JPS5883964A - 補体結合繊維 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト又は動物の組織、細胞、もしくは体液中の
成分と時異的に結合する繊維に関する。

補体はヒト又は動物中の血液中に存在する蛋白質であり
、抗原抗体複合体や凝集したイムノグロブリンＧまたは
細菌、細菌毒素などにより活性化される。活性化された
補体の一部に対して、ある種の病気の患者には抗体が生
じることが知られている。また活性化された補体の一部
に対して特異的に強い親和力を持つ部位（補体リセプタ
ー）を持つ細胞があり、特にリンパ球では補体リセプタ
ーを有する細胞の割合から、８９７７球の割合を測定し
、検査、診断に利用することが試みられている。さらに
、感染症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患や悪性腫瘍
など局所での組織学的変化に伴う補体リセブターの変化
についての研究も試みられている。

特にリンパ球をＴ細胞とＢ細胞とに分離し、その比率を
測定したり、またそれぞれの機能を検討したりすること
は診断上重要となりつつある。さらに、リンパ球の分画
をおこない、一部のみを体内に戻すなどして病気の治療
をおこなうことも検討されつつあり、その第一ステップ
として、Ｔ、Ｂ！Ｊンパ球を迅速にしかも効率よく分離
する技術の確立が望まれている。

リンパ球をＴ細胞とＢ細胞とに分離する方法としては、
大別すると、２種類の方法がある。

１つは、各リンパ球の物理化学的性状の違いを利用して
分離する方法で、粘着能、表面荷電、免疫抑制剤などの
薬剤やリンフ才力イン、またはＸ線に対する感受性の違
いを利用するものである。たとえば、ナイロン繊維に対
する吸着性の差異を利用した分離法などがこれにあたる
。

他の１つは、各リンパ球の細胞表面の免疫学的違いを利
用して分離する方法で、各々の細胞表面にある各々に特
異的な抗原、リセプター免疫グロブリンなどの存在の有
無により分離する方法である。たとえば、膜免疫螢光抗
体を用いて細胞を機器により分別する方法、ロゼツト形
成反応をおこなわせた後で遠心分離をおこない細胞を分
別する方法などがある。

しかしながら、物理化学的性状の違いでＴ、Ｂ細胞を分
別する方法では、２種のリンパ球の性状があまりに似て
いて、定量的な分別は不可能である。したがって、繊維
やゲルを用いた細胞の分離法は迅速で簡便な分離法では
あるが、分離効率などに問題がある。また、生物学的な
違いを利用する方法は、機器が高価であるとか、操作が
煩雑であるなどの欠点を有している。

本発明者らは、補体リセプターを有する細胞もしくは、
補体成分と特異的に結合する物質を簡便に効率よく分離
することを目的として、イムノグロブリンもしくは糖を
共有結合で固定化した繊維を補体と反応させることで、
補体結合繊維を作製し、補体リセプター保有細胞が特異
的に吸着することを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は糖またはイムノグロブリンを固定化
した繊維と補体を補体結合反応により結合させてなる補
体結合繊維に関する。

本発明の特徴の一つは、生物学的に活性な繊維を作製し
たことである。従来の繊維やゲルを用いた細胞の分離法
は、各々の細胞の物理化学的性状のみを利用した方法で
あり、ある種の細胞のみを特異的に吸着する方法ではな
い。本発明による補体結合繊維は、従来の繊維を用いた
細胞の分離法に特異性を付与した効率のよい細胞分離用
繊維である。したがって、簡便、迅速、高効率に補体リ
セプターの有無により細胞の分離をおこなうことができ
る。

本発明で用いる繊維としては、アクリロニトリル系繊維
、セルロース系繊維、ポリ（モノビニル芳香族化合物）
系繊維などがある。繊維の太さは特に限定されないが、
操作上平均直径１μｍから１００μｍの範囲であること
が好ましい。

本発明では補体成分を結合させる為の第一段階として、
繊維に、糖もしくはイムノグロブリンを固定化させ、糖
結合繊維もしくはイムノグロブリン結合繊維とする。こ
のうち、糖結合繊維と血清とを混合すると補体の第２経
路すなわち、補体第６成分の活性化に始まる補体の活性
化経路が活性化され補体結合繊維ができる。補体の第２
経路を活性化する物質として、ザイモサン、イヌリン、
菌体外毒素、コプラ毒、ＩｆＥ１尿酸などが知られてい
る。我々は単糖、２糖、６糖、オリゴ糖または多糖を結
合させた繊維と新鮮なヒトまたは動物の血清とを混合す
ることによっても、補体の第２経路が活性化され、補体
が結合した繊維が得られることを見出した。

繊維に結合させる糖としては単糖でも多糖でもかまわな
いし、もしくはアミノ基、カルボキシル基、スルヒドリ
ル基、スルホン酸基、Ｎ−アセチル基、などの基をそれ
らに導入した糖類でもかまわない。しかし、活性化した
補体を繊維に効率よく結合させた補体結合繊維を調製す
るには、単糖、２糖、３糖などの低分子量の糖類が好ま
しい。

本発明のイムノグロブリンは補体を活性化するものであ
れば良く、特にイムノグロブリンＧ（ＩｆＧ）またはイ
ムノグロブリンＭ（ＩｒＭ）が好ましい。ＩｆＧ、Ｉｒ
Ｍとしては遊離のＩｒＧまたはＩｒＭの他に、熱により
凝集した凝集イムノグロブリンＧ（ＡＧＧ）または凝集
イムノグロブリンＭ（ＡＧＭ）ももちろん使用可能であ
る。ＩｒＧもしくはＩｒＭ結合繊維を血清と混合するこ
とによって、補体の古典経路、すなわち補体の第１成分
から順に活性化される経路が活性化され、補体結合繊維
ができる。

糖およびＩｆＧ、’ＩｆＭの繊維への固定化方法は、繊
維にアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキ
シル基、アミド基などの官能基を導入し、これらを用い
て化学結合により固定化させる方法がある。たとえばア
クリロニトリルを主成分とする繊維においてニトリル基
をアミノ基に還元し、これを利用して固定化することな
どができる。

またモノビニル芳香族化合物を成分とする繊維において
は、特開昭５２−１２０９８５および特開昭５４−１３
５４９７に記したような方法でアミンやカルボン酸など
の官能基を導入することができる。

固定化方法は具体的には、糖の水酸基を過ヨーソ酸で酸
化してアルデヒド基とし、繊維のアミノ基と結合させる
方法、逆に糖にアミノ基が存在する場合には繊維の水酸
基を過ヨーソ酸やシアン化臭素で活性化する方法、繊維
のカルボキシル基とカルボジイミドで結合させる方法、
繊維のエポキシ基と結合させる方法などがある。

またＩｒＧ　、　ＩｆＭと繊維との結合も同様にして、
ＩｆＧ　、　ＩｒＭのアミン基、カルボキシル基などを
利用しておこなえる。繊維から糖やＩｆＧ　、　ＩｒＭ
が遊離し、補体結合繊維の結合能の低下を避けるには、
糖およびＩｒＧ　、　ＩｒＭの繊維への固定化方法とし
て特に共有結合が好ましい。力おここで作製した糖結合
繊維は糖と特異的に結合する蛋白質として知られるレク
チンの精製にも利用できる。

次に糖結合繊維またはＩｐＧ　、ＩｒＭ結合繊維とヒト
又は動物の補体とを補体結合反応で結合させ、補体結合
繊維を作製する。補体の結合には補体結合反応に必要な
成分を混合して使用してもよいが、補体活性が充分な血
清をそのまま使用してもかまわない。また、補体源とし
て、動物種を異にしたり、使用する血清中の補体のある
成分に対して特異的に作用する薬剤などを混合すること
により、各種の補体結合微粒子を作製することが可能と
なる。

補体成分の０６とその成分である０　３ｂ　、　０３ｂ
ｉ。

０３ｄなどを結合した繊維は、補体リセプターを有する
細胞たとえば８９７７球と結合するし、まだある種の病
気の患者血清中に存在するＯ！＋ｂｉと特異的に反応す
るイムノコングルチニンと称する物質とも結合する。し
たがって補体結合繊維は治療診断に有効であると考えら
れる。

本発明の補体結合繊維は短時間で特異性よく補体リセプ
ター保有細胞と非保有細胞とを分離することができ、細
胞になんら傷害を与えることもない。しかも長期間の保
存が可能であり、繰り返して使用することもできる。

以下、実施例をあげ、本発明を具体的に説明する。

実施例１　　マウスリンパ球の分離 （ポリアクリロニトリル繊維の還元） ポリアクリロニトリル繊維（登録商標°゛トレロン′）
１５デニール（４３μｍ）１ｏｒをメタノール中で一晩
還流煮沸して繊維油剤を除去した。油剤除去繊維０．６
５ｆを１００７！の無水エーテルに分散させ、ＬｉＡｌ
Ｈ４０，２５ｆを加えて３０℃で６時間反応させた。反
応後、酢酸エチルで繊維を洗浄した後、ＰＢＳでさらに
洗浄し、アミノ化ポリアクリロニトリル繊維を調製した
。

（Ｄ−グルコースアミン固定化繊維の調製）５０ｍｌの
蒸留水に０．５ｆのアミノ化ポリアクリロニトリル繊維
を分散するように攪拌しながら２５％グルタルアルデヒ
ド１，５ｆを加え、３０℃で６時間反応させた。充分量
の水でグルタルアルデヒド化繊維を洗浄した後、１０％
のＤ−グルコースアミンを含有するＰＢ８５０−にグル
タルアルデヒド化繊維０．５ｔを加え、′５０℃で２０
時間反応させた後ＰＢＳで洗浄しＤ−グルコースアミン
結合繊維を調製した。

Ｄ−グルコースアミンの結合はコンカナバリンＡ　−５
ｅｐｈａｒｏｓｅ’ゝ（ファルマシア）粒子が繊維に吸
着することを顕微鏡下で観察し、確認した。

（マウス補体結合繊維の調製） Ｄ−グルコースアミン固定化繊維０．５２と、マウス血
清をＰＨ７，２の０．１５モル生理リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ　）で１０倍に稀釈した溶液５ｍ７！とを混合し、３
７℃で１５分間反応させ、ＰＢＳで繊維を洗浄し、マウ
ス補体結合繊維を調製した。

（マウスリンパ球の分離） マウスからとり出した牌臓を４片に切り、１０チの牛胎
児血清を含有した細胞培養用培地ＰＢＭ１１６４０（以
下培地液とする。）中で氷冷しながら、ガラス面で圧迫
して破砕し、細胞浮遊液をつくった。ピペッティング操
作でさらに細かくし、試験管に移し、５分４℃に静置し
、上清を取り、ナイロンガーゼで組織片の残りを除去し
た後、冷却遠心機で８００−ｒｐｍで５分間牌細胞を沈
降させる操作を２回繰り返し、培地液による細胞の洗浄
をおこなった。

洗浄した細胞を培地液に分散しポリスチレンのシャーレ
中に２５℃で２０分おいて、マクロファージをシャーレ
に吸着させて除去しマウスリンパ球浮遊液を得た。１０
６のリンパ球を培地液１−に分散したリンパ球浮遊液を
０．５ｆの補体結合繊維を充填したカラムに注入し液が
完全に充填繊維に浸透し終った後にカラムの出口をふさ
ぎ′５７℃で３０分間カラムを静置し、補体リセブター
を表面に有するリンパ球すなわち８９７７球と補体結合
繊維とを結合させた。次に培地液を適当量をゆっくりと
流すことでカラムを洗浄し、繊維に吸着していないリン
パ球を洗浄除去した。次にカラムに勢いよく培地液を注
入する操作によって、吸着したリンパ球の溶出をおこな
った。

（リンパ球のサブポピユレーション試験）カラムに注入
したリンパ球浮遊液および溶出させたリンパ球浮遊液に
ついて、補体結合ヒツジ赤血球（ＢＡＯと略す）による
ロゼツト形成試験をおこなった。ロゼツトを形成した細
胞をＢ細胞、しなかった細胞をＴ細胞として比率を求め
た結果を表１に示した。表１かられかるように、補体結
合繊維にはＢ　ＩＪンパ球が特異的に吸着し、本繊維に
よシ容易にＴ、Ｂ細胞の分離濃縮が可能であることが示
された。

表１　マウスリンパ球の分離結果 実施例２　　マウスリンパ球の分離 （ポリアクリロニトリル繊維の加水分解）特願昭５５−
１６１３７２に記したようにポリアクリロニトリル繊維
（登録商標゛トレロン”）１５デニール（４６μｍ）の
表面を加水分解した。

すなわち、メタノールで繊維油剤を洗浄され℃で１時間
還流をおこないニトリル基の加水分解をおこなった。水
で洗浄し、アミド基を有したポリアクリロニトリル繊維
を得た。

（４ｆＭ固定化繊維の調製） アミド化ポリアクリロニトリル繊維０，５ｆを水５０−
に分散させ、２５％グルタルアルデヒド１．５２を加え
、３０℃で２時間反応させた後、水洗し、アルデヒド化
繊維を得た。次にＩＴｎＩＦ／ｍ７！のＴ、ｔＭを含有
するＰＢＳ溶液１０−にグルタルアルデヒド化繊維０．
５２を加え、３０℃で２時間反応させた後、牛血清アル
ブミンを１０１ｎ１／ｆｎ！、となるように加え、さら
に２時間反応させた。ＰＢＳで繊維を洗浄し、ＩｆＭ固
定化繊維を得た。

（マウスリンパ球の分離） 実施例１と同様にして、補体を補体結合反応により、ア
クリロニトリル繊維に結合させ、マウス補体結合繊維を
作製した。

このマウス補体結合繊維を用いて、実施例１と同様にし
てマウスリンパ球の分離をおこ々い、ＢＡＯロゼツト形
成試験によりＴ、Ｂ細胞の比率を求めた。表２に示した
結果かられかるように、本繊維によりＴ　、　Ｂ　ＩＪ
ンパ球の分離が可能であることが示された。

表２　マウスリンパ球分離 実施例３　　ヒトリンパ球の分離 （ヒト補体結合繊維の調製） 実施例１と同様にして調製したＤ−グルコ−スアミン固
定化繊維０．５ｆとヒト血清５ｆｎ！、とを混合し、３
７℃で１５分間反応させ、ＰＢＳで繊維を洗浄し、ヒト
補体結合繊維を調製した。

（ヒトリンパ球の分離） ポリスチレン製の試験管中でヘパリン加末梢血液に６倍
量のＰＢＳを加え、全量の％量のリンホプレツプ（第一
化学薬品）を重層し、界面が４００Ｇとなるようにして
、３０分等温で遠心し、中間層のリンパ球分画を採取し
、ポリスチレン製の試験管に入れ、パラフィルムで口を
ふさぎ、反転させて、細胞を分散させた。管底部が２４
０Ｇとなるように１０分間遠心し、血小板を除去し、さ
らに細胞をほぐし、十分量のＰＢＳを加えて、１６０Ｇ
で１０分間遠心する操作を２回繰り返した後に、リンパ
球を最終濃度１０６コ／−になるように培地液に分散さ
せ、リンパ球浮遊液を調製した。

実施例１と同様にしてヒト補体結合繊維によシリンパ球
の分離をおこなった後、ＥＡＣロゼツト形成試験により
、Ｔ、Ｂ細胞の比率を求めた。表３に示した結果かられ
かるように、本繊維によりＴ　、　Ｂ　ＩＪンパ球の分
離が可能であることが示された。

表６　ヒトリンパ球分離

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖またはイムノグロブリンを固定化させた繊維に
   、補体を補体結合反応により結合させてなる補体結合繊
   維。