ＣＯＯＨ又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２
Ｃ００Ｈを示す）で表わされる化合物とから成る着色性
化合物に変化する組合わせ試薬を用いることを特徴とす
る過酸化水素の定量方法。