JPS5818071B2 - パ−トリシンの回収・精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はポリエン系抗生物質パートリシンを回収およ
び精製する新規な改良法に関する。

我々の英国特許明細書第１，３５７，５３８号中に新規
なポリエン系抗生物質パートリシンと且つその培養、抽
出および精製法を記載した。

この抗生物質は、かなりの抗真菌および抗原虫活性を有
するものである。

この英国特許明細書第１，３５７，５３８号に記載し、
クレームした方法によると、培養段階の終末時に、生産
されるテトラサイクリン・タイプの抗生物質が、培地を
酸性化し、実際止金てのテトラサイクリン・タイプの抗
生物質を含有する水性層を沢過することにより同時に抽
出される。

この段階で、パートリシンを溶解する適当な溶剤を用い
て菌体からパートリシンを抽出することが可能である。

即ち代表的な方法として、珪藻土または他の沢過助剤を
含有する湿潤菌体をブタノール（菌体１００に、ｙ当り
１００〜４００Ａ）に懸濁し、この懸濁液を攪拌下に水
酸化アンモニウムまたは他の適当な塩基でｐＨ９，２〜
１０．２に調整される。

次いで菌体を沢去し、パートリシンのブタノール溶液を
予め水酸化アンモニウムでｐＨ９，１３に調整し、エチ
レンジアミン・四酢酸の５係水溶液で２回洗浄する。

水層を分離した後で、ブタノール溶液を減圧下、４０〜
４５℃を起えない温度で少量（当初の１／２０〜１／２
５）に濃縮する。

パートリシンは今後結晶として析出する。

上記の特許では、ブタノールに加え、他の溶媒例えばア
セトン、ジメチルスルホキシド、エタノールなどの使用
を記述している。

工業的スケールで抗生物質を抽出し精製するのに溶媒を
使用することは、技術および経済面から多くの問題を生
ずることが知られている。

普通に使用される多くの有機溶剤や有機溶剤混合物が、
燃焼性で爆発性であるのでそれが使用される装置類は、
抗爆発性タイプである必要があり、且つ特に大量の溶剤
が使用されると製造の全工程中かなりの注意をしなけれ
ばならない。

工程の終りでは、溶剤類は、非常に高価であるので回収
しなければならず、且つ高価な装置を用い精留し、再使
用されなければならない。

そのため、溶剤類と複雑なプラントの当初費用、注意し
て操作すること、溶剤類の貯蔵ならびに工程中でのロス
が避けられないことが、工業的方法のコストにかなり逆
効果をもたらす因子となる。

この発明の一つの目的は、実際上と経済上の両方の利益
をもたらすパートリシンの抽出・精製の新規な方法を提
供することにある。

醗酵液からポリエン系抗生物質を抽出する際にみられる
第一に困難なことは、かような抗生物質が通常の有機溶
媒に対する溶解性が低く、且つ水に事実上不溶であるこ
とである。

パートリシンは水ｌこ事実上不溶で、工業的スケールで
最も普通に用いられる有機溶剤に非常に僅かしか溶解し
ない。

しかし、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
、ジ〉チルアセタミドには溶解し、それほど高濃度では
ないがピリジンに溶解する。

文献上に記載されたポリエン系抗生物質の抽出法は、主
に水と混和又は混和しない且つ殆んどが水より低い比重
に有する溶剤を使用している。

これらの溶剤は全醗酵液に加えられるか、通常は水層か
ら分離した菌体に加えられる。

ｎ−ブタノールが通常好まれる溶剤でる。

抽出が行われた際、一般に溶剤は使用し尽した菌体から
分離し減圧濃縮される。

この後の操作を先に行い他の抽出操作を続けることが多
い。

これは大部分の不純物を除くのが目的である。

大量の菌体を、抗生物質がよく溶解しない溶剤で抽出す
れば必然的に大量の溶剤を必要とすることは明白なこと
である。

抽出液の濃縮や使用し尽した菌体に含まれる溶剤を除去
することは工業生産上で経済的不利益をもたらすことに
もなる。

抗生物質パーｔ−ＩＪレシン抽出法にも適用されるこの
ような問題から、我々はかなり少量の有機溶剤を使用す
ればよい別の方法を探した。

この発明による新規な方法は広く言えば、抗生物質パー
トリシンを水層中で、充分な量の界面活性剤（このもの
はアニオン系、カチオン系の倒れでもよいがアニオン系
が好ましい）の手段で溶液にし、その後溶媒を含まない
使用し尽した菌体を沢過又は遠心分離で除去することか
らなる。

次いでパートリシンは、水性ｐ液から次の方法の何れか
によって回収される。

方法 Ａ アルカリ土類金属又は他の金属の塩を添加し、溶液中に
ある界面活性剤とパー） ＩＪレシン沈澱させる。

沈澱物を沢過、遠心分離もしくはパートリシンを含まな
い水性層の実際上全部を傾瀉して除くことを可能にする
水より重い少量の溶剤を加えることによって分離するこ
とができる。

界面活性剤は、この沈澱物から直接溶剤（各種のものが
この目的に使用できる）と処理するか、逆タイプの界面
活性剤（即ち、当初にアニオン系を用いたときはカチオ
ン系）の少なくとも等モル量と処理し、次いで複合物を
溶剤で抽出するかの何れかによって除去しうる。

かくして得られた粗製品を適当な溶剤、例えばジメチル
ホルムアミド、ホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジ
メチルスルホキシド、ピリジンもしくはそれらの混合物
、又はメタノール、エタノール、メチル・エチル・ケト
ンなどの他の溶剤との混合物に好ましくは高められた温
度（４０〜８０℃）で溶解し、次いで水、アセトン、ジ
エチル・エーテルなどの不溶化剤で再沈澱さすことによ
り精製することができる。

あるいは、有機塩基好ましくはトリエチルアミンを用い
、７０〜８０℃までの温度で且つ好ましくはエチレンジ
アミン・四酢酸のような錯生成剤の存在下に、粗製品を
アセトン、メタノール、２−メトキシエタノール、２−
エトキシエタノールなどの有機溶媒の水性混合物に溶解
し、沢過して不純物を分離し、と液を酢酸、塩酸などの
有機又は無機酸でｐＨ３〜８に調整しパートリシンを沈
澱させることにより、最終的な精製を達することができ
る。

これらの工程で得られたパートリシンは高純度であり、
重要な汚濁物を含まない。

使用した界面活性剤の塊りは回収し、再使用できる。

方法 Ｂ 水性涙液を少なくとも５％容量で通常約１０係容量の水
と不混和な溶媒、ならびに抽出に使用したのと逆電荷の
界面活性剤の少なくとも化学当量で処理する。

と５では、水より低い比重を有する例えばメチル・イソ
ブチル・ケトン・酢酸エチル、酢酸ブチルなど、又は水
より大きい比重を有する例えばクロロホルム、四塩化炭
素、メチレンクロリドなどの各種の溶剤が使用できる。

ｐＨは必須条件ではないが、中等度の酸性（ｐＨ３〜６
）で行うのが好ましい。

短時間攪拌した後、二・三時間分離のため放置する。

実際上パートリシンを含まない水層を除去し、一方乳化
した有機層を遠心分離する。

半固体のケーキを適宜、抽出時に使用した溶剤と同−又
は類似の溶剤で、二つの界面活性剤の等モル錯体の大部
分が除去できるように洗浄し、その後アセトン中又は他
の水溶性溶剤中で固体化をさせる。

沢過後パートリシンの３０〜５０チ含量の粗製品が得ら
れ、これは上記の方法Ａで記載した方法によって精製で
きる。

二つの使用した界面活性剤は好収率で回収、再使用がで
きる。

広範囲のカチオン系の界面活性剤例えばアルキル・アリ
ール・アンモニウム塩が使用できるが、アニオン系界面
活性剤例えばアルキル硫酸アルカリ金属塩特にラウリル
硫酸塩で最良の結果が得られた。

満足すべき抽出をするに必要な界面活性剤の量は、通常
醗酵液１１当り１０〜４（ｌである。

最適ｐＨ値は９〜１１であり、またこの範囲でパートリ
シンが最良の安定性を有する。

ラウリル硫酸塩を中和するのに用いるカチオン系界面活
性剤は、”Ａｒｑｕａｄｓ ” （Ａｒｑｕａｄは登録
商標）として知られたトリメチル・アルキル・アンモニ
ウム・クロリドの一つ又はベンザルコニウム・クロリド
の一つなどのような市販の入手可能な製品であってもよ
い。

存在する界面活性剤を逆タイプの界面活性剤で中和する
に先だち、界面活性剤の溶液の滴定又は中和に使用する
界面活性剤との中間体の滴定をする必要がある。

この目的に使用しうる標準分析法としては、例えばＪ、
Ｓｏｃ、 Ｃｈｅｍ、Ｉｎｄ、 、 ６７ 。

４５／１９４８、薬学雑誌７９，５２２／１９５９（Ｃ
ｈｅｍ、 Ａｂｓｔｒ、ａｃｔｓ ６９ 、１７５２
ｃ、 ｄ、 ｅ／１９６８参照）及びＤｅｕｔ、 Ｔ
ｅｘｔｉｌｔｅｃｈ、＋ １７ 。

３０３／１９６７に記載されている。

カチオン系界面活性剤は一般に少過剰使用される。

次の実施例はこの発明を例証する目的で挙げられる。

実施例 １ パートリシン活性５，５００単位／ｒｕｌをもつ醗酵液
６，０００１をラウリル硫酸ナトリウム１８０Ｋｙと処
理し、ｐＨが１０．３になる迄水酸化ナトリウムを加え
る。

３０分攪拌後、２００ Ｋｙの沢過助材じＤｉｃａｌｉ
ｔｅ”４７８又は”Ｒａｎｄａｌｉｔｅ”Ｗ １９ （
Ｄｉｃａｄ ｉ ｔｅ及びＲａｎｄａｌｉ ｔｅは登録
商標）〕を加え沢過面積１１ｍ２の回転式沢過機で沢過
する。

６．５５０１のＰ液が得ら江 このものはパートリシン
活性４，４７０単位／ｍｌを有した。

抽出収率約８９％（Ｐ液中のパートリシン２９．２７Ｋ
ｙ）。

６．５００１の涙液（２９，０５ＫＰのパートリシン１
に相当）を５〜７°Ｃに冷却し、１３０Ｋｙの塩化カル
シウム（１００％として計算）をそれに加える。

１時間攪拌後に、６５０１のクロロホルムを加え、３０
分間攪拌し、５〜７℃で一夜放置した。

約６，０００の上層の水性液を傾瀉する、これは；約１
００単位／ｍｌの活性を有する。

下部のクロロホルム層を２５℃に加温し、ベンザルコニ
ウム・クロリドの５０係水溶液２９５１を混合し、１時
間攪拌する。

その後脱水機で遠心分離する。

遠心分離した溶剤の活性は３５０単位／ｍｌ；で、遠心
分離した水性層の活性は１５０単位／ｍｌである。

半固体ケーキを５００１の新たな溶剤に懸濁し、懸濁液
を再び遠心分離し、得られたケーキを５００４のアセト
ンに再懸濁する。

再び遠心分離と１５０１のアセトンで洗浄し、ケーキを
減圧乾燥する。

６５．７Ｋｐの乾燥製品が得られ、４２０単位／〜の活
性を有した。

実施例 ２ ６、１５０単位／１１１１の活性を有する醗酵液９，０
００１を２７０ＫＰのラウリル硫酸ナトリウムと処理し
、水酸化ナトリウムをｐＨが１０．３になる迄加える。

３０分間攪拌し、３００に、ｒの沢過助剤（Ｄｉｃａ−
ｌｉｔｅ ４７８又はＲａｎｄａｌｉｔｅ Ｗ １９
）を加え、沢過面積１１ｍ２の回転式沢過機で沢過する
。

８．７４０１の涙液が得られ、５，６４０単位／ｍｌの
活性を有した。

抽出収率約９０％（Ｐ液中のパートリシン含量４９．８
に？） ８．７００１の涙液（４９，０６８にグのパートリシン
に相当）に４３２１のベンザルコニウム・クロリドの５
０係水性液と６５２１のクロロホルムを加える。

酢酸を加えて、ｐＨ４，５にし、２０分間攪拌しその後
−夜装置する。

約７，０ＯＯｌの上部の水性層を傾瀉する。

これの活性は約１６０単位／ｍ１０下部の乳化層を脱水
機で遠心分離、ケーキをクロロホルムホルムでよく洗浄
する（遠心分離溶剤層の活性は９７８単位／ｍｌ）。

遠心機より取り出した製品（７００ＫＰ＝５００１）を
新鮮溶剤３５０１と攪拌する。

懸濁液を再び遠心分離し、処理を繰り返し、ケーキを３
００１のアセトンに再懸濁する。

更に遠心分離し、ケーキを減圧乾燥する。９４．８６Ｋ
ｙの乾燥品が得られ、その活性は４５０単位／■（４２
，６９にグ／活性） 実施例 ３ 実施例１で得られる中間品１０Ｋｐ（パートリシン含量
４．２ＫＦ？）を１００１のジメチルホルムアミドに加
える。

１時間攪拌後、フィルタープレスで沢過し、ケーキをジ
メチルホルムアミドで繰り返し洗浄する。

合した涙液と洗浄に５００４の水を加え、その後バッチ
を１０℃に冷却し、一夜攪拌した。

真空沢過機で沢過し、固形物を数回蒸留水で洗浄、次い
でアセトン洗浄した。

最後に、製品を室温で減圧乾燥した。

３．７４’Ｋｙの純パートリシンが得られる。

１０１０単位／７ＩＩ９の力価。実施例 ４ 実施例２で得た中間品２５Ｋｐ（１１，２５０にグのパ
ートリシンに相当）を２００１のジメチルホルムアミド
に５０℃で加える。

１時間攪拌後にフィルタープレスで沢過し、ケーキをジ
メチルホルムアミドで繰り返し洗浄する。

１．０００１のアセトンをジメチルホルムアミド涙液に
加える。

沈澱化を約１０℃に冷却し、次いで３〜５時間攪拌して
完了させる。

真空沢過機で沢過し、固形物をアセトンで次いでジエチ
ルエーテルでよく洗浄し、生成物を最後に室温で減圧乾
燥する。

９．６ Ｋｐのパートリシンを得、このものは１０４５
単位／ｍ９の力価。

実施例 ５ ２Ｋｔのエチレンジアミン・四酢酸ジナトリウム塩を２
０１の蒸留水に溶解する。

実施例１で得られる中間物４Ｋｐ（１，６８Ｋｙのパー
トｌ）シン）をそれに加え、バッチに水酸化ナトリウム
を加えてアルカリ金属（ｐＨ１ｏ、５）にする。

次いで２０７のアセトンを加え、強く攪拌しつ’＞ ６
．’−７１のトリエチルアミンをゆっくり添加する。

バッチをフィルタープレスで濾過、５０係水性アセトン
で数回洗浄する。

涙液と洗液を４〜５℃に冷却し、次いでｐＨが６．０に
なるまで２０％塩酸を加える。

４〜５℃で２時間攪拌し、パートリシンの沈澱化を完了
させる。

真空沢過機で濾過し、５０係水性アセトンで数回洗浄し
、最後に純アセトンで洗浄する。

室温で減圧乾燥し、１．３７Ｋｐのパートリシンを得る
。

１１００単位／ｍグの力価。

実施例 ６ 実施例２で得た中間物Ｉ Ｋｐ（０，４５０ＫＦ？のパ
ートリシンに相当）を５０係水性アセトン７．５１に懸
濁した溶液に１．８１のトリエチルアミンを４５）℃で
強く攪拌しつ５ゆっくり加える。

フィルタープレスで沢過し、ケーキを５０係水性アセト
ンで繰り返し洗浄する。

ｐ液と洗液を４℃に冷却し、２０チ塩酸をｐＨ５になる
まで徐々に加える。

４〜６℃で懸濁液を少なくとも２時間攪拌してパート１
リシンの沈澱化を完了させる。

懸濁液を真空ｒ過機で沢過、固形物を５０係水性アセト
ンでよく洗浄し、最後に純アセトンで洗浄する。

製品を室温で減圧乾燥して力価１１７０単位７ｍｙのパ
ートリシン０．３４６Ｋｐを得る。

ン 次にこの発明の態様を示す。

■、界面活性剤がカチオン系物質である特許請求の範囲
に従う方法。

２、カチオン系界面活性剤がアルキル・アリール・アン
モニウム塩である上記１．に従う方法。

１３、界面活性剤がアニオン系物質である特許請求の範
囲に従う方法。

４、アニオン系界面活性剤がアルキル硫酸アルカリ金属
塩である上記３．に従う方法。

５、界面活性剤を醗酵液１１当り１０〜４０！！用；
いる上記の何れかに従う方法。

６、界面活性剤との処理を９〜１１のｐＨで行う上記の
何れかに従う方法。

７、金属塩を添加し、パートリシンを溶液から沈澱で分
離する上記の何れかに従う方法。

８、金属塩がアルカリ土類金属塩である上記の７に従う
方法。

□９、界面活性剤を沈澱したパートリシンから、溶
媒処理、当初使用したものと逆タイプの界面活性剤の少
なくとも等キル量で処理するかの何れかで除去する上記
の７又は８に従う方法。

１０、水と混和しない溶剤の少なくとも５チ容量及び当
初使用したものと逆タイプの界面活性剤の少なくとも化
学当量を用いて処理し、パートリシンをその水性溶液か
ら分離する特許請求の範囲〜上記１〜６に従う方法。

１１．パートリシンをｐＨ３〜６で分離する上記１０に
従う方法。

１２、分離したパー１− ＩＪレシン溶媒に溶解し、パ
ートリシンを溶さない溶剤を加えて再沈澱して精製する
上記７〜１１に従う方法。

１３、分離したパートリシンを有機塩基と共に７０〜８
０℃で水性有機溶剤に溶解し、沢過で不純物を分離し、
ｐＨを３〜８に調整して涙液からパートリシンを沈澱さ
せて精製する上記７〜１１に従う方法。

１４、水性有機溶剤に錯化剤を含有する上記１３に従う
方法。

１５、錯化剤がエチレンジアミン・四酢酸である上記１
４に従う方法。

１６、有機塩基がトリエチルアミンである上記１３〜１
５に従う方法。

１７、Ｐ液のｐＨを有機又は無機の酸の添加で調整する
上記１３〜１６に従う方法。

１８、使用する酸が酢酸又は塩酸である上記１７に従う
方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ パートリシン含有醗酵液にパートリシンを溶液にす
   るに充分な量の界面活性剤を加え、不溶物を除去し、パ
   ートリシンを水性溶液から回収することを特徴とするパ
   ートリシンの回収・精製法。