JPS5876084A - 細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養方法Info
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- JPS5876084A JPS5876084A JP56172499A JP17249981A JPS5876084A JP S5876084 A JPS5876084 A JP S5876084A JP 56172499 A JP56172499 A JP 56172499A JP 17249981 A JP17249981 A JP 17249981A JP S5876084 A JPS5876084 A JP S5876084A
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- Japan
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- cells
- culture
- film
- culture solution
- regenerated cellulose
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体外で動物の付着性細胞を培養する方法に関
し、詳しくは一方向の水膨潤率が１．０５以上でかつそ
れと直角方向の水膨潤率が１．００以下である再生セル
ロースフィルムを培養基質として動物の付・理性細胞を
培養することを特徴とする細胞培養方法に関する。
し、詳しくは一方向の水膨潤率が１．０５以上でかつそ
れと直角方向の水膨潤率が１．００以下である再生セル
ロースフィルムを培養基質として動物の付・理性細胞を
培養することを特徴とする細胞培養方法に関する。
細胞培養はウィルスワクチン、インターフェロンなどの
抗ウィルス剤又はホルモンなどの生物薬品の製造には欠
く仁とができない。ポリオウィルス、風疹ウィルス、は
しかウィルスなどの生ワクチンの生産にはヒト由来の正
常細胞を用いるべきであるとされているが、このヒト由
来正常細胞などの付着性細胞の培養にはその支持体とな
る培養基質の存在が必須である。これまでその培養基質
の材質としては、細胞に対して無毒性でかつ培養液によ
って膨潤、溶解、腐食されないこと、滅菌操作が容易で
かつそれにより変形、変性しないこと、洗剤によって変
性しないこと、細胞の付着性、伸展性及び増殖性が良好
でしかも均一であることなどの性質を有するものである
ことが必要とされ、例えば、ポリスチレンの平板上にポ
ＩＪ Ｌ ！Ｊレジンコーティングしたものなどが
好ましく使用されている。しかしながら、培養された細
胞があらゆる方向に均一に増殖することは、例えば増殖
し九神経細胞などの細胞を用いてヘビ毒などの神経毒又
祉薬剤の毒性試験を行なうには必ずしも好ましくない。
抗ウィルス剤又はホルモンなどの生物薬品の製造には欠
く仁とができない。ポリオウィルス、風疹ウィルス、は
しかウィルスなどの生ワクチンの生産にはヒト由来の正
常細胞を用いるべきであるとされているが、このヒト由
来正常細胞などの付着性細胞の培養にはその支持体とな
る培養基質の存在が必須である。これまでその培養基質
の材質としては、細胞に対して無毒性でかつ培養液によ
って膨潤、溶解、腐食されないこと、滅菌操作が容易で
かつそれにより変形、変性しないこと、洗剤によって変
性しないこと、細胞の付着性、伸展性及び増殖性が良好
でしかも均一であることなどの性質を有するものである
ことが必要とされ、例えば、ポリスチレンの平板上にポ
ＩＪ Ｌ ！Ｊレジンコーティングしたものなどが
好ましく使用されている。しかしながら、培養された細
胞があらゆる方向に均一に増殖することは、例えば増殖
し九神経細胞などの細胞を用いてヘビ毒などの神経毒又
祉薬剤の毒性試験を行なうには必ずしも好ましくない。
本抛明者らは動物の付着性細胞を効果的に一方向に配列
付着させ増殖させる培養方法につき鋭意研究を重ねた結
果、最も高い水膨潤率を示す方向の水Ｍｅａ率が１．０
５以上でかつそれと直角方向の水！＃＠率が１．００以
下である再生セルロースフィルムを培養基質として培養
を行なった場合には、動物の付着性細胞が該培養基質の
一方向に良好に配列付着し、しかもその表面上で該方向
に効果的に増殖することを見出し、本発明を完成するに
至った。
付着させ増殖させる培養方法につき鋭意研究を重ねた結
果、最も高い水膨潤率を示す方向の水Ｍｅａ率が１．０
５以上でかつそれと直角方向の水！＃＠率が１．００以
下である再生セルロースフィルムを培養基質として培養
を行なった場合には、動物の付着性細胞が該培養基質の
一方向に良好に配列付着し、しかもその表面上で該方向
に効果的に増殖することを見出し、本発明を完成するに
至った。
本発明の方法は動物の槍々の付着性細胞の大量培養に使
用できる他、％に上記の一方向に配列・連結して増殖し
た細胞が得られるという特徴を生かして毒性試験に用い
る細胞の工業的製造に適している。
用できる他、％に上記の一方向に配列・連結して増殖し
た細胞が得られるという特徴を生かして毒性試験に用い
る細胞の工業的製造に適している。
本発明の方法において用いる再生セルロースフィルムは
、通常の銅アンモニア法又はビスコース法のいずれの方
法によって製造された再生セルロースをフィルムとした
ものでもよいが、細胞の付着性、伸展性又は増殖性の点
から鋼アンモニア法によって製造された再生セルロース
をフィルムとしたものがよシ好ましい。その再生セルロ
ースフィルムは最も塙い水膨潤率を示す方向（以下、幅
方向と称す）の水膨潤率が１．０５以上でかつそれと直
角方向（以下、畏さ方向と称す）の水Ｎｅ＠率が１．０
０以下であることが必要であシ、かがるフィルムは例え
ば、フィルム原液を細隙から押し出しそれを凝固する際
に長さ方向に延伸することにより製造される。また本発
明の方法において用いる再生セルロースフィルムは培養
時の細胞の配列性の点から、幅方向の水膨潤率が１．０
５〜１．１０でありかつ長さ方向の水膨潤率が０．９５
〜ｉ、ｏ。
、通常の銅アンモニア法又はビスコース法のいずれの方
法によって製造された再生セルロースをフィルムとした
ものでもよいが、細胞の付着性、伸展性又は増殖性の点
から鋼アンモニア法によって製造された再生セルロース
をフィルムとしたものがよシ好ましい。その再生セルロ
ースフィルムは最も塙い水膨潤率を示す方向（以下、幅
方向と称す）の水膨潤率が１．０５以上でかつそれと直
角方向（以下、畏さ方向と称す）の水Ｎｅ＠率が１．０
０以下であることが必要であシ、かがるフィルムは例え
ば、フィルム原液を細隙から押し出しそれを凝固する際
に長さ方向に延伸することにより製造される。また本発
明の方法において用いる再生セルロースフィルムは培養
時の細胞の配列性の点から、幅方向の水膨潤率が１．０
５〜１．１０でありかつ長さ方向の水膨潤率が０．９５
〜ｉ、ｏ。
であることがより好ましい。なお、水膨潤率Ｆｉ縦５ａ
＋＋横５国のフィルムを２５℃の水に２時間浸漬したの
ちのフィルムと浸漬前のものとの同方向における長さの
比を意味する。
＋＋横５国のフィルムを２５℃の水に２時間浸漬したの
ちのフィルムと浸漬前のものとの同方向における長さの
比を意味する。
本発明の方法において、上記の水膨潤率を有する再生セ
ルロースフィルムを培養基質として使用する場合、予め
エチレンオキシドガス滅菌、ガンマ−線滅菌、オートク
レーブ滅菌などの公知の滅菌方法によシ処理したフィル
ムが用いられる。
ルロースフィルムを培養基質として使用する場合、予め
エチレンオキシドガス滅菌、ガンマ−線滅菌、オートク
レーブ滅菌などの公知の滅菌方法によシ処理したフィル
ムが用いられる。
本発明の方法において、培養基質の表面に付着した動物
細胞は培養液と接触することにょシ成長、増殖する。細
胞はその由来した動物の体温に近い温度に維持されるの
が好ましい。例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物から
誘導された細胞の場合には３５〜３８℃、好ましくは３
７℃前後の温度に維持される。培養基質が細胞の充分に
大きな単層によりおおわれるまで、細胞は成長、増殖を
続ける。培養後、細胞は培養液を除去するために洗滌さ
れ、ついで、例えば培養基質のゆるい攪拌によりトリプ
シン化によってその培養基質から分離され、採取される
。
細胞は培養液と接触することにょシ成長、増殖する。細
胞はその由来した動物の体温に近い温度に維持されるの
が好ましい。例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物から
誘導された細胞の場合には３５〜３８℃、好ましくは３
７℃前後の温度に維持される。培養基質が細胞の充分に
大きな単層によりおおわれるまで、細胞は成長、増殖を
続ける。培養後、細胞は培養液を除去するために洗滌さ
れ、ついで、例えば培養基質のゆるい攪拌によりトリプ
シン化によってその培養基質から分離され、採取される
。
本発明の方法は、生体外でシート状で成長、増殖する哺
乳類、鳥−１両生類、魚類又は昆虫類の動物体から得ら
れる上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織及び血液
、リンパ組織から誘導される付着性細胞を培養するのに
好適である。特に、ヒトを含む哺乳類から誘導される皮
膚、筋肉などの線維芽細胞及び肝臓、腎臓、膵臓などの
上皮細胞を培養するのに好ましく適用される。
乳類、鳥−１両生類、魚類又は昆虫類の動物体から得ら
れる上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織及び血液
、リンパ組織から誘導される付着性細胞を培養するのに
好適である。特に、ヒトを含む哺乳類から誘導される皮
膚、筋肉などの線維芽細胞及び肝臓、腎臓、膵臓などの
上皮細胞を培養するのに好ましく適用される。
上記の培養液は容易に同化しうる炭素源、窒素源及び酸
素源を含むものである。培養液は…が６．５〜８．０の
範囲に調整されたものであシ、金槁塩、例えばアール（
ｉａｒｌｅ）の塩；アスコルビン酸；必須でないア建ノ
酸、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
グリシン、グルタミン酸、プロリン、セリン；又は血清
、例えば牛胎児血清、などを含むことができる。さらに
必要ならば、培養液は抗生物質、例えばペニシリンなど
を含んでいてもよい。好適な培養液としてはイーグル（
Ｅａｇｌｅ）の培養液、フィシ−？ −（Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ）の培養液、ハム（Ｈａｍ）の培養液、リーボビツツ
（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培養液、マツコイ（ｎｌｃｃｏ
ｙ） （Ｄ培養液、＝ ニー −ｖ ン（Ｎｅｕｍａｎ
ｎ）及びタイチル（Ｔｙｔｅｌｌ）Ｏ培養液、バック（
Ｐｕｃｋ） Ｏ培養液、スライム（Ｓｗｉｍ）の培養液
、トロウェル（Ｔｒｏｗｅｌｌ）の培養液、培養液４１
９９、培養液ＮＣＴＣＩＯＱ％培養液ＮＣＴＣ１３５、
培養液ＣＭＲＬ１０６６、培′養液ＲＰＭＩ などを
挙げることができる。
素源を含むものである。培養液は…が６．５〜８．０の
範囲に調整されたものであシ、金槁塩、例えばアール（
ｉａｒｌｅ）の塩；アスコルビン酸；必須でないア建ノ
酸、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
グリシン、グルタミン酸、プロリン、セリン；又は血清
、例えば牛胎児血清、などを含むことができる。さらに
必要ならば、培養液は抗生物質、例えばペニシリンなど
を含んでいてもよい。好適な培養液としてはイーグル（
Ｅａｇｌｅ）の培養液、フィシ−？ −（Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ）の培養液、ハム（Ｈａｍ）の培養液、リーボビツツ
（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培養液、マツコイ（ｎｌｃｃｏ
ｙ） （Ｄ培養液、＝ ニー −ｖ ン（Ｎｅｕｍａｎ
ｎ）及びタイチル（Ｔｙｔｅｌｌ）Ｏ培養液、バック（
Ｐｕｃｋ） Ｏ培養液、スライム（Ｓｗｉｍ）の培養液
、トロウェル（Ｔｒｏｗｅｌｌ）の培養液、培養液４１
９９、培養液ＮＣＴＣＩＯＱ％培養液ＮＣＴＣ１３５、
培養液ＣＭＲＬ１０６６、培′養液ＲＰＭＩ などを
挙げることができる。
培養して得られ九培養基質上の細胞は、通常減面活性剤
を補給した適尚な生理学的緩衝液、例えばメチルセルロ
ースを補給し九リン酸塩緩衝液により洗滌され、ついで
分離、採取される。
を補給した適尚な生理学的緩衝液、例えばメチルセルロ
ースを補給し九リン酸塩緩衝液により洗滌され、ついで
分離、採取される。
以下、冥施例によシ本発明の詳細な説明する。
実施例１
第１表に示す各種の再生セルロースフィルム（厚さ１３
〜２０μ、大きさ３０Ｘ３０ｗ、ＴＯチェタノール水溶
液中に一昼夜浸漬し滅ＩＩ）を培養基質とし、次の方法
によ多細胞培養を行なった。
〜２０μ、大きさ３０Ｘ３０ｗ、ＴＯチェタノール水溶
液中に一昼夜浸漬し滅ＩＩ）を培養基質とし、次の方法
によ多細胞培養を行なった。
直径６ａｌの市販のプラスチックのべ） Ｉ）皿に牛胎
児血清（Ｆｅ２）を１０１６含む／％ Ａ （Ｈａｍ）
の培養液Ｆ１２を入れ、その中にフィルムを敷いた。
児血清（Ｆｅ２）を１０１６含む／％ Ａ （Ｈａｍ）
の培養液Ｆ１２を入れ、その中にフィルムを敷いた。
そのフィルム上に正常なラット肝細胞（ＲＬ−３４）を
ほぼｌＸｌ０’個播種し、３７℃で２４時間培養を行な
った。培養後、この系全体をエタノールで固定し、ギム
ザ染色後、細胞培養の状態が平均的な部分を採取して光
学顕微鏡観察を行ない、７４１表に示す。
ほぼｌＸｌ０’個播種し、３７℃で２４時間培養を行な
った。培養後、この系全体をエタノールで固定し、ギム
ザ染色後、細胞培養の状態が平均的な部分を採取して光
学顕微鏡観察を行ない、７４１表に示す。
細胞数の判定基準
５０個以上の細胞が認められる場合・・・・・・・・・
・・・・・・多 い１０〜５０個の細胞が誌められる場
合・・・・・・・・・・・・少ない細胞の付着性の判定
基準 細胞の拡がシが良好に認められる場合・・・・・・・・
・・・・良 好細胞の拡がりが蘭められる場合 ・・・
・・・・・・・・・・・・・・・普 通細胞の拡がシが
認められない場合・・・・・・・・・・・・・・・・・
・不充分細胞の配列性の判定基準 細胞の直線状の連結・配列が馴められる場合・・・・・
・Ｏ細胞の方向性配列が認められない場合 ・・・・・
・・・・・・・×なお第１表中、鋼アンモニア法再生セ
ルロースフィルム（１）及び（２）は次の方法によシ製
造した。脱脂綿２．４ｔを９重量−のアンモニア水溶液
３００ｄに２５℃で１時間浸漬膨潤させ九のち、ビンセ
ットでこの脱脂綿をとシ出して軽く絞シ、アンモニア水
溶液を除去した脱脂綿を銅アンモニア水溶液（Ｓｃｈｗ
ｅｉｚｅｒ試薬（ＮＨｓ ２ｏｏ１ｃｕ ２．０６％）
３０ｄ ＫＣｕ（ＯＨ）＊の一級試薬１．２０２Ｆを
加えて得られ九溶液〕を入れた１００ｄ容エルレンマイ
ヤーフラスコに投入し、１５℃のウォーターバス上でマ
グネチックスターラーを用いて約１０時間攪拌した。得
うレタ銅アンモニアセルロース溶液（セルＣＩ−ス８．
０９に、 Ｎｋｌｓ ２０ ｔｓｓ Ｃｕ ４．６７−
）を、予め３５℃の恒温水槽上に設置した鉄板に載せて
温度を一足にした表面が平滑なガラス板上に気泡が混入
しないように滴下し、ナイフ・コーダーで一定の淳さに
調整し、風乾した０ついで、これをガラス板とともにｌ
Ｏ重ｉｉｓの希硫酸浴中に浸漬してセルロースを再生さ
せたのち、充分に水洗して外生セルロースフィルムを得
た０生成したフィルムの木彫肉率はナイフ・コーダー操
作条件によって決まる。すなわち、銅アンモニアセルロ
ース溶液をガラス板上に滴下してしばらく放置し、多少
溶液の粘性が増加したのちに、すばやくナイフ・コーダ
ーを移動させることによシ異方向によシ水膨潤率の異な
る再生セルロースフィルム（１）を得、また鋼アンモニ
アセルロース溶液をガラス板上に滴下後、直ちにナイフ
・コーダーをゆっくり移動させることによシ異方向によ
り水膨潤率の変化のない再生セルロースフィルム（２）
ｔ ｌ）た０第 １ 表 なお、上記の培養で得られた銅アンモニア法再生セルロ
ースフィルム（１）上のラット肝細胞の増殖状態を第１
図の光学ａｌｋ鏡写真（倍率： ４５０ｆ片）で示す。
・・・・・・多 い１０〜５０個の細胞が誌められる場
合・・・・・・・・・・・・少ない細胞の付着性の判定
基準 細胞の拡がシが良好に認められる場合・・・・・・・・
・・・・良 好細胞の拡がりが蘭められる場合 ・・・
・・・・・・・・・・・・・・・普 通細胞の拡がシが
認められない場合・・・・・・・・・・・・・・・・・
・不充分細胞の配列性の判定基準 細胞の直線状の連結・配列が馴められる場合・・・・・
・Ｏ細胞の方向性配列が認められない場合 ・・・・・
・・・・・・・×なお第１表中、鋼アンモニア法再生セ
ルロースフィルム（１）及び（２）は次の方法によシ製
造した。脱脂綿２．４ｔを９重量−のアンモニア水溶液
３００ｄに２５℃で１時間浸漬膨潤させ九のち、ビンセ
ットでこの脱脂綿をとシ出して軽く絞シ、アンモニア水
溶液を除去した脱脂綿を銅アンモニア水溶液（Ｓｃｈｗ
ｅｉｚｅｒ試薬（ＮＨｓ ２ｏｏ１ｃｕ ２．０６％）
３０ｄ ＫＣｕ（ＯＨ）＊の一級試薬１．２０２Ｆを
加えて得られ九溶液〕を入れた１００ｄ容エルレンマイ
ヤーフラスコに投入し、１５℃のウォーターバス上でマ
グネチックスターラーを用いて約１０時間攪拌した。得
うレタ銅アンモニアセルロース溶液（セルＣＩ−ス８．
０９に、 Ｎｋｌｓ ２０ ｔｓｓ Ｃｕ ４．６７−
）を、予め３５℃の恒温水槽上に設置した鉄板に載せて
温度を一足にした表面が平滑なガラス板上に気泡が混入
しないように滴下し、ナイフ・コーダーで一定の淳さに
調整し、風乾した０ついで、これをガラス板とともにｌ
Ｏ重ｉｉｓの希硫酸浴中に浸漬してセルロースを再生さ
せたのち、充分に水洗して外生セルロースフィルムを得
た０生成したフィルムの木彫肉率はナイフ・コーダー操
作条件によって決まる。すなわち、銅アンモニアセルロ
ース溶液をガラス板上に滴下してしばらく放置し、多少
溶液の粘性が増加したのちに、すばやくナイフ・コーダ
ーを移動させることによシ異方向によシ水膨潤率の異な
る再生セルロースフィルム（１）を得、また鋼アンモニ
アセルロース溶液をガラス板上に滴下後、直ちにナイフ
・コーダーをゆっくり移動させることによシ異方向によ
り水膨潤率の変化のない再生セルロースフィルム（２）
ｔ ｌ）た０第 １ 表 なお、上記の培養で得られた銅アンモニア法再生セルロ
ースフィルム（１）上のラット肝細胞の増殖状態を第１
図の光学ａｌｋ鏡写真（倍率： ４５０ｆ片）で示す。
この図から明らかなように、細胞が一方向（第１−にお
ける上下方向）に配列増殖していることがわかる。また
ビスコース法再生セルロースフィルム（七四ファン）上
又は表面処理したポリスチレン平板上で培養して得られ
たラット肝細胞の増殖状態をそれぞれ第２図又は第３図
の光学顯黴−写真（倍率Ｘ４５０倍）で示す。
ける上下方向）に配列増殖していることがわかる。また
ビスコース法再生セルロースフィルム（七四ファン）上
又は表面処理したポリスチレン平板上で培養して得られ
たラット肝細胞の増殖状態をそれぞれ第２図又は第３図
の光学顯黴−写真（倍率Ｘ４５０倍）で示す。
第１図、第２図及び第３図はそれぞれ銅アンモニア法再
生七ルロースフイルム（１） 、ビスコース法再生セル
ロースフィルム又は表面処理されたポリスチレン平板を
培讐基質として実施例１の方法によシ培養して得られた
正常なラット肝細胞の光学顕微鏡写真（倍率！４５０倍
）である。 特許出願人 株式会社 り ラ し 代理人 弁理士重要 堅
生七ルロースフイルム（１） 、ビスコース法再生セル
ロースフィルム又は表面処理されたポリスチレン平板を
培讐基質として実施例１の方法によシ培養して得られた
正常なラット肝細胞の光学顕微鏡写真（倍率！４５０倍
）である。 特許出願人 株式会社 り ラ し 代理人 弁理士重要 堅
Claims (1)
- 最も高い水膨潤率を示す方向の水膨潤率が１．０５以上
でかつそれと直角方向の水膨潤率が１．００以下である
再生セルロースフィルムラ培養基質として動電の付着性
細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56172499A JPS5876084A (ja) | 1981-10-27 | 1981-10-27 | 細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56172499A JPS5876084A (ja) | 1981-10-27 | 1981-10-27 | 細胞培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5876084A true JPS5876084A (ja) | 1983-05-09 |
| JPS6318468B2 JPS6318468B2 (ja) | 1988-04-19 |
Family
ID=15943102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56172499A Granted JPS5876084A (ja) | 1981-10-27 | 1981-10-27 | 細胞培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5876084A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012200152A (ja) * | 2011-03-23 | 2012-10-22 | Futamura Chemical Co Ltd | 液体培地用足場部材 |
-
1981
- 1981-10-27 JP JP56172499A patent/JPS5876084A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012200152A (ja) * | 2011-03-23 | 2012-10-22 | Futamura Chemical Co Ltd | 液体培地用足場部材 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6318468B2 (ja) | 1988-04-19 |
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