JPH11512297A

JPH11512297A - 免疫化または遺伝子療法用の筋肉特異的調節要素を含有してなるｄｎａ構築物

Info

Publication number: JPH11512297A
Application number: JP9512813A
Authority: JP
Inventors: リチリャーノ，ジョゼフ・ダブリュー; アラネオ，バーバラ・エイ
Original assignee: ファーマダイム・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 1999-10-26
Also published as: EP0851935A2; AU7160296A; US5795872A; US6310196B1; CA2231806A1; WO1997011190A3; WO1997011190A2; AU710756B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫化または遺伝子療法に有用なＤＮＡ構築物に関する。該本発明構築物は、プロモーターまたはプロモーターおよび１以上のエンハンサー要素などの筋肉特異的調節要素ならびに筋肉特異的調節要素の制御下のＤＮＡ配列を含有してなる。該ＤＮＡ構築物中にいくつかのＤＮＡ配列を取り込んでいてもよい。一の具体例では、該ＤＮＡ配列は、抗原、抗原性決定因子または抗原のエピトープをコードしている。第二の具体例では、該ＤＮＡ配列は、筋肉疾患において影響される正常な筋肉遺伝子である。第三の具体例では、該ＤＮＡ配列は、異常な筋肉細胞を遮断するためのアンチセンスである。第四の具体例では、該ＤＮＡ配列は、哺乳動物血液またはリンパ系において循環するタンパク質をコードしている。本発明は、筋肉細胞内の正常な遺伝子の発現または異常な遺伝子発現の遮断により筋肉の疾患の影響を改善するため、循環タンパク質または筋肉が主としては関係していない病状を変更させるタンパク質をコードしているトランスジーンの異種発現のため、およびワクチン開発のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】免疫化または遺伝子療法用の筋肉特異的調節要素を含有してなるＤＮＡ構築物発明の背景本発明は、直接または間接遺伝子療法に用いることができるＤＮＡ構築物に関する。該ＤＮＡ構築物は、筋肉特異的調節要素および免疫化のための抗原または遺伝子療法のためのタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有するか、または該ＤＮＡ配列は、遺伝子療法のためのアンチセンス配列である。本発明の背景を解明するために本明細書で用いる刊行物および他の文献、特に、実施に関してさらなる詳細を提供するためのケースは、引用して本明細書の記載とし、好都合には、以下明細書において著者および日付により引用し、各々、添付した文献のリストに分類する。生後の遺伝子療法に対する最初の研究は、新しい遺伝子情報を組織中に導入する間接的な手段に頼っていた：標的細胞を身体から取り出し、新しい遺伝子情報を担持しているウイルスベクターに感染させ、次いで、身体に移植する（Ledley ，1987; Eglitis and Anderson，1988; Friedmann，1989）。しかしながら、間接的な遺伝子導入は、遺伝子療法の多くの用途のために有用ではない。これらの場合、遺伝子をin vivoで組織中に直接導入することが望まれる。いくつかの遺伝子導入系は、in vivoで組織に遺伝子を直接または間接的に導入するように開発された。これらの系としては、ウイルス性および非ウイルス性導入法が挙げられる。パポバウイルス、例えばＳＶ４０（Madzak et al.，1992 ）、アデノウイルス（Berkner，1992; Berkner et al.，1988; Gorziglia and K apikian，1992; Quantin et al.，1992; Rosenfeld et al.，1992; Wilkinson et al.，1992; Stratford-Perricaudet et al.，1990）、ワクシニアウイルス（ Moss，1992）、アデノ関連性ウイルス（Muzyczka，1992; Ohi et al.，1990; Sr ivastava，1993）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Margolskee， 1992; Johnson et al.，1992; Fink et al.，1992; Breakfield and Geller， 1987; Freese et al.，1990）および鳥類のレトロウイルス（Brandyopadhyay an d Temin，1984; Petropoulos et al.，1992）、ネズミ（Miller，1992; Miller et al.，1985; Sorge et al.，1984; Mann and Baltimore，1985; Miller et al .，1988）、ならびにヒト起源（Shimada et al.，1991; Helseth et al.，1990; Page et al.，1990; Buchschacher and Panganiban，1992）を含む多くのウイルスが遺伝子導入ベクターとして用いられた。ほとんどのヒト遺伝子療法プロトコールは、無能力にされたネズミレトロウイルスに基づいていた。当該技術分野で知られている非ウイルス性遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム共沈（Graham and van der Eb，1973; Pellicer et al.，1980）などの化学的技術；マイクロインジェクション（Anderson et al.，1980; Gordon et al. ，1980; Brinster et al.，1981; Constantini and Lacy，1981）などの機械的技術；リポソームを介する膜融合媒介導入（Felgner et al.，1987; Wang and H uang，1989; Kaneda et al.，1989; Stewart et al.，1992; Nabel et al.，199 0; Lim et al.，1992）；および直接ＤＮＡ摂取および受容体媒介ＤＮＡ導入（W olff et al.，1990; Wu et al.，1991; Zenke et al.，1990; Wu et al.，1989b ; Wolff et al.，1991; Wagner et al.，1990; Wagner et al.，1991; Cotten e t al.，1990; Curiel et al.，1991a; Curiel et al.，1991b）が挙げられる。ウイルス媒介遺伝子導入は、ウイルスベクターを腫瘍細胞に指向させるが、周囲の非分裂細胞へは指向させない、リポソームデリバリーを用いて直接in vivo遺伝子導入と組み合わせることができる。別法としては、レトロウイルスベクタープロデューサー細胞系を腫瘍中に注入することができる（Culver et al.，1992 ）。次いで、プロデューサー細胞の注入によりベクター粒子の連続供給源が提供される。この技術は、手術不可能な脳腫瘍のヒトにおける使用のために認可された。生物学的および物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチでは、いずれかの大きさのプラスミドＤＮＡをアデノウイルスヘキソンタンパク質に対して特異的なポリリシンコンジュゲート抗体と組み合わせ、得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次いで、三分子複合体を用いて細胞に感染させる。アデノウイルスベクターは、結合したＤＮＡが損傷を受ける前に、有効な結合、内在化、およびエンドソームの分解を可能にする。リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接in vivo遺伝子導入を媒介する能力を有することを示した。標準的なリポソーム調製物において、遺伝子導入プロセスは、非特異的であり、局在化されたin vivo摂取および発現は、例えば直接in situ投与後の、腫瘍デポジットにおいて報告された（Nabel，1992）。 in vivoでの哺乳動物体組織への直接遺伝子導入は、ヒト遺伝子療法において有効な用途を有する開発中の技術である。かかるアプローチの主な利点は、技術の簡易性および安全性である。直接遺伝子導入法の３つのタイプが開発された：粒子衝撃、リポソーム媒介デリバーおよび裸の（naked）ＤＮＡ導入。最初に移植組織の形質転換に適用された（Klein et al.，1987）粒子衝撃法では、ＤＮＡ被覆粒子が標的器官、組織または単細胞に有効に浸透することができるように、該ＤＮＡ被覆粒子を高速に加速する。種々の哺乳動物体組織への遺伝子導入は、粒子衝撃法を用いて in vitro、ex vivoおよびin vitroで有効に行われた（Yang et al.，1990）。リポソーム媒介遺伝子導入はまた、in vivo遺伝子導入のための有効な方法でもある。例えば、ＤＮＡ−リポソーム複合体は、ヒト黒色腫細胞への直接遺伝子導入のために用いられた（Nabel et al.，1993）。中和抗体を生じる、インルエンザＡまたはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルスに対するワクチンを開発する試みは、種々の単離体または菌株の間のウイルスエンベロープタンパク質の多様性である。マウスおよびヒトの両方におけるＣＴＬは、保存された内部ウイルスタンパク質から誘導されたエピトープを認識することが可能であり（Townsend et al.，1989）、ウイルスに対する免疫応答において重要であると考えられる（Taylor et al.，1986）ので、試みは、種々のウイルス菌株に対する異種保護を提供することが可能なＣＴＬワクチンの開発に対して行われた。ＣＤ８⁺ＣＴＬは、それらのＴ細胞受容体が主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ類分子（Germain，1981）に関連するウイルスペプチドを認識するとウイルス感染細胞を殺す。これらのペプチドは、ウイルスにおけるタンパク質の位置または機能に関係なく、内発的に合成されたウイルスタンパク質から誘導される。かくして、保存されたウイルスタンパク質からのエピトープの認識により、ＣＴＬは、交差鎖保護を提供する。ＣＴＬ認識のためにＭＨＣＩ類分子に会合する能力を有するペプチドは、細胞形質または小胞体中に存在するかまたはそれを介して通過するタンパク質から生ずる（Yewdell et a l.，1989）。したがって、一般に、エンドソームプロセシング経路に入る外因性タンパク質は（ＭＨＣＩＩ類分子により与えられる抗原の場合）、ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答発生時に効果的ではない。ＣＴＬ応答を生じるためのほとんどの試みは、複製ベクターを用いて細胞においてタンパク質抗原を産生した（Hahn et al.，1992）か、または、ペプチドの細胞質ゾル中への導入に集中した（Collins et al.，1992）。これらのアプローチは、共に、ワクチンとしてのそれらの有用性を減少させるという限界がある。レトロウイルスベクターは、融合タンパク質として発現することができ、かつ、なおも、組換えウイルスの複製能を維持することができるポリペプチドの部位および構造について制限を持っており（Miller et al.，1992）、続いて起こる免疫化のためのワクシニアのようなベクターの有効性は、該ベクター自体に対する免疫応答により折衷される（Cooney et al.，1991）。また、ウイルスベクターおよび修飾病原体は、ヒトにおけるそれらの使用を妨げる固有の危険を持っている（Hascola et al.，1989）。さらにまた、与えられるべきペプチドエピトープの選択は、個々のＭＨＣ抗原の構造に依存しており、したがって、ペプチドワクチンは、異系交配群におけるＭＨＣハプロタイプの多様性による有効性を制限していた（Townsend et al.，1989; Taylor et al.，1986; Germain，1981）。したがって、ウイルスタンパク質をコードしている非複製プラスミドＤＮＡによる免疫化は、感染因子が関係しておらず、ウイルス粒子の組み立てが必要ではなく、決定因子選択を可能にするので、優れている。核タンパク質（ＮＰ）の配列は、インフルエンザの種々の菌株の間で保存される（Gammelin et al.，1989; Gor man et al.，1991）ので、ここで、ＮＰに関する遺伝子をクローン化した菌株に対して異質であるインフルエンザＡ型の毒性菌株による次なる抗原投与に対して保護を行った。ベクター使用ワクチンは、Kieny et al．(1992)、Hock et al．(1993)およびYankaukas et al．(1993)によっても開示された。マウスにおけるＤＮＡ発現ベクターの筋肉内（i.m.）注射は、筋肉細胞によるＤＮＡの摂取およびＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現を生じることを示した（Ascadi et al.，1991; Fazio et al.，1994）。プラスミドは、エピソーム的に維持されることを示し、複製しなかった。結果として、ラット、魚および霊長類の骨格筋ならびにラットの心筋におけるi.m.注射後に持続性発現が観察された（Wolff et al.，1992）。筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）は、成長しきった動物の骨格筋および心筋の両方において高度に発現される（Eppenberger et al.，1964; Jockers-Wretou et al.，1975; Richterich et al.,1967; Tanzer et al.，1959）。骨格筋原線維分化の間のＭＣＫ転写の活性化が示され（Chamberlain et al.，1985; Jaynes et al.，1986; Perriard 1979; Perriard et al.，1978; Rosenberg et al.，1 982）、多重シス作用性調節配列は、ＭＣＫ遺伝子の５’フランキング配列および第一イントロンにおいて同定された（Jaynes et al.，1988; Sternberg et al .，1988）。最もよく特徴付けられた要素は、ＭＣＫ転写開始部位の約１，１００ヌクレオチド（ｎｔ）５'に位置する２０７塩基対（ｂｐ）筋肉特異的エンハンサーである。別のエンハンサー要素は、第一イントロンにおける９００ｎｔ領域内に位置する。約７７６ｎｔ５’ＭＣＫ配列もまた、培養細胞中で筋肉細胞型特異性を示すが、この要素からの発現の絶対的レベルは、エンハンサーが存在する場合の発現とあまり一致しない（Jaynes et al.，1988）。両方のエンハンサーとは相互に作用するが近位要素とは相互に作用しない筋細胞特異的結合活性ＭＥＦ１が同定された（Buskin et al.，1989）。さらにまた、無傷ＭＥＦ１部位は、５'エンハンサーが培養における骨格筋原線維分化の間にＭＣＫ発現において機能することを必要とする。発明の概要本発明は、免疫化または遺伝子療法に有用なＤＮＡ構築物に関する。本発明構築物は、プロモーターまたはプロモーターおよび１以上のエンハンサー要素などの筋肉特異的調節要素、ならびに筋肉特異的調節要素の制御下のＤＮＡ配列を含有してなる。該ＤＮＡ構築物中にいくつかのＤＮＡ配列を取り込んでいてもよい。一の具体例では、該ＤＮＡ配列は、抗原、抗原性決定因子または抗原のエピトープをコードしている。第二の具体例では、該ＤＮＡ配列は、筋肉疾患において影響される正常な筋肉遺伝子である。第三の具体例では、該ＤＮＡ配列は、異常な筋肉細胞を遮断するためのアンチセンスである。第四の具体例では、該ＤＮＡ配列は、哺乳動物血液またはリンパ系において循環するタンパク質をコードしている。本発明は、筋肉細胞内の正常な遺伝子の発現または異常な遺伝子発現の遮断により筋肉の疾患の影響を改善するため、循環タンパク質または筋肉が主としては関係していない病状を変更させるタンパク質をコードしているトランスジーンの異種発現のため、およびワクチン開発のために有用である。図面の簡単な説明図１は、ＭＣＫの−１３５４から＋７までのＤＮＡ配列を示す。図２は、ｐＭＣＫのマップを示す。図３は、導入された筋肉細胞における単純疱疹ウイルス糖タンパク質ｇＤ２の産生を示すウェスタンブロットの代表例を示す。図４は、ｐＭＣＫｇＤｆまたは対照プラスミドで免疫化されたマウスの膣洗液における抗原投与後相乗平均ウイルス力価を示す。図５は、ｐＭＣＫｇＤｆまたは対照プラスミドで免疫化されたマウスの間での重篤な臨床疾患の発生を示す。図６は、ｐＭＣＫｇＤｆで用量を変化させつつ免疫化されたマウスの膣洗液における抗原投与後相乗平均ウイルス力価を示す。図７は、ｐＭＣＫｇＤｆで用量を変化させつつ免疫化されたマウスの間での重篤な臨床疾患の発生を示す。発明の詳細な説明本発明は、免疫化または遺伝子療法に有用なＤＮＡ構築物に関する。本発明構築物は、プロモーターまたはプロモーターおよび１以上のエンハンサー要素などの筋肉特異的調節要素、ならびに筋肉特異的調節要素の制御下のＤＮＡ配列からなる。ＤＮＡ配列は、一般に、異種配列、すなわち、自然には筋肉特異的調節要素に操作可能に連結しないものである。いくかのＤＮＡ配列を該ＤＮＡ構築物に取り込んでもよい。一の具体例では、該ＤＮＡ配列は、抗原、抗原性決定因子または抗原のエピトープをコードしている。第二の具体例では、該ＤＮＡ配列は、筋肉疾患において影響される正常な筋肉遺伝子である。第三の具体例では、該ＤＮＡ配列は、異常な筋肉細胞を遮断するためのアンチセンスである。第四の具体例では、該ＤＮＡ配列は、哺乳動物血液またはリンパ系において循環するタンパク質をコードしている。本発明は、筋肉細胞内の正常な遺伝子の発現または異常な遺伝子発現を遮断により筋肉の疾患の影響を改善するため、循環タンパク質または筋肉が主としては関係していない病状を変更させるタンパク質をコードしているトランスジーンの異種発現のため、およびワクチン開発のために有用である。本発明ＤＮＡ構築物の第一要素は、筋肉特異的調節要素である。筋肉特異的調節要素は、筋肉組織において特異的に遺伝子の転写または発現に影響を及ぼすが他の体組織では影響を及ぼさない調節要素である。該筋肉特異的調節要素は、一般に、筋肉特異的プロモーターであるが、１以上のエンハンサーを含んでもよい。筋肉特異的調節要素の例としては、クレアチンキナーゼの筋肉イソ酵素(ＭＣＫ)（Sternberg et al.，1988）、ミオシンＬ（light）キナーゼ（Merlie 1992a ，1992b）、筋肉特異的アルドラーゼ（Concordet et al.，1993）、筋肉特異的エノラーゼ（Gaillongo et al.，1993）、トロポニンＣ（Prigozy et al.，1993 ）、ミオシン（Kitsis et al.，1991; Takeda et al.，1992，von Harsdorf et al.，1993）などの筋肉特異的遺伝子から選択されるものが挙げられる。これらのプロモーターの多くは、転写因子のＭyoＤファミリーの制御下にある（Olsen 1990; Hart 1992）。これらの調節要素および他の筋肉特異的調節要素は、それらが作用の筋肉特異性を維持する程に長い不必要な配列を除去するように修飾してもよい。本発明ＤＮＡ構築物の第二要素は、筋肉特異的調節要素に操作可能に連結されるＤＮＡ配列である。「操作可能に連結する」とは、このように記載された成分が所定の方法でそれらを機能せしめる関係にある場合の並置を意味する。例えば、プロモーターは、該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合にコード化配列に操作可能に連結される。免疫化または遺伝子療法に有用なＤＮＡ配列は、本発明ＤＮＡ構築物の第二要素として用いることができる。該ＤＮＡ配列は、一般に、異種配列、すなわち、自然には筋肉特異的調節要素に操作可能に連結しないものである。一の具体例では、該ＤＮＡ配列は、抗原、抗原性決定因子または抗原のエピトープをコードしている。「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して分泌性、体液性および／または細胞性抗原特異的応答を起こすであろう１以上のエピトープを含有する分子を意味する。該用語は、また、「免疫原」と互換性をもって用いられる。該ＤＮＡ配列は、抗原のタンパク質部分をコードするであろう。宿主は、適切には、本発明に従って産生されたタンパク質により提供されるシグナルに従って該タンパク質をその天然状態に修飾するであろう。したがって、宿主抗原において産生された抗原は、タンパク質または宿主修飾タンパク質であってよい。該抗原は、２以上の抗原の融合ペプチドであってよい。特に、抗原としては、天然タンパク質もしくはタンパク質フラグメント、または合成タンパク質もしくはタンパク質フラグメントまたはペプチドが挙げられる。該抗原としては、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、核タンパク質、核ペプチドが挙げられる。また、ペプチド−ペプチドコンジュゲートも挙げられる。抗原の例としては、限定されないが、ウイルス性もしくは細菌性肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ポリオ、肺炎球菌、疱疹、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型、クラミジア、水痘−帯状疱疹ウイルスまたは狂犬病に対する免疫応答を誘発させる能力を有するものが挙げられる。第二の具体例では、ＤＮＡ配列は、筋肉疾患において影響を及ぼされる正常な筋肉遺伝子である。キナーゼ遺伝子は、筋緊張性ジストロフィーにおいて影響を及ぼされることが知られている。この具体例では、正常なキナーゼ遺伝子は、筋肉中への導入のために筋肉特異的プロモーターに操作可能に連結される。第三の具体例では、ＤＮＡ配列は、異常な筋肉遺伝子の発現を遮断するためのアンチセンスである。該アンチセンスは、筋肉遺伝子によって産生されるｍＲＮＡに結合して翻訳を防止するか、または、異常な遺伝子の調節領域に結合して異常な遺伝子の転写を防止する。第四の具体例では、ＤＮＡ配列は、哺乳動物血液またはリンパ系において循環するタンパク質をコードする。循環タンパク質の例としては、限定されないが、インスリン、ペプチドホルモン、ヘモグロビン、成長因子、肝臓酵素、凝固因子および酵素、補体因子、サイトカイン、組織壊死因子およびエリトロポイエチンが挙げられる。本発明ＤＮＡ構築物は、種々のよく知られている方法により構築することができ、部分のライゲーションのオーダーは、変化させることができる。一の具体例では、ＤＮＡ構築物は、免疫化または遺伝子療法のために望ましいベクターに、または、免疫化または遺伝子療法のために用いられるベクターの構築において用いられる中間体ベクターに、筋肉特異的調節要素およびＤＮＡ配列を別々にライゲートすることによって調製される。第二の具体例では、筋肉特異的調節要素およびＤＮＡ配列は、一緒にライゲートされて、免疫化または遺伝子療法のために望ましいベクターに挿入することができるカセットを提供する。免疫化および遺伝子療法のために用いることができるベクターとしては、前記ベクターおよび当該技術分野で一般に知られているものが挙げられる。さらに、ＤＮＡ構築物は、当該技術分野で知られている技術によりベクターを使用せずに筋肉組織中に直接導入することができる。本発明は、ＤＮＡ構築物および医薬的に許容される担体を含有してなるワクチン（またはワクチン組成物）を提供するものである。ＤＮＡ構築物は、単独で用いられるか、または、ワクチンを調製するために用いられるベクターに取り込まれる。このワクチンを用いて、ワクチンの有効な免疫化量を哺乳動物に投与することにより、疾患に対してヒトを含む哺乳動物を免疫化する。ワクチンの有効な免疫化量は、知られているか、または、当業者により容易に決定することができる。ワクチンは、筋肉組織への注射により対象体に投与される。ワクチンは、ＤＮＡ構築物の抗原に対して指向される抗体および／または細胞免疫応答の継続的保護レベルを誘発する。本発明は、また、筋肉細胞内での正常な遺伝子の発現によるかまたは異常な遺伝子発現の遮断により筋肉の疾患の影響を改善するための治療、または、循環タンパク質または筋肉が主としては関係しない病状を変更するタンパク質をコードするトランスジーンの異種発現についての治療を提供するものである。疾患の治療は、本発明ＤＮＡ構築物を筋肉組織に導入することにより行われる。ＤＮＡ構築物は、単独またはベクター中で、筋肉組織への注射により直接導入することができる。別法としては、ベクター中のＤＮＡ構築物を前記した公知の遺伝子療法のいずれかにより筋肉組織に導入することができる。また、ベクター中のＤＮＡ構築物を公知の技術によりin vitroで筋原線維に導入することができ、次いで、処置された筋原線維をin vivo環境に戻すことができる。本発明ＤＮＡ構築物は、当該技術分野で知られているように永久遺伝子導入のために用いることができる。別法としては、本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物が宿主ＤＮＡに組み込まれない可逆的遺伝子導入のために用いることができる。可逆的遺伝子導入では、ＤＮＡ構築物は、医薬品と同様に腹腔内投与される。この場合、ＤＮＡ構築物は、異種ＤＮＡ配列の転写および発現が予め決定されたレベル以下に減少する場合に投与される。筋肉細胞において選択的に発現される調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）の使用に対していくつかの利点がある。好適なベクターにおけるこれらの調節要素は、有効な構成プロモーター(例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど)を用いる比較できるベクターよりも安全利点を提供する。分化した筋肉細胞に対して特異的な転写因子を必要とするプロモータは、他の細胞型において活性ではないであろう。したがって、核酸構築物が相同的または非相同的組換えにより非筋肉細胞のゲノムに取り込まれると、正常なサイレント遺伝子または正常に調節された遺伝子の構成発現を生じないであろう。構成発現の欠損は、抑制されていない手段で望ましくない遺伝子産生物の産生を促進することができる強力な構成プロモーターの使用よりも明らかに優れている。筋肉特異的調節要素により駆動されるクローン化ヌクレオチド配列は、筋肉細胞において構成的に発現されるであろうが、これらの細胞においてベクターを挿入させる組換えは、有害な事象、中断した正常な細胞機能またはホメオスタシスにあまり導かないと思われる。この長所は、主に、筋管の多核化された性質のためである。相同的組換えを介する組込みは、筋肉特異的調製要素を誘導した遺伝子のマルチコピーの１つを役に立たなくするだけであろうし、非相同的組換えの効果は、他の影響を受けない核に存在する対立遺伝子により薄められる。本発明は、説明のために記載されるものであり、如何なる場合も本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を引用して説明される。当該技術分野でよく知られている標準的な方法または以下に詳細に説明する技術が用いられた。説明目的のために、該実施例は、ＭＣＫの調節要素および単純疱疹ウイルス２型の糖タンパク質Ｄ２遺伝子を利用する。しかしながら、ＭＣＫ調節要素の代わりに前記調節要素のいずれかまたは他の筋肉特異的調節要素を用いてもよく、糖タンパク質Ｄ２遺伝子の代わりに他のＤＮＡ配列を用いることができる。実施例１ＭＣＫプロモーターの単離本実施例に従って単離したマウスＭＣＫ遺伝子プロモーターおよびエンハンサー要素は、マウスＭＣＫ遺伝子（Sternberg et al.，1988）のヌクレオチド−１３５４から＋７までに対応しており、図１および配列番号１に記載されている。該ＭＣＫ遺伝子プロモーターおよびエンハンサーは、慣用的な技術および製造者の推奨方法を用いてＰＣＲによりマウスゲノムＤＮＡから単離した。ＰＷＯポリメラーゼを用いて、ＭＣＫ遺伝子要素の増幅における潜在的なエラーを制限した。以下のプライマーを用いた：前向き：5'-GAAGATCTCAGCTGAGGTGCAAAAGGCTCCTG-3'（配列番号２）および逆向き：5'-CCCAAGCTTGTGACCCGGGGGCAGCCCCTGTGCC-3'（配列番号３）。前向きプライマーにおいて下線を付したヌクレオチドは、Ｂgl ＩＩ部位を示し、逆向きプライマーにおいて下線を付したヌクレオチドは、Ｈind ＩＩＩ部位を示す。インビトロジェン（Ｉnvitrogen）（カリフォルニア州サンディエゴ）からプラスミドｐＣＤＮＡ３を入手した。このプラスミドは、プロモーターの下流にポリリンカーを有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する。Ｈind ＩＩＩおよびBgl ＩＩによる消化によりｐＣＤＮＡ３からＣＭＶプロモーターを除去した。増幅したＭＣＫ遺伝子をＨind ＩＩＩおよびBgl ＩＩで消化し、消化されたｐＣＤＮＡ３に挿入して、ｐＭＣＫを産生した。ｐＭＣＫのマップを図２に示す。実施例２ｐＭＣＫにおける単純疱疹２型のｇＤ２遺伝子の挿入ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア（Ｕniversity of Ｐennsylvania）（ペンシルベニア州フィラデフィア）のグレイ・コーエン（Ｇray Ｃohen）およびローゼリン・ローゼンバーグ（Ｒoselyn Ｒosenberg）からプラスミドｐＷＷ６５（Muggeridge et al.，1990）を入手した。該プラスミドは、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（long terminal repeat）プロモーターの制御下でｐＲＳＶｎｔＥＰＡのＨind ＩＩＩ部位に挿入されたＨind ＩＩＩリンカーを有する単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ２（ｇＤ２）遺伝子を含有する。Ｈind ＩＩＩによる消化によりｐＷＷ６５からｇＤ２遺伝子を単離し、ＭＣＫ調節要素の下流でｐＭＣＫのＨind ＩＩＩ部位に挿入した。２つのプラスミド、すなわち、正しい方向にｇＤ遺伝子が挿入されたｐＭＣＫｇＤｆおよび逆方向にｇＤ遺伝子が挿入されたｐＭＣＫｇＤｒを単離した。実施例３筋肉細胞におけるｇＤ２のin vitro産生ｐＭＣＫｇＤｆまたはｐＭＣＫｇＤｒのいずれかを用いて慣用的な技術によりＣ２Ｃ１２筋肉細胞系をトランスフェクトした。後者は、対照として作用する。さらに、構築物の特異性について試験するために、ｐＭＣＫｇＤｆまたはｐＭＣＫｇＤｒのいずれかを用いて慣用的な技術によりＣｏｓ細胞をトランスフェクトした。Ｃｏｓ細胞は、ベクターの筋肉特異性に対して片寄るように選択した。というのは、該ベクターは、該細胞によるＳＶ４０Ｔ抗原発現およびベターにおけるＳＶ４０複製起源の存在の組み合わせのためにＣｏｓ細胞において増幅することができるからである。この増幅により、Ｃｏｓ細胞当たりおよびＣ２Ｃ１２細胞当たりのベクター数が多くなり、したがって、遺伝子発現の機会が多くなる。トランスフェクトした細胞を増殖させ、ウェスタンブロット分析法によりｇＤの発現をモニターした。結果を図４に示す。この図は、ｐＭＣＫｇＤｆでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞は、免疫原性ｇＤを産生し、ｐＭＣＫｇＤｒでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞は、免疫原性ｇＤを産生しなかったことを示す。ｐＭＣＫｇＤｆまたはｐＭＣＫｇＤｒのいずれでトランスフェクトされたＣｏｓ細胞も検出可能な量のｇＤを産生しなかった。実施例４筋肉組織におけるｇＤのin vivo産生および免疫応答の発生本実施例のために６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃを用いた。該マウスを３つのグループに分け、１週１回の間隔で３回、ｐＭＣＫｇＤｆ、ｐＭＣＫｇＤｒまたはｐＲＳＶｎｔのいずれか１００μgで免疫化した。ｐＭＣＫｇＤｒは、第一対照として作用し、ｐＲＳＶｎｔは、第二対照として作用した。ウイルス抗原投与前に、該マウスをメドロキシプロゲステロン２.０mgで皮下前処置して、ウイルス抗原投与に対する均一な感受性を誘発した（Teepe et al.，1990）。最後のワクチン注射から２〜３週間後、ダクロン・プレジェット（Ｄacron pledget）に吸着させたＨＳＶ−２ＭＳ菌株５.３×１０⁴〜１.７×１０⁵ＰＦＵ／mlで膣内生ウイルス抗原投与を行った。膣洗液標本のプラークアッセイにより膣洗液ウイルス力価を得た。マン−ホイットニー（Ｍann-Ｗhitney）Ｕ試験を用いてウイルス力価を比較した。生殖器疾患の発生について毎日マウスを評価した。重篤な疾患は、以下のように定義した：２日間連続で生殖器浸軟の存在、尿停留の発生、根深い悪液質の発生、または後脚麻痺の発生。慣用的な技術を用いて、抗体力価および中和抗体についての血清学的アッセイを行った。バキュロウイルス発現ｇＤ２３μgで９６ウエルプレートを被覆することによりＥＬＩＳＡを行った。正常なヤギ血清の溶液、トウィーン(Ｔween) および生理食塩水と一緒にＥＬＩＳＡプレートをインキュベートすることにより非特異的結合を防止した。試料を１：２から開始して１：１０００に連続希釈した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−マウスＩgＧ抗体と一緒にインキュベートすることにより抗−ｇＤ２抗体の結合を検出した。対数変換した光学密度の回帰分析によりＥＬＩＳＡユニットを得た。マン−ホイットニーＵ試験を用いて血清抗 −ｇＤ２抗体力価（ＥＬＩＳＡによる）および中和活性を比較した。図４は、免疫化マウス由来の膣洗液における抗原投与後の相乗平均ウイルス力価を示す。該ウイルス力価は、抗原投与の２日後、マウスの３つのグループにおいて類似していた。該ウイルス力価は、抗原投与の６日後、ｐＭＣＫｇＤｆ免疫化マウスではｐＭＣＫｇＤｒまたはｐＲＳＶｎｔ免疫化マウスと比較して低下した（各々、相乗平均力価１２６、２８８、４８９ＰＦＵ／ml；ｐ＜０.０５）。図５は、抗原投与後の免疫化マウスにおける重篤な疾患の発生を示す。重篤な疾患の発生は、ｐＭＣＫｇＤｆ免疫化マウスの間ではｐＭＣＫｇＤｒまたはｐＲＳＶｎｔ免疫化マウスと比較して顕著に遅延された（各々、中央値９日、７日、７日；ｐ＜０.０１）。実施例５筋肉組織におけるｇＤのin vivo産生および免疫応答の発生免疫化のためのアジュバントとして１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（１，２５(ＯＨ)₂Ｄ₃）０.１μgを用いて実施例４を繰り返し行った。アジュバントとしての１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃の使用により、膣洗液において測定されるようにウイルス力価の低下が増強され、さらに、ＥＬＩＳＡにより測定されるように血清抗体力価が増強され、血清中和抗体が増強された。実施例６ｐＭＣＫｇＤ免疫化の投与効果６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃを５つのグループに分け、１週１回の間隔で３回、変化する用量のｐＭＣＫｇＤｆ（３μg、１０μg、３０μgまたは１００μg ）およびｐＭＣＫｇＤｒ１００μgで免疫化した。アジュバントとして（１，２５(ＯＨ)₂Ｄ₃）０.１μgを用いて免疫化を行った。実施例４の記載に従って、マウスを処置し、ＨＳＶで抗原投与した。実施例４の記載に従って、疾患の重篤度および血清学的アッセイを分析した。図６は、免疫化マウスからの膣洗液における抗原投与後の相乗平均ウイルス力価を示す。この図は、膣洗液におけるウイルス力価に対する用量相関効果を示す。図６は、抗原投与の２日後、ｐＭＣＫｇＤｆ１００μg免疫化マウスについてのウイルス力価が、対照ｐＭＣＫｇＤｒ免疫化マウスについてのウイルス力価よりも有意に低かったことを示す。図６は、抗原投与の２日後、ｐＭＣＫｇＤｆ１００μg免疫化マウスについてのウイルス力価が対照ｐＭＣＫｇＤｒ免疫化マウスについてのウイルス力価よりも有意に低かったことを示す（ｐ＝０.０５）。図６は、抗原投与の６日後、ｐＭＣＫｇＤｆ３０μgおよび１００μg免疫化マウスについてのウイルス力価が対照ｐＭＣＫｇＤｒについてのウイルス力価よりも有意に低かったことを示す（各々、ｐ＝０.０５、ｐ＜０.０１）。図７は、抗原投与後の免疫化マウスにおける重篤な疾患の発生を示す。この図は、重篤な臨床疾患の発生に対する用量相関効果を示す。重篤な疾患の発生は、ｐＭＣＫｇＤｒ免疫化マウスと比較してｐＭＣＫｇＤｆ免疫化マウスの間で顕著に遅延された（ｐ＝０.０２）。本発明の方法および組成物は、本明細書では数例だけ記載しているが、種々の具体例の形態に取り込むことができると認識されるであろう。他の具体例が存在し、それが本発明の精神から逸脱しないことは、当業者に明らかであろう。したがって、記載した具体例は、説明であり、限定しようとするものではない。文献のリスト Anderson，et al．(1980)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:5399-5403。 Ascadi，G．et al．(1991)．Nature 352:815。 Berkner(1992)．Curr．Top．Microbiol．Immunol．158:39-61。 Berkner，et al．(1988)．BioTechniques 6:616-629。 Brandyopadhyay and Temin(1984)．Mol．Cell．Biol．4:749-754。 Breakfield and Geller(1987)．Mol．Neurobiol．1:337-371。 Brinster，et al．(1981)．Cell 27:223-231。 Buchschacher and Panganiban(1992)．J．Virol．66:2731-2739。 Buskin，J．et al．(1989)．Hol．Cell Biol．9:2627-2640。 Chamberlain，J．S．et al．(1985)Mol．Cell Biol．5:484-492。 Collins，D．et al．(1992)．J．Immunol．148:3335。 Concordet，J．et al．(1993)．Mol．Cell．Biol．13:9。 Constantini and Lacy(1981)．Nature 294:92-94。 Cooney，E．et al．(1991)．Lancet 337:567。 Cotten，et al．(1990)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:4033-4037。 Culver，et al．(1992)．Science 256:1550-1552。 Curiel，et al．(1991a)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8850-8854。 Curiel，et al．(1991b)．Hum．Gene Ther．3:147-154。 Eglitis，M．and Anderson，W．F．(1988)．Biotechniques 6:608。 Eppenberger，H．M．et al．(1964)．Dev．Biol．10:1-16。 Fazio，V．M.，et al．(1994)．Biochem．Biophys．Res．Comm．200:298。 Felgner et al．(1987)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417。 Fink，et al．(1992)．Hum．Gene Ther．3:11-19。 Freese，et al．(1990)．Biochem．Pharmacol．40:2189-2199。 Friedmann，T．(1989)．Science 244:1275。 Gaillongo，A．et al．(1993)．Eur．J．Biochem．214:367。 Gammelin et al．(1989)．Virology 70:71。 Germain，R．(1981)．Nature 353:605。 Gordon，et al．(1980)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:7380-7384。 Gorman et al．(1991)．J．Virol．65:3704。 Gorziglia and Kapikian(1992)．J．Virol．66:4407-4412。 Graham and van der Eb(1973)．Virology 52:456-467。 Hahn，C．et al．(1992)．Proc．Nat．Acad．Sci．USA 89:2679。 Hart，S．(1992)．BioScience 42:582。 Helseth，et al．(1990)．J．Virol．64:2416-2420。 Hock，L．J．et al．(1993)．U.S．Patent No．5,273,876。 Jaynes，J．B．et al．(1986)．Nol．Cell Biol．6:2855-2864。 Jaynes，J．B．et al．(1988)．Mol．Cell Biol．8:62-70。 Jockers-Wretou，E．et al．(1975)．Clin．Chem．Acta．50:233-232。 Johnson，et al．(1992)．J．Virol．66:2952-2965。 Kaneda，et al．(1989)．J．Biol．Chem．264:12126-12129。 Kieny，M-P．et al．(1992)．U.S．Patent No．5,169,763。 Kitsis，R．et al．(1991)．Proc．Nat; Acad．Sci．USA 88:4138。 Klein，T．M.，et al．(1987)．Nature 327:70。 Ledley，F．D．(1987)．J．Pediatrics 110:1。 Lim，et al．(1992)．Circulation 83:2007-2011。 Madzak，et al．(1992)．J．Gen．Virol．73:1533-1536。 Mann and Baltimore(1985)．J．Virol．54:401-407。 Margolskee(1992)．Curr．Top．Microbiol．Immunol．158:67-90。 Mascola，L．et al．(1989)．Arch．Intern．Med．149:1569。 Merlie，J．(1992a)．Cell 69:67。 Merlie，J．(1992b)．Cell 69:79。 Miller，A．(1992)．Curr．Top．Microbiol．Immunol．158:1。 Miller，et al．(1985)．Mol．Cell．Biol．5:431-437。 Miller，et al．(1988)．J．Virol．62:4337-4345。 Hoss(1992)．Curr．Top．Hicrobiol．Immunol．158:25-38。 Muzyczka(1992)．Curr．Top．Microbiol．Immunol．158:97-123。 Nabel，et al．(1990)．Science 249:1285-1288。 Nabel(1992)．Hum．Gene Ther．3:399-410。 Nabel，G．J.，et al．(1993)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:11307。 Ohi，et al．(1990)．Gene 89:279-282。 Olsen，E．(1990)．Genes and Development 4:1454。 Page，et al．(1990)．J．Virol．64:5370-5276。 Pellicer，et al．(1980)．Science 209:1414-1422。 Perriard，J．C．(1979)．J．Biol．Chem．254:7036-7041。 Perriard，J．C．et al．(1978)．Arch．Biochem．Biophys．191:90-100。 Petropoulos，et al．(1992)．J．Virol．66:3391-3397。 Prigozy，T．et al．(1993)．Somatic Cell Mol．Genet．19:111。 Quantin，et al．(1992)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2581-2584。 Richterich，R．et al．(1976)．Comparative studies on creatine kinase and its isoenzymes，pp．243-253．In: N van Thoai et al．(eds.)，Homologous Enzymes and Biochemical Evolution，Gordon and Breach Publishers，New Yor k，N．Y.。 Rosenberg，U．B．et al．(1982)．Proc．Nat．Acad．Sci．USA 79:6589-6592。 Rosenfeld，et al．(1992)．Cell 68:143-155。 Shimada，et al．(1991)．J．Clin．Invest．88:1043-1047。 Sorge，et al．(1984)．Mol．Cell．Biol．4:1730-1737。 Srivastava，A．(1993)．U.S．Patent No．5,242,479。 Sternberg，E．A.，et al．(1988)．Hol．Cell．Biol．8:2896。 Stewart，et al．(1992)．Hum．Gene Ther．3:267-275。 Stratford-Perricaudet，et al．(1990)．Hum．Gene Ther．1:241-256。 Takeda，S．et al．(1992)．J．Biol．Chem．267:16957。 Tanzer，M．L．et al．(1959)．J．Biol．Chem．234:3201-3204。 Taylor．P．et al．(1986)．Immunology 58:417。 Teepe，A．G．et al．(1990)．Antiviral Res．14:227。 Townsend，A．et al．(1989)．Ann．Rev．Immunol．7:601。 von Harsdorf，R．et al．(1993)．Circulat．Res．72:689。 Wagner，et al．(1990)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3410-3414。 Wagner，et al．(1991)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:4255-4259。 Wang and Huang(1989)．Biochemistry 28:9508-9514。 Wilkinson，et al．(1992)．Nucleic Acids Res．20:2233-2239。 Wolff，J．A.，et al．(1990)．Science 247:1465(1990)。 Wolff，J．A.，et al．(1991)．BioTechniques 11:474-485。 Wolff，J．et al．(1992)．Hum．Mol．Genet．1:363。 Wooster，R.，et al．(1994)．Science 265:2088。 Wu，et al．(1989a)．Genomics 4:560-569。 Wu，et al．(1989b)．J．Biol．Chem．264:16985-16987。 Wu，et al．(1991)．J．Biol．Chem．266:14338-14342。 Yang，N．S.，et al．(1990)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9568。 Yankauckas，M．A.，et al．(1993)．DNA Cell Biol．12:771。 Yewdell，J．et al．(1989)．Science 244:1072。 Zenke，et al．(1990)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3655-3659。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．筋肉特異的調節要素および該要素に操作可能に連結されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物。２．筋肉特異的調節要素がプロモーターおよび少なくとも１つのエンハンサーからなる請求項１記載のＤＮＡ構築物。３．筋肉特異的調節要素がクレアチンキナーゼの筋肉イソ酵素（ＭＣＫ）、ミオシンＬキナーゼ、筋肉特異的アルドラーゼ、筋肉特異的エノラーゼ、トロポニンＣ、およびミオシンからなる群から選択された遺伝子の調節要素である請求項２記載のＤＮＡ構築物。４．筋肉特異的調節要素が配列番号２に記載するＭＣＫのプロモーターおよびエンハンサーである請求項２記載のＤＮＡ構築物。５．ＤＮＡ配列が抗原をコードしている請求項１記載のＤＮＡ構築物。６．抗原がウイルス性または細菌性肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ポリオ、肺炎球菌、庖疹、ＲＳウイルス、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型、クラミジア、水痘一帯状病疹ウイルスまたは狂犬病からなる群から選択される請求項５記載のＤＮＡ構築物。７．ＤＮＡ配列がアンチセンスＲＮＡをコードしている請求項１記載のＤＮＡ構築物。８．ＤＮＡ配列が循環タンパク質をコードしている請求項１記載のＤＮＡ構築物。９．循環タンパク質がインスリン、ペプチドホルモン、ヘモグロビン、成長因子、肝臓酵素、凝固因子および酵素、補体因子、サイトカイン、組織壊死因子ならびにエリトロポイエチンからなる群から選択される請求項８記載のＤＮＡ構築物。１０．ＤＮＡ配列が生物学的に機能的な分子タンパク質をコードしている請求項１記載のＤＮＡ構築物。１１．請求項１記載のＤＮＡ構築物を含有してなるベクター。１２．宿主染色体中への組込みが可能なヌクレオチド配列をさらに含有してなる請求項１１記載のベクター。１３．宿主において複製可能なヌクレオチド配列をさらに含有してなる請求項１１記載のベクター。１４．請求項２記載のＤＮＡ構築物を含有してなるベクター。１５．宿主染色体中に組込みが可能なヌクレオチド配列をさらに含有してなる請求項１４記載のベクター。１６．宿主において複製可能なヌクレオチド配列をさらに含有してなる請求項１４記載のベクター。１７．請求項５記載のＤＮＡ構築物および生理学的に許容される担体を含有してなるベクター。１８．請求項６記載のＤＮＡ構築物および生理学的に許容される担体を含有してなるベクター。