JPS58139069A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素免疫測定法、さらに詳しくは、ヒト妊娠特
異性及び／又は異所性β１−グリコプロティンの酵素免
疫測定法並びｋそれに用いる測定試薬に関する。

ヒト妊娠特異性β、−グリ；プロティンは、胎盤から産
生される蛋白の一種であシ、受験後短期間で母体体液中
に見出される。胎盤から産生されたヒト妊娠特異性β１
−グリコプロティンは母体側に分泌され、胎児側へはほ
とんど移行せず、その体液中に十外高い濃変で存在し、
日内あるいはｉ差変動が少なく、かつ、体液中のヒト妊
娠特異性β１−グリ；プロティンＯ半減期が短い等、胎
盤機能マーカーとして十分な条件を満大していゐ。

従って、妊婦体液中のにト妊娠特異性Ｉｔ−グリコブロ
チインを測定すゐことは、早期妊娠診断や切迫流量の予
後経過の観察等に有用である。

また、悪性膿瘍患者の体液中から異所性β１−グリコプ
ロティンが検出され、例えば絨毛瘉、乳癌、胃癌等の患
者体液中ＫＭ）妊娠特異性／１−グリコプロティンと共
通の抗原基をもつ蛋白の存在が指摘されている。

これらの悪性腫瘍患者体液中Ｏ異所性／１−グリコプロ
ティンを測定すゐヒとは、疾患す病態勢を把握すＺため
の補助手段として重要である。

現在まで体液中のヒト妊娠特異性及び／又は異所性β１
−グリコプロティンを定量的に測定するため、種々の方
法が知られている。

（以下、ヒト妊娠特異性β、−グリコブ■ティン及び異
所性β１グリコプロティンを包括して８２本と略記する
。）　　　　　　。

例えば、沈降反応を利用しえ一元免疫拡散法（Ｓｉｎｇ
ｌｅ　Ｒａｄｉａｌ　Ｉｍｍｕａｏ　Ｄ目ｆｕｓｌｏｎ
：８ＲＩＤ　）や免疫電気拡散法（いわゆるロケット電
気泳動法、Ｒｏｃｋｅｔ　Ｉｍｍｕｎｏ　１ｌＬｓ＠＠
ｒｏｐｈｏｒ＠ｓｉｓ　＄ＢＩｌ）等Ｏ方法がある。し
かし、免疫拡散法は操作が簡単であるが、８Ｐｌ）検出
感度（最小検出濃度）が数１０μｍ７１以上と微量の定
量法としては不十分な場合が多い。かつ、試料により、
不鮮明な沈降線を生ずる例があ夛、沈降線に染色を加味
した方法が提案されている（　８ｃｈｕｌｔｉ−Ｌａｒ
ｉｅｎ、　Ｐ、ａｔ　ｍｌ、、　Ｃ目ｎ。

Ｃｈｌｎｎ、　Ａｃｔｍ、、　９９．５９−６９　、１
９７９　：　Ｔｏｗｌａｒ　。

Ｃ，Ｍ、　＠ｔ　ｍｌ、、　ＣｌＩｎ、　Ｃｈｌｍ、　
Ａｅｔａ、　８７　、２８９−２９６゜１９７８）が、
中はシ、微量定量には不十分である。

％に１悪性腫瘍患者の体液中の８Ｐ１（数ｎｔ／ｓｔ〜
数ｔｏｏｎｒ／１１）を測定することは困難である。

高感度の微量定量法としては、放射免疫測定法（ラジオ
イムノアッセイ：ＲＩ人）がある。この方法は測定感度
のみならず精度、再現性及び特異反応性に優れている。

しかし、放射性物質を使用するため、半減期によゐ時間
的制約や放射性同位元素による環境汚染等、また、放射
線取り扱い設備の設置が必要である等、一般臨床検査と
して実用化されＺＫけ檜々の制約を受けるという欠点が
ある。

本発明者らは、前述の種々の測定法におけゐ問題点を解
消し、高感度で、かつ、前述０種々の制約を受＃／ｆな
い８Ｐ１０１１１定法及びそれに用いる測定試薬を提供
する仁とを目的として、鋭意研究を重ね九結果、本発明
を完成すゐに！つた。

すなわち、本発−は、次に示す一連のｌ１、すなわち、 試料を、ヒト妊娠特異性及び／又は異所性β、−グリコ
プロティンに４１１異的な固相化抗体に接触させる工種
： 肢固相化抗体相に該β重−グリコプ驕ティンに特異的な
アルカリホスファターイ標識抗体を接触させる１穆； 過剰の咳アルカリホスファターゼ標識抗体から該固相化
抗体相を分離する１穆； 鋏固相化抗体相上のアルカリホスファターゼ活性を測定
する１穆； からなることを特像とする５ＰＩＯ測定法及びそｔＩＫ
用いる測定試薬に関する。

本発明に応用した酵素を標識物質として使用する酵素免
疫測定法（エンザイムイムノアツセイ；ＢＩ人）は、原
理的ＫＲＩＡと同様に抗原抗体反応を応用している仁と
から測定感度、精度、再現性、特異反応性に優れている
。さらに１前述した試薬有効期間の制約中高価な測定機
器並びに％定の施設を必要としないという長所を有して
いる。

本発明はＥＩＡのうちサンドインチ法忙よる亀のであｐ
ｌその原理は次の通〕である。

担体に抗体を固相化しておき、とれに測定すべき抗原を
接触させ、結合した抗原の残された抗体結合部位に＃素
で標識した抗体を接触させた後、担体上の酵素活性を測
定すると、酵素活性が測定すべき抗原量と相関するとい
う原理である。

本発明は、前記の原理を応用して８Ｐｌ特異的な抗体を
担体に固相化させ（固相化抗体）、これに測定しようと
するヒト体液中の８Ｐ１（抗原）を接触させ、次に酵素
で標識した抗ヒ）８Ｐ１抗体（酵素標識抗体）を接触さ
せて、固相化抗体−抗原−酵素標識抗体からなる複合体
を形成後、過剰の酵素標識抗体から前記複合体を分離し
て、複合体上の酵素活性を測定するととにより、８Ｐ１
の定量を行なう酵素免疫測定法に関すゐ。

本発明に用いる担体は、不溶化担体であれば、どのよう
な本のを用いて亀よい。不溶化担体としては、ポリスチ
レン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ナイロン等
が挙げられるが、ポリスチレン、ポリカーボネイトが好
首しく、ボリスチレいやすさ、担体上の固相化抗体量の
バラツキ度の均−化等実用土の問題から、特にビーズ状
（４％〜８”／ｍ）のものが最も効果的でああ。

８ＰＩＫ特異的な固相化抗体は以下のようＫして調製す
る。すなわち、前記担体を洗剤勢を用いて洗浄後、水洗
した後、抗８Ｐｌ家鷺免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）画分
１〜ｓθ声訃省、好壕しくは１０μｔ、乙−を含む炭酸
緩衝液に４〜４０℃、　好ｔしくは４℃で、６〜７２時
間、好オしくは一夜浸漬する。この時、抗ＳＰ１家兎Ｉ
厘ＧＯ代わ、ｔＪＫ、抗ｓｐｉ家兎ＩｇＧＦ（麿１）’
）ｓ７ラグメントを用いてもよく、仁の場合も、緩衝液
中の濃度Ｆｉ１〜５０μｔ／ｗｉが適轟である。普た、
炭酸緩衝液の代わ如に、リン酸緩衝液又はトリス−塩酸
緩衝液等を用いてもよい。次に１前記担体をクエン酸緩
衝液で洗浄後、ウシ血清アルプ建ン（Ｂ８Ａ）を０．０
１〜ＩＩＧ、好ましくは０．１憾含有するクエン酸緩衝
液に浸漬して１〜７日、好ましくけ２日経てから使用に
供する。

この時、クエン酸緩衝液の代わりに１　リン酸緩衝液又
はトリス−塩酸緩衝液等を用いてもよい。

酵素標識抗体の標識酵素としては、アルカリホスファタ
ーゼを用いたが、その理由は以下のとお抄である。すな
わち、酵素標識抗体の調製が簡単であること、酵素標識
抗体の安定性がよいこと、酵素活性が高いこと、酵素反
応が速いこと、用いる基質が安定であること、ＢＩＡ自
動化システムの組み込み可能なこと等が挙げられる。

酵素標識抗体は以下のようＫして調製した。すなわち、
仔つシ腸由来のアルカリホスファターゼと抗８Ｐｌ家兎
ＩｉＧを重量比で０．５：１〜２．５＝１、好ましくは
２：１０割合で、リン酸緩衝液に溶解し、グルタルアル
デヒドの０．０１〜Ｓ＊、好ましくは１慢水溶液を用い
て架橋反応させる。この時、アルカリホスファターゼは
、仔つシ腸由来の略のの代わりに、大腸菌もしくはブタ
腎臓由来のもの、又は他の山東のアルカリホスファター
ゼを用いてもよい。又、リン酸緩衝液の代わりに１クエ
ン酸緩衝液又はベロナール緩衝液等を用いてもよい。・
このようにして、室温で１０分〜器時間、好ましくＦｉ
３時間放置後、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液の順
に透析し、分画、精製して酵素標識抗体を得る。

Ａｌ１述の架橋反応は、好ましいものとして、グルタル
アルデヒドを用いる方法（グルタルアルデヒド法）Ｋよ
勤行なったが、他の既知の方法であるバラベンゾキノン
法又は過冒つ素酸法によ勤行なって龜よい。この時は、
それぞれに応じて、既知の方法及び条件下で行なう。

また、前記固相化抗体−抗原−酵素標識抗体から々る複
合体の形成及び峡複合体上の酵素活性の測定は以下のよ
うにして行なった。すなわち、前記固相化抗体をクエン
酸緩衝液及び検体を含む容器、好オしくけ小型試験管中
に入れ、４〜４０℃、好オしくけ３７℃で、０．５〜１
６時間、好ましくけ１．５時間インキュベートする。そ
の彼、固相化抗体相（固相化抗体−抗原）を洗浄液で洗
浄後、酵素標識抗体を扁え、４〜４０℃、好ましくは３
７℃で、０．５〜１６時間、好ましくけ１時間インキュ
ベートする。その後、洗浄液で洗滲して、過刺のアルカ
リホスファターゼ標識抗体を洗い流す。この時、洗浄液
としては塩化マグネシウム、食塩、ツイーン（Ｔｗｅ・
ｎ）２０［登録商標］を含む洗浄液、食塩、塩化亜鉛を
含む洗浄液又は食塩、アルジミンを含む洗浄液等が挙げ
らねるが、塩化マグネシウム、食塩、ツイーン２０を含
む洗浄液が好ましい。その後、基質液中に移し、４〜４
０℃、好ましくけ３７℃で、０．５〜１６時間、好壕し
くけ４５分インキエペートした後、呈色液を加えて吸光
度を測定した。この時、基質液とし。

ては、フェニルリン酸及び４−ア建ノアンチビリンを炭
酸緩衝液に溶解したものを用いたが、代わりにフェニル
リン酸及び４−アミノアンチビリンを水酸化ナトリウム
−ホウ酸緩衝液Ｋ１１ｌ解した本のを用いて奄よい。ま
え、呈色液としては、ホウ酸を含む７エリシアン化カリ
ウム＊＊を用いたが、代わりＫＮつ素溶液を用いて亀よ
い。

本発明の一実施態様として、以下に示す測定キットを用
いる測定法が挙げられる。

該測定キットは、次の（１）及び伽）の各試薬を構成要
素とし、 （１）抗ヒ）８Ｐ１抗体吸着ポリスチレン製担体（２）
アルカリホスファターゼ結合抗ヒト８Ｐ１抗体（酵素標
識抗体） 他に（３）〜―）が必要に応じて組み込まれている仁と
を特徴とする。

（３）標準８Ｐ１ （４）酵素基質 （５）反応呈色液 （６）蛋白調整液 （７）反応用緩衝液 （８）洗浄液 錦記キットを用いて、患者の体液中の８Ｆ１を測定し、
従来の市販キラ）　（８ＲＩＤ）と比較した。

その結果を、ＩＩＥＩ表に示す。

第１表 （単位二μｆ廁） 表から明らかなように１本発明の測定法は、従来の測定
法（８ＲＩＤ）Ｋ比し、はるかに高い感度　　）を示し
た。

次に１以下の纂２表に示す対象について、本発明の測定
法によシ、体液中ｅ）８Ｐ１を測定した。

その結果を第２表に示す。

１ 表から明らかなように、本発ｆ！ｏｓｓ定法及び測定試
薬は、妊娠診断、胎盤機能検査及び悪性腫瘍診断に有用
であることが判明した。

以下、実施例によシ本発明をさらＫ［０ＫｌＫ明する。

実施例 （Ａ）試薬及び試薬液の調製 ０抗８Ｐ１家兎ＩｇＧ吸着担体の作成 ビーズ状（寸法、６．４１１ｖ／ＷＬ）のポリスチレン
製担体を中性洗剤で洗浄後、数回水洗した後、抗８Ｐ１
家兎ＩｇＧ画分１μｂ−〜５０μｆ、〆―を含む０．０
５Ｍ炭酸緩衝液−９，６に４℃で一夜浸漬した。このポ
リスチレンビーズを０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６，
８で洗浄後、ｏ、ｉｎｎウシ血清アップオンＢ８Ａ）を
含むクエン酸緩衝液に浸漬して２日経てから使用に供し
た。

０アル力リホスフアターゼ結合抗８Ｐｌ家兎ＩｇＧ複合
体の調製 仔つシ腸由来のアルカリホスファターゼ（べ一リンガー
）ｌｖと抗８Ｐ１家兎ＩｇＧ　２．５　＊を０．０５Ｍ
リン酸緩衝液−６，８に溶解し、１優グルタルアルデヒ
ド水溶液で架橋反応させる。室温で３時間放置後、前記
リン酸緩衝液と０．１　Ｍ　）　＋７スー塙酸緩衝液−
８，０の順に透析し、次にセルロファインＧＯ−７００
ｍ　（チッソ■）で分画、精製して酵素標識抗体を得た
。

０固相に結合した酵素Ｏ活性測定用試薬と測定法フェニ
ルリン酸と４−ア建ノアンチビリンを０．１Ｍ１１ｍｌ
ｌＮＩｔｆｌＮＭ　１０．ＯＫ１１ｌｊｌ　Ｌ＆もＯを
基質とし、反応呈色液はホウ酸を會む７エリシアン化カ
リウム溶液を用いた０反応生成物は分光光度針（ｇｙｖ
ａ社、Ｇ１１ｆｏｒｄ　８ｔａｓａｒ−１）　Ｋよｌ　
、Ｓ　ＯＯｒｕａでの吸光賓で測定した。

（Ｂ）測定操作と結果 抗８Ｐ１家兎ｌ１ＩＧ吸着ポリスチレンビーズ１個を反
応用クエン酸緩衝液ｐＨ６，ｌ　Ｉ！００＊ｊと検体５
０μｍを含む小型試験管に入れ、一方、標準−線用には
反応用クエン酸緩衝液４０Ｇ、＄１１と予め調製した８
Ｐ１標準液ＢＯｓｌ及び予め血清を一定濃度ＫｆＡ＊シ
た蛋白調整液１００＊ｊを含む小蓋試験管に入れ、それ
ぞれ３７℃で１．５時間インキュベートした。その後、
ポリスチレンビーズを塩化マグネシウム、食塩、ツイー
ン２０を會む洗浄液でｌ−ずつ２回洗浄し、アルカリホ
スファターゼ結合抗８Ｐ１家兎ＩｇＧ複合体液４００ｓ
ｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。その俵
、ポリスチレンビーズを洗浄液でｌ−ずつ２回洗浄し、
ポリスチレンビーズを基質液１ｍｌ含む小型試験管に移
し、３７℃で４５分インキエペートした後、１−の前記
呈色液を加えた。呈色した液の吸光度を波長５００　ａ
ｍで試薬ブランクを対照にして測定し、図に示す標準−
線を得、検体中のＳｒ１量を知つ九。図の結果から明ら
かなように、２０〜１６２０ｎｆ／＊の範囲の測定が可
能であることが認められた。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明の測定法により作成し九８Ｐ１標準曲線を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　次に示す一連の１寝、すなわち、試料を、ヒト妊
   娠特異性及び／又は異所性β、−グリコプロティンに４
   １１異的な固相化抗体Ｋｍ触させる工程； 該固相化抗体相に該！１グリコプロティンに％異的なア
   ルカリホス７アターイ標識抗体を接触させる工１； 過剰の該アルカリホス７アターイ標識抗体から該固相化
   抗体相を分離すゐ工１； 該固相化抗体槽上のアルカリホスファターゼ活性を測定
   する工程； からなることを＊１とするヒト妊娠特異性及び／又は異
   所性ムーグリ；プ■ティンＯ測定法。 ２、　ヒト妊娠特異性及び／又は異所性Ｉｔ−グリコプ
   ロティンに４Ｉ異的な固相化抗体。 ３、　ヒト妊娠特異性及び／又は異所性！、−ダリコプ
   ロテインに特異的な固相化抗体並びに該β１−グリコプ
   ロティンに特異的なアルカリホスファターゼ標識抗体を
   組み合わせる仁とを特徴とするヒト妊娠特異性汲び／又
   は異所性β、−グリコプロティンの測定試薬。