JPH11506568A

JPH11506568A - 磁気反応粒子の改良した製法

Info

Publication number: JPH11506568A
Application number: JP9500468A
Authority: JP
Inventors: リバティ，ポール・エイ; ラオ，ガラ・シー; チャラッパ，ジョゼフ・エヌ; ピッコリー，スティーブン・ピー
Original assignee: Immunivest Corp
Current assignee: Immunivest Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1999-06-08
Also published as: EP0842042B1; CA2220169C; DE69632785T2; US6120856A; DE69632785D1; CA2220169A1; US5698271A; EP0842042A4; WO1996040502A1; EP0842042A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、合成または天然ポリマー、特に、生物学的に活性なペプチドおよび蛋白質で、遷移的に安定な、コロイド状微粒子磁性基質を直接被覆する方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】磁気反応粒子の改良した製法発明の分野本発明は、磁性粒子の安定な懸濁および再懸濁可能な被覆磁性粒子、特に、限定はしないが、生化学的または生物学的活性を有するもの、かかる粒子を包含する組成物に関し、およびかかる粒子ならびに組成物の製法および使用法に関する。生物学的に活性な磁性粒子は、様々な調製および診断技術における使用を提供する。なかでも、磁場を利用して磁性粒子を懸濁から分離する高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）がある。これらの粒子が関係する生物学的物質（例えば、細胞、薬剤）に結合するところの例において、関係物質または標的物質は、それによって、磁性粒子と結合しない他の物質から分離できる。本明細書中で使用するように、「再懸濁可能な被覆粒子」なる語は、コロイド状懸濁を形成し、懸濁から分離でき、次いで再懸濁できる精巧に分離した固体を示す。「磁性」は、永久磁性であってもよく、または永久磁性でなくてもよく、常磁性または超常磁性であってもよいが、どの場合でも、磁場における反応を示す、すなわち磁気反応する物質を含む。「崩壊した」粒子は、小さすぎて完全な磁区を含有できない粒子、あるいは、そのブラウンエネルギーが磁気モーメントを上回る粒子である。一般に、これらの粒子は、サイズが０．０３ミクロン以下である。関連分野の記載多くの技術が、磁性粒子または有機磁性体調製のための先行分野で提唱されてきた。そのような粒子は、一般に、３つのカテゴリー：小粒子の大、小および微小凝塊に分かれる。１０ミクロン（μ）以上の直径を有する大きな磁性粒子は、弱磁場および磁場勾配に応答する。それらのサイズにより、それらは溶液から迅速に沈降し、また、単位重量あたりの限られた表面領域を有する傾向がある。また、大きな粒子は、永久に磁化し得るので、磁場に属した後、凝集する傾向がある。平均０．０３μ以下の直径の磁心を有する小さな粒子は、ブラウンエネルギーによって溶液中に残存し、従って自発的に沈降しない。かかる小磁性粒子の微小凝塊は、様々な方法によって調製する。微小凝塊のサイズに依存して、無理のない時間溶液中に残存し得る物質を調製することができる。さらに、小粒子および小粒子の微小凝塊の磁性特性は、より大きな永久磁性粒子の磁気特性と有意に異なる。酸化鉄のような強磁性体の単結晶かまたはかかる結晶の凝塊のいずれかから成る小磁性粒子は、強磁性体の結晶サイズが約０．０３μ以下であるとき、「超常磁性」になる。強磁性結晶とは異なり、超常磁性結晶は、単に、それらが磁場勾配にあるとき磁気作用のみを示し、永久磁化にはならない。そのような物質は、分散可能な磁性酸化金属粒子および磁気反応粒子を示す。生物レセプターを生じる磁性粒子を得るための一の可能な経路は、米国特許第３９７０５１８号および第４０１８８８６号にあるGiaeverの、吸着によるかかる物質の磁性粒子への物理的な被覆である。ウシ血清アルブミンの１μ径ニッケル粒子への被覆が例示されている。米国特許第４２３０６８５号、Senyeiらは、米国特許第３９７０５１８号の教示を考慮し、「非被覆磁性粒子は、効果的に抗体と結合することができるという論文の検証はない」、およびおそらく生物レセプターについてもないということを述べる。米国特許第４５５４０８８号、Whiteheadらは、酸化鉄に吸着した抗体は、１Ｍ塩化ナトリウム中５０℃、２４時間のインキュベーションによって、実質上分離され、また、吸着した物質の量は少ないことを述べる。本明細書中に記載された超常磁性粒子の一タイプ、すなわちコロイド粒子に関して、米国特許第３９７０５１８号および第４０１８８８６号、Giaeverにおいて提唱された回収方法は、非吸着物質を洗い去るためにかかる粒子を捕獲するのに必要な磁場の力は巨大であるので、かかるコロイド粒子上で容易に使用することはできなかった。さらに、磁場勾配が必要であり、それは、そこに記載された装置では達成できない。高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）の調製での使用に関連して、Giaeverの概念は、抗体または生物レセプターのかかる粒子上での吸着および保持のための効果的な方法が存在するところで働き得る。機能的に許容できる磁性粒子を生物レセプター吸着を経て製造することが明らかにできないので、いくつかの他のアプローチを追求している。これらは、マグネタイト、アルブミン、および蛋白質Ａを含有するミクロスフェアの調製を開示する、Senyeiらによる米国特許第４２３０６８５号を包含する。Senyeiによって教示された調製法は、前記の成分のエマルジョン重合を含む。米国特許第４５５４０８８号、Whiteheadらは、続いて、生物活性分子と共有結合し得る磁性酸化金属のシラン化を教示する。隣接して先行するどちらのアプローチも、凝塊した超常磁性粒子と関係し；従って、凝塊した物質は、磁気反応するとして分類される。関連すると考えられる他の特許は、Robinsonらによる米国特許第４１５２２１０号、Mosbachによる第４３３５０９４号、Kennedyらによる第４０７０２４６号、およびCzer1inskiによる第４４５４２３４号を包含する。これらの特許は、磁性生物学的粒子の調製または使用を開示するが、本発明に類似すると考えられるものは、一つもない。 Moldayによる米国特許第４４５２７７３号は、２５％（ｗ／ｗ）ポリサッカライド溶液中でマグネタイトを形成することによって非イオン性ポリサッカライドでコートした「コロイドの」酸化鉄粒子を開示する。Moldayはさらに、よく知られた化学結合技術による、生物活性分子とそのようにして形成された粒子との共有結合を教示する。リファレンスによって本明細書中に記載されるOwenらによる米国特許第４７９５６９８号は、実質的に多くの不対電子を有するポリマーまたは蛋白質によって、本質的に共有結合状態であると考えられる方法において、被覆されたコロイドサイズの酸化鉄粒子の調製法を教示する。抗体または酵素のような生物活性分子は、（１）わずかにアルカリｐＨまで塩基で滴定することによる遷移元素酸化物と０．１〜１ｍｇ／ｍ１のポリマーまたは蛋白質の共沈、（２）共沈澱物の連続洗浄および（３）適当な緩衝液中での共沈澱物の再懸濁、次いで穏やかな音波処理の結果得られるコロイド磁気反応粒子を含むOwenらのプロセスにおいて、生物活性を保持する。該プロセスにおいて、ほぼ全てのポリマーまたは蛋白質が沈澱する。デキストラン被覆粒子の沈澱がOwenらのプロセス条件に従おうとしたとき、再懸濁可能なコロイド粒子を得ることができなかった。Owen らが、明らかに直接、遷移金属と相互作用する、実質上多くの不対電子を有するポリマーとの共沈を必要とする事実（Moldayが教示するデキストランおよび他の非反応ポリサッカライドとは対照的に）に加えて、その結果は、MoldayおよびOwen らのプロセスが実質上異なることを示唆する。また、Owenらのプロセスは、蛋白質またはポリマーが水または低イオン強度緩衝液中にあることを必要とすることに注目すべきである。デキストランを有する第二鉄および第一鉄と天然のMoldayデキストラン粒子との相互作用は、明らかに存在しないので、そこに教示されたプロセスを調べることは有益である。Moldayのコロイド粒子は、２５％（ｗ／ｗ）水性デキストランＴ−２０（Pharmacia）または他の同様の濃縮ポリサッカライドの存在下で、ＮＨ₄ＯＨを有する第二および第一塩化鉄からマグネタイトを形成することによって調製される。該プロセスにおいて形成された凝集塊は、次いで、低Ｇ力での３サイクルの遠心分離によって除去される。上清中のコロイドデキストランマグネタイトは、非反応デキストランを空隙容量において現れるコロイド粒子から分離するゲル濾過によって回収する。遊離のデキストランの実質量は、粒子が形成された後に存在する。コロイドデキストラン形成のメカニズムについての論議は存在しないが、デキストランが該プロセスにおいて物理的なまたは「バリヤー」としての役割を果たすという考えが妥当なようである。この考えは、２５％（ｗ／ｗ）デキストラン溶液が、豊富なヒドロキシル基と水との相互作用のために、大量の水素結合を有し、極度に粘性であるということに基づく。これらの因子は、拡散を制限する系を創造する。これは、第二および第一鉄イオンと塩基との相互作用を可能にして、その成長が第三のイオンの関与する能力に関連するであろう局部結晶核形成部位を形成する。従って、デキストランの存在は、イオンの関与を制限し、その結果、デキストラン分子がその表面に吸着できる小さいマグネタイト結晶（３００Å以下）が形成する。従って、この筋書きにおいて、デキストランは該プロセスにおけるいくつかの役割を果たす。 Moldayデキストランマグネタイトの別法の形成メカニズムは、マグネタイトの基本的な特性に関連する。Whiteheadらの電子顕微鏡写真から、およびSenyeiらの記載物質から、通常の塩化鉄の塩基性沈澱によって調製したマグネタイトが、約３００Åまたはそれ以下のサイズの安定な結晶からなることは、明らかである。マグネタイトが安定なコロイド分散中で調製できることを示す報告論文はないので、これらの結晶は、相互分子引力を経て凝塊する強い傾向を有するようである。一方、「ｉｎｓｉｔｕ」で、およびMoldayによって使用された高濃度のデキストランによって形成された「チャンバー」中で結晶を形成することによって、ならびに、かかる結晶上を崩壊でき、およびかかる結晶を被覆できるこれらの個々のチャンバーの「壁」を有することによって、Moldayは、コロイド安定磁性粒子の製造を成しげられることを明らかにしている。Giaeverの物質と対照的に、かかる個々のマグネタイト結晶によって提供される表面領域における莫大な差異故に、Moldayは、付加的に、思いがけなく発見して、ある特定のポリサッカライドの吸着問題を解決したようである。ロケット燃料における磁性粒子のコロイド分散は、Papellによる米国特許第３２１５５７２号において開示されている。分散は、０．２５μ径およびより小さい、特に０．１０μ径以下のマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）のような磁性粒子を包含すると言われる。分散は、より大きな粒子サイズの磁性粒子の懸濁を推進剤中で、「破砕進行に従う微小粒子の凝塊または溶結」を防ぐ破砕試薬と共にボールミルすることによって製造する（列２、３３〜３４行）。ボールミルは、破砕作用を生じるための金属ボールを包含する。一般に２％オーダー、しかし１０％でも可能なレベルで包含される破砕試薬は、典型的に、オレイン酸からなり；さらに「・・・他の破砕試薬、例えばステアリン酸およびセチルアルコールは、磁性推進剤の製造に有益であり得、同様の高い表面張力を有する他の長鎖炭化水素、例えばベンゼン、エタン、ヒドラジンおよびガソリンは、粒子担体として有益であり、磁気推進剤の主要な成分であり得る」（列４、５〜６行）。米国特許出願第３９７１０６号は、２５ｎｍないしミクロンサイズ範囲の物質を製造するために、被覆剤存在下での先に形成した結晶凝塊（遷移元素酸化物に関連するマグネタイト）の崩壊を伴うポリマー／蛋白質被覆磁性粒子の製法を開示する。得られる産物のサイズは、分散の度合および条件ならびに被覆物質の結晶凝塊に対する割合に依存する。様々な条件下での音波処理は、選択方法として開示される。ポリマー被覆物質の場合、該プロセスは、例えばMoldayまたはOwen のように、酸化金属が被覆物質存在下のｉｎｓｉｔｕで形成されるところの利益を超える大きな利益を有する。遷移元素酸化物結晶を調製するプロセスを被覆工程から分離することによって、先のプロセスにおける被覆物質の干渉を回避する。そのような干渉は、様々な不利益、例えば外来性結晶成長、酸化プロセスの調節の困難および結晶の不完全という結果になり得、それら全てが最終産物を不純にし得る。米国特許出願第３９７１０６号のＣＩＰである米国特許出願第０８／２３１３７９号は、多くの点において、結晶凝塊崩壊が被覆剤の非存在下で行われる前記のプロセスの改善を構成する別の修飾に関する。その修飾は、被覆されるための物質が崩壊プロセスによって逆に影響されるとき、有益である。崩壊を被覆工程から分離するすることの別の利益は、被覆剤の存在が２結晶凝塊をいっしょに結合することによって崩壊を阻害でき、従って崩壊プロセスを干渉することである。最後に記載した特許出願において記載されたプロセスの単純さおよび得られる物質の有益さにもかかわらず、これらのプロセスから分離した物質は、ある特定の点で制限される。これらの物質の一の制限は、それらに凝塊を引き起こし、最終的に溶液から沈降させる適度なイオン強度緩衝液（０．０１Ｍ）中での安定性の欠如である。従って、製造プロセスにおいて、凝塊を導くイオン強度における変化は、回避されるべきである。さらにかかる物質は、一般に、もしそれらが低イオン強度の緩衝液中にあるならば、磁気補集後に再懸濁するのみであろう。次いで、繰返しの磁気補集および再懸濁でさえも、凝塊を導き得る。しかしながら、この特性は、血清または０．１５Ｍに近いイオン強度緩衝液中での免疫アッセイ行う場合において有益であり得る。これらの培地は、アッセイのインキュベーション時間の間いくつかの凝塊を導くので、および凝塊を、溶液から引き付けるために、より小さい磁気勾配を要するので、いくつかの例において望ましくないこの特性は、本当の利益になり、この現象の存在しない場合よりも小さいサイズの物質の使用を可能にし、または、別法で低磁気勾配分離装置の使用を認める。一方、磁性コロイドの完全なサイズがとても重要であり、そのような凝塊はあまり望ましくないという多くの出願がある。一例は、研究室でのこれらの物質の使用あるいは、腹水液または培養体からのモノクローナル抗体のバイオプロセシング単離（ＭＡｂ）であろう。典型的にそのような培地は、生理学的イオン強度（０．１５Ｍ）であり、例えば、蛋白質ＡをＭＡｂとの結合、および次に続くＭＡｂの脱着に使用するとき、そのようなイオン強度またはかなり高いイオン強度の緩衝液を使用する。また、凝塊が望ましくない免疫アッセイ、例えば二工程インキュベーションでにおける例もある。例えば、慢性肝炎をアッセイするために、典型的なアプローチは、試料中のＩｇＭを捕獲するためにヒトＩｇＭに特異的な強磁性流体を患者の血清と共にインキュベーションすることを伴うであろう。捕獲は、捕獲物質を磁気分離し、次いで非特異的な蛋白質を洗い去ることによって、成し遂げられるであろう。次に、患者ＩｇＭを生じる強磁性流体は、過剰なラベルした肝炎抗原でインキュベートし、再び分離し、洗浄して、いくつかの適当な方法でラベル検出を行う。該プロセスの二工程インキュベーションおよび二工程分離は、イオン強度の調節および、磁気分離ならびに再懸濁操作のどちらに対しても安定であろう物質を必要とする。前記のプロセスでの広範囲な研究および発展の過程で、いくつかの観察から、高イオン強度コロイドの不安定さの問題が、被覆ポリマー／蛋白質の使用による不完全な結晶凝塊に起因することがわかった。さらに、たとえかかる凝塊の表面領域およびそれに単層として吸着すべき被覆物質の量を正確に計算することが、非常に困難であっても、計算は、不完全な結晶凝塊の可能性を示唆する。分散マグネタイト結晶凝塊での広範囲な経験から、表面電荷が凝塊分散の維持に対して重要であることは明白である。これは、低イオン強度リン酸緩衝液（１０〜２０ｍＭ）中でのマグネタイトの音波処理のような単純な実験を行うことによって明らかにできる。そのようなプロセスの結果、遷移的に安定な分散を生じるであろう。もしもそのような物質が、分散状態においてだが、磁気的に補集されるならば、それは再懸濁しないことがわかるであろう。また分散は、単にイオン強度を単純な塩で増加させることによって、迅速に凝塊することができる。さらに該プロセスが完全な被覆という結果にならないことを示唆する証拠は、（１）アニオン性ポリマー、デキストランまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コート物質が、哺乳類細胞に対して非特異的に付着し、および結合は、一部分、結晶表面での鉄原子に起因する正電荷を有するであろう「むきだしの箇所（bare spots）」の細胞表面シアル酸と拮抗し得るアニオン性ポリマーを用いて減少され得る（米国特許出願第０７／９７６４７６号参照）；（２）とても純度の高いスチールウールを用いるＨＧＭＳ（１５０ｋガウス／ｃｍを超える勾配）によって補集された物質の実質的部分をプロセスにおいて凝集する；および（３）物質のサイズをイオン強度によって作用し、０．０２Ｍ程の低いイオン強度にて凝塊を観察できることである。いくつかの理由のために、よく被覆された粒子塩基物質を有することが望ましい。より大きな度合まで、親水性被覆で物質を被覆することによって、高イオン強度培地における安定性が達成されるべきであり、「むきだしの箇所」を覆うことは、細胞表面に対する非特異的結合を減少させ、よりよく被覆された物質は一般に、より多量の生物レセプターをより高い生物活性の発生に結び付けるであろう。また、よりよく被覆された物質は磁気的に補集でき、凝集塊を導くであろう結晶一結晶相互作用なしで再懸濁できるので、当然生ずるべきプロセス利益が存在する。かかるプロセスの高イオン強度誘導凝集塊の関係からの独立もまた、様々な製造工程、例えば精製における有意な利益であろう。さらに、磁気をいくつかの粒子工程における非結合試薬の除去に用いることは、カラムクロマトグラフィーを用いるよりもむしろ単純である。発明の概要本発明は、一部、磁気反応超常磁性粒子の製造を単純化するための新規な方法に関する。本発明の一の態様に従って、プロセスを提供し、それにより、磁気反応酸化金属を、得られる結晶が崩壊状態にある間に被覆を行うことができるような、結晶凝塊を崩壊する被覆プロセス法に用いることによって効果的に被覆できる。広範囲な物質（デキストラン、蛋白質、合成ポリペプチド、ポリマー、コポリマー、界面活性剤およびそれらの組み合わせを包含する）は、結果としてコロイド磁気反応粒子を生じるかかる結晶上を被覆し得る。コロイド産物を得ることに加えて、多くの例において、被覆剤の量を制限することによって、非常に効果的な方法において吸着物質を保持し、単純な研究室の磁石で溶液から除去することができる安定な微小凝塊を得ることが可能である。別法の具体例において、本発明は、高イオン強度系、例えば１．０〜２．０ＭＮａＣｌにおいてコロイド的に安定であり、繰り返し、高勾配磁気分離および、濁度または粒子サイズ成長の発生により明示されるようなサイズ成長なしに再懸濁することができる磁気反応超常磁性粒子の製造に関する。そのような物質は、製造コストを有意に減少させる製造におけるプロセス利益を提供する。これらの利益は、得られる粒子をカラムクロマトグラフィーよりむしろ磁気分離によって、試薬から繰り返し分離する能力、これらのプロセスならびにカップリング化学または修飾／誘導反応において使用できる緩衝液の選択（タイプおよび緩衝液強度）における有意により大きい範囲を包含する。また、これらの物質は、フィルターを通過する産物量に関して、有意により大きいフィルター滅菌（２００ｎｍ以下の物質の場合）する能力をも有する。さらに、それらは、フィルター物質のより大きな選択と矛盾しない。また、これらの物質は、特に哺乳類細胞に対しての有意により低い非特異的結合を行う。また、この新規なクラスの物質は、有意な応用利益、しばしば多くのインキュベーションアッセイで要求されるように、例えば繰り返し分離および再懸濁を行う能力を有する。被覆剤のそれらの増加した含量に起因して、それらは、より大量の生物リガンドをそれらと結合するより大きな能力を有する。これらの物質の存在が例えば化学発光免疫アッセイまたは核酸欠失におけるような発達シグナルをクエンチまたは吸収するような応用において、より高い生物活性の結果、より少量の物質を使用でき、その結果、より大きなシグナルを生じる。幅広い条件下でのこのより高い生物活性ならびにコロイド安定性は、典型的に、生物学的およびバイオプロセシング系において見られ、様々な他の製造応用またはプロセスにおいて見られるようであり、それらは、予め可能な方法によって作製された磁性 −ポリマー粒子を超える、これらの物質に有意な利益を与える。これらの物質は、本当に、様々な遷移元素酸化物の結晶、特にマグネタイトの被覆クラスターについての先行文献を超える有意な進歩を表す。被覆の安定化（好ましくは、生化学的または生物学的に活性な）を伴う小サイズの磁性粒子（一般に最大粒子サイズ０．２μ以下）を、本発明の一の具体例に従って、やや大きなサイズの親磁性粒子（凝塊であると考えられる）の懸濁を、親粒子の細分で細分された比較的小さい「微小粒子（sub-particle）」上での被覆形成に適応させた物質といっしょに形成することによって、製造する。該混合物は、次に、親粒子を細分または崩壊するために、およびその状態において粒子を維持するために処理し、該混合物を適当に加熱して、脱凝塊または細分粒子上の被覆を形成し、従って粒子サイズを減じてそれらを安定化する。産物は、安定な懸濁である。被覆剤の適当な選択で、被覆細分粒子産物を分離および再懸濁できる。もし安定化被覆が生物活性化合物またはリガンドであるならば、得られる再懸濁産物は、生物分析的応用および産業的バイオプロセシングに特に有用である。本発明の磁性粒子は、また、一時的に安定な微粒子磁性基質で行われる別法の直接被覆プロセスによって調製でき、それは、さらに本明細書中に後に記載する。本発明のこの具体例の実施において、微粒子磁性出発物質は、凝集する能力を有する多数のより小さなサイズの粒子へ分けられ、それにより、むきだしのまたは非被覆粒子磁性基質を提供する。従って、安定な液体培地中に懸濁した得られる微粒子磁気基質は、次いで、被覆剤が基質粒子に吸着するのに充分な時間、適当な被覆剤と接触して、実質的に微粒子磁性基質凝塊が起こる前に混合物を形成し、それによって、所望の再懸濁可能な、被覆磁性粒子を生じる。別法の具体例において、混合物はまた、充分な時間加熱して、基質の磁性粒子への吸着を容易にする。従って、例えば生物活性な生物機能リガンドでコートされた有用なコロイド磁性粒子を得るために、被覆剤存在下で粒子磁性出発物質を細分することは、最も重要である。むしろ、この後者の具体例は、予備形成された、一時的に安定な微粒子磁性基質の被覆を可能にする。基質粒子の安定期間は、以下に記載する方法におけるありきたりの実験によって容易に決定できる。このアプローチは、ある特定の顕著な利益を提供し、なかでもそれは、選択した崩壊技術が被覆剤上で有し得る、いずれの有害な影響の回避である。さらに、被覆剤の一連の付加は、微粒子出発物質を被覆剤存在下で細分するときに特有のある特定の操作制限を除去する。これは、一次被覆剤が、磁性微粒子基質に対してより大きな親和性を有する他の基質との混合物中に存在するところのいくつかの重要点である。また、一連の被覆は使用される被覆剤量のより大きな調節を提供するので、最終産物の処理は、大いに単純化される。付加被覆剤の一次被覆剤を生じる粒子への応用、例えば粒子分散補助もまた、本発明の範囲内であると考えられる。また、本発明に従って、様々な高分子電解質、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの、本明細書中に記載の再懸濁可能な、コロイド磁性粒子への選択的結合方法を提供し、該方法を生物分析技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸配列決定の実施において利益を与えるために使用してもよい。該方法は、高分子電解質の電荷、化学的処理前のコロイド微粒子に存在するいずれの電荷と同じかまたは異っている化学的に処理した、再懸濁可能な、コロイド微粒子の表面電荷と極性が反対の表面電荷を有する化学的に処理した、再懸濁可能な、コロイド微粒子を提供すること、および高分子電解質を含む試料と化学的に処理し、再懸濁可能なコロイド微粒子との接触からなり、それにより、コロイド微粒子は直接、高分子電解質に結合し、それによって、高分子電解質および粒子を含有する凝塊を形成する。一度、高分子電解質が化学的に処理した、再懸濁可能な磁性粒子上で捕獲されると、例えば、一般に本出願と共に挙げられる米国特許第５１８６８２７号または米国特許第５２０００８４号の装置および方法を用いる磁気分離によって、試験試料から除去することは容易である。最後に記載した特許の両方の全開示は、本明細書中でリファレンスとして記載される。また、実質的に純粋な高分子電解質は、イオン強度またはｐＨの適当な操作によって回収することができる。適当な回収方法は、以下に例示する。該方法において、核酸の、複合混合物、例えば細胞ライゼートからの抽出を容易にすることができる。高分子電解質の選択的結合のための前記の方法の実施において使用した化学的に処理した、再懸濁可能なコロイド磁性粒子は、標的認識および分離能力が個々の処理粒子において結合することにおいて独特であると考えられる。すなわち、高分子電解質とコロイド磁性粒子の化学的に処理した表面との間の親和性は、物理的相互作用に起因する。磁性粒子に対するそれらの応用のための付加親和性試薬または方法は、必要ではない。さらに、小サイズの磁性粒子は、反応速度を増加させ、多くの粒子を標的分子と結合させ、標的分子の磁気誘因を増幅させる。好ましくは、懸濁中の親磁性粒子出発物質を崩壊する方法は、音波処理であるが、他の機械的または化学的方法も使用してもよい。これらの他の「方法」は、例えば、加熱、他の型の粒子エネルギー賦与、例えば照射、および化学的方法、例えばｐＨ修飾またはこれらの処理の組み合わせを包含する。特に、ｐＨ修飾と音波処理の組み合わせを使用してもよい。本発明の別の態様に従って、最大粒子サイズ０．２ミクロン以下を有する、酸処理した、再懸濁可能な、コロイド粒子を提供し、該コロイド粒子は直接、負電荷の高分子電解質と結合し、負電荷の高分子電解質および酸性処理したコロイド微粒子からなる凝塊を形成する。本発明のさらに別の態様に従って、最大粒子サイズ０．２ミクロン以下を有する、塩基処理した、再懸濁可能な、コロイド微粒子を提供し、該コロイド微粒子は直接、正電荷の高分子電解質と結合し、正電荷の高分子電解質および塩基性処理したコロイド微粒子からなる凝塊を形成する。本明細書中に記載した方法は、かかる結晶上へのポリマーまたは蛋白質の被覆が熱によって著しく作用され、増幅される驚くべき発見を具体化する。より特別には、もし被覆反応が蛋白質を伴うプロセスが通常なされる温度にて実施されるならば、有意により多くの被覆が達成されるだけでなく、高イオン強度においてコロイド安定である産物をも得られる。蛋白質被覆反応が冷たいまたは３７℃より高くない温度でなされるという事とは反対に、もしマグネタイトスラリーをＢＳＡのような蛋白質と混合し、６０℃以上の温度、典型的には７５〜８０℃に加熱し、音波処理するならば、その結果、塩安定であり、繰り返し分離および再懸濁できる産物を得るということを発見した。さらに、もし、かかる混合物の音波処理を米国特許出願第３９７１０６号に記載のように、冷たい（０〜５℃）温度で行い、次いで過剰な被覆剤の存在下で７５°に加熱するならば、前記と同じ特性を有するであろう産物を得るということを発見した。この結果は、塩安定物質への転換が音波処理に無関係であり、明らかに高温度被覆反応にのみ依存することを実証する。被覆反応を、マグネタイトのスラリーを最初に音波処理して結晶凝塊の分散−崩壊の度合に依存する２００ｎｍの大きさの凝塊までの単結晶−にし、次に独立した工程でコートするという米国特許出願第０８／２３１３７９号に開示されたような二工程で行うことができるかどうかを調べるために、マグネタイトを５℃または７５℃での音波処理によって分散し、次に７５℃にて蛋白質／ポリマーでコートした。どちらの場合も、高濃度の単純な塩、２ＭＮａＣｌに対して、および繰り返しの磁気分離ならびに再分散に対して安定な産物を得る。発明の詳細な説明磁性体、またはさらに一般的には、遷移元素酸化物は、粒子形において、重要な表面極性を有する傾向があり、それは、かかる物質の結晶の凝塊によって最小化するという仮説を設ける。これらの結晶凝塊を細分、または崩壊するとき、それらは不安定になり、再び時間をかけて結晶凝塊を形成する傾向がある。本発明に従って、これらの微小粒子の発生期の（および、おそらく電荷した）表面を、親粒子が細分されるとき、またはその後、しかし結晶凝塊が形成し始める前に、同時にまたは続いてこれらの表面上に沈殿し得る被覆剤によって安定化する。その目的のために、脱凝塊した磁性粒子の表面極性に応答する特性に基づいて、被覆剤を選択してもよく、従って、様々な被覆剤が個々に異なる微粒子磁性体と反応するであろう。もし、処理または崩壊技術がｐＨ修飾であり、またはｐＨ修飾を包含するならば、微小粒子表面極性および被覆剤極性でのｐＨ修飾の効果もまた、考えられる。被覆剤は、脱凝塊または細分した粒子の表面に付着する、もしくは吸着される能力、あるいは言い換えると、脱凝塊または細分した粒子の表面の特性を修飾する能力に関して、各々の場合に選択され、それ故、減少したサイズの粒子産物の安定性は保持され、その安定な懸濁を提供する。本発明は、コロイド状物質のためのMoldayおよびOwenらを越える、該方法固有の単純さを越える有意な利益を提供する。例えば、もしも、化合物を酸化金属粒子に付着させたいのならば、そこでは、該化合物はその後の他の物質、例えば抗体または酵素の付着に対して活性基あるいは活性化された基を有するのだが、Mo ldayおよびOwenらの方法は、かかる化合物の選択がかかわる範囲で、制限される。なぜならば、これらのプロセスは、必ず、かかる化合物とそれら自体が該化合物と反応でき、また酸性ｐＨを引き起こす塩化金属との混合によって開始するからである。さらに、塩基付加、通常水酸化アンモニウムが、酸化金属の形成に必要とされ、明らかに、次のカップリングに使用する様々な活性化された化学基に有害な影響を与え得る。対照的に、本発明の直接吸着法には、そのような制限がない。さらに、本発明の被覆プロセスは、非水性条件下または水が微量成分である系において行うことができ、それによって、限られた水溶性を有する被覆剤の使用を可能にする。ある特定のタイプの被覆、例えばPapellの特許において提唱された長鎖炭化水素は、界面活性効果を有する。かかる被覆は、細分された凝塊磁性粒子を溶解し、例えばPapellが教示したような安定な懸濁を生産することができる。本発明に従って、これらの懸濁をマグネタイトから、崩壊法のような音波処理を用いて、 Papellによって記載されたボールミリングプロセスにおけるよりも速く製造する。再懸濁産物を製造するためには、細分された磁性粒子を安定化するだけでなく、無傷のままで被覆粒子を懸濁から除去できる被覆剤を選択することが重要であり、それは、Papellのケースではない。被覆が崩壊と同時にまたは連続して行われる、崩壊した粒子の被覆方法の研究において、比較的高い温度に加熱することによって、かかる反応が顕著に促進されることを発見した。約４５〜５０℃の温度が効果的であり、８５℃程度の高さの温度では、最適には７５℃が使用された。第二および第三構造を有する蛋白質被覆およびある特定のポリマーの場合、驚くべきことに、これらの物質を該方法で処理できる。得られる再懸濁可能な産物は、細胞ならびに巨大分子に対する低い非特異的結合を示す特徴を有し、非加熱処理した産物よりも有意に高レベルの被覆物質を有し、およびほとんど全てが高イオン強度緩衝液中でコロイド安定を維持する通常の特徴を有する。加熱の度合（温度または時間）に依存して、０．５ＭＮａＣｌ〜０．２ＭＮａＣｌ中で安定な物質を製造することができる。本発明における出発物質として使用し得る磁性化合物は、単磁性化合物、例えばＧｄ₃Ｆｅ₅Ｏ₁₂において異なる遷移金属を有してもよい遷移金属酸化物、硫化物、ケイ化物および炭化物を包含する。好ましくは、フェライト、一般にＭＯ・Ｆｅ₂Ｏ₃（ここで、ＭはＺｎ、Ｇｄ、Ｖ、Ｆｅ、Ｉｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｍｇ）および特にマグネタイト（ＦｅＯ・Ｆｅ₂Ｏ₃）として知られる磁性酸化物のクラスである。 Owenらによって記載された化合物を含有する遷移元素および前記のフェライトに加えて、鉄を含まない磁性金属酸化物のクラスを本発明の記載に従って被覆できる。これらの化合物は、２またはそれ以上の金属イオン：Ａｌ（＋３）、Ｔｉ（＋４）、Ｖ（＋３）、Ｍｂ（＋２）、Ｃｏ（＋２）、Ｎｉ（＋２）、Ｍｏ（＋５）、Ｐｄ（＋３）、Ａｇ（＋１）、Ｃｄ（＋２）、Ｇｄ（＋３）、Ｔｂ（＋３）、Ｄｙ（＋３）、Ｅｒ（＋３）、Ｔｍ（＋３）およびＨｇ（＋１）の組み合わせの酸化物を包含する。それらは、外見および磁化率の両方においてフェライトとは異なる。非フェライトは、白または黄色から緑および茶色へ、いずれかの色を着けることができる。このことは、それらを吸光分光への応用において特に有用にする。非フェライトは、一般にフェライトより磁性が小さく、例えば、選択的磁性回復を可能にするフェライトを基盤とする物質を補集できる磁場においてＨＧＭＳフィルターを通過する。非フェライト酸化物は、Whiteheadらによって記載された酸化金属の代わりに使用でき、前記の所望の特徴を有するシランコート磁性粒子を製造することができる。同様に、かかる組み合わせの塩化物（または硫化物）をmoldayまたはOwen らにより教示された方法に従って使用するとき、非常に望ましい磁性およびスペクトル特性を有するコート産物を得ることができる。前記のように、非水性溶液培地中のまたは融解形で安定な被覆剤もまた使用してもよいが、使用してもよい被覆剤は、水性懸濁または溶液中であるのが好ましい。被覆剤は、通常、合成または天然のポリマーであり、蛋白質、ペプチドまたは核酸であってもよい。しかしながら、原則として、被覆剤は、かかる結晶の表面に対して親和性を有し、高温度にさらすことによって逆影響を受けるいずれかの物質であり得る。被覆剤の存在下での微粒子磁性出発物質の崩壊を伴う本発明のプロセスの実施において、通常、第三液体成分、例えば水を包含する２物質は、液体混合物中で結合して、懸濁を形成する。該混合物におけるこれらの物質の比率は、重要であるとは考えられない。しかしながら、一般に、磁性粒子の被覆剤に対する重量比は、１０００：１〜１：１０である。磁性出発物質の被覆微小粒子の安定な懸濁を調製するために、該混合物を磁性微粒子出発物質を崩壊または細分するための多くの方法で処理してもよい。これらは、機械的および化学的方法、例えば穏やかな加熱、振動、照射、音波処理、ｐＨ修飾、またはこれらの組み合わせを包含する。なかでも音波処理が特に好ましい。該プロセスの間または該プロセスの後で、系を好ましくは７５℃に加熱し、被覆が最大化するまでその温度を維持してもよい。磁性微粒子出発物質を崩壊または細分する方法の研究において、被覆剤非存在下でさえも、たとえ一般に一時的な状態においても、安定性に関するかぎり、出発物質を本当に、より小さなサイズの粒子に分けることができることを発見した。この観察から、もしも被覆剤を適当な液体培地中のより小さなサイズの微粒子磁性基質の懸濁へ加えるならば、磁性出発物質の分割の後、および実質の微粒子磁性基質凝集が起こる前に、すなわち、より小さなサイズの磁性粒子が安定に懸濁している間、再懸濁可能な被覆磁性粒子を製造することができる。「実質の微粒子磁性基質凝集」によって、実質的数の粒子がそれらの最も微細な分割状態ではないことを意味し、同様に、いくつかの場合、粒子凝集形成を示す、懸濁の外見の光沢から曇りへの変化によって実証される。別法で、実質の粒子凝集の発生は、準電光分散法によって、平均粒子サイズがその最小サイズからの有意な増加を示すとき決定できる。被覆剤はまた、粒子関連物質を最初、限られた量の細分した物質に加え、粒子表面に付着する時間を与えるような崩壊プロセス後に連続で加えることがきる。抽出時間は、どれほど長く結晶再凝集を選択した特異的被覆剤に暴露する条件下で行うかに依存するであろう。次に、崩壊した結晶の一次被覆によってむきだしのままの部分を被覆し、および凝塊を防ぐ機能を有する異なる被覆剤を加えて、系を安定化する。様々な分散補助剤をこの目的に使用してもよい。適当な分散補助剤は、例えば、常用の界面活性剤、アニオン性、カチオン性および／または非イオン性界面活性剤などを包含する。適当な分散補助剤の選択は、コロイド磁性粒子での天然の表面電荷に依存するであろう。分散補助剤は、懸濁中でコロイド、磁性粒子の安定化を助ける。連続の被覆アプローチは、関係する被覆剤の取り込みを最大化し、多くの場合において、実質的に完全な粒子被覆を達成できる。この方法において、一次被覆剤量を制限でき、被覆プロセスを、非結合一次被覆剤の所望のコート磁性粒子産物からの実質的精製の必要なしに、行うことを可能にする。さらに、連続で加えられた被覆剤の濃度および／またはタイミングを注意深く調節することによって、異なるサイズの安定な凝塊を得ることができる。微粒子磁性出発物質の脱凝集後の被覆剤添加の別の利益は、崩壊プロセスが被覆剤で有し得るいずれの逆効果をも回避するであろうことである。さらに、二つの別の工程における被覆操作を行う許容範囲は、粒子状態に対する多くの明白なプロセスの利益を有する。我々はまた、かかる粒子の製造において高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）の使用が、今までは達成または認識されていなかったそれらの製造にディメンションを与えるという発見をした。MoldayおよびOwenらのプロセスは、遠心分離、ゲル濾過または「塩析」を操作方法として、コロイド物質のプロセシングに利用する。本明細書中の実施例において、ＨＧＭＳをコロイド粒子の非結合被覆剤からの分離に使用した。化学的に物質をかかる粒子に結合させることが望ましいプロセスにおいて、ＨＧＭＳを伴うプロセシングは、難無く測定され、大いに有効である。ＨＧＭＳはまた、調整した磁場に協調して、それらの磁性率／磁性粒子用量比に基いて試料を分別するために使用することができる。このことは、別個のサイズの粒子試料の常用の分別および製造を可能にする。ＮＭＲ対照試薬として使用されるとき、粒子のサイズは、物質の代謝の終末において重要な役割を果す。再び調整した磁場を用いて、ＨＧＭＳをまた、粒子を選択的に捕獲するために使用することができ、そこでは、磁気反応核が、混合物において他よりも高い磁性率を有する遷移元素酸化物を含有する。この概念は、異なる磁性率ならびに異なる生物レセプターを有するコロイド粒子を試料と混合でき、勾配場強度の増加を用いる一連のＨＧＭＳによって除去できる系において有用である。ＨＧＭＳは非吸着被覆剤または非反応物質および副産物をコロイド、磁性粒子産物から分離するために使用できるだけでなく、被覆磁性産物の固定化および固定化された物質での反応を行うことにも利用できる。従って、もしも、得られる被覆を化学的に修飾することが望まれるならば、反応物を磁性固定物質に加えることができ、磁性固定状態で反応を行い、過剰な反応物または他の反応産物を容易に洗い去ることができる。この概念は、やや支持体でペプチド合成されるように、適確に一連の反応を与える。磁性微粒子出発物質の細分はまた、被覆剤の非存在下で行うことができ、被覆工程を行う一連の加熱を利用する。これは、０℃〜８５℃の範囲の温度で達成することができ、前記の様々な機械的または化学的方法を使用することができる。磁性微粒子物質の崩壊の好ましい具体例では、０〜５℃にて、低濃度の天然リン酸緩衝液（５〜３０ｍＭ）の存在下で崩壊し、崩壊方法として音波処理を使用した。この範囲の温度を維持することは、結晶の酸化およびその後の磁性の危険性を低温度で回避することおよび、より小さな結晶凝塊が同じエネルギー投入で得られるという、高温度崩壊を越える２つの利益を与える。被覆剤非存在下で磁性体を崩壊することによって、結晶凝塊サイズの分配が生じ、それは再懸濁可能である。分配方法は、エネルギー投入（音波処理の時間および強度）に関連し、崩壊プロセス以前および／または間の様々な化学種の存在、結晶が生じる物質および方法の磁気飽和度に関連するようである。例えば、マグネタイトおよび他の遷移金属酸化物の調製において、塩化物または硫化物からの酸化物形成における塩基を添加する比率（または天然の塩基、例えば、ＮＨ₄ＯＨ対ＮａＯＨ）によって、得られる結晶のサイズが変化し、および異なる度合に崩壊させることができる。例えば、鉄の硫酸塩へのＮａＯＨの速い添加は、典型的に、ゆっくり添加することによってまたは、酸化に効果的なＮＨ₄ＯＨを使用することによってのいずれかで形成した結晶よりも小さいマグネタイト結晶クラスターをもたらす。結晶凝塊の分配が形成するとすぐに、被覆剤を再凝塊を抑制するのに充分な濃度で、速やかに混合し、混合物を加熱して、被覆反応を起こす。被覆剤は、同じ温度または高温度であり得る。特に好ましい具体例に従って、磁性出発物質を加熱を用いて、被覆剤存在下で細分し、次に７５〜８０℃にて、続いて７５℃で３０〜４０分被覆剤と混合する。当業者が認識するように、崩壊工程を再凝塊を防ぐ手順から分離し、次に被覆を行い、完成する工程を行うことにおけるいくつかの利益がある。明らかに、もしも崩壊工程が、明らかに被覆反応が要求される被覆剤の存在下で高温度でなされるならば、次に被覆剤の存在は、崩壊反応に干渉するようである。たとえ高イオン強度コロイド安定物質をこの方法において製造できても、たいへん多くの様々な反応が高温度で起こっているという事実は、そのようなプロセスの調節が困難であることを示唆する。一方、原則として被覆剤の非存在下での崩壊反応の実施には、プロセスを調節でき、結晶サイズ、構造がとても類似した、および磁性体の場合、磁性特徴が類似した物質で予備操作を行うべきである。再凝塊を防ぐのに充分量の被覆剤の添加、次いでその系を加熱して被覆反応を起こすことによる再凝塊からの崩壊系の抑制によって、被覆物質が隣接する結晶凝塊に密接に架橋するであろう可能性を最小化する。本発明の前記の方法は被覆方法として特徴づけられるが、かかる方法は、特別の応用に依存して、適切に抽出方法と考えてもよい。従って、本明細書中に記載の方法は、複合混合物から標的物質を抽出するという特異的な目的、例えば、汚れた川からの環境的な有害物質の単離、反応混合物からの産物回収または一般に価値のない成分を含む混合物からの価値のある成分の分離に有益に利用し得る。現存する本発明の別の応用は、高分子電解質、例えば核酸をコロイド磁性粒子に結合させる方法である。該方法は、かかる標的分子を複合混合物から抽出する方法として、化学的処理した、再懸濁可能な、コロイド磁性粒子の、高分子電解質、例えばＤＮＡまたはＲＮＡへの選択的結合のための使用を伴う。かかる再懸濁可能な、コロイド磁性粒子が高分子電解質ならびにかかる物質の巨大な表面領域に結合する能力は、磁気的に回収される能力といっしょになって、使用時に有意な利益をもたらす。該結合試薬は、微粒子磁性出発物質を所望の表面電荷をかかる微粒子に与える化学試薬で処理する多数の再懸濁可能な、より小さいサイズの微粒子へ細分することによって、都合よく調製される。崩壊技術、例えば音波処理またはｐＨ調整を、この目的に使用してもよく、前者がより好ましい。音波処理は、微粒子磁性出発物質の脱凝集を生じるだけでなく、ある特定の生物学的存在、例えば、標的分子をその含量に包含する細胞または細菌の崩壊をも同時に引き起こす。音波処理を経た解離において、標的分子は、適当な化学処理を施された生ずるコロイド磁性粒子へ結合する。該プロセスの実施において、微粒子磁性出発物質を崩壊して、一時的なコロイドを形成し、本明細書に記載のように、該コロイドに標的分子を含有する試験試料を結合させるために続いて添加し得る、または、微粒子磁性出発物質は標的分子存在下で崩壊することができる。以下に示す実施例は、細分した磁性微粒子のｐＨ調整のための様々な化学試薬、例えば酸または塩基での処理が、著しく選択的な様々なポリアニオンおよびポリカチオンの結合に影響することを実証する。従って、抽出方法として、該方法が関係する高分子電解質の多くの特異性を提供することは、明白である。溶媒、緩衝液および塩条件を結合工程の後および結合した高分子電解質物質が磁性的に分離した後に調整することによって、標的高分子電解質を容易に、生物学的活性型で回収する。標的高分子電解質の回収後、微粒子磁性体を再利用してもよい。該プロセスが、本明細書中に前記したように、比較的低い磁性率特性を有する遷移元素酸化物とともに機能し得るであろうことは、高く評価されるべきである。高分子電解質捕獲に使用される物質が、効果的な磁気分離に充分な磁性体ではない場合、濾過を分離およびその後の回収に使用できた。以下の実施例は、本発明の原理を説明するであろう。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。これらの実施例において使用された全ての試薬および化学物質は、特記しないかぎり、分析用の等級であり、Fisher Scientific（Valley Forge，PA）から得た。実施例１マグネタイトは、３．０および１．５ｍｇ／ｍｌの塩化第二鉄六水和物溶液および塩化第一鉄四水和物溶液をそれぞれ、ｐＨをＮＨ₄ＯＨで８．６に上昇させる間、室温で撹拌して混合することによって、調製した。生ずるマグネタイトを磁気的に捕集し、蒸留水で３度洗浄し、蒸留水に再懸濁した。そのようにして調製した試料は、１．５ｍｇ／ｍｌのマグネタイトを含有した。３分間７０％出力で音波処理（Fisher-Sonic Dismembrator Model 300）後でさえ、これらの試料は約２分間以上懸濁のままではないであろう。本発明の方法によってマグネタイト粒子を被覆するために、様々な濃度の様々な被覆剤の０．５ｍｌアリコートを１．５ｍｇ／ｍｌマグネタイト懸濁の０．５ｍｌのアリコートと混合した。試料を円錐形のプラスチック遠心管中で混合し、続いて、室温にて３分間７０％出力で音波処理した。正のまたは部分的に正の被覆結果は、試料によって光が分散される方法の視覚的検査から明らかになった。被覆能率を決定するために、さらに、生じる試料の沈降を観察し、また、生じる試料を以下の：１２ｘ７５ｍｍ試験管中の音波処理混合物の０．５ｍｌアリコートをCiba-Corning磁気分離器（Walpole，MA）にセットし、視覚的に観察する方法において、コロイド状被覆マグネタイトまたはそれらの微凝塊へ分画した。被覆マグネタイト結晶がコロイド状であるかどうか決定するために使用した判定基準は、生じた物質が磁気分離器中の溶液中に、すなわち、磁性上清中に１０分間残存するかどうかを観察することであった。該判定基準は、Owenらのプロセスによって調製された蛋白質被覆したコロイド状マグネタイト溶液が、かかる期間磁気分離器中におかれるとき、磁気分離器中で磁気的に分離できなかったことに基づいて確立された。磁気分離器中で試験管の側面へ引き付けた、安定で、被覆された、しかし凝塊した物質を形成した音波処理混合物の一部を決定するために、そのように形成された物質を２０ｍＭリン酸塩で３度洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁した。非被覆マグネタイトと比較したそれらの再懸濁の特徴は、それらが数時間懸濁のままであったのに比べて、非被覆マグネタイトは数分間であったように、明らかに異なった。第二の判定基準は：推定コロイド状物質を母液からＨＧＭＳによって分離し、洗浄し、および緩衝液中に再懸濁して、コロイドの発生および安定性を視覚的に観察したというように、磁性上清を試験することを伴った。ＨＧＭＳは、約２０ｍｇの高純度の汚れのないスチールウール（McMaster-Carr，New Brunswick，NJ ）（界面活性剤中で洗浄し、１％ＢＳＡリン酸セーライン緩衝液（ＰＢＳ）でインキュベートし、脱イオン水でリンスし、乾燥させて、約３ｍｍ長にカットする）を１２ｘ７５ｍｍガラス試験管中へ置くことによって行った。試験するために、１００μｌの上清を汚れのないスチールウールを含む試験管に加え、磁気分離ラック中に２分間置き、その時間によって、磁性体を汚れのないスチールウール上に捕集した。明らかな非磁性上清をパスツールキャピラリーピペットで除去し、磁性体を３度３００μｌの２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）で洗浄した。３度目の洗浄後、磁気ラックから試験管を外して、捕集した磁性体をリン酸緩衝液中に再懸濁し、安定なコロイドの発生を視覚的に試験した。いくつかの例において、回収した物質はまた、レーザー光分散（Coulter Sub Micron Particle Analyzer N4SD，Hialeah，FL）によってサイズを測定した。いくつかの上清を非吸着物質から、Sephacryl-300（Pharmacia）またはウルトラゲルAcA-22上のゲル濾過クロマトグラフィーによって分離した。表Ｉは、被覆実験で使用した異なる化合物、それらの濃度、および他の溶媒条件のリストである。コロイドの存在および半定量ならびに凝塊した物質を前記の方法によって、コロイドおよび凝塊保存物の既知混合物から調製した標準物と比較することによって視覚的に決定した。表Ｉから明らかなように、化合物を試験する度に、いくつかの量の安定なコロイド物質が生じた。注目すべきことに、ＨＧＭＳおよびリン酸緩衝液中に再懸濁に従う安定性もまた、示唆される。全ての場合、被覆実験の成功は、光分散からの音波処理法に従って、または溶液の明らかな「光沢」によって、すぐに決定できる。対照的に、被覆条件が不適当である（例えば、安定な被覆した細分粒子を生じない）物質は、外見が曇っていて、不均一であった。実施例２蛋白質被覆の定量および保持Ｉ−１２５ラベルＢＳＡおよびＩｇＧをFrackerおよびSpeckのヨードゲン(Iod ogen)法（Biochem．Biophys．Res．Comm．80 849，(1978)）によって調製した。特異的活性は、それぞれ５２０，０００ｃｐｍ／μｇおよび８１０，０００ｃｐｍ／μｇであった。ＢＳＡを（１）１０ｍＭリン酸緩衝液中の７．５％ＢＳＡで、その後３分音波処理する、および（２）２５ｍＭリン酸緩衝液中の７．５％ＢＳＡで、その後３分音波処理するような２セットの条件下で、マグネタイト上を被覆した。どちらの場合も、音波処理の前に、８００，０００ｃｐｍのラベルＢＳＡを混合物（０．５ｍｌ）に加えた。視覚的判定基準から、より高濃度のリン酸塩が結果として有意により多くのコロイド状物質を生じたことが明らかであった。各実験の磁気的に捕集可能な沈殿を捕集し、２０ｍＭリン酸緩衝液で２度洗浄して、カウントした。条件１および２の磁性凝塊物質は、それぞれ２４２１および２８２８ｃｐｍを含有した。どれほど良くＢＳＡがこれらの凝塊試料に吸着したかを決定するために、回収した物質を０．１Ｍグリシンに室温でｐＨ３．０にて４０分間懸濁し、磁気分離して、２０ｍＭリン酸緩衝液で１度洗浄した。実験条件１および２の場合、保持されたカウントは、それぞれ９１および８４％であった。同様な試料を緩衝液中に再懸濁して３７℃で一晩インキュベートしたとき、マグネタイトから脱着する物質はなかった。コロイド状マグネタイトＢＳＡの安定性を決定するために、コロイド上に吸着したＢＳＡの量を次のとおりに定量した：上清３ｘ１００μｌアリコートをＨＧＭＳによって個々に集め、３００μｌのリン酸緩衝液で２度洗浄して、１００μ ｌの同じ緩衝液に再懸濁した。長時間（１６時間）にわたる観察によって、コロイド物質が安定であることが明らかとなった。全上清に対してＨＧＭＳによって回収した放射性ＢＳＡは、５４００ｃｐｍであった。条件２の場合に得られた上清および凝塊物質の放射能ならびに用量から、７，８２８ｃｐｍがマグネタイトに取り入れられたことが決定した。全ＢＳＡの０．０１％に当たるこの量を、そのように調製されたマグネタイト約０．７５ｍｇ／ｍｌに相当する系に加えた。この値は、Owenらの方法によってマグネタイト上を被覆できるＢＳＡの最適量に非常に近い。ＩｇＧ被覆実験は、ＰＢＳ／２（ＰＢＳのＨ₂Ｏ中での１：２希釈）中５％蛋白質濃度にて行われた。音波処理の前に、混合物に１．８ｘ１０⁶ｃｐｍの放射ラベルＩｇＧを加えた。これらの実験の場合、全添加蛋白質の１．２％が吸着され、それは１．２ｍｇＩｇＧ／ｍｌのマグネタイトに相当することが明らかになった。また、これは、Owenらの技法によって得ることができる最大の被覆に近い。ＨＧＭＳを該実験のマグネタイト上清で行ったとき、２３，０００ｃｐｍがコロイド物質に保持された。凝塊磁性ペレットは、洗浄操作後１７，３００ｃｐｍを保持した。磁性ペレットを前記のようにｐＨ３．０でグリシンに再懸濁したとき、たった５０％の数がその後の磁性ペレットに保持された。しかしながら、これらの実験において、微凝塊物質のグリシン処理が実質的部分（およそ半分）をコロイド物質に変化させたことが明らかとなり；従って、ＩｇＧ被覆物質は、本当に安定である。ＨＧＭＳによって回収したコロイド物質は、視覚的観察によって安定であった。実施例３生物活性の保持ヤギ抗マウスＦｃ（Jackson Laboratories，West Grove，PAから得た）を実施例１に記載のように、マグネタイト上を被覆した。被覆のために、非処理抗血清を５０ｍＭリン酸塩で１：４に希釈した。音波処理後、生じた物質のほとんどがコロイド状であった。全ての上清をSephacryl-300で分離した。空隙用量中に現れるコロイド状物質を回収し、以下の試験を行った：回収したコロイド１００μ ｌを１００，０００カウントの１２５−ＩラベルマウスＩｇＧかまたは１００，０００カウントの１２５−ＩＢＳＡのどちらかと混合した。これらの混合物を前記のように鉄粉存在下で、１２ｘ７５ｍｍ試験管中でインキュベートした。室温にて９０分後、ＨＧＭＳを行い、前記のように、上清を捨て、集めた物質を２％ＢＳＡを含有する０．８ｍｌのＰＢＳで２度洗浄した。これらのコロイド試料（３つ）の場合、平均で、５，２００カウントのマウスＩｇＧが、６３２ｃｐｍの非特異的結合ＢＳＡに対してＦｃ被覆コロイドに結合したことがわかった。実施例４淡色粒子混合した遷移金属酸化物を室温および６５℃にて、実施例１に記載のような適当な塩化金属に塩基を添加することによって調製した。表ＩＩは調製条件、モル比、酸化物の最初の色および１週間後の色、または新たに調製した酸化物を８時間Ｏ₂バブルした後の色のリストである。表ＩＩＩは、本発明の方法に従って、表ＩＩの酸化物試料（試料１、２、３および４）をデキストランで、およびＢＳＡで被覆した結果のリストである。明らかに、これらの物質をマグネタイトと同様に被覆することができる。表ＩＩに挙げた非フェライトおよびフェライト酸化物をマグネタイトの代わりに、Whitehea dらの技法と共に使用でき、同様な色のシランコート物質を生じることを示す。これらの物質の適当な塩化物（または硫化物）をMoldayまたはOwenらの技法で使用するとき、可視領域において透明に近いコロイド状物質を得ることが可能である。実施例５コロイド粒子サイズＢＳＡマグネタイトを、アリコートを２番目の３分間音波処理および別の３番目の３分間音波処理を除いて前記のように、実施例１のマグネタイトおよび５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０中の１％ＢＳＡで調製した。磁気ラックでのいずれの凝塊物質の除去後、前記のように、生じるコロイド状試料をレーザー光分散（Coul ter Submicron Particle Analyzer）によってサイズ測定した。実験の誤差内で、各々の試料は、平均８０ｎｍの粒子径を有した。次に、被覆のためのマグネタイトを、Owenらの方法において粒子サイズを減じることがわかっている２つの方法、すなわち、塩基の非常に迅速な添加および上昇した温度（６５℃）での塩基の非常に迅速な添加によって調製した。Owenらに従って調製したマグネタイトを伴うが、ＢＳＡマグネタイトを１回の３分間の音波処理工程で調製したとき、生じたコロイドは、どちらも平均５０ｎｍ径であった。実施例６ｐＨによって影響されるようなマグネタイトの特徴３．７５％ＮＨ₄ＯＨを０．６ｍｌ／分にて２００ｍｌの脱気した塩化第二鉄水和物および塩化第一鉄水和物、それぞれ７および３ｍｇ／ｍｌの撹拌混合物に加えた。始めに酸性混合物のｐＨが７．０に近付いたとき（暗オレンジから黒へ色が変化することによって示される）、３００μｌのアリコートを除去し、１０ｘ７５ガラス試験管中に入れ、ネオジム／鉄／ホウ素棒磁石を試験管の側面に置き、視覚的に磁気クリアリング（clearing）を観察することによってマグネタイトの存在を試験した。非磁性または部分的磁性体から全磁性体への移行は、１２．２ｍｌの塩基を加えた後ｐＨ７．４にて起こった。この点にて、６０ｍｌの混合物を除去し、調製Ａをとした。付加塩基をｐＨ８．９まで混合物に加え；６０ｍｌのアリコートを除去して、調製Ｂとした。さらに塩基をｐＨ９．８まで反応混合物に加え、該物質のアリコートを調製Ｃとした。マグネタイト調製Ａ、ＢおよびＣを蒸留水で４度洗浄し、水に再懸濁すると、鉄塩が元の溶液の開始濃度であった。Ａ、ＢおよびＣの後者の懸濁の０．５ｍｌアリコートを７０％出力（Fi sher Sonic Dismembrator）にて３分間音波処理した。音波処理後すぐに、各々がコロイド状マグネタイトの光沢のある外見を有したが、全て、２分以内に曇った懸濁へ（粒子凝集を示す）逆戻りした。調製Ｃの場合、移行は、音波処理後２０〜３０秒で起こり；調製Ｂの場合、４０〜５０秒；一方調製Ａでは、この移行に２分を要した。音波処理後すぐに調製をCorning 磁気ラックに置くと、それらは、完全に前と同じオーダーで、および同じ時間範囲にわたって、懸濁から透明になった。再凝集の後、試料の間に認識できる差異は無かった。調製したマグネタイトの音波処理による解離に対する感受性がＨ⁺またはＯＨ^ー処理によって変化するかどうかを決定するために、調製Ｃ懸濁のアリコート０．５ｍｌを試験管中に入れ、磁気分離および上清吸引によってそれらの上清から分離した。次いで、磁性ペレットを０．５ｍｌの希ＨＣｌ（０．１、０．０１、０．００１または０．０００１Ｍ）かまたは希ＮａＯＨ（０．１、０．０１、０．００１または０．０００１Ｍ）に再懸濁し、前記のように３分間音波処理して、視覚的に調べた。これらの試料の場合、酸および塩基処理が、酸および塩基濃度に対する比において、マグネタイトの崩壊を増加させることが明らかになった。０．１ＭＨＣｌまたはＮａＯＨ中に再懸濁して音波処理したアリコートは、１２時間近く光沢した、すなわちコロイドのままであった。０．００１Ｍ酸または塩基に再懸濁下アリコートもまた、有意な時間、コロイドの性質を示した。一方、０．０００１Ｍ酸または塩基に再懸濁したアリコートは、親物質が水中でするように、音波処理後すぐに凝集した。実施例７ｐＨ修飾したマグネタイトの被覆実施例６の調製Ｃは、音波処理を経た崩壊によってアニオン性およびカチオン性ポリペプチドで被覆された。アニオン性ターポリペプチドは、６０モル％グルタミン酸、３０モル％アラニン、１０モル％チロシン（GAT，Lot #M18G）からなり、およびカチオン性コポリマーは、６０モル％リジン、４０モル％アラニン（ LA，Lot #M-5B）からなり、どちらもPilot Chemicals，Watertown，MAから得られたものを使用した。どちらも約１００，０００ダルトンのこれらのポリペプチドは、適当な酸または塩基でトリチュレートすることによって溶解し、中和し、リン酸セーライン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、続いて蒸留水に対して透析した。被覆は１０ｍｇ／ｍｌポリペプチド溶液および同じものの１／１６の一連の希釈液で試された。被覆実験は、前記のように音波処理によってなされた。これらの実験の場合、ＧＡＴおよびＬＡの両方の１／１６および１／１８希釈は、安定なコロイド溶液を生じた。１／４、１／２および希釈していないポリペプチド溶液は、結果としてコロイドの分配および凝塊した物質を生じた。どちらの例のコロイド量も、一般に、ポリペプチド濃度の増加とともに減少した。しかしながら、２５ｍｇ／ｍｌＧＡＴにて、全ての物質はコロイド状であった。実施例６の調製ＡおよびＣは、ＧＡＴで被覆された。マグネタイトの０．５ｍｌのアリコートを１．０ｍｌのＨＣｌ（０．０１および０．１Ｍ）またはＮａＯＨ（０．０１および０．１Ｍ）中に６０秒再懸濁し、次に０．５ｍｌ水で２回洗浄した。これらの前処理したマグネタイトを２．５ｘ１０⁶ｃｐｍ^125IＧＡＴ（前記のヨードゲン法によって放射ラベルした）を含む１ｍｇ／ｍｌＧＡＴの０．５ｍｌアリコート中に再懸濁し、前記のように音波処理した。音波処理した試料をコーニング磁気ラック（Corning magnetic rack）に置き、一晩分離させておいた。磁性ペレットを０．５ＭＮａＣｌ中で１度洗浄して、カウントした。様々なマグネタイト上を被覆したＧＡＴの結合数およびパーセントは、表ＩＶに示す。表ＩＶのデータから、マグネタイト結晶表面電荷が、酸での前処理によってより大きな正電荷を作り得ること、逆に塩基での処理は、一般に負に電荷したポリマーに対して利用できる部位を減少させることが明らかである。カチオン性ターポリマーＬＡＴ（６０モル％Ｌｙｓ、３０モル％Ａｌａ、１０モル％Ｔｙｒ）の 125Ｉ試料（Dr．H．J．Callahan，Jefferson Medical College，Philadelphia， PAから得た）を同様に前処理したマグネタイトといっしょに使用したとき、該正電荷物質のより大きな結合が、塩基で前処理したマグネタイト上で起こった。酸または塩基処理を経た結晶表面電荷変化が遷移元素酸化物の一般的特性であるかどうかを決定するために、例えば、異なるモル比のＦｅ（ＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＩＩ）の塩化物から得た物質を前記のように、酸または塩基で処理し、放射ラベルＧＡＴおよび／またはサケ精子ＤＮＡ（Sigma Chemical Co.， St．Louis，MO）と混合した。マグネタイトを用いる場合のように、酸処理は、これらの負電荷高分子電解質の結合を促進した。実際、０．１ＭＨＣｌで前処理し、その後音波処理で水洗浄した非被覆物質は、前記のマグネタイト試料のような性質を有する物質、すなわち、一時的に安定なコロイドを与える。これらの物質が該半安定コロイド状態であるとき、適当な量のサケ精子ＤＮＡの添加は、結晶が実質上、正の表面電荷を有することを示す完全な凝集を導いた。実施例８音波処理後の直接被覆磁性液体第一鉄は、下記の方法に従って、むきだしのマグネタイトを音波処理した後、被覆剤を添加することによって調製した。むきだしのマグネタイトは、前記の実施例１に記載のプロセスによって調製した。マグネタイトを棒磁石によって水から分離し、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中に再懸濁した。マグネタイトの平均粒子サイズは、連続して１０秒振動および１０秒休止を用いる５分間の音波処理（Fisher's Sonic Dismembrator 550）によって減少した。音波処理後すぐに、一次被覆剤、すなわちｐＨ７．５にて２０ｍＭリン酸緩衝液中の１ｍｇ／ｍ１９ｘビオチン−ＢＳＡを、音波処理したむきだしのマグネタイトといっしょに、室温にて１５分間インキュベートした。二次被覆剤、すなわちｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸緩衝液中５ｍｇ／ｍｌＢＳＡをマグネタイトと一次被覆剤の混合物に加えた。表Ｖは、被覆濃度の変化の、長時間でのコロイド磁性粒子サイズおよび高勾配磁場での分離率への影響を示す。粒子サイズは、クールター半微量粒子分析器（ Model N4SD）によって測定した。コロイド粒子の磁性特性は、４ｋＧ不変磁場におけるグリッドを用いる３００μｌミクロタイターウェル中での高勾配磁気分離によって測定した。実施例９同時に音波処理を伴うビオチン化ＢＳＡの直接被覆による安定な、コロイド磁性粒子の調製安定な、コロイド磁性粒子は、同時に起こる粒子磁性出発物質のサイズ減少および音波処理の間の被覆によって調製した。むきだしのマグネタイトは、前記の実施例１記載のようなプロセスによって調製した。マグネタイトは、棒磁石によって水から分離し、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸緩衝液中１ｍｇ／ｍ１９ｘビオチン−ＢＳＡに再懸濁した。マグネタイトの平均粒子サイズは、連続して１０秒振動および１０秒休止を用いる１分間の音波処理（Fisher's Sonic Dismenmrator 550）によって減少した。粒子サイズおよびマグネタイト分離率は、前記の実施例８に記載のように測定した。平均粒子サイズは、８０ｎｍであった。分離率は、３０秒に８５％および１分に＞９５％であった。生じた産物を２週間にわたってモニターして、直接被覆マグネタイトが懸濁中に残存し、外見が透明であったとき、安定であることを発見した。実施例１０非被覆コロイド磁性粒子を用いた、溶液からのＤＮＡの結合および除去本実施例は、純粋なλＤＮＡがむきだしの、非被覆コロイド磁性粒子を用いて、酸性条件下で結合し、回収できることを示す。コロイド磁性粒子は、実施例１のように調製したむきだしのマグネタイトの懸濁を１ｍｇ鉄／ｍｌ溶液レベルでの水中で、磁気沈降することよって調製された。マグナタント（magnatant）（沈降しない液体層）を吸引し、元の用量と等しくなるように、０．１ＭＮａＣｌに再懸濁した。懸濁を５秒間振盪し、次いで、脱イオン水で３ど連続で洗浄した。それぞれの洗浄の間、マグネタイトは、適所に磁気を保持した。 Hoechst dye H33258（LIFE TECHNOLOGIES カタログ # 5250SB）で蛍光ラベルしたＤＮＡの２試験試料を調製した。１つ目の試料、試料Ａは、ｐＨ５の２０ｍリン酸緩衝液中８μｇ／ｍｌのλＤＮＡ１ｍｌを加え、すぐに１つ目の試験管を振盪することによって作った。次いで、得られた混合物を氷上、試験管中でマイクロチッププローブを用いて１分間音波処理（Fisher Sonic Dismembrator，mod el 550; セッティング 3，１秒オン／１秒オフのサイクル）した。２つ目の試料、試料Ｂは、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸緩衝液中８μｌ／ｍｌのλＤＮＡ１ｍｌを使用する以外は同じプロトコールで行った。ＤＮＡ量は、蛍光分析によって、磁気分離前および後の蛍光量を比較することによってアッセイした。表ＶＩは、蛍光シグナルおよびコロイド状の、磁性粒子に結合させることによって溶液から除去した％ＤＮＡ計算値を示す。実施例１１むきだしのマグネタイトによるＤＮＡの結合および緩衝液による回収該実施例は、酸性条件下で捕獲されたλＤＮＡを結合コロイド磁性粒子から、洗浄緩衝液の選択によって除去できることを示す。マグネタイトおよびλＤＮＡは、前記の実施例１０の記載に従って調製した。１０個のマグネタイト試料を調製した。全てを２０ｍＭリン酸緩衝液を用いるｐＨ４の酸性条件下で、蛍光ラベルしたＤＮＡといっしょに音波処理した。開始ＤＮＡ溶液の初期蛍光シグナルは８０であった。ＤＮＡを磁気で１０分間引き付け、上清を測定した。開始蛍光および上清シグナル間の差異から、回収したＤＮＡ％を計算した。表ＶΙΙは、音波処理によって抽出したパーセントが５８〜６３％に変化したことを示す。洗浄緩衝液の相対効率を％回収として示す。実施例１２〜２３で使用した全ての試薬および化学物質は、特記しないかぎり分析用の等級であり、Fisher Scientific（Pittsburgh，PA）から得た。実施例１２熱被覆反応を伴った熱音波処理マグネタイトマグネタイトは、１７ｇおよび１２ｇの硫化第二鉄五水和物および硫化第一鉄六水和物を、それぞれ、６０ｍｌの水酸化アンモニウムでｐＨを上昇させる間、水中で窒素雰囲気下７０℃で撹拌して混合することによって調製した。生じたマグネタイトを磁気的に収集し、蒸留水で１０分洗浄し、６００ｍｌの蒸留水に再懸濁した。そのようにして作った試料は、約１０ｍｇ／ｍｌのマグネタイトを含有した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−強磁性流体を調製するために、前記で調製したマグネタイトを１．０ｇ測定し、ビーカーに入れ、磁気的に２度水で洗浄した。最終懸濁を１００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で行った。マグネタイトを７０℃に予め加熱し、次いでFisher Sonic Dismembrator Model 55 0で２０分間、パルス音波処理１秒オン／１秒オフ（全部で４０分）で音波処理した。その間、１．８ｇのＢＳＡを６０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶解し、７５℃で１０分間加熱した。音波処理後、３０ｍｌの音波処理したマグネタイトをすばやく除去し、熱ＢＳＡと混合して、７５℃で５〜２０分間加熱し、次いでアイスバス中で冷却した。強磁性流体サイズ分配は、その表面にて３ｋガウス磁場を有するチャンバーにおける一連の調節した磁気洗浄によって狭くなった。固定時間の合間に捕集した物質を保持した。普通は、該方法をそれぞれの試料に対して３度行った。下記に、該プロセスを高磁場洗浄と称する。炭素分析によって測定したときのサイズ、塩安定性、および吸着した蛋白質の値は、表ＶΙΙΙ、列１〜３に示す。実施例１３熱被覆反応を伴った冷音波処理マグネタイトマグネタイトは、前記の実施例１２の記載に従って調製した。ＢＳＡ強磁性流体を調製するために、３．６ｇのＢＳＡを１２０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶解し、７５℃で１０分間加熱した。その間、前記で調製したマグネタイトを１．０ｇ測定して、ビーカーに入れ、水で２度磁気的に洗浄した。最終懸濁を１００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で行った。マグネタイトをFisher Sonic Dismembrator Model 550で１０℃にて３０分間、パルス音波処理１秒オン／１秒オフ（全部で６０分）、出力セッティング７で音波処理した。音波処理温度は、−４℃にてエチレングリコールを含む循環冷却系で調節した。音波処理後、６０ｍｌの音波処理マグネタイトをすばやく除去し、熱ＢＳＡと混合して、７５℃で５〜６０分間加熱し、次いでアイスバス中で冷却した。強磁性流体は、高磁場において洗浄した。サイズ、塩安定性、および吸収した炭素の測定は、表ＶＩＩＩ、列４〜９において示す。実施例１４強磁性流体の塩安定性および吸着した蛋白質の測定ＢＳＡ強磁性流体試料の塩安定性を測定するために、強磁性流体の０．２５ｍｌ試料を最終濃度が０、０．５、１．０およびときどき２．０ＭであるＮａＣｌを含むリン酸緩衝液中に入れた。次いで、試料をクールターＮ４ＣＤ半微量粒子分析器（Coulter Corp.，Hialeah，FL）で、室温にてｔ＝０、１、２、４、及び１７時間でサイズを測定した。吸着した蛋白質量を測定するために、、２〜３ｍｇの強磁性流体を１ｍｌ濃ＨＣｌと混合し、ガラスアンプル中へ入れ、封をした。一晩１１０℃で温浸後、試料をｐＨ２〜４に中和した。全ての吸着炭素は、ＴＯＣ５０００（Shimadzu， Kyoto，Japan）で測定した。前記の方法の結果は、下記の表ＶΙΙΙ中の実施例１２および１３において調製した強磁性流体を要約する。対照として、強磁性流体の１試料（実施例１２に記載の冷音波処理したマグネタイト）をＢＳＡと混合して、室温（２０℃）にて３０分間、加熱しないで放置した（列１０参照）。サイズデータにおける誤差範囲は、約５％であり、それゆえ小さな変化は誤差範囲内である。しかしながら、より大きなサイズ変化は重要である。前記の約３００ｎｍの粒子は、結局、溶液から逆に沈降するであろう。吸着炭素データにおける誤差範囲は、約４％である。注目すべきは、ＢＳＡとの「音波処理後の加熱時間」をより長くした結果、ＢＳＡで大いに被覆された（＞３００μｇＢＳＡ／ｍｇＦｅ）強磁性流体を生じることである。また、注目すべきは、これらの強磁性流体のサイズが、塩安定性の基準を満たす高塩濃度であっても、比較的一定のままであることである。最後に、注目すべきは、冷対照（列１０）は、有意に少ないＢＳＡ被覆を有し、それは、緩衝液イオン（２０ｍＭリン酸塩）のみを含む塩溶液中でさえも、大いに不安定であることである。実施例１５冷音波処理したＢＳＡ強磁性流体の熱処理強磁性流体は、米国特許出願第３９７１０６号に記載のように、マグネタイトと蛋白質の混合物の冷音波処理を用いて調製することができる。該強磁性流体の加熱はまた、結果として蛋白質被覆および塩安定性の増加をもたらすであろう。マグネタイトは、前記の実施例１の記載に従って調製した。ＢＳＡ強磁性流体は、２．０ｇのＢＳＡと１．０ｇのマグネタイトを２００ｍｌ中で混合することによって調製した。次いで、混合物をFisher Sonic Dismembrator Model 550で４５分間、パルス音波処理１秒オン／１秒オフ（全部で９０分）、出力７で音波処理した。音波処理温度は、−４℃にてエチレングリコールを含む循環冷却系で調節した。音波処理の間測定し温度は、３０℃であった。次いで、生じた強磁性流体を８０℃で、時間を０〜９０分の範囲で変化させて加熱した。吸着した蛋白質をBioRad Corp．(Richmond，CA)から商業的に入手できる蛋白質アッセイキットによって測定した。試料は、米国特許第５２０００８４号に記載のImmunicon Protein Separator（Immunicon Corp.，Huntingdon Valley,PA）中に置かれたワイヤースクリーンと適合したミクロタイターウェルにおける５分ＨＧＭＳを用いて、全磁性粒子を溶液から除去することによって、アッセイ用に調製した。上清をピペットを用いてミクロタイターウェルから除去し、キットの説明書の記載に従って、純粋なＢＳＡから作った標準曲線を用いてアッセイを行った。磁性粒子に結合した蛋白質は、マグネタイトに加えられた元のＢＳＡ量から非磁性上清中に見られたＢＳＡ量を差し引くことによって測定した。実験結果は、下記のグラフＩに示し、そこでは、鉄ｍｇ当たりの吸着したＢＳＡ量を加熱時間の相関としてプロットする。約３０分で起こる被覆の急な増加は、塩安定性における増加と相関がある（データを示さない）。実施例１６音波処理時間の間の加熱の機能としての非特異的結合マグネタイトは、前記の実施例１２に従って調製した。ＢＳＡ強磁性流体を調製するために、０．１７５ｇのマグネタイトを測定し、ビーカーへ入れ、水で２度磁気的に洗浄した。最終懸濁を１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中１０ｍｇ／ｍｌの調製したＢＳＡ溶液３５ｍｌで行った。混合物を被覆したビーカー（Heat Systems，Farmingdale，NY）に入れ、下記の表ＩＸに挙げた温度に冷却または加温した。次いで、混合物をFisher Sonic Dismembratorで２０分間、パルス音波処理１秒オン／１秒オフ（全部で４０分）、出力セッティング７で音波処理した。音波処理の実際の温度を測定した。音波処理後、BioRadアッセイを実施例１５に記載のとおり行い、結合蛋白質量を決定した。次いで、強磁性流体サイズ分配は、「高磁場」を用いる連続した３度の磁気洗浄によって狭まった。再懸濁は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で行った。次いで、強磁性流体をさらに２度の「低磁場」磁気洗浄を用いて分画した。磁場の強度は、捕集表面で約０．４ｋガウスであった。この場合、上清のみを各洗浄後に捕集し、ペレットを捨てた。サイズ、塩安定性、および固有のＮＳＢをこの点で測定した。ＮＳＢ（非特異的結合）は、この場合、細胞を次の操作で磁気的に捕集することが可能である強磁性流体と混合したとき、溶液から除去された細胞パーセントとして定義付けられる。強磁性流体／細胞溶液において、強磁性流体および細胞に相互作用を引き起こすべき物質は存在しない。例えば、抗体、レクチン、または一般的な捕獲試薬、例えばビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、または蛋白質ＡまたはＧは、存在しない。ＮＳＢは、放射性相違アッセイで測定した。ＣＥＭ細胞を⁵¹Ｃｒで、１０％胎児コウシ血清、１００ユニットのペニシリン−ストレプトマイシン、および１．２５％Ｌ−グルタミン（全て、Mediatech，Washington，DCによって供給された）で補助したＲＰＭ１２ｍｌ中５．０ｘ１０⁷細胞になるまで懸濁することによってラベルした。⁵¹Ｃｒは、Dupont（Wilmington，DE）から得、ボトルからそのまま使用した。クロムのｃｐｍは、CobraＩＩガンマカウンター（Packard，Downer's Grove，IL）でカウントすることによって決定した。約１ｘ１０⁷ｃｐｍのクロムを細胞に加えて、１５分毎振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。アッセイの場合、試験管中で２．５ｘ１０⁶細胞／ｍ１の１６０μｌのラベル細胞を２０μｇＦｅ／ｍｌの強磁性流体１６０μｌと、等張リン酸セーライン緩衝液（ＩＰＢＳ）中で混合した。混合液を５分間インキュベートした。インキュベーション時間の間、⁵¹Ｃｒのカウントをガンマカウンターでカウントすることによって決定した。次いで、２５０μｌの混合液をミクロタイターウェル中へ入れ、米国特許第５２０００８４号に記載のとおりImmunicon Cell Separator（Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA）で強磁性流体を５分磁気減少させて除去した。減少後、ミクロタイターウェルを除去し、個々に試験官へ移した。カウント数を記録した。さらに、試料をミクロタイターウェルに移した後の試験官に残存しているインキュベーション混合物を⁵¹Ｃｒでカウントした。開始カウント数は、試験管中に残存しているこれらのカウントを最初に各試験管へ加えたカウント数から引くことによって決定した。除去パーセント（ＮＳＢ）は、式：によって決定した。該実施例のデータは、下記の表ＩＸに示す。注目すべきは、前記の実際の音波処理温度が約６０℃で行うときのみ、強磁性流体は塩安定になるということである。それより高温度では、磁性粒子上の「むきだしの箇所」の脱離によって引き起こされ得る、鉄の正電荷に起因するＮＳＢドロップが、細胞に結合し、非特異的にそれらを溶液から除去し得る。実施例１７ストレプトアビジンのＢＳＡ強磁性流体への結合ストレプトアビジンは、以下の方法によってＢＳＡ強磁性流体と結合できる。熱被覆強磁性流体を、６０分ＢＳＡ被覆時間を用いて実施例１３のように調製した。強磁性流体をデカントし、高磁場で３度洗浄した。各洗浄後、強磁性流体を１８０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に再懸濁した。ＢＳＡ強磁性流体をＮ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Pierce，Rockford，IL）を用いて、製造者の説明書に従って活性化した。次いで、活性化した強磁性流体を３度洗浄した。各洗浄後、強磁性流体を４℃にて１８０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５に再懸濁した。鉄の質量の２倍に等しいストレプトアビジン（Prozyme，R ichmond，CA）量の質量を計り、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶解した。ストレプトアビジンは、トラーツ（Trauts）試薬（ Pierce，Rockford，IL）を用いて、製造者の説明書に従って活性化した。次いで、活性化したストレプトアビジンをＰＤ−１０カラム（Pharmacia Biotech，Upp sala，Sweden）に付して精製し、１ｍｌカラムフラクションを集めた。フラクション４および５は蛋白質を含んでおり、プールした。次いで、活性化した強磁性流体および鉄ミリグラムあたり１．５ｍｇの活性化したストレプトアビジンを混合し、室温で４時間、撹拌しながら反応させた。次いで、反応を５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中の４ｍｇ／ｍｌメルカプトコハク酸でクエンチした。クエンチング反応は、４℃で１６時間撹拌しながら反応させた。クエンチ反応後、強磁性流体を高磁場で２度洗浄した。各洗浄後、強磁性流体を０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１５０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に再懸濁した。しかしながら、最終再懸濁は、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で行った。得られた強磁性流体をFisher bath sonicator FS-14中に２分間浸し、次いで０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中で洗浄した。最後に０．２ミクロンの濾過を行った。実施例１８熱被覆ストレプトアビジン強磁性流体を伴うＣＥＭ細胞の減少最初に、抗−ＣＤ４５（Becton-Dickinson，San Jose，CA）モノクローナルを有効なアミノ基を用いてビオチン化した。約１〜２ｍｇの抗体を約０．５ｍｌの０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５中で調製した。Ｎ−スクシニミジル６ −（ビオチンアミド）ヘキサノエートエステル（Molecular Probes，Eugene，OR ）をＤＭＳＯに溶解し、抗−ＣＤ４５に過剰に加えた。混合物を４℃で２時間反応させた。抗体をＰＤ−１０カラム（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）で精製し、フラクション３および４（１ｍｌフラクション）を集めた。ＣＥＭ細胞を捕集し、約２．２ｘ１０⁷細胞／ｍｌの濃度になるまで、１％ＢＳＡを含む等張リン酸セーライン緩衝液（１％ＢＳＡ／ＩＰＢＳ）に懸濁した。一連の細胞懸濁試料０．８５ｍｌを、１μｇビオチン化抗−ＣＤ４５を用いて室温で１０分間インキュベートした。実施例６（lot188−143−6）のように、および一般に米国特許出願第３９７１０６号（lot0994-1282W）に記載のように調製したストレプトアビジン強磁性流体の溶液を次いで、０．８５ｍｌ容量で細胞へ加えた。強磁性流体の量は、鉄１２．５μｇから１００μｇへ変化した。混合物を室温で５分間インキュベートさせた。各試料を米国特許第５２０００８４号（ Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA）に記載のように、ピペットで２ｍ１細胞分離チャンバーへ移した。試料を７分間磁気的に捕集し、次いでそれらを磁場から除去した。各試料を次いで、ピペットで混合し、別の７分間の磁気捕集のために新たに少量を用いて、再び磁場に置いた。減少の効力は、 BD monoclonal antibody sourcebookに示されたように調製し、１：１で細胞懸濁と混合したエチジウムブロミド／アクリジンオレンジ色素を用いて、細胞数を血球計（Hausser Scientific，Horsham，PA）でカウントすることによって決定した。減少の結果は、下記の表Ｘに示す。注目すべきは、どちらの強磁性流体も能率よく細胞を除去するが、熱被覆したストレプトアビジン強磁性流体は、非加熱処理した強磁性流体が要するレベルの半分の鉄レベルと等しい、細胞の９９％以上を除去した。実施例１９熱被覆した強磁性流体と非加熱処理した強磁性流体の比較熱被覆した強磁性流体は、実施例１３の記載に従って調製し、実施例１７に記載のように（lot #188-191-15）ストレプトアビジンでコートした。非加熱処理したストレプトアビジン強磁性流体を実施例１８において使用された強磁性流体（lot #0395-1308）と同様にして調製した。ＴＯＣ５０００によって測定したとき、全吸収炭素は、熱被覆強磁性流体の場合２７８μｇ／ｍｇであった。非加熱処理した強磁性流体の場合、全吸着炭素は約１４５であった。これらの測定は、いずれのストレプトアビジン結合の以前にＢＳＡ粒子を獲得した。さらに、熱被覆強磁性流体は、塩安定であったが、一方、非加熱処理した強磁性流体は安定ではなかった。しかしながら、蛋白質被覆における差異および固有の性質は、ＢＳＡ粒子が二次蛋白質、例えばストレプトアビジンで被覆された後も続く。例えば、結合能力は、ストレプトアビジン強磁性流体と結合できるビオチン化した蛋白質の量を測定する。より多くのストレプトアビジンが粒子、結合できるより多くのビオチン化ＢＳＡ（ｂＢＳＡ）を被覆するので、結合能力値は、密接に蛋白質被覆と関係している。結合能力のアッセイは、ビオチンＢＳＡの¹²⁵Ｉでのラベリングで始まる。ビオチン−ＢＳＡは、Ｎ−スクシニミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートエステル（Molecular Probes，Eugene，OR）で、製造者の提示したプロトコールに従ってビオチン化した。次いで、ＰＤ−１０カラムに付してランニングすることによって精製し、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を用いて５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２００μｌのヨードゲン（Sigma，St．Louis， MO）を試験管中に入れ、窒素ガスを吹きいれることによって乾燥させた。１ミリキュリーの¹²⁵Ｉを試験管に加え、次に２００μｌのビオチン−ＢＳＡを加えた。混合物を氷上で１０分間インキュベートした。次いで、８００μｌのリン酸緩衝液を試験管へ加え、全容量を新たなＰＤ−１０カラムに付した。ラベルしたビオチン−ＢＳＡは、４および５番目の１ｍｌフラクションに溶出した。結合能力アッセイは、標準試料で開始した。１５〜５００μｇｂＢＳＡ／ｍｌの標準試料をリン酸緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび０．１５ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）２．５％¹²⁵Ｉラベルしたビオチン化ＢＳＡで調製した。強磁性流体を０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび０．０５％ ProClin300（Supelco，Inc.，Bellefonte，PA）を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を用いて４００μｇ／ｍｌに希釈した。次いで、強磁性流体をさらに、専用の前記のリン酸緩衝液で１０倍に希釈し、１５分インキュベートした。１００μｌの強磁性流体をミクロタイターウェルの空の各ウェルに置いた。各標準試料１００μｌを各ウェルに加え、１０分インキュベートした。次いで、各ウェルを、米国特許第５１８６８２７号に記載のように、ミクロタイターウェルのサイズを正確に開けて、四極子磁気分離器に置いた。５分後、非磁性上清を各ウェルから捨て、磁性体を５度、０．１％Tween20を含むＰＢＳ緩衝液を１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび０．０５％ProClin300を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ中の最終再懸濁と一緒に用いて洗浄した。次いで、ウェルを磁気分離器から除去し、各ウェルを１２ｘ７５ｍｍ試験管に入れた。各ミクロタイターウェル中に残存しているｃｐｍは、ガンマカウンターでカウントした。さらに、１０μｌの５００μｇ／ｍｌ標準試料（または５μｇｂＢＳＡ）をガンマカウンターでカウントした。この数を１．２５で割って、４μｇのｂＢＳＡに標準化した。次いで全試料数をこのファクターで割って、１０００をかけて、鉄ミリグラムあたりの結合したビオチンＢＳＡマイクログラム数を計算した。この結合能力アッセイの結果は、熱被覆強磁性流体（lot#188-191-15）および非加熱処理した強磁性流体（lot#0395-1308）の場合、表ＸＩに示す。データは、ほとんど全部のｂＢＳＡ範囲に対して、熱被覆プロセスによって製造した強磁性流体が、熱処理しなかった強磁性流体の約２倍の結合能力を有したことを示す。これは、いったん粒子がストレプトアビジンで被覆されると、有意により多くのビオチン化蛋白質が強磁性流体によって結合されたということである。強磁性流体粒子に結合したストレプトアビジン量の別の結果は、ビオチン化抗体でラベルした細胞の溶液からの除去における、強磁性流体の作用である。より多くのストレプトアビジンと結合した粒子は、低い量の鉄でより多くの細胞を除去できる。作用のアッセイには、非放射性ＣＥＭ細胞を１．０ｘ１０⁷細胞／ｍｌにて使用する。２ｍｌの細胞を実施例１８に記載のように調製した２．０μｇのビオチン化抗−ＣＤ４５と混合した。細胞および抗体を３０分間インキュベートした。次いで、１５０μｌの細胞混合物を空のミクロタイターウェルの各々に置き、次に１．５〜２５μｇ／ｍｌの１５０μｌの強磁性流体と混合した。強磁性流体は、ブロッキング緩衝液（強磁性流体希釈緩衝液、Immunicon Corporatio n，Huntingdon Valley，PAから入手可能）で少なくとも３０分間、プレインキュベートした。１０分のインキュベートの次に、実施例１８に記載のようにImmnic on Cell Separatorで５分分離した。細胞分離器から除去後、ウェル中の上清をピペットで混合し、１００μｌの試料を１０ｍｌの等張へマタール希釈液で満たした細胞カウンティングびんに移した。細胞数をクールターＺＦ細胞カウンター（Culter，Hialeah，FL）で測定した。減少は、試料から除去した細胞の強磁性流体の代わりに加えた緩衝液を有する試料と比較したパーセントによって測定した。様々な鉄濃度での減少を表ＸＩＩに示す。高い鉄値では、どちらの強磁性流体も同様な細胞パーセント減少するが、低い鉄値では、熱被覆した強磁性流体が有意により多くの細胞を除去することに注目すべきである。実施例２０熱被覆した強磁性流体を有する低密度フラクション単核細胞の減少単核細胞は、末梢血液試料からFicoll-Paque ET（Pharmacia Biotech，Uppsal a，Sweden）を用いる密度遠心分離によって単離し、１％ＢＳＡ／ＩＰＢＳ中で２度洗浄し、約２６．５ｘ１０⁶細胞／ｍｌ濃度になるまで、同じ緩衝液中に懸濁した。各細胞懸濁０．８５ｍｌの２試料を室温にて１０分間、前記の実施例１８のように調製した１μｇビオチン化抗−ＣＤ４５といっしょにインキュベートした。実施例１７（lot 188-143-6）のように調製したストレプトアビジン強磁性流体溶液を次いで、０．８５ｍｌ容量における細胞に加えた。１０．０μｇおよび７５μｇの鉄／試験を該実施例で用いた。混合物を室温で５分間インキュベートさせた。次に、各試料をピペットで前記の実施例１８で使用したような２ｍｌ細胞分離チャンバー（Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA）中へ移した。試料を実施例１８のように、７分磁気捕集を２回、捕集の間にピペットで再懸濁して磁気捕集した。減少の効力は、１０．０μｇ鉄で９７．２％および７５．０μｇ鉄で９７．９％であることを決定した。実施例２１ＢＳＡ強磁性流体への蛋白質Ａの結合他の蛋白質は、前記のようにＢＳＡ強磁性流体へ結合できる。一例は、蛋白質Ａである。ＢＳＡ強磁性流体は、全音波処理時間を３０分にした以外は実施例１２のとおり調製した。熱被覆は、２００ｍｌ中６００ｍｇのＢＳＡで行った。熱被覆後、試料を冷却し、−４℃エチレングリコールバス中で冷却しながらさらに５分間音波処理した。４℃で一晩、強磁性流体をインキュベーションした後、強磁性流体をデカントし、高界磁石で分画して、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で４度洗浄した。ＢＳＡ強磁性流体を調製して、実施例１７の記載のようにＳＭＣＣで活性化した。蛋白質Ａ（Pharmacia Bioteh，Uppsala，Sweden）を実施例１７の記載のようにトラーツ試薬で活性化した。次いで、１．０ｍｇの強磁性流体および１．０ｍｇの蛋白質Ａを混合し、室温で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。反応を実施例１７記載のようにメルカプトコハク酸でクエンチし、強磁性流体を４度洗浄した。この熱被覆した蛋白質Ａ強磁性流体の結合能力は、非加熱処理した強磁性流体、それ以外は全く同じに調製したものの結合能力より２倍大きく、該物質は容易にフィルター滅菌した。実施例２２ＢＳＡ強磁性流体へのヤギ抗−マウスの結合ヤギ抗−マウス抗体もまた、ＢＳＡ強磁性流体に結合できる。ＢＳＡ強磁性流体を調製し、実施例２１記載のようにＳＭＣＣで活性化した。ヤギ抗−マウス抗体（Jackson Labs，West Grove，PA）を実施例２１記載のようにTraut試薬で活性化した。次いで、３０．５ｍｇの強磁性流体および１５．６ｍｇヤギ抗−マウス抗体を混合し、室温で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。反応を実施例２１記載のようにメルカプトコハク酸でクエンチし、強磁性流体を４度洗浄した。該方法で調製した強磁性流体は、同様に調製した非加熱処理した強磁性流体と比べて低濃度の強磁性流体で、より効果的に細胞を減少させた。実施例２３ＢＳＡ以外のポリマーを用いる熱被覆強磁性流体の調製加熱処理した強磁性流体をＢＳＡ以外のポリマーおよび蛋白質を用いて調製することもまた、可能である。デキストランＴ−１０およびＴ−４０（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）のようなポリマー、およびベーターラクトグロブリン（Sigma，St．Louis，MO）のような蛋白質を、ＢＳＡでの熱被覆を前記のポリマーでの熱被覆に置き換えた以外は実施例１３記載のプロセスで使用した。該熱被覆プロセスによって調製した強磁性流体は、同様なプロセスによって、しかし加熱工程なしで調製した強磁性流体と比較し、およびサイズならびに全吸着炭素を比較した。全ての場合、熱被覆プロセスの結果、比較的高い度合の被覆を有する小さい強磁性流体を生じ、一方、冷プロセスの結果、溶液からすみやかに沈降し、有意に少ない吸着被覆剤を有した大きい、不安定な粒子を生じた。本発明のある特定の具体例を記載し、例示するが、それは、本発明をかかる具体例に限定しようとするものではなく、しかし、以下のクレームに示すような本発明の範囲および精神からはずれることなしに、様々な修飾をそれに行ってもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラオ，ガラ・シーアメリカ合衆国08540ニュージャージー州プリンストン、ヘリティッジ・ブールバード６番 (72)発明者チャラッパ，ジョゼフ・エヌアメリカ合衆国08822ニュージャージー州フレミントン、クラーク・サークル903 番 (72)発明者ピッコリー，スティーブン・ピーアメリカ合衆国19067ペンシルベニア州モーリスビル、フェアービュー・アベニュー 75番

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．磁性出発物質の少なくとも１粒子を複数の、凝集できる、より小さなサイズの粒子に分割して、非被覆微粒子磁性基質を得、ｂ．該非被覆微粒子磁性基質を液体媒体中に懸濁し、ｃ．該被覆、懸濁微粒子磁性基質を、微粒子磁性基質の実質的な凝集が起こる前に、被覆剤が基質に付着するのに十分な時間被覆剤で被覆し、再懸濁できる被覆磁性粒子を形成させることからなる被覆剤を微粒子磁性基質に直接適用することによる再懸濁できる被覆磁性微粒子の製造法。２．さらに、被覆工程中で、微粒子磁性基質を少なくとも約４５℃にて、被覆剤が基質に付着するのに十分な時間加熱することからなる請求項１記載の方法。３．該磁性出発物質が、少なくとも１種の遷移金属酸化物を含む請求項１または２記載の方法。４．遷移記載酸化物がマグネタイトである請求項３記載の方法。５．被覆剤が天然または合成ポリマーである請求項１または２記載の方法。６．磁性出発物質を、照射、振動、ｐＨ変動、音波処理またはこれの組み合わせの下で分割する請求項１または２記載の方法。７．被覆した磁性粒子が一般に最大寸法０．２μ以下を有する請求項１または２記載の方法。８．微粒子磁性基質の、被覆剤に対する重量比が、約１０００：１〜約１：１０である請求項１または２記載の方法。９．さらに、磁性被覆粒子を水または水性緩衝液に再懸濁することからなる請求項１または２記載の方法。１０．さらに、被覆磁性粒子を該被覆に特異的なに二官能性化合物と反応させる工程を含む請求項１または２記載の方法。１１．さらに、被覆磁性粒子を二官能性化合物と反応させ、得られた粒子を二官能リガンドと反応させる工程を含む請求項１または２記載の方法。１２．さらに、被覆磁性粒子を活性化剤と反応させ、得られた粒子を二官能リガンド反応させる工程を含む請求項１または２記載の方法。１３．加熱を、約６０℃〜約８５℃の温度で行う請求項２記載の方法。１４．微粒子磁性出発物質を、被覆剤の存在下、約５０℃〜約８５℃の温度で細分する請求項２記載の方法。１５．微粒子磁性出発物質を、加熱せずに、被覆剤の実質的に非存在下で細分し、ついで、細分した出発物質と被覆剤を、加熱しながら接触させる請求項２記載の方法。１６．磁性出発物質が、からなる群から選らばれる一対のイオンを含む請求項１記載の方法。１７．さらに、（ａ）微粒子磁性出発物質の液体混合物を形成し、（ｂ）該混合物を、約７５℃の温度で、４０〜１８０ｎｍのサイズの粒子を生ずるに十分な時間音波処理して、微粒子磁性出発物質を、液体中に懸濁する、凝集できる、より小さなサイズの粒子に分割し、（ｃ）該加熱、非被覆、懸濁した、より小さなサイズの粒子を、該小さなサイズの粒子が実質的に凝集する前に、７０〜８０℃の温度で、被覆剤が基質に付着するのに十分な時間、被覆剤と接触させて、再懸濁できる、被覆磁性粒子の安定な懸濁液を形成することからなる請求項２記載の方法。１８．非被覆、懸濁微粒子磁性基質を、再懸濁できる被覆磁性粒子の完全な被覆を与えるに十分な量以下の被覆剤と接触させる請求項１７記載の方法。１９．請求項１７の方法により調製された、再懸濁できる、被覆磁性粒子。２０．室温で２４時間までの期間、粒子を１モル塩溶液に曝した場合、粒径増加２倍以下で示される、塩溶液におけるコロイド安定性を示す再懸濁できる被覆磁性粒子。