JPH03993B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト又は動物の組織、細胞、もしくは
体液中の成分と時異的に結合する繊維に関する。 補体はヒト又は動物中の血液中に存在する蛋白
質であり、抗原抗体複合体や凝集したイムノグロ
ブリンＧまたは細菌、細菌毒素などにより活性化
される。活性化された補体の一部に対して、ある
種の病気の患者には抗体が生じることが知られて
いる。また活性化された補体の一部に対して特異
的に強い親和力を持つ部位（補体リセプター）を
持つ細胞があり、特にリンパ球では補体リセプタ
ーを有する細胞の割合から、Ｂリンパ球の割合を
測定し、検査、診断に利用することが試みられて
いる。さらに、感染症、自己免疫疾患、アレルギ
ー性疾患や悪性腫瘍など局所での組織学的変化に
伴う補体リセプターの変化についての研究も試み
られている。 特にリンパ球をＴ細胞とＢ細胞とに分離し、そ
の比率を測定したり、またそれぞれの機能を検討
したりすることは診断上重要となりつつある。さ
らに、リンパ球の分画をおこない、一部のみを体
内に戻すなどして病気の治療をおこなうことも検
討されつつあり、その第一ステツプとして、Ｔ，
Ｂリンパ球を迅速にしかも効率よく分離する技術
の確立が望まれている。 リンパ球をＴ細胞とＢ細胞とに分離する方法と
しては、大別すると、２種類の方法がある。１つ
は、各リンパ球の物理化学的性状の違いを利用し
て分離する方法で、粘着能、表面荷電、免疫抑制
剤などの薬剤やリンフオカイン、またはＸ線に対
する感受性の違いを利用するものである。たとえ
ば、ナイロン繊維に対する吸着性の差異を利用し
た分離法などがこれにあたる。他の１つは、各リ
ンパ球の細胞表面の免疫学的違いを利用して分離
する方法で、各々の細胞表面にある各々に特異的
な抗原、リセプター免疫グロブリンなどの存在の
有無により分離する方法である。たとえば、膜免
疫螢光抗体を用いて細胞を機器により分別する方
法、ロゼツト形成反応をおこなわせた後で遠心分
離をおこない細胞を分別する方法などがある。 しかしながら、物理化学的性状の違いでＴ，Ｂ
細胞を分別する方法では、２種のリンパ球の性状
があまりに似ていて、定量的な分別は不可能であ
る。したがつて、繊維やゲルを用いた細胞の分離
法は迅速で簡便な分離法ではあるが、分離効率な
どに問題がある。また、生物学的な違いを利用す
る方法は、機器が高価であるとか、操作が煩雑で
あるなどの欠点を有している。 本発明者らは、補体リセプターを有する細胞も
しくは、補体成分と特異的に結合する物質を簡単
に効率よく分離することを目的として、イムノグ
ロブリンもしくは糖を共有結合で固定化した繊維
を補体と反応させることで、補体結合繊維を作製
し、補体リセプター保有細胞が特異的に吸着する
ことを見い出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は糖またはイムノグロブリン
を固定化させた繊維に、補体を補体結合反応によ
り結合させてなる細胞分離用補体結合繊維に関す
る。 本発明の特徴の一つは、生物学的に活性な繊維
を作製したことである。従来の繊維やゲルを用い
た細胞の分離法は、各々の細胞の物理化学的性状
のみを利用した方法であり、ある種の細胞のみを
特異的に吸着する方法ではない。本発明による補
体結合繊維は、従来の繊維を用いた細胞の分離法
に特異性を付与した効率のよい細胞分離用繊維で
ある。したがつて、簡便、迅速、高効率に補体リ
セプターの有無により細胞の分離をおこなうこと
ができる。 本発明で用いる繊維としては、アクリロニトリ
ル系繊維、セルロース系繊維、ポリ（モノビニル
芳香族化合物）系繊維などがある。繊維の太さは
特に限定されないが、操作上平均直径1μmから
100μmの範囲であることが好ましい。 本発明では補体成分を結合させる為の第一段階
として、繊維に、糖もしくはイムノグロブリンを
固定化させ、糖結合繊維もしくはイムノグロブリ
ン結合繊維とする。このうち、糖結合繊維と血清
とを混合する補体の第２経路すなわち、補体第３
成分の活性化に始まる補体の活性化経路が活然化
された補体結合繊維ができる。補体の第２経路を
活性化する物質として、ザイモサン、イヌリン、
菌体外毒素、コブラ毒、IgE、尿酸などが知られ
ている。我々は単糖、２糖、３糖、オリゴ糖また
は多糖を結合させた繊維と新鮮なヒトまたは動物
の血清とを混合することによつても、補体の第２
経路が活性化され、補体が結合した繊維が得られ
ることを見出した。繊維に結合させる糖としては
単糖でも多糖でもかまわない、もしくはアミノ
基、カルボキシル基、スルヒドリル基、スルホン
酸基、Ｎ−アセチル基、などの基をそれらに導入
した糖類でもかまわない。しかし、活性化した補
体を繊維に効率よく結合させた補体結合繊維を調
製するには、単糖、２糖、３糖などの低分子量の
糖類が好ましい。 本発明のイムノグロブリンは補体を活性化する
ものであれば良く、特にイムノグロブリンＧ
（IgG）またはイムノグロブリンＭ（IgM）が好ま
しい。IgG，IgMとしては遊離のIgGまたはIgM
の他に、熱により凝集したイムノグロブリンＧ
（AGG）または凝集イムノグロブリンＭ（AGM）
ももちろん使用可能である。IgGもしくはIgM結
合繊維を血清と混合することによつて、補体の古
典経路、すなわち補体の第１成分から順に活性化
される経路が活性化され、補体結合繊維ができ
る。 糖およびIgG，IgMの繊維への固定化方法は、
繊維にアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、
ヒドロキシル基、アミド基などの官能基を導入
し、これらを用いて化学結合により固定化させる
方法がある。たとえばアクリロニトリルを主成分
とする繊維においてニトリル基をアミノ基に還元
し、これを利用して固定化することなどができ
る。 またモノビニル芳香族化合物を成分とする繊維
においては、特開昭52−120985および特開昭54−
135497に記したような方法でアミンやカルボン酸
などの官能基を導入することができる。 固定化方法は具体的には、糖の水酸基を過ヨー
ソ酸で酸化してアルデヒド基とし、繊維のアミノ
基と結合させる方法、逆に糖にアミノ基が存在す
る場合には繊維の水酸基を過ヨーソ酸やシアン化
臭素で活性化する方法、繊維のカルボキシル基と
カルボジイミドで結合させる方法、繊維のエポキ
シ基と結合させる方法などがある。またIgG，
IgMと繊維との結合も同様にして、IgG，IgMの
アミノ基、カルボキシル基などを利用しておこな
える。繊維から糖やIgG，IgMが遊離し、補体結
合繊維の結合能の低下を避けるには、糖および
IgG，IgMの繊維への固定化方法として特に共有
結合が好ましい。なおここで作製した糖結合繊維
は糖と特異的に結合する蛋白質として知られるレ
クチンの製精にも利用できる。 次に糖結合繊維またはIgG，IgM結合繊維とヒ
ト又は動物の補体とを補体結合反応で結合させ、
補体結合繊維を作製する。補体の結合には補体結
合反応に必要な成分を混合して使用してもよい
が、補体活性が充分な血清をそのまま使用しても
かまわない。また、補体源として、動物種に異に
したり、使用する血清中の補体のある成分に対し
て特異的に作用する薬剤などを混合することによ
り、各種の補体結合微粒子を作製することが可能
となる。 補体成分のC3とその成分であるC3b，C3bi，
C3dなどを結合した繊維は、補体リセプターを有
する細胞たとえばＢリンパ球と結合するし、また
ある種の病気の患者血清中に存在するC3biと特
異的に反応するイムノコングルチニンと称する物
質とも結合する。したがつて補体結合繊維は治療
診断に有効であると考えられる。 本発明の補体結合繊維は短時間で特異性よく補
体リセプター保有細胞と非保有細胞とを分離する
ことができ、細胞になんら傷害を与えることもな
い。しかも長時間の保存が可能であり、繰り返し
て使用することもできる。 以下、実施例をあげ、本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ マウスリンパ球の分離 （ポリアクリロニトリル繊維の還元） ポリアクリロニトリル繊維（登録商標“トレロ
ン”）15デニール（43μm）10ｇをメタノール中で
一晩還流煮沸して繊維油剤を除去した。油剤除去
繊維0.65ｇを100mlの無水エーテルに分散させ、
LiAlH₄0.25ｇを加えて30℃で３時間反応させた。
反応後、酢酸エチルで繊維を洗浄した後、PBS
でさらに洗浄し、アミノ化ポリアクリロニトリル
繊維を調製した。 （Ｄ−グルコースアミン固定化繊維の調製） 50mlの蒸留水に0.5ｇのアミノ化ポリアクリロ
ニトリル繊維を分散するように撹拌しながら25％
グルタルアルデヒド1.5ｇを加え、30℃で３時間
反応させた。充分量の水でグルタルアルデヒド化
繊維を洗浄した後、10％のＤ−グルコースアミン
を含有するPBS50mlにグルタルアルデヒド化繊
維0.5ｇを加え、30℃で20時間反応させた後PBS
で洗浄しＤ−グルコースアミン結合繊維を調製し
た。 Ｄ−グルコースアミンの結合は“コンカナバリ
ンＡ−sepharose”（フアルマシア）粒子が繊維
に吸着することを顕微鏡下で観察し、確認した。 （マウス補体結合繊維の調製） Ｄ−グルコースアミン固定化繊維0.5ｇとマウ
ス血清をPH7.2の0.15モル生理リン酸緩衝液
（PBS）で10倍の稀釈した溶液５mlとを混合し、
37℃で15分間反応させ、PBSで繊維を洗浄し、
マウス補体結合繊維を調製した。 （マウスリンパ球の分離） マウスからとり出した脾臓を４片に切り、10％
の牛胎児血清を含有した細胞培養用培地
PRMI1640（以下培地液とする。）中で氷冷しなが
ら、ガラス面で圧迫して破砕し、細胞浮遊液をつ
くつた。ピペツテイング操作でさらに細かくし、
試験管に移し、５分４℃に静置し、上清を取り、
ナイロンガーゼで組織片の残りを除去した後、冷
却遠心機で800rpmで５分間脾細胞を沈降させる
操作を２回繰り返し、培地液による細胞の洗浄を
おこなつた。 洗浄した細胞を培地液に分離し、ポリスチレン
のシヤーレ中に25℃で20分において、マクロフア
ージをシヤーレに吸着させて除去しマウスリンパ
球浮遊液を得た。10⁶のリンパ球を培地液１mlに
分散したリンパ球浮遊液を0.5ｇの補体結合繊維
を充填したカラムに注入し液が完全に充填繊維に
浸透し終つた後にカラムの出口をふさぎ、37℃で
30分間カラムを静置し、補体リセプターを表面に
有するリンパ球すなわちＢリンパ球と補体結合繊
維とを結合させた。次に培地液を適当量をゆつく
りと流すことでカラムを洗浄し、繊維に吸着して
いないリンパ球を洗浄除去した。次にカラムに勢
いよく培地液を注入する操作によつて、吸着した
リンパ球の溶出をおこなつた。 （リンパ球のサブポピユレーシヨン試験） カラムに注入したリンパ球浮遊液および溶出さ
せたリンパ球浮遊液について、補体結合ヒツジ赤
血球（EACと略す）によるロゼツト形成試験を
おこなつた。ロゼツトを形成した細胞をＢ細胞、
しなかつた細胞をＴ細胞として比率を求めた結果
を表１に示した。表１からわかるように、補体結
合繊維にはＢリンパ球が特異的に吸着し、本繊維
により容易にＴ，Ｂ細胞の分離濃縮が可能である
ことが示された。

【表】 実施例２ マウスリンパ球の分離 （ポリアクリロニトリル繊維の加水分解） 特願昭55−161372に記したようにポリアクリロ
ニトリル繊維（登録商標“トレロン”）15デニー
ル（43μm）の表面を加水分解した。 すなわち、メタノールで繊維油剤を洗浄された
ポリアクリロニトリル繊維1.6ｇをターシヤリー
ブタノール50ｇ中でKOH10ｇと混ぜ、95℃で１
時間還流をおこないニトリル基の加水分解をおこ
なつた。水で洗浄し、アミド基を有したポリアク
リロニトリル繊維を得た。 （IgM固定化繊維の調製） アミドポリアクリロニトリル繊維0.5ｇを水50
mlに分散させ、25％グルタルアルデヒド1.5ｇを
加え、30℃で２時間反応させた後、水洗し、アル
デヒド化繊維を得た。次に１mg／mlのIgMを含有
するPBS溶液10mlにグルタルアルデヒド化繊維
0.5ｇを加え、30℃で２時間反応させた後、牛血
清アルブミンを10mg／mlとなるように加え、さら
に２時間反応させた。PBSで繊維を洗浄し、IgM
固定化繊維を得た。 （マウスリンパ球の分離） 実施例１と同様にして、補体を補体結合反応に
より、アクリロニトリル繊維に結合させ、マウス
補体結合繊維を作製した。 このマウス補体結合繊維を用いて、実施例１と
同様にしてマウスリンパ球の分離をおこない、
EACロゼツト形成試験によりＴ，Ｂ細胞の比率
を求めた。表２に示した結果からわかるように、
本繊維によりＴ，Ｂリンパ球の分離が可能である
ことが示された。

【表】 実施例３ ヒトリンパ球の分離 （ヒト補体結合繊維の調製） 実施例１と同様にして調製したＤ−グルコース
アミン固定化繊維0.5ｇとヒト血清５mlとを混合
し、37℃で15分間反応させ、PBSで繊維を洗浄
し、ヒト補体結合繊維を調製した。 （ヒトリンパ球の分離） ポリスチレン製の試験管中でヘパリン加末梢血
液に３倍量のPBSを加え、全量の1/2量のリンホ
プレツプ（第一化学薬品）を重層し、界面が
400Gとなるようにして、30分等温で遠心し、中
間層のリンパ球分画を採取し、ポリスチレン製の
試験管に入れ、パラフイルムで口をふさぎ、反転
させて、細胞を分散させた。管底部が240Gとな
るように10分間遠心し、血小板を除去し、さらに
細胞をほぐし、十分量のPBSを加えて、160Gで
10分間遠心する操作を２回繰り返した後に、リン
パ球を最終濃度10⁶コ／mlになるように培地液に
分散させ、リンパ球浮遊液を調製した。 実施例１と同様にしてヒト補体結合繊維により
リンパ球の分離をおこなつた後、EACロゼツト
形成試験により、Ｔ，Ｂ細胞の比率を求めた。表
３に示した結果からわかるように、本繊維により
Ｔ，Ｂリンパ球の分離が可能であることが示され
た。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 糖またはイムノグロブリンを固定化させた繊
   維に、補体を補体結合反応により結合させてなる
   細胞分離用補体結合繊維。