JPH11502925A - タウ−タウ会合の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異常なタウ−タウタンパタ質会合および異常な神経フィラメント凝集を調整するかもしくは阻害することができる物質を検出するための新規な方法に関する。本発明の方法は、アルツハイマー病、運動ニューロン病、Lewy小体病、ピック病、および進行性核上性麻痺の予防および処置用の物質のスクリーニングに特に有用である。さらに、正常な細胞骨格機能を保持したまま異常な凝集を選択的に阻害することのできる物質も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 タウ−タウ会合の阻害 本発明は、異常な（pathological）タウ−タウタンパク質会合および異常な神 経フィラメント凝集を調整するかもしくは阻害し得る物質を検出するための新規 な方法に関する。本発明の方法は、アルツハイマー病の予防および処置のための 物質のスクリーニングに特に有用である。 アルツハイマー病(AD)は、後期の人生における痴呆の最も一般的な単一の原因 である(Livingstone（1994）The scale of the problem．Dementia（eds．Burns and Levy）Chapman & Hall，London，pp.21-35)。アルツハイマー病の個体は、 記憶の喪失の増大、判断力、知覚および言語における障害、ならびに全体的な知 力の悪化を呈する進行性の痴呆によって特徴付けられる(Roth and Iversen（198 6）Brit．Med．Bull.，42(special volume))。 アルツハイマー病の主な病的特徴は、老人斑(senile plaque)および神経原線 維変化(neurofibrillary tangle)であり、どちらも対になったらせん状線維(pai red helical filaments: PHF)を含み、微小管関連タンパク質タウが、その構成 成分である(Wischik et al．（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，4506-4 510)。（老人）斑もまた、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおける 未だに不確定の異常から誘導されるβアミロイド原線維を含む(APP; Kang et al ．（1987）Nature，325，733-736)。 アルツハイマー病の研究は、正常な微小管関連タンパク質タウの喪失(Mukaeto va-Ladinska et al．（1993）Am．J．Pathol.，143，565-578; Wischik et al． （1995a）Neurobiol．Ageing，16: 409-417;Lai et al．（1995b）Neurobiol．A geing，16: 433-445)、異常な対 になったらせん状原線維の蓄積(PHFs; Mukaetova-Ladinska et al．(1993)，前 出; Harrington et al．（1994a）Dementia，5，215-228; Harrington et al． （1994b）Am．J．Pathol.，145，1472-1484; Wischik et al．（1995a）前出)お よび認知障害の強い明確なマーカーとしての中−前頭皮質におけるシナプスの喪 失(Terry et al．（1991）Ann．Neurol.，30，572-580)を指摘してきた。シナプ スの喪失(Terry et al．前出)および錐体(pyramidal)細胞の喪失(Bondareff et al．（1993）Arch．Gen．Psychiatry，50，350-356)は、どちらもタウ反応性神 経原線維異常の形態(morphometric)測定と相関しており、これは、アルツハイマ ー病における、可溶性形態から重合した形態(PHF)へのタウタンパク質プールの ほとんど完全な再分布(redistribution)と分子レベルで相関している(Mukaetova -Ladinska et al．(1993)，前出; Lai et al．(1995)，前出)。これらの変化の 可能な説明は、タウタンパク質のPHFへの異常な再分布が、錐体細胞内での軸索 チューブリンの重合状態の維持の不足を介して、皮質−皮質関連回路における軸 索の輸送の不足を引き起こすということである(Wischik et al．(1995a)，前出; Wischik et al．（1995b）Neurobiol．Ageing，印刷中; Wischik et al．（199 5c）Structure，biochemistry and molecular pathogenesis of pairedhelical filaments in Alzheimer's disease．Eds．A．Goate and F．Ashall，印刷中; L ai et al．（1995），前出)。突出細胞体(projection soma)から遠位の関連新皮 質までのシナプス成分の輸送の不足の結果、シナプスの損失と認知障害に至る。 さらなる要因は、錐体細胞におけるPHF蓄積の直接的な毒性(Bondareff et al.， (1993)，Arch．Gen．Psychiat．50: 350-356;(1994)，J．Neuropath．Exp．Neur ol．53:158-164)、および細胞の機能を損なう短縮型タウの蓄積と いう直接的毒性の可能性(Mena et al．(1991)，J．Neuropath．Exp．Neurol．50 : 474-490)を含む。 モデル系における分子的病因の研究はβ−アミロイド蓄積の神経毒性の役割を 強調してきたが(Harrington and Wischik（1994）Molecular Pathobiology of A lzheimer's disease．Dementia(eds．A．Burns and R.Levy)．Chapman & Hall L ondon，pp.211-238に概説)、β−アミロイド沈着をヒトにおける認知障害と直接 的に関連付ける証拠は薄弱である。APPの改変されたプロセシングが、タウタン パク質の改変されたプロセシングを開始し得るいくつかの可能な要因の唯一のも のであることの方がありそうである。他の開始要因は、apoE4に関連する未知の プロセス(Harrington et al．(1994b)，前出)、第21染色体のトリソミー(Mukaet ova-Ladinska et al．（1994）Dev．Brain Dysfunct．7: 311-329)、および環境 要因、例えば、アルミニウムの亜毒性レベルへの長時間の曝露(Harrington et a l．（1994c）Lancet，343，993-997)を含む。他の病因因子は、タウタンパク質 プロセシングにおける一般的なパターンの障害を引き起こすことができ、その障 害は：Glu-391でのＣ−末端短縮化、PHFタウポリマーの形成、可溶性タウの喪失 および異常にリン酸化されたタウ種の蓄積を含む(Wischik et al．（1996）Int ．Rev．Psychiat.，印刷中)。 PHFのプロテアーゼ耐性コア構造の不可欠な成分であることが示されてきた微 小管関連タンパク質タウのフラグメントは、タウの微小管結合ドメインから誘導 される93/95アミノ酸残基フラグメントである(Wischik et al．(1988)，前出; K ondo et al.，（1988）Neuron，1，827-834; Jakes et al.，（1991）EMBO J.，10 ，2725-2729; Novak et al.，（1993）EMBO J.，12，365-370)。タウタンパク 質は、成人の脳に、352〜441ア ミノ酸残基の６つのアイソフォームで存在する(Goedert et al．（1989）Neuron ，3，519-526)。一般的な構造では、タウ分子は、252残基の長いＮ−末端ドメイ ンで微小管から突出しているもの、３または４個の縦列反復物からなる93〜125 残基の縦列反復領域で微小管結合ドメインであるもの、および64残基のＣ−末端 尾部からなっている。各縦列反復物は、19残基のチューブリン結合セグメント、 および12残基のリンカーセグメントを含んでいる(Butner and Kirschner（1991 ）J．Cell．Biol.，115，717-730; 図１)。主なタウの成分はプロテアーゼ耐性 コアPHF濃縮調製物から抽出することができ、３反復および４反復アイソフォー ムのどちらからも誘導される12kDaのフラグメントであるが、アイソフォームに 関わらず３縦列反復物の等価物に限定される(Jakes et al.，前出; 図２)。フラ グメントのＮ−末端およびＣ−末端の境界は、特徴的なプロテアーゼ耐性コアPH Fタウユニットの正確な長さを規定する。それは、Butner and Kirschner、前出 、により定義された正常な分子の結合物／リンカー構成(図１)に関して、14/16 残基分フェーズシフトし、Glu-391で、または４反復アイソフォームの第３番目 の反復物内の同じ場所でＣ−末端が短縮されている(Novak et al．（1993）、前 出; 図３)。このＣ−末端短縮点を特異的に認識するモノクローナル抗体(mAb 42 3)が入手可能であり、この抗体を用いる組織学的研究は、神経原線維退化の全て の段階でGlu-391でＣ−末端が短縮されたタウタンパク質の存在を示した(Mena e t al．（1995）Acta Neuropathol.，89，50-56; Mena et al．（1996）Acta Neu ropathol．(印刷中))。したがって、PHF構築に関与する可能な翻訳後修飾は、異 常なタンパク質分解である。 ＡＤ脳組織に見られるいくつかのタウプール：正常可溶性タウ、リン酸化され たタウ、およびプロテアーゼ耐性PHF、の区別を可能にする方法が開 発されてきた(Harrington et al.，(1990)，(1991)，(1994a)，前出)。これらの 方法は、重篤なＡＤおよびダウン症候群の研究(Mukaetova-Ladinska et al.，（ 1993; 1995）、前出)、初期段階のＡＤで将来を見越して評価された症例(Wischi k et al．（1995a）、前出; Lai et al．(1995)前出)ならびにLewy小体型の老人 性痴呆およびパーキンソン病型を含む他の神経病理学的診断の症例(Harrington et al．(1994a)，(1994b)，前出)において展開されてきた。脳組織内の全PHF含 有量は、アルツハイマー型の痴呆を有する患者と有さない患者との間では明白に 異なる。PHF含有量には19倍の違いがあり、側頭皮質では、その違いは40倍にも 達する。PHFが蓄積する主な部位は、組織学的研究から予測されるように、プロ テアーゼ耐性PHFもしくはリン酸化されたタウタンパク質種のいずれの蓄積に関 しても老年期のコントロールと異ならない(Harrington et al．(1994a)，(1994b )，前出)。さらに、皮質のLewy小体のアポリポタンパク質Ｅの遺伝子型の場合は 、E4アレル体の頻度がＡＤにおいて見られるのとほぼ同じ程度に上昇したことを 示した。したがって、E4アレル体の存在が、ＡＤの特徴的なタウ異常の唯一の原 因ではあり得ない。なぜなら、これはLewy小体の場合では見られなかったからで ある(Harrington et al．(1994b)，前出)。 ＡＤを有する場合と有さない場合を区別するさらなるパラメーターは、正常可 溶性タウタンパク質の量である。タウレベルは灰白質内より白質内の方が高いが 、軸索微小管関連タンパク質について予測されるように、灰白質内に見いだされ る量は求心性の軸索の神経分布も反映する。ＡＤの場合、全脳領域に一様に作用 する正常可溶性タウタンパク質の実質的な喪失がある(Mukaetova-Ladinska et a l．(1993)、前出)。この一様な減少の分子的基礎は末知であり、タウmRNAの減少 によって説明することはでき ない(Goedert et al．（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，4051-4055)。 PHFの蓄積と可溶性タウの喪失という２つのプロセスの正味の効果は、タウタン パク質プールの、白質主体から灰白質主体への、前頭皮質主体から側頭皮質主体 への、解剖学的再分布である。 ＡＤにおけるタウタンパク質の再分布の全体的な範囲は、図４に示されるデー タから理解することができ、そこでは全遊離タウプールおよびPHF結合プールが 比較されている。コントロールでは97％のタウタンパク質プールが可溶性期にあ るのに対し、ＡＤでは、87％のタウタンパク質プールが不溶性期にあることが見 いだされ、ほぼ全体が短縮されPHFに重合した形態である(Mukaetova-Ladinska e t al．(1993)前出)。臨床的診断器具CAMDEXによって将来を見越して評価された 場合(Roth et al．(1986)Brit．J．Psych.，149，698-709)およびBraak and Bra akの実施基準により死後と分類された場合((1991)，Acta Neuropathol．82，239 -259)における早期のＡＤの研究は、可溶性タウの喪失がもつれの数(tangle cou nt)とPHF蓄積の程度に直接関係していることを示した(Laiet al．(1995)前出)。 異常にリン酸化されたタウタンパク質は、可能なPHF前駆体と考えられてきた が(Lee et al．(1991)Science，251，675-678; Goedert et al．(1994)，in Mic rotubules（Hyams and Lloyd eds.）pp.183-200．John Wiley & Sons，NY)、正 常なタウは、以前にはPHF関連タウタンパク質において異常にリン酸化されてい ると考えられていた多くの部位でリン酸化されていることがわかった(Matsuo et al．(1994)Neuron 13，989-1002)。初期ＡＤの研究において、不溶性過リン酸 化タウ種は、はじめ、PHFへのかなりのタウ再分布が起こった後に見られた(Lai et al．1995; 図５)。PHFもしくは神経原線維のもつれの現れる前のリン酸化さ れ た種の選択的蓄積の証拠はなかった(Lai et al．(1995)，前出)。同様に、異常 の進行の間にリン酸化されたタウが全PHF結合プールに送り込まれるという証拠 はなかった(Lai et al.，(1995)，前出)。タウタンパク質のリン酸化は、それが 異常である限りにおいて、異常のどの段階でも約５％のPHFに影響を及ぼす二次 的なプロセスのようである(Wischik et al．(1995a)，(1995c)，前出)。 初期段階のアルツハイマー病の研究はまた、可溶性タウのPHFへの変化の速度 は、PHFレベルに関して幾何級数的であり、PHFレベルがより高い環境での取り込 み速度は漸進的に増加するということも示した(Lai et al (1995)，前出; 図６ Ｂ)。さらに、異常の進行をともなう可溶性タウの観察された喪失率は、観察さ れたPHFの蓄積率を完全に説明できるほど十分ではない。周囲の可溶性タウレベ ルが580pmol/gより低下するにつれ漸進的により多くの新しいタウ合成が誘導さ れ、そしてこれもPHFの構築に送り込まれる（図６Ａ）。したがって、PHFの構築 率は、可溶性前駆体の状態もしくは濃度により測定されるのではなく、それはＡ Ｄにおいてさえ完全に正常であるようである(Wichik et al．(1995a)，(1995b) ，前出)。むしろ可溶性タウのPHFへの変化率は、周囲のPHF-タウレベルにより決 定され、そのことは、PHF構築を行う重要な翻訳後修飾が、タウのPHFへの取り込 みの時点で起こることを示唆している。 これらの発見の適当な説明は、タウタンパク質が、PHFへの取り込みの時点で 、誘導された構造的な変化を受け、それが、先に詳細に記載された縦列反復領域 における半反復フェーズシフト(phase shift)に関係しているということである( Novak et al．(1993)、前出)。この構造的な変化は、さらなるタウ分子の捕獲お よび誘導された構造的修飾等を可能にする高親和性タウ捕獲部位を露出させるこ とができる。PHF構築の速度を決定するタ ウタンパク質における重要な構造的変化は、したがって、可溶性タウの化学的修 飾である必要はなく、タウタンパク質の異常な基質への結合により生じる誘導さ れた構造的変化でなければならない。この過程は、例えば、APP代謝の産物(Capu to et al．(1992)Brain Res.，597，227-232)、修飾されたミトコンドリアタン パク質(Wallace（1994）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91，8739-8746)などのよ うな非タウタンパク質により開始することができる。一旦タウの捕獲が開始され ると、この過程は、さらなるタウの捕獲速度が異常なタウ複合体の分解(degrada tion)速度を上回る場合に限り継続し得る。分解は、PHFのコアタウ複合体がプロ テアーゼに対して耐性であるという事実によって限定される(Wischik et al．(1 988)、前出; Jakes et al．前出)。そのような過程は、「タウタンパク質のアミ ロイド沈着」であり、一般的に示唆されているように、可溶性タウタンパク質の 介在する化学的修飾が無くても開始され、そして幾何級数的に進行し得る。 図７は、アルツハイマー病におけるタウタンパク質のPHFへの型転換を略図的 に示している。PHFコアの主要なタンパク質成分は、正常なら微小管結合ドメイ ンとして機能するタウ分子のフェーズシフトした形態の縦列反復領域を含む93残 基のフラグメントにまで短縮されたタウタンパク質の形態である。PHFの構築は 、異常なタウ−タウ結合が中枢的役割を果たす繰り返される一連の事象の結果起 こると考えることができる。この遊離のタウの結合は、一方のタウ分子が既に異 常な捕獲（例えば、APP代謝産物への捕獲(Caputo et al．（1992）Neurobiol．A geing，13，267-274)、あるいは変更されたミトコンドリアタンパク質への捕獲( Jancsit et al．（1989）Cell Motil．Cytoskel.，14，372-381; Wallace，前出 ))を受けている不均衡な場合においてのみ生理学的濃度で好都合であり、そし てさらなるタウ結合は、短縮型タウユニットのみを残して捕獲された種の部分的 なタンパク質分解過程により促進される。一旦完全長もしくは短縮型ユニットが 完全長分子に結合すると、異常な複合体の部分的タンパク質分解過程は結果とし て二量体のコアタウユニットを産生し、それは、以前の完全な分子のＮ−末端お よびＣ−末端を欠いている。タンパク質分解過程の限界は、タウ−タウ会合領域 により決定され、それは、正確に、本発明者らが記載した最小プロテアーゼ耐性 タウユニットに対応する(Novak et al．(1993)、前出; 図16および17参照)。し かし、この部分的タンパク質分解の最終的な結果は、コアタウユニットの再生で あり、それは、さらなる完全長タウ分子を捕獲することができる。この過程は、 無期限に反復することができる。それは、利用可能なタウタンパク質プールが無 くなる点まで継続するための２つの重要な工程を必要とする。まず第１は、短縮 型ユニットによる完全長タウの反復捕獲であり、そして第２は、コアユニットを 再生するための結合した完全長タウの短縮化である。 これまでは、異常なタウ−タウ会合の信頼し得る測定方法は利用可能でなく、 かつ異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得る物質も記述されたこ とはない。 上記の技術的問題の解決は、請求の範囲において特徴付けられる実施態様を提 供することにより達成される。 したがって、本発明は、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得 る物質の検出方法に関し、該方法は、 ａ）タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を、 ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害し得ると推測される物質、および ｃ）工程ａ）のタウタンパク質に結合し得る標識されたタウタンパク質も しくは標識されたその誘導体と、または工程ａ）のタウタンパク質とは区別され るがやはり工程ａ）のタウタンパク質と結合し得るタウタンパク質もしくはその 誘導体と接触させる工程、ならびに ｄ）タウ−タウ結合の検出工程、 を包含する。 タウのPHFへの重合を行うタウの修飾は、タウの前述のいかなる化学的翻訳後 修飾よりむしろ物理的な構造的変化によって促進される。驚くべきことに、異常 なタウの捕獲の時点でin vivoで誘導されるこの修飾を、固相へ最初にタウを結 合させることにより、上記の過程にしたがって、in vitroの方法に移行すること が可能である。ラットの新生児の脳から単離したタウは、PHFのコアタウユニッ トに結合することが全くできなかった(図14; POTr)。しかし、以前には固相マト リックスに受動的に結合していた新生児タウは、未修飾完全長タウタンパク質を 、コアタウユニットによって示されていたものと同じ高い親和性で結合するよう に誘導された(図15および16)。したがって、異常な結合ができないタウ種を高い 親和性でさらなるタウ分子を捕獲することのできる種に変換するのに必要とされ る重要な要因は、新生児タウの固相基質への受動的結合により誘導される構造的 な変化である。このことは、高親和性タウ捕獲部位の露出は、タウが適切な基質 に結合する場合に生じる構造的な変化により物理的に誘導することができ、いか なる他の化学的修飾も必要としないことを実証する。 本発明によれば、in vitroで再現される異常な結合は、ヒトの脳においてみら れるのと同じ特定の重要な性質を有していた。このことは、特に、Ala390で終結 し、したがって、モノクローナル抗体423によって認識されるのに必要なGlu-391 を欠いているコアタウユニット（図21、SEQ ID NO:４）に結合した完全長タウタ ンパク質が、結合したタウ複合体を広範囲の プロテアーゼ、すなわちPronaseで処理した後でも、Pronase消化の範囲において は量に依存するように、mAb423と反応するようにさせることができる(図16)。Ｎ −末端タウ免疫反応性の消化依存性喪失は、コアPHFの特徴であるmAb423免疫応 答性の獲得と平行して起こることを示すことができる(図16)。したがって、PHF のコアから単離され、アルツハイマー病の脳において産生されるタウユニットの 創製に必要とされる必須の要件は、in vitroで再現される異常なタウ−タウ相互 作用である。 さらに、完全長タウのAla-390で終結しているコアタウユニットへの結合の反 復サイクル、続くPronase処理、その次の完全長タウの結合とさらなるPronase消 化など４サイクルまでは、Ｃ−末端がGlu-391で短縮されているタウの漸進的な 蓄積と関連し(図17)、かつ各サイクル後のさらなる完全長タウの結合のための能 力の漸進的な増強と関連する(図18)。このことは、図７に示したモデルにおける タンパク質分解の実質的な役割が飽和を防ぎ、したがって、可溶性タウのコアPH Fの短縮型タウユニットへの無制限の漸進的変形を促進することであることを示 している。 図７に示された全ての工程が、in vitroで再現され得ること、およびその過程 の進行の重要な要件が高親和性タウ捕獲工程であることが示されてきたので、高 親和性タウ−タウ相互作用をブロックし得る化合物を見いだすための結合アッセ イの使用を示すことが可能である。ほとんどの潜在的な阻害性化合物が、タウに 関してモル比１：１で存在する場合に、20％の競合的阻害を示すことができ、さ らなる阻害は、モル比１０：１までの範囲内でほぼ直線的であることがわかった (図19)。 縦列反復領域は全体として機能するので、その分子の同じ領域を介するタウの チューブリンへの正常な結合を干渉しない、異常なタウ−タウ結合の選択的な競 合的阻害を示すことが可能であろうということは予想外のこ とである。いかなる可能な干渉、すなわち、タウもしくはその誘導体のチューブ リン分子への結合、をも決定する方法は、脱重合したチューブリン調製物もしく はタキソール安定化微小管の調製物を、異常なタウ−タウ会合を調整するかもし くは阻害し得ることが推定される物質、および上記の工程ｃ）で言及したタウ化 合物と接触させる工程、それに続くタウ−チューブリン結合の検出を包含する。 用語「タウタンパク質」とは、上記で言及したタウタンパク質ファミリーの任 意のタンパク質およびそれらの誘導体をいう。タウタンパク質は、構築と分解と いう反復サイクルの間に微小管と同時に精製される多数のタンパク質ファミリー のうちの１つのファミリーとして特徴付けられ(Shelanski et al．(1973)Proc． Natl．Acad．Sci．USA，70，765-768)、微小管関連タンパク質(MAP)として知ら れている。さらに、このタウファミリーは、このファミリーの全てのメンバーが 共有している特徴的なＮ−末端セグメント、このＮ−末端セグメントに挿入され ている〜50アミノ酸の配列で、脳において発生上調節されるもの、31〜32アミノ 酸の３または４個の縦列反復物からなる特徴的な縦列反復領域、およびＣ−末端 尾部の存在により特徴付けられる(図２)。 本発明の好ましい実施態様においては、このタウタンパク質は図21のアミノ酸 配列（SEQ ID NO:５）で、「Ｔ４０」(Goedert et al．(1989)，Neuron 3: 519- 526)といわれるもの、もしくはそのフラグメントを含み、そして２つのＮ−末端 挿入物および４つの縦列反復物を有するタウタンパク質の形態を含む。 用語「タウコアフラグメント」は、その最も基本的な形態において、縦列反復 領域から誘導される短縮されたタウタンパク質配列を含むタウフラグメントとし て定義され、それは適当な条件下でさらなるタウタンパク質 の縦列反復領域に高い親和性で結合し得る。通常、好ましいタウタンパク質、タ ウタンパク質誘導体、およびタウタンパク質コアフラグメントは、対応するヒト タウタンパク質アミノ酸配列（図21、SEQ ID NO:５）と少なくとも70％のアミノ 酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは少なくとも80％、そして 最も好ましくは少なくとも90％の同一性を有し、さらにそれらはヒトタウコアフ ラグメントに結合し得ることで特徴づけられる。このアッセイ方法の特に好都合 な実施態様は、図22（SEQ ID NO:６；Novak et al.，1993）に示したアミノ酸配 列を有するタウコアフラグメントを含む。E．coliによってin vitroで発現され るこの組換えタウペプチドは、プロテアーゼ耐性コアPHF調製物から単離される 種と同じである(Wischik et al．(1988)、前出; Jakes et al．(1991)，前出)。 用語「タウコアフラグメント」はまた、以下に記載されるような、そして図25お よび26（SEQ ID NO:９および10）で言及されるような、それらの誘導体も含む。 用語「タウタンパク質誘導体」および「タウコアフラグメント誘導体」は、天 然に生じるもしくは天然に生じないタウタンパク質、および少なくともタウタン パク質の縦列反復領域に似た部分アミノ酸配列を含む関連タンパク質、すなわち 、天然のタウもしくはそのフラグメントの１以上のアミノ酸が結合活性を失うこ となく置換もしくは欠失されているタンパク質を含む。縦列反復領域において配 列類似性を有する天然に生じるタンパク質の例は、微小管関連タンパク質である (MAP2; 図25および26; SEQ ID NO:９および10; Kindler and Garner（1994）Mol ．Brain Res．26，218-224)。そのようなアナログは、ペプチド化学法という公 知の方法により、あるいは組換えＤＮＡ技術により産生されてもよい。 用語「タウタンパク質誘導体」および「タウコアフラグメント誘導体」 は、残基上に側鎖として生じる官能基から、またはＮ−末端もしくはＣ−末端基 から、当該分野で公知の手段により調製することができる誘導体を含む。これら の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは 二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アル カノイル基もしくは炭素環式アロイル基）により形成されるアミノ酸残基の遊離 のアミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル部分により形成される遊離のヒド ロキシル基の（例えば、セリル残基もしくはトレオニル残基のそれ）Ｏ−アシル 誘導体を含み得る。 コアPHFタウフラグメントは、ＡＤ脳組織からWischik et al．((1988);(1995a )，前出)に記載された方法により単離することができる。この方法は、経験に基 づいて決められた緩衝液および密度条件下で行われる一連の異なる遠心分離工程 に依存し、最後の重要な遠心分離工程は、密度が1.05〜1.18までの範囲の連続的 なスクロース勾配で、10μg/mlのPronase存在下で行われ、高密度塩化セシウム との境界でプロテアーゼ耐性コアPHF画分を生じる。タウタンパク質は、そのPHF 調製物を濃縮蟻酸で処理し、凍結乾燥し、そしてpH5.5の緩衝液中で音波処理し た後に、実質的に精製された調製物としてpH5.5の上清中に（50mmol酢酸アンモ ニウム）コアPHFから放出され得る。 正常な可溶性タウは、ＡＤ、コントロールのヒト脳組織、もしくは動物の脳組 織から、３時間未満の死後遅延で、単離することができる。微小管タンパク質は 、Shelanski et al．(1973，前出)による３サイクルの温度依存性構築−分解に より入手される。タウタンパク質は、温度安定性画分からゲル濾過により精製さ れる(Herzog and Weber（1978）Eur．J．Biochem.，92，1-8)。あるいは、タウ タンパク質は、Lindwall and Cole(1984; J．Biol．Chem.，259，12241-12245) の手法によりタウ タンパク質の2.5％過塩素酸中の可溶性に基づいて単離することができる。 タウタンパク質およびフラグメントの産生は、さらに、当業者が熟練した従来 の組換えＤＮＡ技術により達成することができる。そのような技術は、文献にさ らに説明されており、例えば、Sambrook，Fritsch & Maniatis”Molecular Clon ing．A Laboratory Manual”（1989）Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y．お よびAusubel et al．"Current Protocols in Molecular Biology"，Green Publi sh．Association & Wiley Interscienceを参照されたい。 さらに、完全なもしくは部分的タウタンパク質をコードするＤＮＡ分子もしく はそのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技法を用いて入手すること ができる。当該ＤＮＡ分子の3'および5'部分をコードするプライマーを目的のタ ウタンパク質のために合成してもよく、そしてタウタンパク質ファミリーの個々 のメンバーを増幅するためにそれを用いることができる。 チューブリンタンパク質もしくはそのフラグメントの調製物は、当該分野で公 知であり、例えば、Slobada et al．(1976，Cell Mobility(R.Goldman，T．Poll ard and J．Rosenbaum，eds.)，Cold Spring Laboratory，Cold Spring Harbor ，New York.，pp 1171-1212)により記載されている。 ＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は、幅広い種々の宿主／ベクターの組合せを用い て発現させることができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体 および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなっていてもよい。そのようなベクター の例は、SV40の種々の公知の誘導体のようなウイルスベクター、E.coli由来のプ ラスミドのような細菌ベクター、λファージ、M13および他の線状一本鎖ＤＮＡ ファージの多くの誘導体のようなファージ ＤＮＡ、ならびに２μプラスミドの誘導体のような酵母において有用なベクター 、真核生物細胞において有用なベクター、より好ましくは動物細胞において有用 なベクター、例えば、SV40、アデノウイルスおよび／またはレトロウイルス誘導 ＤＮＡ配列を含むものである。 本明細書中で用いるように、「ＤＮＡ配列」とは、別々のフラグメントの形態 で、あるいはより大きなＤＮＡ構築物の成分としてのＤＮＡポリマーをいい、そ れは、少なくとも一回は実質的に精製された形態に単離されたＤＮＡ、すなわち 、内在性物質の混入が無く、標準的な生化学的方法、例えば、クローニングベク ターを用いるような方法によりその配列およびその成分ヌクレオチド配列の同定 、操作および回収が可能な量もしくは濃度であるＤＮＡから誘導される。そのよ うな配列は、好ましくは内部非翻訳配列もしくはイントロン（真核生物遺伝子に 典型的に存在する）によって中断されていないオープンリーディングフレームの 形態で提供される。しかし、当該配列を含むゲノムＤＮＡもまた用いることがで きるというのも明らかであろう。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディング フレームから5'側または3'側に存在してもよく、そこで、それらはコード領域の 操作もしくは発現を干渉しない。 本明細書中で用いられるように、用語「発現ベクター」および「発現プラスミ ド」とは、次の部品を含む転写ユニットを含むプラスミドをいう（１）遺伝的エ レメントもしくは遺伝子発現において調節的役割を有するエレメント、例えばプ ロモーターもしくはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻 訳される構造配列もしくはコード配列、および（３）適当な転写および翻訳の開 始ならびに停止配列。種々の真核生物発現系における使用が意図される構造エレ メントは、好ましくは、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可 能にするリーダー配列を含 む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列もしくは輸送配列なしで発現さ れる場合、それはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、最終産 物を提供するため、発現された組換えタンパク質からその後任意に切断すること ができる。 ＤＮＡ配列の発現に用いられる宿主細胞は、種々の公知の宿主から選択するこ とができる。そのような宿主の例は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞である 。多数のそのような宿主が、American Type Culture (DSM)のような種々の寄託機関から利用可能である。原核生物細胞宿主の例は、E .coli、B.subtilis等のような細菌株である。好ましい宿主は、マウス3T3細胞の ような哺乳動物細胞、NIE-115、N2A、PC-12のような神経芽腫細胞系、あるいはS V40で形質転換したアフリカミドリザル腎臓細胞系COSなどで、市販されている。 この発明のＤＮＡ配列により形質転換された原核生物および真核生物宿主の発 酵により産生されるタウタンパク質は、次いで、実質的に均一になるまで、例え ば、異なる速度での遠心分離による、硫酸アンモニウムを用いる沈殿による、透 析（正常圧もしくは減圧下で）による、調製的等電点電気泳動による、調製的ゲ ル電気泳動による、もしくはゲルろ過、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、イ オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および親和性クロマト グラフィー（例えば、Sepharose Blue CL-6Bもしくは担体結合モノクローナル抗 体上での）のような種々のクロマトグラフィー法によるような公知の方法により 精製することができる。 本発明によれば、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含むそのフ ラグメントを、タウタンパク質と、異常なタウ−タウ会合を調整す るかもしくは阻害し得ると推定される物質と一緒にインキュベーションする。こ の物質の阻害能力に相関するタウ−タウ結合の範囲は、種々の方法により検出す ることができる： 好ましい方法においては、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含 むそのフラグメントを、最初のタウタンパク質とは異なる、好ましくは免疫学的 に異なっているタウ誘導体とインキュベーションする。この場合、タウ誘導体の 結合は、例えば、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体あるいはその 誘導体を介して検出される。この種の検出の例は、コアフラグメントに相当する 短縮型タウタンパク質を、試験物質および完全長タウタンパク質もしくは水相で コアPHFタウユニットを刺激する短縮型タウタンパク質フラグメントのいずれか と一緒にインキュベーションすることを特徴とするタウ−タウ結合の検出のアッ セイ方法である(図８および10)。 この場合、タウ−タウ結合は、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを 認識する抗体、あるいは、例えば、Glu-391で短縮されたコアタウフラグメント を認識するmAb 423のような抗体を用いて従来の方法で免疫化学的に検出するこ とができる。好都合には、本発明のモノクローナル抗体自身が、マーカーもしく は以下に例示するようなマーカーに直接的もしくは間接的にカップリングする基 を有する。また、ポリクローナル抗血清を用いることもできる。これは、対応す るタウタンパク質を動物、好ましくはウサギに注射し、ポリクローナル抗体を抗 原の結合したカラムを通過させて免疫親和性精製により抗血清を回収し、そのポ リクローナル抗体を従来の方法で溶出させることにより生じる。 本発明の方法の特に好都合な実施態様は、タウタンパク質のＮ−末端に近いGl y-16とGln-26との間のヒト特異的セグメントに対する抗体の使用を 包含する。この種の抗体の使用は、完全長組換えヒトタウの、種々の発生段階に ある他の動物種（例えば、ラット）由来の完全長タウアイソフォームへの結合を 測定することを可能にする。短縮型タウの結合は、Ala-390で終結しmAb 423によ って認識されない似たようなフラグメントに結合する、Glu-391で終結している 短縮型コアタウフラグメントを検出するmAb 423のような抗体の使用により検出 することができる(図８)。 抗体もしくはそのフラグメントは、当該分野で公知の任意のイムノアッセイ系 において用いることができ、それらは、ラジオイムノアッセイ、「サンドイッチ 」アッセイ、酵素免疫吸着測定法(ELISA)、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡ イムノアッセイなどを含むがこれらに限定されない。 特に好ましいのは、タウ−タウ結合アッセイのための次の構成である（図10） ：タウフラグメント、好ましくは組換えタウフラグメントであって、コアPHFの 短縮型タウユニットに相当するものが固相、例えば、従来のELISAプレートに、 タウ−タウ会合に適当でないことが示された緩衝液条件下で結合している。この 短縮型タウタンパク質は、好ましくは受動的(passively)にその固相に結合して いる。なぜなら、これは縦列反復領域内の高親和性タウ−タウ結合部位を露出す ることがわかっているからである。この固相は、通常、ポリ（ビニルクロライド ）であるが、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、もし くはポリプロピレンのような他のポリマーであってもよい。固相支持体は、チュ ーブ、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレート、あるいはアッセイを行うの に適した他の表面であって、タウタンパク質の受動的結合の際に高親和性タウ捕 獲部位を露出する表面の形態であってよい。結合後、この固相−抗体複合体を試 験サンプルの準備のために洗浄する。 驚くべきことに、自己会合がなく、そして縦列反復領域中の高親和性タ ウ捕獲部位への妨害もない、コアPHFの短縮型タウユニットの固相基質への結合 に適当な緩衝液条件を決定することができた。アッセイ系を図８に示すように確 立し、そこでは、Ala-390で短縮されたコアタウユニットを最初に固相マトリッ クスに結合させた。次に、Glu-391で終結した短縮型ユニットをインキュベーシ ョンした。後者のみをmAb 423免疫反応性として検出することができた。図９は 、このアッセイの特異性を実証し、そこで、mAb 423の免疫反応性は、タウ−タ ウ結合が予想される条件下でのみ見られた。アルカリ性緩衝液（炭酸ナトリウム 、trisなど）、好ましくはpH9-10、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH9. 6）はコアタウユニットの無視し得る自己会合に関連していることがわかった(図 ９)。したがって、固相マトリックスへの受動的結合のためのコアタウユニット の接種は、この緩衝液中で行われた。所望なら、同じ緩衝液中の脱重合したチュ ーブリン調製物もしくは微小管の調製物を、タウ−チューブリン結合の測定用の 受動的結合のために接種することができる。過剰な結合部位をブロックするため の適切な物質は、牛乳抽出物、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなどである。固相 結合コアタウユニットを生理学的緩衝液条件へ移し、標準的なアッセイ形式にお いて完全長タウとインキュベーションした後(図10)、正常完全長タウタンパク質 の非常に高い親和性捕獲を実証することが可能であった。固相に前もってコアタ ウユニットを接種しないと、完全長タウの結合は見られなかった。どちらの種も 存在する場合には、結合は両種の濃度に依存することがわかった。固相種もしく は水相種のいずれかが飽和している場合、他方の種の結合定数は８−25nMであり 、測定されたタウの特定のアイソフォームに依存していた(図11)。タウ−タウ結 合用の緩衝液条件には、適切な塩濃度および適切なpH値を含むべきである(図12 および13)。タウ−タウ結合用の塩濃度は、好ましくは50〜400mMの塩化ナトリウ ム、より好ましくは100〜200mMの塩化ナトリウム、または対応する塩もしくは匹 敵するイオン強度の塩混合物、例えば、PBS(137mM塩化ナトリウム、1.47mMリン 酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、8.1mMリン酸水素二ナト リウム、2.68mM塩化カリウム)である。pHの範囲は、pH4〜pH10の、より好ましく は、pH5〜pH8のpH値を含むべきである。過剰な結合部位を飽和させるため、およ び非特異的結合を避けるため、固相をブロッキング剤、例えば、牛乳抽出物、ウ シ血清アルブミン、もしくは好ましくはゼラチンと一緒にインキュベーションし てもよい。受動的に結合したコアタウユニットを生理学的緩衝液条件下に移した 後では、著しく高い親和性の正常完全長タウタンパク質の捕獲（Kd=８〜25nM、 テストした特定のタウ種に依存する）を示すことが可能である。 固相のタウタンパク質に結合し得るタウタンパク質を含む液相を、テスト物質 と一緒に、結合させるのに十分な時間にわたって固相タウタンパク質に添加する 。結合したタウ複合体を、二次的に結合したタウ種を選択的に検出するが最初の 固相種は検出しない抗体の添加の準備のため、再度洗浄する。この抗体をレポー ター分子に連結する。このレポーター分子の可視性のシグナルは第２のタウタン パク質種の結合を示すために用いられる。 あるいは、結合の検出は、第１の標識されていないタウ特異的抗体に結合し得 る二次抗体を用いて行ってもよい。この場合、その二次抗体は、レポーター分子 に連結されている。 本明細書中で用いられる「レポーター分子」により、その化学的性質により抗 原結合抗体の検出を可能にする分析的に検出し得るシグナルを提供する分子が意 味される。検出は、サンプル中の抗原の量の検出を可能にするため、少なくとも 相対的な定量が可能でなければならず、これは、絶対項(absolute terms)で計算 してもよいし、あるいは公知の正常レベルの 抗原を含む標準（もしくは一連の標準）との比較により行われてもよい。 このタイプのアッセイに最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素もし くは蛍光団のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、ある酵素を二次抗体 に、しばしばグルタルアルデヒドもしくはペリオデートにより結合させる。しか し、容易に認識されるように、幅広い種々の異なる結合技術が存在し、それらは 当業者に周知である。一般に用いられる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、 グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファター ゼなどを含む。 特定の酵素と一緒に用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解 の際に、検出し得る色の変化を生じるということに関して選択される。例えば、 p-ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼ結合体との使用に適 切であり；ペルオキシダーゼ結合体には1,2-フェニレンジアミンもしくはテトラ メチルベンジジンが一般的に用いられる。蛍光性(fluorogenic)基質を用いるこ ともまた可能である。それは上記の色素生産性基質よりむしろ蛍光産物を生じる ものである。どの場合においても、酵素標識した抗体を、対応するタウ−タウタ ンパク質複合体に添加し、その複合体へ結合させ、次いで、過剰な試薬を洗い流 す。次いで、適当な基質、すなわち過酸化水素を含む溶液を、抗体−抗原−標識 複合体という三次複合体(tertiary complex)に添加する。この基質は抗体に連結 されている酵素と反応し、定性的な可視シグナルを与え、それはさらに、通常は 分光光度計で定量されて、血清サンプル内に存在する抗原の量の評価を与える。 あるいは、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光化合物を抗体の結 合能を変えることなく抗体に化学的にカップリングさせてもよい。特定の波長の 光を照射することにより活性化される場合、蛍光色素で標識 した抗体は、光エネルギーを吸収して分子内に励起力を誘導し、それに特徴的な より長い波長での光の放射が続く。この放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能 な特徴的な色として現れる。酵素イムノアッセイ(EIA)においてのように、蛍光 標識抗体は、第一の抗体−タウ−ペプチド複合体に結合することができる。非結 合試薬を洗浄した後、残った三重複合体を、次に適当な波長の光に曝露し、観察 された蛍光が抗原の存在を示す。 もう一つの好ましい実施態様においては、テスト物質と一緒に液相に添加され る第２のタウタンパク質種は、上記のレポーター分子に連結されていてもよい。 第２のタウ種は直接的に改変されていてもよいし(例えば、放射性のもしくは酵 素的に検出可能な標識でマークされている)、あるいは分子のドメイン、例えば 、Ｎ−末端セグメントであって、高親和性タウ−タウ結合部位に含まれていない ことが知られており、それにより、それ自身がタウ−タウ結合アッセイにおいて リガンドとしておよびレポーター分子としての両方で機能するドメイン内で、（ 例えば蛍光色素に）結合されていてもよい。 本発明の特に好ましい実施態様を、実施例１に詳細に記載する。 本発明の方法に用いられる抗体もしくはそのフラグメントは、従来の方法によ って産生され、すなわち、タウエピトープに選択的なモノクローナ タウエピトープに対する適切なモノクローナル抗体を公知の方法で改変してFab フラグメントもしくは(Fab')₂フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは 短鎖抗体にした態様を提供することができる。 タウ−タウ相互作用における結合親和性を測定するのにも、in virtoで示され る結合とヒトの脳において生じる結合との間の免疫化学的関係を示すのにも有用 なモノクローナル抗体の例を以下に示す： Ｎ−末端もしくはＣ−末端タウエピトープを認識するモノクローナル抗体によ り、短縮型タウ種と完全長タウ種との間の結合を測定することが可能である。特 に有用なのは、ヒト特異的エピトープを認識する抗体である。モノクローナル抗 体（AK 499と表される）は、それが非ヒト起源から誘導される限りにおいて、タ ウのGly-16とGln-26との間の領域に存在するヒト特異的エピトープを認識し、そ れにより、完全長タウ種間の結合の測定もまた可能にする（Lal（1995）The rol e of abnormal phosphorylation of tau protein in the development of neuro fibrillary pathology in Alzheimar's disease．博士論文，University of Cam bridge)。抗体342は、Ser-208とAsn-265との間に位置する非種特異的な一般的エ ピトープ（図21、SEQ ID NO:4）を認識するが、それはタウ−タウ相互作用の過 程において部分的に妨げられる(Lai，前出)。 他の有用な抗体は、既に記載されている：抗体423は、タウのＣ−末端がGlu-3 91で短縮されているものを認識する(Novak et al．（1993），前出)。この短縮 化は、アルツハイマー病におけるPHF構築の過程で自然に生じる(Mena et al．（ 1995），（1996），前出; Novak et al．（1993），前出; Mena et al．（1991 ）前出)。同じＣ−末端短縮化は、完全長タウの、Ala-390で終結している短縮型 タウフラグメントであって、mAb 423によって認識されないフラグメントへの結 合と(Novak et al．（1993），前出)、それに続く広範囲のプロテアーゼ、すな わちPronaseによる消化後にin virtoで示すことができる(図16)。この構成にお いて、mAb 423の免疫反応性の唯一の可能な起源は、結合した完全長タウの消化 からであり、そしてこれは、Pronaseの増加にともなって濃度依存性に増加する ことを示し得る(図16)。このことは、in vitroで生成されるタウ−タウ結合相 互作用の分子コンホメーションが、脳において生じるそれと全く同じであり、し たがって、in Vitroで示される結合の選択的阻害はヒトの脳に普遍化することが できる。 抗体7.51は、タウの最後から３番目の反復物に位置する一般的なタウエピトー プを認識し(Novak et al．（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，5837-584 1)、それは、タウがPHF様免疫化学的構成の状態で結合する場合には閉鎖される が、蟻酸処理後に露出され得る(Harrington et al．（1990），（1991），前出; Wischik et al．（1995a）、前出)。正常な可溶性タウ、もしくは微小管に結合 したタウは、蟻酸処理しなくても、mAb 7.51により検出することができる(Harri ngton et al．（1991），前出; wschik et al．（1995a）、前出)。タウ−タウ 結合アッセイにおける完全長タウの結合は、mAb 7.51エピトープの部分的閉鎖に 関連している。 本発明の実施において、98〜108nMのKiで結合の阻害を生じるフェノチアジン が同定された(図19)。20％の阻害は、タウに関しては１：１のモル比で示すこと ができ、さらなる阻害は10:1までのモル比の範囲ではほぼ線状であった。これら の発見は、以下の仮定に一致する：タウ−タウ結合は、限られた数の飽和可能な 結合部位により決定され、したがって、特異的である；協同性がない、すなわち 、１分子のタウの結合は、阻害の生じる部位でのさらなるタウ分子の結合に影響 を及ぼさない；結合は可逆性であり、そして動的平衡状態にあり、そこでは結合 は濃度および結合親和性のみによって決定される。 タウの縦列反復領域がチューブリン結合ドメインとして正常に機能すると仮定 すれば、そしてその分子の同じ領域がPHF構築を行う高親和性タウ捕獲部位をも 含むと仮定すれば、より些細な分子的差違をこれら２つのタイ プの結合の間で示すことができる場合、タウの異常な結合を妨げる薬学的な介在 を予見することが可能となるだけである。その介在により、正常なタウ−チュー ブリン結合を阻害しない、異常なタウ−タウ相互作用の選択的な阻害が可能であ る。なぜなら、シナプス小胞の軸索輸送(Okabe and Hirokawa（1990）Nature，3 43 ，479-482)を含む多くの正常な細胞過程が、チューブリンを重合状態に維持す る細胞の能力に依存しているからである。以前の実験は、免疫化学的差違（タウ −タウ結合相互作用においてはmAb 7.51エピトープの閉鎖があるが、タウ−チュ ーブリン相互作用には閉鎖はない; Harrington et al．（1991），前出; Novak et al．（1991）、前出)および分子的差違（ＰＨＦ様構成で結合したタウは、特 徴的なＮ−およびＣ−末端タンパク質分解性開裂部位により示されるチューブリ ン結合ドメインの正常なチューブリン結合セグメント／リンカーセグメント機構 に関して14/16アミノ酸残基のフェーズシフトを示す; Novak et al．(1993)、前 出; 図３）を示した。驚くべきことに、これらの差違はまた、十分に確立されて いる薬の分類内で小分子を用いる薬の識別のための基礎をも提供することができ る。特に、異常なタウ−タウ会合を阻害することが示されたフェノチアジンの効 果が、正常なタウ−チューブリン結合の阻害に関してテストされた。実質的に、 タウに関しては、モル比1000:1までは結合の阻害は示されなかった(図20)。にも かかわらず、タウの過リン酸化は、タウ−チューブリン相互作用を阻害すること が示されていたが、このタウ−チューブリン結合アッセイにおいても同等の阻害 を生じることが示された(Lai，前出)。したがって、異常なタウ−タウ会合を阻 害する本発明によって提供される化合物は、タウのチューブリンへの正常な結合 を阻害しない。このことは、本発明の重要な発見を示している。なぜなら、それ は、PHF中の縦列反復領域の異常な結合と、タウ−チューブリン相互作用 における縦列反復領域の縦列の正常な結合とを薬学的に識別し得る本明細書中に 記載されたスクリーニング系に基づいて化合物を発見する技術的可能性を示すか らである。 これまでにPHFコア内で同定された唯一の微小管関連タンパク質は、タウタン パク質である。にもかかわらず、PHFは、主な微小管関連タンパク質がMAP2であ る樹状突起細胞体区分に結集する(Matus，A．Microtubules(Hyams and Lloyd，e ds)pp 155-166，John Wiley and Sons，NY)。MAP2のアイソフォームは、縦列反 復領域ではほとんどタウタンパク質と同じであるが、Ｎ−末端ドメインの配列と 長さがどちらも実質的に異なる（図25および26、SEQ ID NO：９および10)。実施 例３に示すように、縦列反復領域での凝集は、特定のタウコアアミノ酸配列に選 択的ではなく、チオニンの様なフェノチアジン阻害剤の阻害活性は、タウの独特 な配列に依存しない。 さらに、本発明はまた、対応するin vivoの方法にも関する。これらの方法は 、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質のスクリーニングに 関し、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体によっ て、あるいはタウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体 を発現し得るベクターによってトランスフェクションした細胞系を、タウ−タウ 会合を調整するかもしくは阻害することが推測される物質と接触させ、続いてそ の細胞系の生存および／またはその細胞系の形態を検出することを特徴とする。 実施例４および５は、線維芽細胞が、トランスジェニック完全長タウタンパク 質を発現する場合に十分生存可能であり、トランスジェニック完全長タウタンパ ク質の細胞骨格分布(cytoskeltal distribution)が、潜在的なタウ−タウ結合阻 害物質を有する培養細胞によって妨げられない、と いうことを明らかにする。フェノチアジンであるチオニンは、実質的な内在性毒 性を有しているようにはみえない。しかし、線維芽細胞は、PHFのトランスジェ ニックコアタウユニットを発現する場合に生存可能ではないし、正味の形態的異 常も示さない。生存トランスフェクタントの頻度および短縮型タウの発現レベル は、トランスフェクション後にチオニン中で細胞を増殖させることにより用量依 存性に増加する。短縮型タウを発現している生存トランスフェクタントは、チオ ニンに依存し、その投与の中止により生存率は低下して異常な形態に戻る。 これらの発見は、したがって、非ニューロン細胞系における本発明の主たる発 見を実証するものである。すなわち：その細胞内の高レベルのPHF−コアタウは 毒性であり：この毒性は異常なタウ−タウ結合相互作用の選択的な阻害物質であ る化合物により取り消すことができ：そしてそのような化合物はタウのチューブ リンへのin vivoでの正常な結合を破壊しない。これらの発見は、短縮型タウタ ンパク質による細胞の誘導トランスフェクション系および直接トランスフェクシ ョンを含む他の実験モデルにも普遍化することができる。 これまでの結果は、タウ−タウ結合阻害物質を短縮型タウユニットの毒性を覆 すことに使用することを支持しているが、これらの過程のニューロンモデルを確 立することが所望される。一般に、神経芽腫細胞系は、発生の過程で微小管ネッ トワークの発生とそれに対応する神経フィラメントのネットワークの発生との間 のバランスに応じた複雑な細胞骨格変化を受ける。より高分子量の微小管関連タ ンパク質(MAP1A、MAP1B)は、これらの細胞骨格系の間の架橋を提供すると考えら れる(Schoenfield et al．(1989) J．Neurosci．9，1712-1730)。微小管系と脱 重合物質(Wisniewski and Terry（1967）Lab．Invest．17，577-587)、もしく はアルミニウム(Langui et al．（1989）Brain Res．438，67-76)との直接的な 干渉は、細胞質内に特徴的な螺旋(whorl)を形成する中間体フィラメントの崩壊 にいたることが知られている(Wischik and Crowther（1986）Br．Med．Bull．42 ，51-56)。神経フィラメント細胞骨格の同様の凝集が、分化できない神経芽腫細 胞系内で同時に起こるのを見ることができる。これらの凝集体形成におけるMAP の役割は、現在のところわかっていない。しかし、これらの凝集体の形成、悪化 および阻害は、微小管細胞骨格が神経フィラメント細胞骨格と関連し、それを新 しく形成された神経突起に輸送する能力の間接的なマーカーを示す。 実施例６および７は、チオニンのようなフェノチアジン阻害剤が２μMまでの 濃度ではニューロン細胞系にとって毒性ではなく、チオニンはトランスジェニッ クタウタンパク質の内在性微小管ネットワークへの取り込みを妨害しないことを 明らかにする。これらのフェノチアジンは、短縮型タウを発現しているプラスミ ドによる安定なトランスフェクションに続く生存可能なニューロン細胞系の生成 に必要である。さらに、短縮型タウの構造的発現は、pNFH凝集体の形成を強調し 、一方、後者は完全長タウ発現により阻害される。細胞質pNFH凝集体の形成は、 チオニンのようなフェノチアジンにより阻害され、pNFH免疫反応性のニューロン 過程への取り込みは、これらの化合物により容易になる。 これらの発見は、短縮型タウによるニューロン細胞系の安定なトランスフェク ションが、本来毒性であること、そして生き残っている細胞における微小管系の 不安定化により、結果的に、発生過程の神経突起に輸送されない推定される神経 フィラメント凝集体の形成にいたることを示した。これらの作用は、in vivoで タウ−タウ凝集をブロックするその能力によって選択される化合物により阻害す ることができ、この作用は、おそらく、 内在性タウもしくは微小管の安定化に必要な他のMAPの発現に対する消極的作用 により仲介される。チオニンのようなフェノチアジンはまた、トランスフェクシ ョンされていない細胞における神経フィラメントの凝集を、ニューロン分化を容 易にすることによるか、もしくは神経フィラメントの凝集を直接阻害することに よりブロックする予期せぬ能力を有する。アルツハイマー病におけるタウ凝集の 予防におけるそれらの使用の可能性に加えて、そのような化合物は、運動ニュー ロン病およびLewy小体病のような異常な神経フィラメント凝集によって特徴付け られる疾患の処置における使用のさらなる可能性を有し得る。神経フィラメント サブユニットを過剰発現するトランスジェニックマウスが、神経フィラメントの 凝集を、変性を受ける大きな運動ニューロン内で選択的に進行させ、筋肉の喪失 と虚弱にいたることが見いだされた(Cote et al．（1993）Cell 73，35-46; Xu et al．（1993）Cell 73，23-33)。他の神経変性疾患、すなわちピック病およ び進行性核上性麻痺は、異常な短縮型タウのそれぞれ歯状回および新皮質の星状 錐体細胞における蓄積を示す。既に記載された化合物もまたこれらの神経変性疾 患において有用性を有する。 したがって、本発明は、特に、上記のin vivo方法に関し、ここで、前記細胞 系は好ましくは線維芽細胞もしくはニューロン細胞系であり、より好ましくは線 維芽細胞3T3、PC-12もしくはNIE-115細胞系である。これらの細胞系は、好まし くは短縮型タウタンパク質であって少なくともコアタウユニットを有するものに よりトランスフェクションされている。このタウタンパク質の発現は、構造的制 御下でもしくは誘導制御下にあるか、あるいはこのタウタンパク種は直接トラン スフェクションされてもよい。 本発明はまた、上記に記載した任意の方法により入手可能なタウ−タウ会合を 調整するかもしくは阻害する化合物にも関する。 上記の結果に基づくと、本発明はまた下式のフェノチアジン： 式中、Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキ シ、カルボキシ、置換または非置換アルキル、ハロアルキルもしくはアルコキシ から選択され； Ｒ₂およびＲ₈は独立して水素もしくは下式： から選択され、 Ｒ₅は、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロア ルキル、アルコキシもしくは単（一重）結合から選択され； Ｒ₁₀およびＲ₁₁は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非 置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシもしくは単結合から選択される； および薬学的に受容可能なその塩の、異常なタウ−タウもしくは異常な神経フィ ラメントの凝集の予防用かつ処置用の、特にアルツハイマー病、運動ニューロン 病およびLewy小体病の予防用かつ処置用の組成物の製造における使用も提供する 。 本明細書中で用いる用語「アルキル」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状の基をい い、好ましくは１〜８個の、より好ましくは１〜６個の炭素原子を有する。例え ば、「アルキル」とは、メチル、エチル、n-プロピル、イソプ ロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペン チル、tert-ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等をいうことができる。本発明 に用いる置換アルキル基の適切な置換基は、メルカプト、チオエーテル、ニトロ 、アミノ、アリールオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、およびカルボニル基、なら びにアリール、シクロアルキル、および非−アリール複素環基を含む。 用語「アルコキシ」とは、上記本明細書中で定義するように、アルキル基をい い、場合により、そのアルキル基はそれらの間に挿入された酸素原子、およびそ れらが付着する基質残基を有する。 用語「ハロアルキル」は、１、２、もしくは３個のハロゲン原子が付着した１ 〜４個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状アルキル鎖を表す。代表的な ハロアルキル基は、クロロメチル、２-ブロムエチル、1-クロロイソプロピル、3 -フルオロプロピル、2,3-ジブロムブチル、3-クロロイソブチル、ヨード-t-ブチ ル、トリフルオロメチルなどを含む。 「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードを示す。 本発明のいくつかの化合物は、１以上の非対称的に置換された炭素原子を有し 、したがって、ラセミ体および光学活性体で存在する。本発明はまた、化合物の ラセミ体形態ならびにそれらの任意の光学活性形態を包含することを意図する。 薬学的に受容可能な酸付加塩は、式(I)の塩基性化合物と、無機酸、例えば、 塩酸および臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸(hydrohalic acid)、硫酸、硝 酸、リン酸など、もしくは有機酸、例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマ ル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの間に形成され る。 特に好ましい実施態様においては、本発明は、上記のフェノチアジン、 式中、 Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉は独立して、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅、も しくは−Ｃ₃Ｈ₇から選択され； Ｒ₂およびＲ₈は独立して から選択され、式中Ｒ₁₀およびＲ₁₁は独立して単結合、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅ 、もしくは−Ｃ₃Ｈ₇から選択され； Ｒ₅は、単結合、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅もしくは−Ｃ₃Ｈ₇から選択される、お よび薬学的に受容可能なそれらの塩を提供する。 特に好ましいのは、以下のフェノチアジンである： 異常なタウ−タウ会合のブロッキングに有用な化合物、好ましくはフェノチア ジン（図23および24）は、0.4未満の結合係数およびタウ−チューブリン結合ア ッセイにおける阻害の欠除により特徴付けられ、好ましくは、タウのモル濃度に 関してモル比が1000:1までである。 本発明のフェノチアジンは、当該分野で公知であり、標準的なテキストに示さ れた方法により製造することもできる(例えば、Merck Manual，Houben-Weyl，Be ilstein E III/IV 27，1214 ff，J．Heterocycl．Chem．21，613（1984），など )。 上記の式の化合物、それらの薬学的に受容可能な塩、または示したアッセイに おいて定義された性質を有することがわかった他の化合物は、毒性に関するさら なるテストの後に薬物として用いることができる(例えば、医薬製剤の形態で)。 幅広い範囲の医学的適応症におけるメチレンブルーの薬学的使用が以前から記載 されてきており、それらには、メトヘモグロビン血症の処置および繰鬱病の予防 が含まれ(Naylor（1986）Biol．Psychiatry 21，915-920)、そして全身投与後の ＣＮＳ浸透も記載された(Muller（1992）Acta Anat.，144，39-44)。Azure Aお よびAzure Bの生成は、メチレンブルーの正常な代謝変性産物として生じる(Disa nto and Wagner（1972a）J．Pharm．Sci．61，598-602; Disanto and Wagner（1 972b）J．Pharm．Scl．61，1086-1094)。医薬の投与は、例えば経口で(錠剤、被 覆錠剤、糖衣錠、硬質および軟質ゼラチンカプセル、溶液、乳濁液もしくは懸濁 液の形態で)、鼻腔に(例えば、鼻腔スプレーの形態で)、直腸に（例えば、坐薬 の形態で）局所的に行うことができる。しかし、投与はまた筋肉内もしくは静脈 内のような局所的にも行うことができる(例えば、注射溶液の形態で)。 錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセルの製造のため、式Ｉの 化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸付加塩を、薬学的に不活性な無機も しくは有機賦形剤を用いて加工することができる。ラクトース、トウモロコシデ ンプンもしくはその誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩等を、例えば 、そのような賦形剤として、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセルに 用いることができる。 軟質ゼラチンカプセルに適した賦形剤は、例えば、植物油、ロウ、脂質、半固 体および液体ポリオールなどである。 溶液およびシロップの製造に適した賦形剤は、例えば、水、ポリオール、サッ カロース、転化糖、グルコースなどである。 注射用溶液に適した賦形剤は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセ ロール、植物油等である。 坐薬に適した賦形剤は、例えば、天然のもしくは固化した油、ロウ、脂質、半 固体もしくは液体ポリオールなどである。 さらに、この医薬調製物は、保存料、可溶化剤、増粘物質、安定化剤、湿潤剤 、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を変化させる塩、緩衝液、コーティ ング剤もしくは抗酸化剤を含むこともできる。それらはまた、さらに治療的に価 値のある物質を含むことができる。 本発明によると、上記の式の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な塩は、 アルツハイマー病の処置もしくは予防に、特に異常なタウ−タウ会合のブロッキ ング、調整、および阻害のために用いることができる。用量は幅広い範囲で変化 し得、もちろん、各々特定の場合における個々人の必要性に合わせる。一般に、 経口投与の場合、一日に約50mg〜約700mgで十分のはずであり、好ましくは約150 mg〜約300mgを好ましくは１〜３ユニットの用量に分け、それらは例えば、同量 である。しかし、上記に示した上限は、これが指示されたものとわかっている場 合には、越えることができ るということが理解されるであろう。 本発明は、添付の図面と一緒に読む場合、よりいっそう理解することができる ： 図１：微小管に結合しているタウタンパク質の図(Butner and Kirschner、前 出、の後に改変)。 図２：タウタンパク質のアイソフォームの略図、図21に示したアミノ酸配列お よびｃＤＮＡ配列に対応。252残基のＮ−末端ドメインは、さらに58残基にのぼ る１または２個の挿入物("１"、"２")、それに続く３または４個の縦列反復物を 有する93〜125残基の縦列反復領域、および64残基のＣ−末端尾部を有する。濃 縮プロテアーゼ耐性PHF−コア調製物から単離したタウフラグメントは、F5.5"と 命名され、３反復および４反復アイソフォームの両方から誘導した種の混合物か らなるが、93〜95残基で、３反復に相当するものを含み、それらは縦列反復領域 の縦列の正常な機構に関して14〜16残基フェーズシフトしている。全てのF5.5" 種および正常タウは、mAb7.51によって認識されるが、mAb423は、Glu391で終結 しているF5.5フラグメントしか認識しない。mAb499、AT8および342に対するエピ トープの位置もまた示されている。 図３：コアPHF調製物から放出された12kDaのF5.5フラグメントのＮ−末端配列 分析は、３−反復（Ａ：反復１−３; SEQID NO: １）もしくは４−反復（Ｂ：反 復１−３; SEQ ID NO: ２、またはＣ：反復２−４; SEQ ID NO３）アイソフォー ムに由来する３組に分けることのできる６個の異なるペプチドの存在を明らかに した(Jakes et al.，前出)。mAb423免疫反応性は、Glu-391でのＣ−末端境界を 規定するのに役立つ(矢印で示す、Novak et aｌ．（1993），前出)。このように して、Ｎ−およびＣ−末端境界は、配列相同性反復に関して14-16残基シフトし ているPHFコア内の縦列 反復領域の同調化(phasing)を規定するのに役立つ。この最小限のプロテアーゼ 耐性コアPHFタウユニットは、93/95残基の長さであり、３反復したものと正確に 等価である。このユニットの境界はまた、Butner and Kirschner（前出）によっ て提案されたチューブリン結合ドメインに関してはフェーズ外にあり、下線を付 して示されている。 図４：コントロールおよびアルツハイマー病における総タウタンパク質含有量 。正常可溶性タウ（白色）は、コントロール中に見られる主な形態であり、一方 、アルツハイマー病においては、タウの主な形態は、PHFに重合している(黒)。 図５：アルツハイマー病の初期の可溶性タウ、リン酸化されたタウ、およびも つれの数における変化(Lai et al．（1995），前出)。PHF結合タウの蓄積を水平 軸に示す。これは、正常可溶性タウにおける相対的な喪失と同調している。リン 酸化されたタウの最初の出現は、もつれの最初の出現と緊密に関連している。し かし、これらの両方とも、可溶性から重合したタウへのフェーズの実質的な再分 布の後でないと出現しない。 図６：アルツハイマー病の初期における、新しいタウの合成から可溶性タウプ ールへの移行の計算された速度(a)、および可溶性タウからPHF結合プールへの移 行の計算された速度(b)(Lai et al．（1995），前出)。可溶性タウレベルが580p mol/gより下がるにつれて、PHF産生速度に追いつくように漸進的により多くのタ ウ合成が必要とされ、これは、可溶性タウの周囲のレベルに関してネガティブフ ィードバック形式で調節されているようである(a)。可溶性タウからPHFへの移行 速度は、PHF-タウの周囲のレベルに関して幾何級数的である(b)。 図７：アルツハイマー病におけるタウタンパク質のPHFへの形態変化の仮説的 概要。一旦タウが固定されて短縮されると、高親和性の異常なタウ捕 獲部位が露出される。タウのさらなる分子が捕獲されると、部分的なタンパク質 分解のみが可能となる。なぜなら、高親和性タウ−タウ会合の領域は、さらなる タウ分子の捕獲に利用し得るさらなる高親和性タウ捕獲部位を残して、タンパク 質分解から保護されているからである。可溶性から短縮型PHF結合相へのタウタ ンパク質の再分布は自己触媒的であり、反復性の高親和性タウ捕獲と部分的タン パク質分解により仲介される。 図８：２つの短縮型ユニットの結合を測定するタウ結合アッセイの構成。Ala- 390で終結した種（"ａ"）で最初にELISAプレートを被覆する(炭酸ナトリウム緩 衝液中：50mM、pH9.6)。次いで、Glu-391で終結している第２の短縮型タウ種（" ｅ"）を、図９に示した種々の緩衝液条件下でインキュベーションする。"ｅ"種 のみがmAb423によって認識され、したがって、mAb423の免疫反応性は、第２のイ ンキュベーションの間に結合するタウのみを測定する。 図９：リン酸緩衝正常生理食塩水("正常")、水("水")および炭酸ナトリウム緩 衝液("炭酸"、50mM、pH9.6)中での"ｅ"種(0または20μg/ml)の"ａ"(0または10μ g/ml)への結合。垂直方向の軸は、mAb423免疫反応性を示す。"ａ"種のみで被覆 した場合には免疫反応性は検出されない。なぜなら、mAb423は、"ａ"を認識しな いからである。前もって"ａ"を接種しないで"ｅ"をインキュベーションすると、 免疫反応性は検出されない。これは、用いたブロッキング条件が、"ｅ"のELISA プレートへの非特異的結合を妨げるからである。免疫反応性は、"ａ"および"ｅ" がどちらも存在する条件下でのみ見られ、"ａ"に結合した"ｅ"のみの特異的検出 を示す。"ｅ"が炭酸ナトリウム緩衝液に添加される場合には、結合は見られない 。したがって、この条件は、この条件で自己凝集が最小化されるので、最初の" ａ"の接種にとっては最適な条件である。 図１０：完全長タウ（"ｔ"）の、先に固相に受動的に結合している短縮型コア タウユニット（"ａ"）への結合の測定のための一般的な構成。コアPHFの短縮型 タウユニットに相当する組換えタウフラグメント("ａ")を、ELISAプレートに種 々の濃度で、タウ−タウ会合にとっては好ましくないことが示された条件下で接 種する(図９)。ブロッキング後、完全長組換えタウ("ｔ")を、タウ−タウ結合の 選択的な検出を可能にする条件下で接種する。結合は、適切な抗体で検出され、 この抗体は、完全長タウのＮ−末端近くに位置するエピトープを認識する。この 抗体は"ａ"を認識しない。 図１１：完全長タウ("T40")の、Ala-390で終結する短縮型コアタウユニット(" ａ")への結合のKdの、結合した完全長ヒトタウを測定するmAb499を用いる測定。 上部グラフの水平方向の軸は、用いたT40の濃度を示し、そして垂直方向の軸は 、mAb499の免疫反応性を示す。各結合曲線は、示された"ａ"の接種濃度で入手す る。"ａ"がない場合、結合はなく、用いたアッセイ条件下でのT40の非特異的結 合がないことを確証する。結合は、T40の濃度と"ａ"の濃度の両方に依存する。 下の図は、"ａ"の各接種濃度に対応するKdの計算値を示す。"ａ"の濃度が増大す るにつれ、飽和条件は漸近的に近づき、そしてこれは、T40の短縮型コアタウユ ニットへの結合の飽和Kdを表し、この実験では、22.8nMと測定された。 図１２：図１０に示した標準的アッセイ形式を用い、"ａ"種を10μg/mlの濃度 で被覆し、そしてT40を示した濃度（0〜50μg/mlの範囲）で加え、一定のpH(pH7 .4)で、塩化ナトリウム濃度を変えて結合を測定した。安定状態は、生理学的塩 濃度である137mMの付近で観察された。結合は、適度に低い、および高い塩濃度 で低下するが、非常に低い塩濃度がより好ましい。 図１３：図１２に示したのと同様の実験で、塩化ナトリウム濃度を 137mMで一定に保ち、pHを0〜10の範囲で変化させ、比較のため、生理学的リン酸 緩衝正常生理食塩水("PBS"、pH7.4)中での結合をしめす。結合は、極端なpHで低 下する。mAb499および342によって検出された結合を示す。 図１４：固相の短縮型コアタウユニット"a"を用い、Biernat et al.，（1992 ）EMBO J．11，1593-1597)の方法を用いてin vitroでリン酸化した("T40P")もし くはリン酸化しない("T40")完全長タウをインキュベーションする典型的な結合 曲線。Kdは、この実験でリン酸化されることにより、１０倍減少したが、水相お よび固相におけるリン酸化の状態を規則正しく変化させると、リン酸化の全体と しての効果は、平均して２０倍の結合阻害を示すことができる。リン酸化の胎児 状態は、異常なタウ−タウ結合を測定するために重要であると幾人かの人々によ って提案されており、水相に導入される場合のラット胎児タウ("POTr")がコアタ ウユニットへ異常な結合ができないことをここに示す。 図１５：図１４とは対照的に、胎児タウが固相に受動的に結合された後、完全 長非リン酸化タウの結合が可能である。完全長タウ("T40")および胎児タウ("POT au")の濃度を示した濃度範囲内で変化させた典型的な結合曲線をＡに示す。誘導 された漸近的なKdをＢに示す。完全長タウが短縮型コアタウユニットに結合する ように、完全長タウの固定された胎児タウへの結合も、〜20nMという同じKdを有 する。したがって、胎児タウは水相で存在する場合にはタウに結合しないが(図1 4)、固相への受動的な結合だけでタウ結合種に変換される。したがって、タウの 固体マトリックスへの受動的な結合は、高親和性タウ捕獲部位を露出する。 図１６：水相もしくは固相において示される種を用いるタウ−タウ結合アッセ イにおけるKd値の比較。水相で用いられる完全長組換えタウのリン酸化は、図１ ４に示したように、因子により結合を１０倍阻害し、ラット 由来の胎児／新生児タウは結合しない。新生児タウを固相で用いる場合、T40は 、短縮型コアPHFユニットに対するのと同じ親和性で結合する。水相のT40のリン 酸化は、３０倍の結合阻害を生じる。固相の新生児タウの過リン酸化は、同程度 まで阻害し、両相における過リン酸化は、５０倍の結合阻害を生じる。したがっ て、リン酸化の仮説とは逆に、リン酸化は、本アッセイ全ての構成においてタウ タンパク質の異常な自己凝集を阻害する。 図１７：凝集した完全長タウタンパク質のタンパク質分解的消化。（Ａ）完全 長タウ(20μg/ml)を、PBS中でdGA(20μg/ml)に結合し、洗浄し、示された濃度の Pronaseと水中で５分間インキュベーションした。免疫反応性は、mAb'342(▲)、 499(○)、および423(●)を用いて測定した。（Ｂ）完全長タウ(10μg/ml)は、dG A非存在下では固相で半分凝集しており、同様に消化されて、免疫反応性をmAb'3 42(▲)および423(●)を用いて測定した。どちらの場合にも、mAb'499および／ま たは342に対する免疫反応性のプロテアーゼ濃度依存的な喪失が、mAb423免疫反 応性の獲得とともに生じた。（Ｃ）（Ａ）の結果を略図で示す。インキュベーシ ョンされていた(hatched)固相を最初に被覆していた短縮型dGAは、反復領域との 相互作用を介して高親和性で完全長タウに結合する。どちらの種も消化前はmAb4 23エピトープを欠いている。この複合体のタンパク質分解消化（点線）は、示し たような位置にあるmAb499および342エピトープの喪失を伴いながら、完全長タ ウ分子のＮ−末端部分を除去する。mAb423との免疫反応性の獲得は、完全長タウ のGlu-391での短縮を示す。タンパク質分解に対して安定な複合体の正確なＮ− 末端の長さはわかっていないが、反復領域にすぐ隣接するmAb342エピトープは含 まれず、タウ結合ドメインが含まれる。 図１８：短縮型タウの反復するタウ捕獲による蓄積。固相の短縮型タウフラグ メント(dGA，20μg/ml)からはじめて、完全長組換えヒトタウ(20 μg/ml)を結合させ、Pronase(1ng/ml)で５分間消化し、洗浄し、そしてこの調製 物を再度完全長タウ(20μg/ml)と一緒にさらにインキュベーションし、もう一度 消化した。この結合／消化サイクルを４回繰り返した；mAb499の免疫反応性を、 各Pronase消化工程の前後に測定し、そしてmAb423は後だけに測定した。（Ａ） 複合体のPronase消化は、各消化サイクルの後に固相でGlu-3で短縮化されている タウタンパク質の増加的蓄積に関連していた。（Ｂ）完全長タウの結合は、タウ のＮ−末端への免疫反応性の出現により検出され(mAb499)、それは、Pronase消 化により完全に破壊された。続くインキュベーションサイクルでは、水相中で一 定濃度でインキュベーションした完全長タウについては結合能力は増加した。増 加したmAb499の免疫反応性は、先行サイクルから残された残りの免疫反応性によ って説明することはできない。したがって、Pronase消化後に残されたタンパク 質分解に安定な複合体は、さらなるタウに結合する能力を保持しており、そして この結合能力は、短縮型タウが固相に蓄積するにつれて、増加する。 図１９：標準的な阻害性のフェノチアジンの増加する濃度（水平方向の軸）の 存在下での相対的タウ−タウ結合（垂直方向の軸）。この阻害は、標準的な競合 阻害モデルによって表すことができ、Kiの計算値は98〜108nMである。これらの 近似値の相関係数は、0.99であり、示すように統計的に高度に有意である。 図２０：チオニンによるタウ−タウ結合の選択的阻害。短縮型タウタンパク質 を、489nMで、図８においてのように、水相および固相のアッセイの両方におい て用いた(黒丸)。タウ−チューブリンアッセイでは、脱重合したチューブリンを 200nMで被覆して(白丸)、タウを400nMでインキュベーションした。結合データは 、標準的モデルにより数理的に記載するこ とができ、それは、高親和性タウ捕獲部位での競合阻害を呈する。そのKi値は、 完全長タウを用いる同様の結合研究から得たKd値を用いて計算した。データの点 は４回測定した平均を示す。 図２１：ヒトタウタンパク質アイソフォームのヌクレオチド配列と予測される アミノ酸配列(SEQ ID NO:４)。ｃＤＮＡクローンhtau40から推定される配列は、 以前に決定した３反復型(Goedert et al．（1988），前出)とは異なり、アミノ 末端領域（下線）に余分な58アミノ酸が挿入され、そして以前に記載された(Goe dert et al．（1989），EMBO J．8 393-399)31アミノ酸の余分な反復（下線）が ある。ヌクレオチドは5'-3'方向に番号付けされている。このｃＤＮＡクローンh tau40(Goedert et al．（1989b）Neuron 3，519-526)は、NdeI部位（5’末端） に挿入された上記の配列およびコドン終結(***)への3'側のEcoRI部位を有する。 図２２：PHF−コアタウユニットのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列（SEQ ID NO:６; Novak et al．（1993），前出）および好ましいコアタウユニットの構築 に用いたプライマー(SEQ ID NO:７および８)。 図２３：タウ−タウ相互作用の阻害による化合物のランキング。ランキングは 化合物の非存在下で見られた結合と比較し、１μg/mlおよび10μg/mlで観察され た平均として採った標準化した結合に基づいている。このランキングにおいて、 "1"は、化合物の非存在下で観察された結合に等しいものを表し、一方、"0.2"は 、結合が、試験化合物の濃度が1μg/mlおよび10μg/mlで平均の20％まで減少し たことを表す。したがって、数が小さければ小さいほど、eおよびaの結合の阻害 における化合物の効果も大きくなるのである。見て解るように、最初の５つのフ ェノチアジンは、標準化した結合係数が0.4より低い。すなわち、1〜10μg/mlの 範囲で見られる結合は、化合物の非存在下で見られるそれの40％より少ないので ある。 図２４：試験した化合物の化学構造と図１７により標準化した結合に関する値 。 図２５：タウ、MAP2（成体型）、MAP2C（幼若型）、および高分子量タウ（末 梢神経系および神経芽細胞系で見いだされる）の略図。これらのタンパク質は、 同じ微小管−結合ドメインを有しているが、Ｎ−末端突出(projection)ドメイン の配列および長さは実質的に異なっている。タウおよびMAP2の幼若型は縦列反復 を３つしか有していない。４−反復型のMAP2も存在する。 図２６：ヒトタウ（上の線; SEQ ID NO:９）およびヒトMAP2（下の線; SEQ ID NO:10）の縦列反復領域における配列の違い。垂直方向の矢印は、Glu-391で終 結する短縮型PHF−コアフラグメントの境界を示し、チューブリン−結合セグメ ントは下線を付して示されている。 図２７：pIF2発現ベクターは、SV40を基にした真核生物発現ベクターである(p SV2neo; Sambrook et al．（1989），前出; SEQ ID NO:11および12、外来ＤＮＡ の発現を行うβグロビンプロモーターを含むように改変されている(M．N．Neube rger))。それは、Geneticin選択のためネオマイシン耐性マーカーを有する。 図２８：ＰIF2::T40でトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、完 全長ヒトタウタンパク質(T40)を発現し、mAb7.51（上図）およびmAb499（下図） で免疫標識したもの。細胞は、細長い過程を形成し、タウの免疫反応性もまた核 周囲部において細胞骨格分布を有することがわかる。 図２９：PIF::dGAEでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、Glu- 391で終結した短縮型PHF-コアタウフラグメントを発現し、mAb7.51で免疫標識し たもの。トランスフェクションし、チオニンなしで成長させた初期細胞系。細胞 は、大いに異常であり、多核であり、液胞化し、細胞 質内にタウタンパク質の凝集体を有する。 図３０：リポフェクチン／タウタンパク質の、PIF2::T40でトランスフェクシ ョンした3T3細胞への移動。相対的細胞生存率（タンパク質なしでリポフェクチ ン処理した後、細胞数に正規化した）を、3.5μMのチオニンなしの場合（陰なし ）およびありの場合（陰あり）における、ほぼ等モル濃度の完全長タウ(T40、22 0nM)および短縮型タウ(dGAE、300nM)について示している。等モル濃度の場合、 完全長タウの場合には総タンパク負荷は５倍以上であるという事実にも関わらず 、完全長タウ(p=0.02)よりも短縮型タウの方がより毒性が強い。 図３１：（Ａ）短縮型タウの毒性の逆転：リポフェクチンを介して完全長タウ を発現している3T3細胞に移動した短縮型タウの毒性は、濃度依存性である。チ オニン（実線）は、短縮型タウの３つ全ての濃度においてチオニンの非存在下で 見られる毒性を取り消した。（Ｂ）完全長タウが、リポフェクチンを介して完全 長タウを発現している3T3細胞に移動した同様の実験。毒性およびチオニンの効 力はともに明確さが低下した。 以下の実施例は、本発明の詳細を説明することを目的とし、それにより本発明 をどのようにも限定するものではない。 実施例 実施例１ ：タウ−タウ−結合アッセイ このアッセイは、96ウェルのPVCマイクロタイタープレートを用いて行い、溶 液を添加し、そして個々のウェルに関して読みとる： a）50mM炭酸ナトリウム溶液中(pH9.6)0-50μg/ml（0、1、5、10、50μg/ml ）の範囲で濃度が変化する50μlの精製短縮型タウペプチド溶液を各ウェルに添 加して37℃で１時間インキュベーションする。 b）このマイクロタイタープレートを0.05％のTweenと一緒に、もし くはそれ無しで水で３回洗浄する。 c）リン酸緩衝正常生理食塩水（"PBS"、137mM塩化ナトリウム、1.47mMリン 酸二水素カリウム、8.1mMリン酸水素二ナトリウム、2.68mM塩化カリウム）で作 製した200μlの２％牛乳抽出物("Marvel")溶液を各ウェルに添加して37℃で１時 間インキュベーションする。 d）このプレートをｂ）のように洗浄する。 e）１％ゼラチン、0.05％Tweenを含むPBS中の上記a)と同じ範囲の濃度の5 0μlの完全長組換えタウ(T40)溶液を各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュ ベーションする。 f）このプレートをｂ）のように洗浄する。 g）50μlのモノクローナル抗体499溶液を、組織培養上清をPBS中２％牛乳 抽出物("Mervel")で１／２に希釈して各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュ ベーションする。 h）このプレートをｂ）のように洗浄する。 i）0.05％Tweenを含むPBSで1/1000に希釈した50μlの二次抗体溶液（西洋 ワサビペルオキシダーゼに結合したブロッティンググレードの親和性精製ヤギ抗 マウスIgG(H+L)、Bioradカタログ番号170-6516)を各ウェルに添加し、37℃で１ 時間インキュベーションする。 j）このプレートを水中0.05％のTween溶液で３回洗浄し、次いで水で一回洗 浄する。 k）発色溶液の調製は以下の通りである。10〜15mgの3,3',5,5'-テトラメチ ルベンジジン(TMB; BCLカタログ番号784974)をジメチルスルホキシド中に最終濃 度が10mg/mlとなるように溶解する(TMB溶液)。水90mlに10mlの酢酸ナトリウム保 存液(0.5M、pH5.0)を添加する。撹拌中に1mlのTMB溶液をゆっくりと添加し、次 いで10μlの過酸化水素を添加する。 l）50μlのTMB溶液を各ウェルに添加してペルオキシダーゼ呈色反応を行い 、発色速度を２分間にわたって650nmで、Molecular Devices Microplate reader 中で、Kineti L1 Softmax software packageを用いて読みとる。実施例２ ：組換えタウフラグメントの調製 タウのｃＤＮＡを、標準的なプロトコール(Sambrook et al.，前出)を用いて 、その組織を死後３時間で入手したアルツハイマー病患者の脳組織から単離した ｍＲＮＡから生成した。ｃＤＮＡライブラリーを、PHFコアタンパク質(Goedert et al．（1988），前出)の一部に由来する配列から誘導した合成17merオリゴヌ クレオチドプローブを用いてスクリーニングした。完全長ｃＤＮＡクローンをM1 3mp18のEcoRI部位にサブクローニングし、部位特異的変異を用いて開始コドンに 関連するNdeI部位を誘導した。NdeIおよびEcoRIによる開裂に続き、得られたｃ ＤＮＡフラグメントをNdeI／EcoRIで切断した発現プラスミドpRK172のＴ７ ＲＮ Ａポリメラーゼプロモーターの下流にサブクローニングした(McLeod et al．（1 987）EMBO.J,6，729-736)。pRK172は、pBR322の誘導体で、pBR322のコピー数の 制御領域を除去してあるため、E.coli内で非常に多くのコピー数に増える。この プラスミドは、組換えクローンの選択のため、アンピシリン耐性遺伝子を有して いる。 タウの短縮型をコードしている構築物は、Novak et al．（1993，前出）に記 載されたようにｍＲＮＡから調製した。このｍＲＮＡを、特別なオリゴヌクレオ チドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いた。この センスプライマーは、NdeI部位を有し、アンチセンスは、EcoRI部位を有する。P CRフラグメントを、上記のようにpRK172にサブクローニングした。dGAEの構築に 用いたプライマーを図２２に示す。発現用 に用いた全てのＤＮＡの正当性は、両鎖の完全長配列決定により確認した。 htau40("T40")ｃＤＮＡの構築の詳細は、(Goedert et al．（1989），前出) に記載されている。この配列は、ＣＮＳ中に見いだされたタウの最長の形態で、 各々が29アミノ酸の２つのＮ−末端挿入物とチューブリン結合ドメイン中の余分 な31アミノ酸反復物を有するタウタンパク質をコードしている。このＤＮＡ配列 およびその予測されるアミノ酸配列を図２１に示す(SEQ ID NO:４)。 組換えプラスミドを用いて、E.coli BL21(DE3)を形質転換した。この株は、原 核生物の発現に用いられ、lacUV5プロモーターの制御下にあるバクテリオファー ジＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有している(Studier and Mo ffat（1986），J.Mol.Blol．189，113-130)。指数的に増殖する培養物をIPTG（ イソプロピルチオガラクトシド）で３時間誘導した。 タウフラグメントの大規模精製（１Ｌ細菌培養物）を、改変を少し加えて、Go edert and Jakes(1990，EMBO J.，9，4225-4230)によって記載されたように行 った。細胞を、液体窒素中で細胞ペレットを急速冷凍することにより破壊した。 次いで、このペレットを50mM PIPES、1mMジチオスレイトール(DTT)(pH6.8)を含 む緩衝液で懸濁した。上清中の温度安定性のタンパク質をPIPES/DTTに対して透 析し、次いで、同じ緩衝液で平衡化したホスホセルロースの入ったカラムにのせ た。タウタンパク質を、上記緩衝液中のNaCl勾配(0-0.5M)により溶出させた。画 分をSDS-PAGEにより、クーマシー染色およびイムノブロッティングの両方で分析 した。タウを含む画分をプールし、25mM MES、1mM DTT(pH6.25)に対して透析し 、約5mg/mlで-20℃で保存した。タンパク質濃度はLowry法により測定した(Harri ngton（1990），前出)。実施例３ ：胎児MAP2Cの短縮型タウおよび完全長タウへの結合 PHF内のMAP2の欠除の一つの可能な説明は、MAP2が、反復領域における配列の 違いのために、PHFのコアタウユニットに結合することができないというもので ある。これを２つの構成で標準的な結合アッセイを用いて実験的に試験した：固 相の短縮型タウと水相の胎児MAP2C、および固相のMAP2Cと水相の完全長タウであ る。結合は、どちらの構成でも見ることができ、チオニンがタウ／MAP2結合の相 互作用をブロックしていた。したがって、縦列反復領域における凝集はタウに対 して選択的ではなく、チオニンのようなフェノチアジン阻害剤の阻害活性は、タ ウの独特な配列に依存しない。MAP2がPHF中に見られない理由は、現在のところ 解らないが、いくつかの要因には、成人形態のMAP2に見られる大きなＮ−末端ド メインの貢献、細胞内の区分の違い、あるいはMAP2分子のプロセシング中の他の 違いが含まれるかもしれない。実施例４ ：ヒトタウタンパク質によるマウス3T3細胞のトランスフェクション マウス線維芽細胞3T3を、βグロビンプロモーターの構造的制御下にある完全 長および短縮型タウタンパク質を含む真核生物発現ベクター(pIF2)を用いてトラ ンスフェクションした。このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を選択マーカ ーとして有している(pSV2neo; Sambrook et al．(1989)，前出、M.N．Neuberger により改変)。細胞を、抗菌剤および10％ウシ胎児血清を含む規定された最少必 須混合物(DMEM)内で37℃で、５％ＣＯ₂雰囲気内で培養した。それらを標準的な リン酸カルシウムプロトコールもしくはリポフェクション（製造者のプロコール にしたがって；Gibco BRL）のいずれかを用いてプラスミドＤＮＡによりトラン スフェクションした。プラスミドＤＮＡが組み込まれた細胞をGeneticinを含む 培 地(0.5mg/ml; Southern and Berg（1982），J．Mol．Appl．Genet．1，327)中の 生存により選択した。 完全長タウタンパク質を発現している安定にトランスフェクションされた3T3 線維芽細胞は容易に産生された。発現は、一般的な(mAB7.51)およびヒト特異的( mAB499)抗タウ抗体を用いて組織学的に(図２８)、および細胞抽出物のイムノブ ロット（示していない）により示すことができた。短縮型コアタウユニットを有 する同じベクターを用いてトランスフェクションを実施した場合、２つの生存可 能な細胞系が生じた。短縮型タウはこれらの細胞において組織学的に示すことが できたが、これらの細胞の形態は完全長タウを発現しているものに比べて大いに 異常であった(図２９)。異常さには、プロセス進展の欠除、大きな丸い細胞の形 成、タウの細胞質蓄積、および細胞質の液胞形成を含む。しかし、これらの細胞 は、不安定であることがわかり、そして、Geneticinの継続的な存在にも関わら ず、短縮型タウタンパク質を発現しない形態に容易に転換した。短縮型タウの毒 性は、細胞における毒性のタウ−タウ凝集体の蓄積、もしくは細胞にとって必須 な外因性マウスMAPへの短縮型タウの結合のいずれかにより説明することができ るかもしれない。実施例５ ：タウでトランスフェクションした細胞のフェノチアジン阻害剤存在下 での成長 短縮型コアタウユニットの毒性は、標準的なフェノチアジン阻害剤がin vivo での自己凝集をブロックするために用いられる場合には、部分的に可逆的であり 得る。これは、タウ−タウ結合をブロックするために必要とされる濃度で、その 化合物が本来毒性でない場合に限り可能である。3T3において最も低い毒性を有 する阻害剤は、チオニンおよびアクリフラビンであり、細胞は、in vitroのタウ −タウ結合の阻害のためのKi値(100nM)を実 質的に越える濃度のこれらの化合物への長い露出でも生存し得る。実際には、3T 3細胞は、２μMのチオニンの存在下で数ヶ月成長することができた。 チオニンがタウ−チューブリン結合相互作用に及ぼす影響を、完全長タウタン パク質でトランスフェクションした3T3線維芽細胞を、ある範囲の濃度のチオニ ン存在下で培養することによりin vivoで試験した。タウ免疫反応性の正常な細 胞質分布の破壊が、４−８μMの範囲で見られ、それはin vitroでのタウ−チュ ーブリン結合相互作用の阻害の公知のKi（8μM）に匹敵するが、トランスフェク ションされた3T3細胞が日常的に培養されている濃度範囲(0.5-2μM)では、何の 影響も見られなかった。これらの発見は、トランスフェクションした細胞系を、 標準的な阻害剤の存在下で、細胞の生存能およびトランスジェニック完全長タウ タンパク質の正常な細胞骨格分布のどちらも損なうことなく培養し得る可能性を 実証する。 トランスフェクションした細胞をタウ−タウ結合の阻害剤の存在下で成長させ ることは、短縮型タウでトランスフェクションした細胞の生存能を用量依存性に 高めることがわかった。短縮型タウでトランスフェクションした細胞系の生存数 は、その細胞を高濃度のチオニン存在下で成長させた場合に増加した。さらに、 半定量的規模で免疫組織化学的に測定した短縮型タウの発現の強さは、トランス フェクション後に用いられたチオニン濃度の関数として増加することが解った。 3T3細胞の形態および短縮型タウタンパク質の分布は、トランスフェクション した細胞系をチオニン存在下で産生させると異常性が大いに低くなる。短縮型タ ウタンパク質は、内在性の微小管ネットワークの分布に従うようであるが、タウ 染色は完全長タウで見られるより壊れた特徴を有している。高レベルの短縮型タ ウを発現している細胞は、チオニンを除去すると、細胞の細胞質の全体的な崩壊 を伴って凝集体を形成することが解った。 これは、チオニンの非存在下でトランスフェクションされた細胞に関する最初の 発見と類似している。実施例６ ：トランスフェクションされない正常細胞系 ニューロン細胞系(N2A,NIE-115)を、２％もしくは10％のウシ胎児血清および ５％のウマ血清を含むDMEM中で、コラーゲンに被覆された組織培養プレート上で 培養した。これらを全て37℃で５％ＣＯ₂を含む雰囲気下で成長させた。トラン スフェクション前のはじめのニューロン細胞系の免疫組織化学的研究は、ジブチ リル−ｃＡＭＰ（db-cAMP、組織培養物中の神経芽細胞を分化させることが知ら れている）による短時間の処理の後に、未分化な神経芽細胞(N2A細胞)の細胞質 内およびPC-12細胞内に形成される、mAb423と免疫反応性の細胞質凝集体の同定 にいたった。これらの構造は、神経フィラメントタンパク質（NFH；SMI-31、Ste rnberger et al．（1985）PNAS 82，4274-4276)）を認識する抗体と免疫反応性 であり、そして神経フィラメントに結合することが知られているMAP1Aを認識す る抗体とは、より乏しい免疫反応性であることが示された。分化の過程で、この 内在性のmAb423免疫反応性は細胞質から神経突起へシフトすることが解った。こ れらの細胞からのmAb423の免疫反応性の免疫沈降は、SMI-31によって認識される 、ゲル移動度が230kDaの種の同定に至った。これらの結果は、齧類ニューロン細 胞系内でmAb423によって認識される構造は、凝集した状態の高分子量神経フィラ メントタンパク質を含むということを示唆するが、それらが変化したMAPをも含 むという可能性も排除しない。本発明者らは、それらを推定的NFH凝集体(pNFH) という。細胞質内のpNFH凝集体の用量依存的阻害は、トランスフェクションされ ていないPC-12細胞においてチオニンを用いて実証することできた。実施例７： ニューロン細胞系の完全長および短縮型タウタンパク質によるトラン スフェクションおよびタウ凝集阻害剤の効果 Ａ．PC-12細胞 PC-12細胞を、Glu-391で短縮されたPHFコアタウフラグメントもしくは完全長 タウタンパク質を有するpIF2ベクターでトランスフェクションした。3T3線維芽 細胞と同じように、トランスフェクション後にチオニン中で細胞を成長させなか った場合には、短縮型タウでトランスフェクションした生存細胞系は産生されな かった。一旦安定化させて、トランスフェクションした細胞を、db-cAMPの存在 下もしくは非存在下で、およびチオニンの存在下もしくは非存在下で分析した。 ２つの目的：細胞質pNFH凝集体の形成、およびpNFH免疫反応性の神経突起への分 布、を試験した。 db-cAMPとの短時間のインキュベーションは、神経フィラメント凝集体を有す る細胞の割合を９％から37％に増加させた(p＜0.001)。この効果は、短縮型タウ によってトランスフェクションされた細胞(10％ vs 47％、p＜0.001)においても 見られ、短縮型タウの異なる効果はそれ自身有意であった(p＝0.005)。したがっ て、短縮型タウによるトランスフェクションは、db-cAMPに反応したpNFH凝集体 の形成を強調した。 db-cAMP処理後のチオニン回収の効果は、pNFH凝集体を有する細胞の頻度を二 倍にした(27％ vs 49％、p=0.05)。これらの増加は、完全長タウによってトラン スフェクションされた細胞（16％ vs 32％）でも短縮型タウによってトランスフ ェクションされた細胞（36％ vs 60％）でも見られた。さらなる効果は、pNFH免 疫反応性の神経突起へのチオニン依存性取り込みであった。これは、短縮型によ ってトランスフェクションしたPC-12細胞において特に明らかであったが、完全 長タウもしくはトランスフェク ションしなかった細胞ではそうではなかった(pNFH-神経突起指数は、チオニンあ りもしくは無しでそれぞれ0.49 vs 0.04、p=0.07)。 Ｂ.NIE-115細胞 一般に、N2A細胞の細胞質に見られるpNFH凝集体は、トランスフェクションさ れていないNIE細胞では生じなかった。pNFHの免疫反応性は、初期の核周囲弓期( perinuclear-arc stage)も見られたが、むしろ、通常、分化の過程で成長しつつ ある神経突起に取り込まれる。NIE細胞を、上記のように、完全長もしくは短縮 型タウタンパク質を有するpIF2ベクターによりトランスフェクションし、チオニ ン存在下で成長させた。チオニン存在下もしくは非存在下でのdb-cAMPの添加の 効果を、次に試験した。 PC-12細胞と同様に、短縮型タウでトランスフェクションされた安定なNIE細胞 は、チオニンの非存在下では産生されなかった。短縮型タウでトランスフェクシ ョンされたものは、完全長タウでトランスフェクションされた細胞より有意に高 い頻度のpNFH凝集物を細胞質中に生じ（９％ vs 26％、p<0.001)、db-cAMPとの インキュベーションは、短縮型タウによってトランスフェクションした細胞にお いてpNFHの凝集を誘導したが、完全長タウによってトランスフェクションしたも のでは誘導しなかった（６％ vs36％、p<0.001)。 完全長タウでトランスフェクションした細胞では、チオニンの存在は、トラン スジェニックタウタンパク質の微小管細胞骨格（微小管組織化中心、拡散した細 胞質分布、および神経突起への伸長を含む）への取り込みを妨害しなかった。完 全長タウでトランスフェクションした細胞におけるチオニンの回収はpNFH凝集体 を有する割合を増大させた(７％ vs 16％、p=0.03)。短縮型タウでトランスフェ クションした細胞では、チオニンの回収は結果的に特定の細胞系におけるpNFH凝 集体を増加させ(例えば、 NIE-ND6、14％ vs 44％、p=0.07)、それは分化の抑制によっても特徴付けられた 。以前にはNIE細胞においてではなく未分化なN2A細胞においてのみ見られた表現 形へのこの修正は著しかった。 PC-12細胞と同様に、チオニン依存性のpNFHの神経突起への取り込みは、特定 の細胞におけるdb-cAMP処理後に実証することができた(例えば、チオニンありも しくは無しの場合のNIE-NDl、pNFH-神経突起指数は、それぞれ0.1 vs 0.66、p=0 .であった)。pNFHの神経突起へのチオニン依存性の移動は、チオニン存在下での トランスフェクションされた細胞における細胞質神経フィラメントと神経突起神 経フィラメントNHFとの間の免疫反応性の関係の逆転として定量的に見ることが できた(チオニン無しおよびありの場合のr=-0.52 vs r=+0.52; それぞれp=0.お よび0.02)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月２８日 【補正内容】 発されてきた(Harrington et al.，(1990)，(1991)，(1994a)，前出)。これらの 方法は、重篤なＡＤおよびダウン症候群の研究(Mukaetova−Ladinska et al.，( 1993; 1995)、前出)、初期段階のＡＤで将来を見越して評価された症例(Wischik et al．（1995a）、前出; Lai et al．(1995)前出)ならびにLewy小体型の老人 性痴呆およびパーキンソン病型を含む他の神経病理学的診断の症例(Harrington et al．(1994a)，(1994b)，前出)において展開されてきた。脳組織内の全PHF含 有量は、アルツハイマー型の痴呆を有する患者と有さない患者との間では明白に 異なる。PHF含有量には19倍の違いがあり、側頭皮質では、その違いは40倍にも 達する。PHFが蓄積する主な部位は、組織学的研究から予測されるように、プロ テアーゼ耐性PHFもしくはリン酸化されたタウタンパク質種のいずれの蓄積に関 しても老年期のコントロールと異ならない(Harrington et al．(1994a)，(1994b )，前出)。さらに、皮質のLewy小体のアポリポタンパク質Ｅの遺伝子型の場合は 、E4アレル体の頻度がＡＤにおいて見られるのとほぼ同じ程度に上昇したことを 示した。したがって、E4アレル体の存在が、ＡＤの特徴的なタウ異常の唯一の原 因ではあり得ない。なぜなら、これはLewy小体の場合では見られなかったからで ある(Harrington et al．(l994b)，前出)。 ＡＤを有する場合と有さない場合を区別するさらなるパラメーターは、正常可 溶性タウタンパク質の量である。タウレベルは灰白質内より白質内の方が高いが 、軸索微小管関連タンパク質について予測されるように、灰白質内に見いだされ る量は求心性の軸索の神経分布も反映する。ＡＤの場合、全脳領域に一様に作用 する正常可溶性タウタンパク質の実質的な喪失がある(Mukaetova-Ladinska et a l．（1993）、前出)。この一様な減少の分子的基礎は未知であり、タウmRNAの減 少によって説明することはでき ない(Goedert et al．（1988） Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，4051-4055) 。PHFの蓄積と可溶性タウの喪失という２つのプロセスの正味の効果は、タウタ ンパク質プールの、白質主体から灰白質主体への、前頭皮質主体から側頭皮質主 体への、解剖学的再分布である。 ＡＤにおけるタウタンパク質の再分布の全体的な範囲は、図４に示されるデー タから理解することができ、そこでは全遊離タウプールおよびPHF結合プールが 比較されている。コントロールでは97％のタウタンパク質プールが可溶性期にあ るのに対し、ＡＤでは、83％のタウタンパク質プールが不溶性期にあることが見 いだされ、ほぼ全体が短縮されPHFに重合した形態である（Mukaetova-Ladinska et al．(1993)前出）。臨床的診断器具CAMDEXによって将来を見越して評価され た場合(Roth et al．（1986）Brit．J．Psych.，149，698-709)およびBraak and Braakの実施基準により死後と分類された場合((1991)，Acta Neuropathol．82 ，239-259)における早期のＡＤの研究は、可溶性タウの喪失がもつれの数(tangl e count)とPHF蓄積の程度に直接関係していることを示した(Lai et al．(1995) 前出)。 異常にリン酸化されたタウタンパク質は、可能なPHF前駆体と考えられてきた が(Lee et al．（1991）Science，251，675-678; Goedert et al．(1994)，in M icrotubules（Hyams and Lloyd eds.）pp.183-200．John Wiley & Sons，NY）、 正常なタウは、以前にはPHF関連タウタンパク質において異常にリン酸化されて いると考えられていた多くの部位でリン酸化されていることがわかった(Matsuo et al．（199４）Neuron 13，989-1002)。初期ＡＤの研究において、不溶性過リ ン酸化タウ種は、はじめ、PHFへのかなりのタウ再分布が起こった後に見られた( Lai et al．1995; 図５)。PHFもしくは神経原線維のもつれの現れる前のリン酸 化され む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列もしくは輸送配列なしで発現さ れる場合、それはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、最終産 物を提供するため、発現された組換えタンパク質からその後任意に切断すること ができる。 ＤＮＡ配列の発現に用いられる宿主細胞は、種々の公知の宿主から選択するこ とができる。そのような宿主の例は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞である 。多数のそのような宿主が、American Type Culture (DSM)のような種々の寄託機関から利用可能である。原核生物細胞宿主の例は、E .coli、B.subtilis等のような細菌株である。好ましい宿主は、マウス3T3細胞の ような哺乳動物細胞、NIE-115、N2A，PC-12のような神経芽腫細胞系、あるいはS V40で形質転換したアフリカミドリザル腎臓細胞系COSなどで、市販されている。 この発明のＤＮＡ配列により形質転換された原核生物および真核生物宿主の発 酵により産生されるタウタンパク質は、次いで、実質的に均一になるまで、例え ば、異なる速度での遠心分離による、硫酸アンモニウムを用いる沈殿による、透 析（正常圧もしくは減圧下で）による、調製的等電点電気泳動による、調製的ゲ ル電気泳動による、もしくはゲルろ過、高速液 ロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー（例えば、Sepharose Blue CL-6Bもしくは担体結合モノクローナル抗体上での）のような種々のクロマトグ ラフィー法によるような公知の方法により精製することができる。 本発明によれば、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含むそのフ ラグメントを、タウタンパク質と、異常なタウ−タウ会合を調整す るかもしくは阻害し得ると推定される物質と一緒にインキュベーションする。こ の物質の阻害能力に相関するタウ−タウ 結合の範囲は、種々の方法により検出 することができる： 好ましい方法においては、タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを含 むそのフラグメントを、最初のタウタンパク質とは異なる、好ましくは免疫学的 に異なっているタウ誘導体とインキュベーションする。この場合、タウ誘導体の 結合は、例えば、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体あるいはその 誘導体を介して検出される。この種の検出の例は、コアフラグメントに相当する 短縮型タウタンパク質を、試験物質および完全長タウタンパク質もしくは水相で コアPHFタウユニットを刺激する短縮型タウタンパク質フラグメントのいずれか と一緒にインキュベーションすることを特徴とするタウ−タウ結合の検出のアッ セイ方法である(図８および10)。 この場合、タウ−タウ結合は、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを 認識する抗体、あるいは、例えば、Glu-391で短縮されたコアタウフラグメント を認識するmAb 423のような抗体を用いて従来の方法で免疫化学的に検出するこ とができる。好都合には、本発明のモノクローナル抗体自身が、マーカーもしく は以下に例示するようなマーカーに直接的もしくは間接的にカップリングする基 を有する。また、ポリクローナル抗血清を用いることもできる。これは、対応す るタウタンパク質を動物、好ましくはウサギに注射し、ポリクローナル抗体を抗 原の結合したカラムを通過させて免疫親和性精製により抗血清を回収し、そのポ リクローナル抗体を従来の方法で溶出させることにより生じる。 本発明の方法の特に好都合な実施態様は、タウタンパク質のＮ−末端に近いGl y-16とGln-26との間のヒト特異的セグメントに対する抗体の使用を 内在性タウもしくは微小管の安定化に必要な他のMAPの発現に対する消極的作用 により仲介される。チオニンのようなフェノチアジンはまた、トランスフェクシ ョンされていない細胞における神経フィラメントの凝集を、ニューロン分化を容 易にすることによるか、もしくは神経フィラメントの凝集を直接阻害することに よりブロックする予期せぬ能力を有する。アルツハイマー病におけるタウ凝集の 予防におけるそれらの使用の可能性に加えて、そのような化合物は、運動ニュー ロン病およびLewy小体病のような異常な神経フィラメント凝集によって特徴付け られる疾患の処置における使用のさらなる可能性を有し得る。神経フィラメント サブユニットを過剰発現するトランスジェニックマウスが、神経フィラメントの 凝集を、変性を受ける大きな運動ニューロン内で選択的に進行させ、筋肉の喪失 と虚弱にいたることが見いだされた(Cote et al．（1993）Cell 73，35-46; Xu et al．（1993）Cell 73，23-33)。他の神経変性疾患、すなわちピック病および 進行性核上性麻痺は、異常な短縮型タウのそれぞれ歯状回および新皮質の星状錐 体細胞における蓄積を示す。既に記載された化合物もまたこれらの神経変性疾患 において有用性を有する。 したがって、本発明は、特に、上記の方法に関し、ここで、前記細胞系は好ま しくは線維芽細胞もしくはニューロン細胞系であり、より好ましくは線維芽細胞 3T3、PC-12もしくはNIE-115細胞系である。これらの細胞系は、好ましくは短縮 型タウタンパク質であって少なくともコアタウユニットを有するものによりトラ ンスフェクションされている。このタウタンパク質の発現は、構造的制御下でも しくは誘導制御下にあるか、あるいはこのタウタンパク種は直接トランスフェク ションされてもよい。 本発明はまた、上記に記載した任意の方法により入手可能なタウ−タウ会合を 調整するかもしくは阻害する化合物にも関する。 上記の結果に基づくと、本発明はまた下式のフェノチアジン： 式中、Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇およびＲ₉は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキ シ、カルボキシ、置換または非置換アルキル、ハロアルキルもしくはアルコキシ から選択され； Ｒ₂およびＲ₈は独立して水素もしくは下式： から選択され、 Ｒ₅は、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロア ルキル、アルコキシもしくは単（一重）結合から選択され； Ｒ₁₀およびＲ₁₁は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非 置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシもしくは単結合から選択される； および薬学的に受容可能なその塩の、異常なタウ−タウもしくは異常な神経フィ ラメントの凝集の予防用かつ処置用の、特にアルツハイマー病、運動ニューロン 病およびLewy小体病の予防用かつ処置用の組成物の製造における使用も提供する 。 本明細書中で用いる用語「アルキル」とは、直鎖状もしくは分岐鎖状の基をい い、好ましくは１〜８個の、より好ましくは１〜６個の炭素原子を有する。例え ば、「アルキル」とは、メチル、エチル、n-プロピル、イソプ 化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸付加塩を、薬学的に不活性な無機も しくは有機賦形剤を用いて加工することができる。ラクトース、トウモロコシデ ンプンもしくはその誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩等を、例えば 、そのような賦形剤として、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセルに 用いることができる。 軟質ゼラチンカプセルに適した賦形剤は、例えば、植物油、ロウ、脂質、半固 体および液体ポリオールなどである。 溶液およびシロップの製造に適した賦形剤は、例えば、水、ポリオール、サッ カロース、転化糖、グルコースなどである。 注射用溶液に適した賦形剤は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセ ロール、植物油等である。 坐薬に適した賦形剤は、例えば、天然のもしくは固化した油、ロウ、脂質、半 固体もしくは液体ポリオールなどである。 さらに、この医薬調製物は、保存料、可溶化剤、増粘物質、安定化剤、湿潤剤 、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を変化させる塩、緩衝液、コーティ ング剤もしくは抗酸化剤を含むこともできる。それらはまた、さらに治療的に価 値のある物質を含むことができる。 本発明によると、上記の式の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な塩は、 アルツハイマー病の処置もしくは予防に、特に異常なタウ−タウ会合のブロッキ ング、調整、および阻害のために用いることができる。用量は幅広い範囲で変化 し得、もちろん、各々特定の場合における個々人の必要性に合わせる。一般に、 経口投与の場合、一日に約50mg〜約700mgで十分のはずであり、好ましくは約150 mg〜約300mgを好ましくは１〜３ユニットの用量に分け、それらは例えば、同量 である。しかし、上記に示した上限は、これが指示されたものとわかっている場 合には、越えることができ るということが理解されるであろう。 本発明は、添付の図面と一緒に読む場合、よりいっそう理解することができる ： 図１：微小管に結合しているタウタンパク質の図(Butner and Kirschner、前 出、の後に改変)。 図２：タウタンパク質のアイソフォームの略図、図21に示したアミノ酸配列お よびｃＤＮＡ配列に対応。252残基のＮ−末端ドメインは、さらに58残基にのぼ る１または２個の挿入物("１"、"２")、それに続く３または４個の縦列反復物を 有する93〜125残基の縦列反復領域、および64残基のＣ−末端尾部を有する。濃 縮プロテアーゼ耐性PHF−コア調製物から単離したタウフラグメントは、"F5.5" と命名され、３反復および４反復アイソフォームの両方から誘導した種の混合物 からなるが、93〜95残基で、３反復に相当するものを含み、それらは縦列反復領 域の縦列の正常な機構に関して14〜16残基フェーズシフトしている。全てのF5.5 種および正常タウは、mAb7.51によって認識されるが、mAb423は、Glu391で終結 しているF5.5フラグメントしか認識しない。mAb499、AT8および342に対するエピ トープの位置もまた示されている。 図３：コアPHF調製物から放出された12kDaのF5.5フラグメントのＮ−末端配列 分析は、３−反復（Ａ：反復１−３; SEQ ID NO:１）もしくは４−反復（Ｂ：反 復１−３; SEQ ID NO:２、またはＣ：反復２−４; SEQ ID NO:３）アイソフォー ムに由来する３組に分けることのできる６個の異なるペプチドの存在を明らかに した(Jakes et al.，前出)。mAb423免疫反応性は、Glu-391でのＣ−末端境界を 規定するのに役立つ(矢印で示す、Novak et al．(1993)，前出)。このようにし て、Ｎ−およびＣ−末端境界は、配列相同性反復に関して14-16残基シフトして いるPHFコア内の縦列 とができ、それは、高親和性タウ捕獲部位での競合阻害を呈する。そのKi値は、 完全長タウを用いる同様の結合研究から得たKd値を用いて計算した。データの点 は４回測定した平均を示す。 図２１：ヒトタウタンパク質アイソフォームのヌクレオチド配列と予測される アミノ酸配列(SEQ ID NO:４)。ｃＤＮＡクローンhtau40から推定される配列は、 以前に決定した３反復型(Goedert et al．（1988），前出)とは異なり、アミノ 末端領域（下線）に余分な58アミノ酸が挿入され、そして以前に記載された(Goe dert et al．(1989)，EMBO J．8 393-399)31アミノ酸の余分な反復（下線）があ る。ヌクレオチドは5'-3'方向に番号付けされている。このｃＤＮＡクローンhta u40(Goedert et al．(1989b) Neuron 3，519-526)は、NdeI部位（5'末端）に挿 入された上記の配列およびコドン終結(***)への3'側のEcoRI部位を有する。 図２２：PHF−コアタウユニットのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列（SEQ ID NO:６; Novak et al．(1993)，前出）および好ましいコアタウユニットの構築に 用いたプライマー(SEQ ID NO:７および８)。 図２３：タウ−タウ相互作用の阻害による化合物のランキング。ランキングは 化合物の非存在下で見られた結合と比較し、１μg/mlおよび10μg/mlで観察され た平均として採った標準化した結合に基づいている。このランキングにおいて、 "1"は、化合物の非存在下で観察された結合に等しいものを表し、一方、"0.2"は 、結合が、試験化合物の濃度が1μg/mlおよび10μg/mlで平均の20％まで減少し たことを表す。したがって、数が小さければ小さいほど、eおよびaの結合の阻害 における化合物の効果も大きくなるのである。見て解るように、最初の５つのフ ェノチアジンは、標準化した結合係数が0.4より低い。すなわち、1〜10μg/mlの 範囲で見られる結合は、化合物の非存在下で見られるそれの40％より少ないので ある。 図２４：試験した化合物の化学構造と図２３により標準化した結合に関する値 。 図２５：タウ、MAP2(成体型)、MAP2C(幼若型)、および高分子量タウ（末梢神 経系および神経芽細胞系で見いだされる）の略図。これらのタンパク質は、同じ 微小管−結合ドメインを有しているが、Ｎ−末端突出(projection)ドメインの配 列および長さは実質的に異なっている。タウおよびMAP2の幼若型は縦列反復を３ つしか有していない。４−反復型のMAP2も存在する。 図２６：ヒトタウ（上の線; SEQ ID NO:９）およびヒトMAP2（下の線; SEQ ID NO:10）の縦列反復領域における配列の違い。垂直方向の矢印は、Glu-391で終 結する短縮型PHF−コアフラグメントの境界を示し、チューブリン−結合セグメ ントは下線を付して示されている。 図２７：pIF2発現ベクターは、SV40を基にした真核生物発現ベクターである（ pSV2neo; Sambrook et al．(1989)，前出; SEQ ID NO:11および12、外来ＤＮＡ の発現を行うβグロビンプロモーターを含むように改変されている(M．N．Neube rger))。それは、Geneticin選択のためネオマイシン耐性マーカーを有する。 図２８：PIF2::T40でトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、完全 長ヒトタウタンパク質(T40)を発現し、mAb7.51（上図）およびmAb499（下図）で 免疫標識したもの。細胞は、細長い過程を形成し、タウの免疫反応性もまた核周 囲部において細胞骨格分布を有することがわかる。 図２９：PIF::dGAEでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞3T3で、Glu- 391で終結した短縮型PHF-コアタウフラグメントを発現し、mAb7.51で免疫標識し たもの。トランスフェクションし、チオニンなしで成長させた初期細胞系。細胞 は、大いに異常であり、多核であり、液胞化し、細胞 質内にタウタンパク質の凝集体を有する。 図３０：リポフェクチン／タウタンパク質の、PIF2::T40でトランスフェクシ ョンした3T3細胞への移動。相対的細胞生存率（タンパク質なしでリポフェクチ ン処理した後、細胞数に正規化した）を、3.5μMのチオニンなしの場合（陰なし ）およびありの場合（陰あり）における、ほぼ等モル濃度の完全長タウ(T40、22 0nM)および短縮型タウ(dGAE、300nM)について示している。等モル濃度の場合、 完全長タウの場合には総タンパク負荷は５倍以上であるという事実にも関わらず 、完全長タウ(p=0.02)よりも短縮型タウの方がより毒性が強い。 図３１：（Ａ）短縮型タウの毒性の逆転：リポフェクチンを介して完全長タウ を発現している3T3細胞に移動した短縮型タウの毒性は、濃度依存性である。チ オニン（実線）は、短縮型タウの３つ全ての濃度においてチオニンの非存在下で 見られる毒性を取り消した。（Ｂ）完全長タウが、リポフェクチンを介して完全 長タウを発現している3T3細胞に移動した同様の実験。毒性およびチオニンの効 力はともに明確さが低下した。 以下の実施例は、本発明の詳細を説明することを目的とし、それにより本発明 をどのようにも限定するものではない。 実施例 実施例１ ：タウ−タウ−結合アッセイ このアッセイは、96ウェルのPVCマイクロタイタープレートを用いて行い、溶 液を添加し、そして個々のウェルに関して読みとる： a）50mM炭酸ナトリウム溶液中(pH9.6)0-50μg/ml（0、1、5、10、50μg/ml ）の範囲で濃度が変化する50μlの精製短縮型タウペプチド溶液を各ウェルに添 加して37℃で１時間インキュベーションする。 くはそれ無しで水で３回洗浄する。 c）リン酸緩衝正常生理食塩水（"PBS"、137mM塩化ナトリウム、1.47mMリン 酸二水素カリウム、8.1mMリン酸水素二ナトリウム、2.68mM塩化カリウム）で作 製した200μlの２％牛乳抽出物("Marvel")溶液を各ウェルに添加して37℃で１時 間インキュベーションする。 d）このプレートをｂ）のように洗浄する。 濃度の50μlの完全長組換えタウ(T40)溶液を各ウェルに添加し、37℃で１時間イ ンキュベーションする。 f）このプレートをｂ）のように洗浄する。 g）50μlのモノクローナル抗体499溶液を、組織培養上清をPBS中２％牛乳 抽出物("Mervel")で１／２に希釈して各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュ ベーションする。 h）このプレートをｂ）のように洗浄する。 液（西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したブロッティンググレードの親和性精 製ヤギ抗マウスIgG(H+L)、Bioradカタログ番号170-6516）を各ウェルに添加し、 37℃で１時間インキュベーションする。 で一回洗浄する。 k）発色溶液の調製は以下の通りである。10〜15mgの3,3',5,5'-テトラメチ ルベンジジン(TMB; BCLカタログ番号784974)をジメチルスルホキシド中に最終濃 度が10mg/mlとなるように溶解する(TMB溶液)。水90mlに10mlの酢酸ナトリウム保 存液(0.5M、pH5.0)を添加する。撹拌中に1mlのTMB溶液をゆっくりと添加し、次 いで10μlの過酸化水素を添加する。 l）50μlのTMB溶液を各ウェルに添加してペルオキシダーゼ呈色反応を行い 、発色速度を２分間にわたって650nmで、Molecular Devices Microplate reader 中で、Kinetic L1 Softmax software packageを用いて読みとる。実施例２ ：組換えタウフラグメントの調製 タウのｃＤＮＡを、標準的なプロトコール(Sambrook et al.，前出)を用いて 、その組織を死後３時間で入手したアルツハイマー病患者の脳組織から単離した ｍＲＮＡから生成した。ｃＤＮＡライブラリーを、PHFコアタンパク質(Goedert et al．(1988)，前出)の一部に由来する配列から誘導した合成17merオリゴヌク レオチドプローブを用いてスクリーニングした。完全長ｃＤＮＡクローンをM13m p18のEcoRI部位にサブクローニングし、部位特異的変異を用いて開始コドンに関 連するNdeI部位を誘導した。NdeIおよびEcoRIによる開裂に続き、得られたｃＤ ＮＡフラグメントをNdeI／EcoRIで切断した発現プラスミドpRK172のＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーターの下流にサブクローニングした(McLeod et al．（198 7）EMBO.J，6，729-736)。pRK172は、pBR322の誘導体で、pBR322のコピー数の制 御領域を除去してあるため、E.coli内で非常に多くのコピー数に増える。このプ ラスミドは、組換えクローンの選択のため、アンピシリン耐性遺伝子を有してい る。 タウの短縮型をコードしている構築物は、Novak et al．（1993，前出）に記 載されたようにｍＲＮＡから調製した。このｍＲＮＡを、特別なオリゴヌクレオ チドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いた。この センスプライマーは、NdeI部位を有し、アンチセンスは、EcoRI部位を有する。P CRフラグメントを、上記のようにpRK172にサブクローニングした。dGAEの構築に 用いたプライマーを図２２に示す。発現用 請求の範囲 １．タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質をスクリーニングする方 法であって、 ａ）タウタンパク質もしくは該タウコアフラグメントを有するその誘導体で あって、固相に結合しているものを、 ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することができると推測され る物質、および ｃ）タウタンパク質と結合することができる標識されたタウタンパク質また は標識されたその誘導体、あるいは前記ａ）のタウタンパク質とは異なる、タウ タンパク質に結合することのできるタウタンパク質もしくはその誘導体と接触さ せる工程、および ｄ）該タウ−タウ結合の検出工程、 を包含する方法。 ２．タウのチューブリンへの結合が、脱重合したチューブリン調製物もしくは微 小管調製物を、前記工程ｂ）およびｃ）で定義した化合物と接触させ、続いて該 タウ−チューブリン結合の検出により決定されることを特徴とする、請求項１に 記載の方法。 ３．前記固相への結合が、pH9〜pH10のアルカリ性緩衝液中で行われることを特 徴とする、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記タウタンパク質もしくはそのフラグメントの結合後の過剰な結合部位が 、ブロッキング剤によってブロックされることを特徴とする、請求項３に記載の 方法。 ５．前記工程ｂ）の物質および前記工程ｃ）のタウタンパク質が、液相で前記工 程ａ）のタンパク質と一緒にインキュベーションされることを特徴とする、請求 項１〜２に記載の方法。 ６．前記タウ−タウ結合が、50〜400mMの塩化ナトリウム、または匹敵するイオ ン強度の塩もしくは塩混合物中で、pH4〜pH10の範囲のpHで行われることを特徴 とする、請求項１〜５に記載の方法。 ７．前記工程ｃ）のタウタンパク質が、前記工程ａ）のタウタンパク質とは免疫 学的に異なっていることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。 ８．前記タウタンパク質の結合が、抗体によって検出されることを特徴とする、 請求項７に記載の方法。 ９．前記工程ｃ）のタウタンパク質が、放射性のもしくは酵素的に検出可能な標 識で印が付けられていることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。 １０．タウ−タウ結合およびタウ−チューブリン結合の検出のためのELISAアッ セイであって、 ａ）コアフラグメントに相当し、Ala-390で終結している短縮型タウタンパ ク質を、タウ−タウ会合にとって好ましくない緩衝液条件下で固相上に接種し、 ｂ）チューブリンタンパク質を同じ緩衝液条件下で固相に接種し、 ｃ）完全長タウタンパク質を、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは 阻害することができるがタウ−チューブリン会合は妨害しないと推測される物質 と一緒に液相で添加し、そして ｄ）タウ−タウ結合を、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを認識 する抗体を用いて免疫化学的に検出する、 ことを特徴とするアッセイを包含する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法 。 １１．タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質をスクリーニングする 方法であって、 ａ）タウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体、あ るいはタウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を発現 することのできるベクターによってトランスフェクションされた細胞系を、 ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することができると推測され る物質と接触させ、そして ｃ）該細胞系の生存および／または該細胞系の形態を検出することを包含す る、方法。 １２．前記細胞系が線維芽細胞もしくはニューロン細胞系である、請求項１１に 記載の方法。 １３．前記細胞系が、線維芽細胞3T3、PC-12、もしくはNIE-115細胞系である、 請求項１２に記載の方法。 １４．前記タウタンパク質が短縮型タウタンパク質である、請求項１１〜１３に 記載の方法。 １５．前記短縮型タウタンパク質がコアタウユニットである、請求項１４に記載 の方法。 １６．前記タウタンパク質の発現が、構造的制御下にある請求項１１〜１５に記 載の方法。 １７．前記タウタンパク質の発現が、誘導制御下にある請求項１１〜１５に記載 の方法。 １８．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法により得られる、タウ−タウ 会合を調整するかもしくは阻害する化合物。 １９．下式のフェノチアジン 式中、 Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキ シ、カルボキシ、置換または非置換アルキル、ハロアルキル、もしくはアルコキ シから選択され； Ｒ₂およびＲ₈が独立して水素もしくは下式 から選択され； Ｒ₅が、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロ アルキル、アルコキシまたは単結合から選択され； Ｒ₁₀およびＲ₁₁は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは 非置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたは単結合から選択される、 および薬学的に受容可能なそれらの塩の、異常なタウ−タウ凝集もしくは異常な 神経フィラメント凝集の予防および処置用の組成物の製造における使用。 ２０．前記フェノチアジンが、 Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉が、独立して、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅ もしくは−Ｃ₃Ｈ₇から選択され； Ｒ₂およびＲ₈が独立して下式 から選択され、式中、 Ｒ₁₀およびＲ₁₁が、独立して、単結合、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅もしくは− Ｃ₃Ｈ₇から選択され、そして Ｒ₅が、単結合、一水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅もしくは−Ｃ₃Ｈ₇である、および 薬学的に受容可能なそれらの塩である群から選択される、請求項１９に記載のフ ェノチアジンの使用。 ２１．前記フェノチアジンが、トルイジンブルーＯ、チオニン、Azure A、Azure Bもしくは1,9-ジメチルメチレンブルーからなる群から選択される、請求項２０ に記載の使用。 ２２．アルツハイマー病、運動ニューロン病、Lewy小体病、ピック病、および進 行性核上性麻痺の予防および処置用の組成物の製造における請求項１９〜２１に 定義したフェノチアジンの使用。 ２３．請求項１９に定義した異常なタウ−タウ会合のブロッキング用の組成物の 製造における化合物の使用であって、該化合物が0.4未満の結合係数を有し、タ ウのモル濃度に関して1000:1のモル比まではタウ−チューブリン結合を阻害しな いことを特徴とする、化合物の使用。 ２４．治療的に有効な量の請求項１９に定義した化合物、および治療的に不活性 なキャリア物質を含む、異常なタウ−タウ会合を処置するための医薬組成物。 ２５．請求項１９に定義したフェノチアジンを投与することを包含する、異常な タウ−タウ会合を処置する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｍ 33/566 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エドワーズ，パトリシア・キャロル イギリス国、ケンブリッジ シービー２ ２キューエイチ、ヒルズ・ロード（番地な し） エムアールシー・センター、ユニバ ーシティ・オブ・ケンブリッジ・クリニカ ル・スクール (72)発明者 ハリントン，チャールズ・ロバート イギリス国、ケンブリッジ シービー２ ２キューエイチ、ヒルズ・ロード（番地な し） エムアールシー・センター、ユニバ ーシティ・オブ・ケンブリッジ・クリニカ ル・スクール (72)発明者 ロス，マーチン イギリス国、ケンブリッジ シービー２ ２キューエイチ、ヒルズ・ロード（番地な し） エムアールシー・センター、ユニバ ーシティ・オブ・ケンブリッジ・クリニカ ル・スクール (72)発明者 クルーグ，アーロン イギリス国、ケンブリッジ シービー２ ２キューエイチ、ヒルズ・ロード（番地な し） エムアールシー・センター、ユニバ ーシティ・オブ・ケンブリッジ・クリニカ ル・スクール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質をスクリーニングする方 法であって、 ａ）タウタンパク質もしくは該タウコアフラグメントを有するその誘導体を 、 ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することができると推測され る物質、および ｃ）タウタンパク質と結合することができる標識されたタウタンパク質また は標識されたその誘導体、あるいは前記ａ）のタウタンパク質とは異なる、タウ タンパク質に結合することのできるタウタンパク質もしくはその誘導体と接触さ せる工程、および ｄ）該タウ−タウ結合の検出工程、 を包含する方法。 ２．タウのチューブリンへの結合が、脱重合したチューブリン調製物もしくは微 小管調製物を、前記工程ｂ）およびｃ）で定義した化合物と接触させ、続いて該 タウ−チューブリン結合の検出により決定されることを特徴とする、請求項１に 記載の方法。 ３．前記工程ａ）のタンパク質が固相に結合していることを特徴とする、請求項 １〜２に記載の方法。 ４．前記固相への結合が、pH9〜pH10のアルカリ性緩衝液中で行われることを特 徴とする、請求項３に記載の方法。 ５．前記タウタンパタ質もしくはそのフラグメントの結合後の過剰な結合部位が 、ブロッキング剤によってブロックされることを特徴とする、請求項３に記載の 方法。 ６．前記工程ｂ）の物質および前記工程ｃ）のタウタンパク質が、液相で 前記工程ａ）のタンパク質と一緒にインキュベーションされることを特徴とする 、請求項１〜２に記載の方法。 ７．前記タウ−タウ結合が、50〜400mMの塩化ナトリウム、または匹敵するイオ ン強度の塩もしくは塩混合物中で、pH4〜pH10の範囲のpHで行われることを特徴 とする、請求項１〜６に記載の方法。 ８．前記工程ｃ）のタウタンパク質が、前記工程ａ）のタウタンパク質とは免疫 学的に異なっていることを特徴とする、請求項１〜７に記載の方法。 ９．前記タウタンパク質の結合が、抗体によって検出されることを特徴とする、 請求項８に記載の方法。 １０．前記工程ｃ）のタウタンパク質が、放射性のもしくは酵素的に検出可能な 標識で印が付けられていることを特徴とする、請求項１〜７に記載の方法。 １１．タウ−タウ結合およびタウ−チューブリン結合の検出のためのELISAアッ セイであって、 ａ）コアフラグメントに相当し、Ala-390で終結している短縮型タウタンパ ク質を、タウ−タウ会合にとって好ましくない緩衝液条件下で固相上に接種し、 ｂ）チューブリンタンパク質を同じ緩衝液条件下で固相に接種し、 ｃ）完全長タウタンパク質を、異常なタウ−タウ会合を調整するかもしくは 阻害することができるがタウ−チューブリン会合は妨害しないと推測される物質 と一緒に液相で添加し、そして ｄ）タウ−タウ結合を、完全長タウタンパク質のＮ−末端セグメントを認識 する抗体を用いて免疫化学的に検出する、 ことを特徴とするアッセイを包含する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方 法。 １２．タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害する物質をスクリーニングする 方法であって、 ａ）タウタンパタ質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体、あ るいはタウタンパク質もしくはタウコアフラグメントを有するその誘導体を発現 することのできるベクターによってトランスフェクションされた細胞系を、 ｂ）タウ−タウ会合を調整するかもしくは阻害することができると推測され る物質と接触させ、そして ｃ）該細胞系の生存および／または該細胞系の形態を検出することを包含す る、方法。 １３．前記細胞系が線維芽細胞もしくはニューロン細胞系である、請求項１２に 記載の方法。 １４．前記細胞系が、線維芽細胞3T3、PC-12、もしくはNIE-115細胞系である、 請求項１３に記載の方法。 １５．前記タウタンパク質が短縮型タウタンパク質である、請求項１２〜１４に 記載の方法。 １６．前記短縮型タウタンパク質がコアタウユニットである、請求項１５に記載 の方法。 １７．前記タウタンパク質の発現が、構造的制御下にある請求項１２〜１６に記 載の方法。 １８．前記タウタンパク質の発現が、誘導制御下にある請求項１２〜１６に記載 の方法。 １９．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法により得られる、タウ−タウ 会合を調整するかもしくは阻害する化合物。 ２０．下式のフェノチアジン 式中、 Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキ シ、カルボキシ、置換または非置換アルキル、ハロアルキル、もしくはアルコキ シから選択され； Ｒ₂およびＲ₈が独立して水素もしくは下式 から選択され； Ｒ₅が、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは非置換アルキル、ハロ アルキル、アルコキシまたは単結合から選択され； Ｒ₁₀およびＲ₁₁は、独立して、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換もしくは 非置換アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたは単結合から選択される、 および薬学的に受容可能なそれらの塩の、異常なタウ−タウ凝集もしくは異常な 神経フィラメント凝集の予防および処置用の組成物の製造における使用。 ２１．前記フェノチアジンが、 Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₉が、独立して、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅ もしくは−Ｃ₃Ｈ₇から選択され； Ｒ₂およびＲ₈が独立して下式 から選択され、式中、 Ｒ₁₀およびＲ₁₁が、独立して、単結合、水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅もしくは− Ｃ₃Ｈ₇から選択され、そして Ｒ₅が、単結合、−水素、−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅もしくは−Ｃ₃Ｈ₇である、および 薬学的に受容可能なそれらの塩である群から選択される、請求項２０に記載のフ ェノチアジンの使用。 ２２．前記フェノチアジンが、トルイジンブルーＯ、チオニン、Azure A、Azure Bもしくは1,9-ジメチルメチレンブルーからなる群から選択される、請求項２１ に記載の使用。 ２３．アルツハイマー病、運動ニューロン病、Lewy小体病、ピック病、および進 行性核上性麻痺の予防および処置用の組成物の製造における請求項２０〜２２に 定義したフェノチアジンの使用。 ２４．請求項２０に定義した異常なタウ−タウ会合のブロッキング用の組成物の 製造における化合物の使用であって、該化合物が0.4未満の結合係数を有し、タ ウのモル濃度に関して1000:1のモル比まではタウ−チューブリン結合を阻害しな いことを特徴とする、化合物の使用。 ２５．治療的に有効な量の請求項２０に定義した化合物、および治療的に不活性 なキャリア物質を含む、異常なタウ−タウ会合を処置するための医薬組成物。 ２６．請求項２０に定義したフェノチアジンを投与することを包含する、異常な タウ−タウ会合を処置する方法。