CN1100787C - 新型血吸虫疫苗肽 - Google Patents

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Abstract

本发明属于有机化合物。具有下列基本结构的多肽：n＝1，2，4，5该结构对血吸虫病有保护性免疫作用，可用丁制备抗血吸虫病的疫苗类药物。

Description

新型血吸虫疫苗肽
本发明属于有机化合物。
血吸虫病是目前世界上广为流行的一种寄生虫传染病。其主要的病原体是日本血吸虫和曼氏血吸虫。它是目前最有希望用疫苗的方法加以控制的传染病之一。
结构精确的亚单位疫苗是现代疫苗发展的一个主要方向，在使用的安全性和便捷性上，它都优于经典的减弱活疫苗。本发明的目的即在于利用血吸虫蛋白质的多肽片断构建具有特定结构的血吸虫亚单位疫苗。此种疫苗的重要意义在于可以采用人工大量合成，经人工合成的疫苗接种量小，可以减少异种蛋白的过敏反应，并可大量制备，且无灭活不完全造成的致病危险，有实际应用前景。
日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)是流行于我国的唯一虫种，曼氏(Schistosoma Mansoni，Sm)血吸虫则流行于非洲及南美地区。曼氏血吸虫28KD谷胱甘肽S-转移酶(Sm 28GST)具有较好的免疫原性，可以在实验动物中诱导保护性，但Sj中相应蛋白的免疫原性却较弱。而另一方面，Sm28GST和Sj28GST的氨基酸序列却具有高度同源性，且两者之间有强烈的血清学交叉反应。因此本发明利用曼氏血吸虫的多肽序列构建抗日本血吸虫病疫苗，取得了较好的生物活性。
小分子多肽的免疫原性通常较弱，近年来发展的多抗原肽方法(multiple antigen peptide，MAP)为解决这一难题带来了希望。该方法是以寡聚赖氨酸为母核，然后在赖氨酸的氨基上合成并联的多条抗原肽链，以提高抗原的分子量，延长它在体内的停留时间，增加抗原性。当所连接的赖氨酸级数为n时，母核中含有2n-1个赖氨酸，肽段的数目2n。
本发明所涉及的有机化合物—多抗原肽，是结构精确的血吸虫可溶性亚单应疫苗，其通式是：
Figure C9810183800041
在上式中，n为赖氨酸母核中所接赖氨酸的级数，(n＝1，2，4，5)，2n-1为母核中赖氨酸的数目，2n-1为多抗原肽分子中所含该肽段的数目。
A可以是天然氨基酸残基，也可以是对应的D-构型氨基酸残基，还可以是β-丙氨酸。
B可以是：i)NHR，R为H或C1-5烷基。
      或ii)OR，R为H或C1-5烷基。
C可以为氢，或RCO形式的基团，这里，R为H或C1-5烷基。肽段1的序列为：
Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys
(称为P1)
肽段2的序列可以与肽段1的序列相同，也可以是
i)Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly(称为P2)
或
ii)Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys(称为P3)
本发明实施例中即利用MAP方法分别合成了含有一种和两种多肽片段的四聚体，并以小鼠为模型进行了抗日本血吸虫(大陆株)的生物活性试验，取得了令人满意的结果，其中一种多肽的四聚体免疫BALB/C种小鼠，减虫率和减卵率可分别达到62.5％和54％，按照国际公认标准，如果抗原的减虫率、减卵率达到50％以上，即有进一步开发为疫苗的可能性。
本发明涉及的多肽可以以其自由的形式存在，也可以以药物上可以接受的盐的形式或复合物的形式存在。
本发明涉及的多肽可以用已知的多肽化学方法进行合成，以下的实施例中给出了用固相多肽合成法进行合成的过程。
                      实施例1.含有同种肽段的多抗原肽四聚体的合成：
合成中，以接合甘氨酸的PAM树脂作为起始物(0.34mmol/g)，所有氨基酸的α-氨基均采用Boc保护(叔丁氧羰酰基)，Lys侧链氨基用Z(苄氧羰酰基)保护。Thr，Ser，Glu，Asp的侧链官能团分别用苄醚和苄酯进行保护。每步缩合中，用50％TFA(三氟乙酸)/DCM(二氯甲烷)、溶液脱除Boc保护基，用10％TEA(三乙胺)/DCM中和，接肽缩合剂采用DCC/HoBt，以DMF作为接肽反应的溶剂。每步接肽反应中，所用氨基酸、缩合试剂与树脂氨基的摩尔数之比为2.5∶1。合成结束后，先用50％TFA/DCM脱去末端氨基酸的Boc基团，整个肽段最后用HF从树脂上裂解下来。所得粗肽用Sephadex G-50柱纯化后，冷冻干燥得到目标物。合成的流程如下：
Figure C9810183800071
2.含有两种多抗原肽的四聚体的合成
两种肽链的α-氨基分别用Fmoc(芴甲氧羰酰基)和Boc进行保护，在Fmoc保护的氨基酸中，Asp，Glu，Ser，Thr，Tyr的侧链官能团分别以叔丁酯和叔丁醚的形式进行保护。Boc氨基酸的保护法同上，在合成中，Fmoc官能团以50％哌啶/DCM溶液进行脱除。Boc基团的脱除仍使用50％TFA/DCM，中和过程则采用10％DIPEA/DCM溶液。合成的简要流程如下所示：
Figure C9810183800081
Figure C9810183800091
缩略语简表
Ala          丙氨酸
Arg          精氨酸
Asn          天冬酰胺
Asp          天冬氨酸
Boc          叔丁氧羰基
Bop          benzotriazolyl-N-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium
             hexafluoropho sphate
DCC          二环己基碳二亚胺
DCM          二氯甲烷
DIPEA        二异丙基乙基胺
Fmoc         9-芴甲氧羰酰基
Gly          甘氨酸
Glu          谷氨酸
Gln          谷氨酰胺
HOBt         1-羟基苯并三氮唑
Leu          亮氨酸
Ile          异氨酸
Lys          赖氨酸
Phe          苯丙氨酸
Pro          脯氨酸
Ser          丝氨酸
Sj           日本血吸虫
Sm           曼氏血吸虫
TFA          三氟乙酸
TEA          三乙胺
Thr          苏氨酸
Trp          色氨酸
Tyr          酪氨酸
Val          缬氨酸

Claims (2)

1.一种多肽或其药物学上可接受的盐，其特征在于化学结构如下
式所示：
Figure C9810183800021
其中P1：Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys；
P2：Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly；
P3：Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-
    Lys。
2.一种治疗和预防血吸虫病的药物组合物，其中含有根据权利要求1中的任一种多肽或其盐作为有效成份以及药物学可以接受的稀释剂和载体。
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WO1991009621A1 (fr) * 1989-12-29 1991-07-11 Institut Pasteur FRAGMENT PEPTIDIQUE COMPRENANT UNE SEQUENCE ISSUE DE LA PROTEINE 28 kDa DE SCHISTOSOMA MANSONI ET COMPOSITIONS VACCINANTES ET/OU THERAPEUTIQUES COMPRENANT LEDIT FRAGMENT
CN1112930A (zh) * 1994-06-08 1995-12-06 北京医科大学 新型血吸虫疫苗肽(二)
CN1179829A (zh) * 1995-03-27 1998-04-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Tau－Tau结合的抑制

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