JPH11500454A

JPH11500454A - 強心性配糖体またはそれらのアグリコンおよび誘導体を使用してリーダーレスタンパク質輸送を阻害する方法

Info

Publication number: JPH11500454A
Application number: JP9528759A
Authority: JP
Inventors: ゼット．フローキーウィッツ，ロバート
Original assignee: ザスクリプスリサーチインスティテュート
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 1999-01-12
Also published as: DE69700464T2; EP0828497B1; AU706644B2; EP0941733A2; CA2242245A1; DE69700464D1; US6281197B1; AU2123197A; EP0941733A3; US6107283A; ES2140215T3; ATE183922T1; EP0828497A1; WO1997028808A1; US6071885A; US5891855A

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞を強心性配糖体またはアグリコン誘導体と接触させることにより、細胞由来のリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する方法を提供する。リーダーレスタンパク質には、FGF-1、FGF-2、IL-1α、IL-1β、および第XIIIa因子が含まれる。これらの方法は、腫瘍および糖尿病を含む状態の処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】強心性配糖体またはそれらのアグリコンおよび誘導体を使用してリーダーレスタンパク質輸送を阻害する方法本発明の支援は、政府の資金援助によって、NIH DK18811を通して部分的に提供された。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。技術分野本発明は、一般に、リーダーレスタンパク質輸送のインヒビターに関し、そしてより詳細には、細胞外空間へのリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する強心性配糖体またはアグリコン誘導体の使用に関する。発明の背景多くのタンパク質は、細胞表面レセプターに結合することによって媒介されるシグナルトランスダクションを介する細胞増殖、細胞分化、および炎症に対して効果を及ぼす。さらに、血餅形成を開始するかまたは血餅形成のために必要な因子のような他のタンパク質は、血液中で酵素的に作用する。一般に、これらの作用が通常のプロセスの一部（特定の環境下）である一方で、特定のタンパク質の作用および続いて起こるシグナリングの効果を限定または阻害することが所望され得る。例えば、成長因子（例えば、メラノーマ細胞において作用するbFGF）によって促進される腫瘍の増殖は、有害であり、そしてしばしば死を導く。特定のタンパク質を阻害するためのアプローチは、タンパク質-基質またはタンパク質-レセプター相互作用を妨害することに主に集中してきた。代表的には、これは、レセプター結合に対する競合物（competitor）の投与によるかまたはタンパク質のプロテアーゼ消化によって、タンパク質に競合的に結合する抗体または他の分子の使用を包含する。別のアプローチは、一般的には行われていないが、転写または翻訳レベルでその発現を阻害することによってタンパク質レベルを減少させることである。タンパク質の転写または翻訳を阻害することによってタンパク質レベルを減少させる方法は、１つまたはいくつかのタンパク質の特異的な発現の阻害の本質的な問題のために達成するのが困難であった。特定のタンパク質（例えば、成長因子）、炎症のメディエーター、および血液凝固のメディエーターが非古典的分泌経路を通して輸送されるという発見は、これらのタンパク質に対する特異的なインヒビターの開発を可能にする。これらのタンパク質は、古典的Golgi/ER経路による分泌を媒介する疎水性リーダー配列のそれらの欠乏によって同定される。これらのタンパク質は、エキソサイトーシスによって細胞から輸送されると考えられる。本発明は、所望でない増殖および炎症の制御を可能にするこれらのリーダーレスタンパク質の輸送のインヒビター、ならびに他の関連する利点を提供する。発明の要旨本発明は、一般に、タンパク質を発現する細胞由来のリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する方法を提供する。本発明の１つの局面において、輸送は、タンパク質を発現する細胞を強心性配糖体と接触させることによって阻害される。特定の実施態様において、強心性配糖体は、ジゴキシン、ストロファンチンＫ、ジギトキシン、ラナトシドＡ、およびウアバインからなる群より選択される。好ましくは、強心性配糖体は、ウアバインまたはジゴキシンである。本発明の別の局面において、細胞を強心性配糖体のアグリコン誘導体と接触させることにより、タンパク質を発現する細胞由来のリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する方法が提供される。特定の実施態様において、アグリコン誘導体は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、およびウザリゲニンからなる群より選択される。好ましくは、アグリコン誘導体は、ジゴキシゲニンである。他の局面において、細胞を強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体と接触させる工程を包含する、FGF-2を発現する細胞由来のFGF-2の輸送を阻害するための方法が提供される。さらに他の局面において、強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体の治療的有効投与量を投与し、それによって輸送されるFGF-2の量を減少させる工程を包含する、患者においてFGF媒介性病態生理学的状態を処置する方法が提供される。特定の実施態様において、病態生理学的状態はメラノーマ、卵巣癌、奇形癌、および神経芽細胞腫である。さらに他の局面において、細胞を強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体と接触させる工程を包含する、FGFレセプターを有する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。なお他の局面において、細胞を阻害量の強心性配糖体またはアグリコン誘導体と接触させる工程を包含する、糖尿病の合併症を処置するための方法が提供される。細胞を式１、式２、式３、式４、または式５からなる群より選択される化合物で処理する工程を包含する、リーダーレスタンパク質の輸送を阻害するための方法もまた提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面の参照により明らかになる。特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載している種々の参考文献を以下に示す。これらの参考文献は全てその全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、種々の強心性配糖体のアグリコン核の一般的な構造の図である。図２は、ウアバインなしでの処理後（パネルＡ）およびウアバインでの処理後（パネルＢ）の、パルス標識し、免疫沈降した細胞性FGF-2（Ｃで記したレーン）および細胞外FGF-2（Ｍで記したレーン）のSDS-PAGEゲルである。図３は、ウアバインなしでの処理後（パネルＡ）およびウアバインでの処理後（パネルＢ）の、パルス標識し、免疫沈降した細胞性ヒトコリオゴナドトロピン α（corionic gonadatrophin）（Ｃで記したレーン）および細胞外ヒトコリオゴナドトロピン（Ｍで記したレーン）のSDS-PAGEゲルである。図４は、ウアバインでの処理後のFGF-2輸送量を示すグラフである。図５は、代謝標識後の細胞画分（Ｃ）および培地画分（Ｍ）由来の免疫沈降したFGF-2およびHCG-αの写真である。COS-1細胞を、p18dxまたはhCG-αを用いてトランスフェクトし、そして培地のみ（Ａ）、Brefedin A（Ｂ）、または2-デオキシ-D-グルコース＋NaN₃（Ｃ）中で代謝的に標識した。FGF-2およびHCG-αを、細胞（Ｃ）または培地（Ｍ）から免疫沈降し、電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーした。図６は、細胞内またはCF-18および野生型COS細胞における細胞表面上のFGF-2 を検出するウェスタンブロットである。細胞内タンパク質を、ヘパリンセファロースによって精製する。FGF-2を、矢印でマークし、分子量標準を右に示す。図7Aおよび図7Bは、ウェスタンブロットおよびブロットの結果を定量化するグラフである。ブロットのために、CF18細胞を、炭酸緩衝液で洗浄し、そしてウアバインの存在下または非存在下でインキュベートする。Ａ、細胞表面タンパク質の代表的なウエスタン、FGF-2を矢印で記し、分子量標準は右側にある。CLT、コントロール；48、48時間培養された；+OUA、ウアバインの存在下で48時間培養された。Ｂ、細胞内FGF2について調整したシグナルの平均±標準偏差。^*、コントロールに対してp＜0.002；＋、48時間に対してp＜0.002（n=6）。図８は、種々のウアバイン濃度の存在下または非存在下でインキュベートされた正常な軟骨細胞から放出されたFGF2（コントロールの％として）を示すグラフである。バーは、標準偏差を示す。図9Aおよび9Bは、IL-1をコードするプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。図10は、IL-1を発現するプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。図11は、IL-1を発現するプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。COS細胞を、５mMのウアバインで処理する。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。図12は、IL-1を発現するプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。図13は、IL-1を発現するプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。細胞を、５mMのウアバインで処理する。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。図14は、IL-1を発現するプラスミドでのCOS細胞のトランスフェクション後、抗IL-1抗体を用いる免疫沈降のオートラジオグラムである。COS細胞を、５mMのウアバインで処理するかまたは処理を与えない。Ｃ、細胞抽出物；Ｍ、細胞馴化培地。発明の詳細な説明本発明の理解を助けるために、本明細書中で使用される特定の用語の定義を提供する。「強心性配糖体」は、構造的に関連する化合物の群をいう。構造的に、これらの化合物は、ステロイド化合物に特有のシクロペンタノペルヒドロフェナントレン核に由来し、Ｄ環のＣ17での５員環不飽和ラタトン環または６員環二重不飽和ラクトン環、１つ以上の糖残基へのエーテル結合による結合のためのＡ環中のＣ３での水酸基、およびＣ14での水酸基を有する（図１）。強心性配糖体のアグリコン誘導体は類似した構造を有するが、強心性配糖体に特有の炭水化物を欠く。これらのアグリコン誘導体はまた、本発明において有用である。この基の代表は、多くの植物起源ならびに動物に見出される。（A Survey of Cardiac Glycosid es and Genins，University of South Carolina Press，1961を参照のこと。）強心性配糖体には、哺乳動物から単離されているウアバイン様／ジゴキシン様化合物が含まれる（米国特許第4,780,314号を参照のこと）。「リーダーレスタンパク質」は、細胞外環境に到達するが正規のリーダー配列を欠くタンパク質またはポリペプチドをいう。リーダー配列は、ERへの移動を媒介し、そしてシグナル認識タンパク質（SRP）によって認識される。細胞外環境中のタンパク質には、細胞外空間に見出される分泌タンパク質ならびに膜に結合するが完全な膜タンパク質でないタンパク質が含まれる。原型リーダー配列は、アミノ末端の正に帯電した領域（中心の疎水性領域）、およびより極性のカルボキシ末端領域を有する（von Heijne，J．Membrane Biol．115: 195-201，1990を参照のこと）。リーダーレスタンパク質には、FGF-1、FGF-2、インターロイキン１α、インターロイキン１β、精管タンパク質、血小板由来内皮細胞増殖因子、毛様体神経栄養因子、チモシン、パラチモシン、14.5 kDaレクチン（L14）、トランスグルタミナーゼ、チオレドキシン様タンパク質、坐骨神経成長促進活性、第XIIIa因子、およびint-2が含まれる。これらの発明の文脈中には、リーダーレスタンパク質には、天然に存在するタンパク質ならびにリーダー配列を欠くように操作されているが輸送されるタンパク質が含まれる。本明細書中において、用語「シグナル配列」、「リーダーペプチド」、および「リーダー配列」は、交換可能に使用される。タンパク質の「輸送」は、翻訳された細胞産物を細胞外空間またはリーダー配列による以外の機構による細胞膜に輸送する代謝的に活性なプロセスをいう。リーダーレスタンパク質上記のように、リーダーレスタンパク質は、細胞外環境下に到達するがSRP認識によってER中のタンパク質の移動を媒介するために機能するシグナル配列を欠くタンパク質である。代表的には、これらのタンパク質は、それらの一次翻訳産物が正規の疎水性リーダー配列またはシグナル配列（これは、通常一次翻訳産物のＮ末端に位置し、そしてGolgi/ERを介した輸送プロセスにおいて使用される）を欠くので最初に同定される。リーダー配列は、３つの別個のドメインを有する：約１〜５残基長のアミノ末端の正に帯電した領域；約７〜15残基長の中心の疎水性領域；および約３〜７残基長のより極性のカルボキシ末端ドメイン（von He ijne、前出）。疎水性の中心の領域は重要である。いくつかのリーダーレスタンパク質は、細胞外環境におけるそれらの位置、Go lgi/ERを介する以外の機構による輸送、およびリーダー配列の欠乏によって同定されてきた。このようなタンパク質には、IL-1α（配列番号４、５；前駆体、成熟形態）、IL-1β（配列番号６、７；前駆体、成熟形態）、FGF-1、FGF-2（配列番号１、２；cDNA、18 kD形態）、PD-ECGF（血小板由来内皮細胞増殖因子）、CN TF（毛様体神経栄養因子）、坐骨神経成長促進活性、精管タンパク質、トランスグルタミナーゼ、L-14レクチン、第XIIIa因子、チオレドキシン様タンパク質（A DF）、チモシン、パラチモシン、およびint-2が含まれる。輸送される他のリーダーレスタンパク質は、２部分アッセイ（two-part assay ）によって同定され得る：（１）膜を含む細胞外空間中のタンパク質の同定、および（２）ブレフェルジン耐性輸送。候補のリーダーレスタンパク質を同定するための予備的評価は、一次翻訳産物のアミノ酸配列の調査によってなされ得る。本明細書中に記載のように（von Heijne、前出）、アミノ末端配列と他の公知のリーダー配列との比較または原型パターン配列の同定は、潜在的なリーダーレスタンパク質を分類するための手段を提供する。上記で議論したように、リーダー配列は、約15〜25アミノ酸長であり、かつ最小で７〜15疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、メチオニン、トレオニン、セリン、プロリン、システイン、アラニン、チロシン、およびトリプトファン）の中心領域を含む。このような配列を欠くタンパク質の任意の一次翻訳配列は、輸送されるリーダーレスタンパク質の候補である。上記のように、リーダーレスタンパク質としてのタンパク質の同定は、２部分アッセイ、細胞外環境におけるタンパク質の発見、およびブレフェルジン耐性に基づく。最初のアッセイは、細胞外でタンパク質を検出するために行う。このアッセイのために、リーダーレスタンパク質を発現する試験細胞が必要である。試験細胞がタンパク質を天然に産生し得るか、または好ましくは、タンパク質をトランスフェクトした発現ベクターから産生し得る。FGF-2発現のために、COS細胞がトランスフェクションのために好ましい。IL-1の発現のために、p388D1細胞が好ましい。発現後、タンパク質を種々の周知の方法および手順のいずれか１つによって検出する。このような方法には、フローサイトメトリーとともに抗体を用いる染色、共焦点顕微鏡法、画像分析、細胞培地の免疫沈降、細胞培地のウェスタンブロット、ELISA、およびバイオアッセイが含まれる。最初のスクリーニングの間の好ましいアッセイは、ELISAである。任意の候補物が他のアッセイのうちの１つによって（好ましくは代謝標識後、細胞培地の免疫沈降によって）確証される。簡単に述べれば、候補のリーダーレスタンパク質を発現する細胞を、メチオニンおよび/またはシステインを含まない培地中で³⁵S-メチオニンおよび/または³⁵ S-システインとともに15分間パルス標識し、そして過剰のメチオニンおよび/またはシステインを補充した培地中でチェイスする。培地の画分を回収し、そして微量遠心分離機(microfuge)中での遠心分離によって明澄化する。プロテアーゼを阻害するために、１％NP-40、0.5％デオキシコレート（DOC）、20mM Tris（pH 7 .5）、５mM EDTA、２mM EGTA、10nM PMSF、10ng/mlアプロチニン、10 ng/mlロイペプチン、および10 ng/mlペプスタチンを含む溶解緩衝液を明澄化した培地に添加する。候補のリーダーレスタンパク質に対する抗体を添加し、そして冷却下におけるインキュベーションの後、沈降した二次抗体または免疫グロブリン結合タらなるインキュベーションのために添加する。並行して、コントロールとして、サイトゾルタンパク質をコードするベクターを同時トランスフェクトし、そして免疫沈降において公知のサイトゾルタンパク質に対する抗体を使用する。免疫複合体をペレット化し、そして氷冷溶解緩衝液を用いて洗浄する。複合体を、氷冷 IP緩衝液（0.15M NaCl、10mM リン酸ナトリウム（pH 7.2）、１％ DOC、１％NP- 40、0.1％SDS）でさらに洗浄する。免疫複合体をSDSゲルサンプル緩衝液中に直接溶出し、そしてSDS-PAGEにおいて電気泳動する。アクリルアミドの割合は、リーダーレスタンパク質の分子量に依存する。ゲルを蛍光光度法のために処理し、乾燥し、そしてX線フィルムに曝露する。サイトゾルタンパク質のコントロールと比較して培地中により高いレベルで発現されるタンパク質を、ブレフェルジン耐性輸送について試験する。上記のように、リーダーレスタンパク質を発現する細胞におけるブレフェルジン耐性を測定する。簡単に述べれば、COS-1細胞のような細胞を、リーダーレスタンパク質（例えば、FGF-2）の発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトする。約２日後、トランスフェクトされた細胞をメチオニンおよびシステインを含まない培地中で、³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システインとともに15分間代謝的にパルス標識する。標識を取り除き、そして細胞を15μg/mlブレフェルジンＡを含有する培地中でさらにインキュベートする。FGF-2輸送の定量のために、25 μg/mlヘパリンをチェイス培地に添加する。FGF-2輸送における統計的に有為な減少の欠如は、タンパク質輸送が、ブレフェルジンＡ耐性であることを示す。インヒビター上記のように、強心性配糖体およびアグリコンは、リーダーレスタンパク質の輸送のインヒビターである。強心性配糖体およびそれらのアグリコン誘導体は、ステロイド化合物に特有のシクロペンタノペルヒドロフェナントレン核に由来する（図１）。Ｄ環のC17において、５員環不飽和ラクトン環または６員環二重不飽和ラクトン環が存在する。Ａ環のＣ3において、エーテル結合による１つ以上の糖残基に結合するための水酸基が存在し、そしてＣ14において水酸基が存在する。さらに、他のＣ原子（例えば、Ｃ16）は、側基(side group)を有し得る。Ｃ 3における糖基には、単糖類（グルコース、ラムノース、シマロースを含む）、二糖類、三糖類、および多糖類（シマロース-β-D-グルコース、L-ラムノース-D -グルコース、トリジギトキソース、ジギトキソース₃-D-グルコースなどを含む）ならびに糖誘導体が含まれる。アグリコン誘導体は、強心性配糖体に類似の構造を有するが、炭水化物残基を欠く。しかし、他の側基は、アグリコン誘導体中のＣ3位で置換され得る。同時に、強心性配糖体およびアグリコン誘導体は、カルデノリドとして分類される。本発明において有用な強心性配糖体には、ラナトシドＡ、デスアセチルラナトシドＡ、アクチルジギトキシン、ジギトキシン、ラナトシドＣ、デスアセチルラナトシドＣ、ジゴキシン、ストロファントシド、Ｋ-ストロファンチン、ウアバイン、シラレンＡ、プロシラリジンＡ、ウザリン、ジトキソース、ジトキシン、ストロファンチジン-3β-ジギトキソシド、ストロファンチジンα-L-ラムノピラノシド、ストロファンチドール、オレアンドリン、アコベノシドＡ、ストロファンチジンジギラノビオシド、ストロファンチジン-D-シマロシド、ジギトキシゲニン-Ｌ-ラムノシドジギトキシゲニンセレトシドなどが含まれるが、これらに限定されない。アグリコンには、ストロファンチジン、ジギトキシゲニン、ウザリゲニン、ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン3,12-ジアセテート、ギトキシゲニン、ギトキシゲニン3-アセテート、ギトキシゲニン3,16-ジアセテート、16-アセチルギトキシゲニン、アセチルストロファンチジン、ウアバゲニン、3-エピジゴキシゲニンなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、強心性配糖体は、ウアバイン、ジゴキシン、またはジギトキシンである。最も好ましくは、強心性配糖体はウアバインであり、そしてアグリコン誘導体は、ストロファンチジンである。強心性配糖体およびアグリコンは、生物（例えば、植物）かまたはヒト血清または尿から精製され得る。（例えば、Merck Index．第10版；PCT出願WO 91/1717 6; 米国特許第4,780,314号；Kellyら、Kidney Int'l 30: 723-729，1986における参考文献を参照のこと）。化合物はまた、商業的に購入され得る（例えば、Si gma Chemical Co.，St．Louis，MO; Calbiochem，San Diego，CA）。リーダーレスタンパク質の輸送の阻害を検出するためのアッセイリーダーレスタンパク質の輸送の強心性配糖体インヒビターまたはアグリコン誘導体インヒビターを、本明細書中に記載のアッセイの１つによって同定する。簡単に述べれば、リーダーレスタンパク質を発現する細胞を強心性配糖体またはアグリコン誘導体で処理し、そして細胞外タンパク質として検出されるリーダーレスタンパク質の量を処理無しで検出される量と比較する。本発明の文脈内で、インヒビターは３つの基準を満たさなければならない：（１）リーダーレスタンパク質の輸送をブロックする、（２）リーダー配列を有する分泌タンパク質の輸送をブロックしない、（３）細胞外環境において、サイトゾルタンパク質の発現を促進しない。本明細書中に記載の任意のアッセイにおいて、試験細胞は、天然、またはタンパク質をコードする組換えDNA分子の導入後のいずれかでリーダーレスタンパク質を発現し得る。同様に、分泌タンパク質およびサイトゾルタンパク質の発現は、天然、またはタンパク質をコードするベクターのトランスフェクション後のいずれかであり得る。リーダーレスタンパク質の組換え発現が好ましい。上記の任意のリーダーレスタンパク質、キメラのリーダーレスタンパク質（すなわち、別のタンパク質またはタンパク質フラグメントとのリーダーレスタンパク質の融合物）、またはリーダー配列を欠くように操作されたタンパク質配列を使用し得る。リーダー配列によって輸送される分泌タンパク質は周知であり、そしてそれらには、ヒトコリオゴナドトロピン（HCGα）（配列番号３）、成長ホルモン、肝細胞増殖因子、トランスフェリン、神経成長因子、血管内皮成長因子、オボアルブミン、およびインスリン様増殖因子が含まれる。同様に、サイトゾルタンパク質は周知であり、そしてそれらには、ネオマイシン、β−ガラクトシダーゼ、アクチン、および他の細胞骨格タンパク質、酵素（例えば、タンパク質キナーゼＡまたはＣ）が含まれる。最も有用なサイトゾルタンパク質または分泌タンパク質は、便利なアッセイ（例えば、ELISA）で容易に測定されるタンパク質である。３つのタンパク質は、天然に同時発現するかもしくは試験細胞へのトランスフェクションによって同時発現され得るかまたは宿主細胞中に別々にトランスフェクトされ得る。タンパク質は、一時的に発現され得るかまたは安定な形質転換細胞から発現され得る。単に例示のために、FGF-2の18kDのイソ型を含む構築物を記載する。プラスミド18dxは、FGF-2の18kDのイソ型（これは、以前に記載のように（FlorkiewiczおよびSommer、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 3978，1989）、野生型ヒトFGF-2 cDNAに由来した）をコードする。FGF-2配列は、18kDのイソ型のATGコドンの11b p5'で先を切断された。従って、18kD形態のみが発現され得る。cDNAを含むフラグメントを、pJC119（SV-40に基づく発現ベクター）に挿入した。他の発現ベクターが相互交換可能に使用され得、そしてベクターの選択がトランスフェクトされるべき宿主細胞に一部依存することは明らかである。FGF-2 cDNAを、SV-40に基づく発現ベクターを用いてCOS細胞中で発現させた。ベクターであるpJC119（S pragueら、J．Virol．45: 773，1983）は、SV-40に基づくベクターであり、これは挿入した遺伝子の発現を制御するためにSV40後期プロモーターを使用する。CO S細胞を選択した。なぜなら、それらは、通常、非常に低レベルのFGF-2を発現し、そしてそれ自身このリーダーレスタンパク質の輸送についての適切な細胞機構を有するからである。上記の他のリーダーレスタンパク質が、FGF-2の代わりに構築物において使用され得る。これらのタンパク質をコードするDNA分子を、従来の方法（例えば、ライブラリースクリーニング、PCR増幅、およびクローニング）によって得ることが出来るか、またはヒトおよびマウスのDNAプローブのATCC/NIH保管所から得ることが出来る。一般に、これらのタンパク質のヌクレオチド配列は、Genbank およびEMBLデータベースまたは刊行物から入手可能である。他の細胞型、ベクター、プロモーター、および発現に使用された他のエレメントは、周知の原理に従って容易に置換され得ることが認識される。最少で、リーダーレスタンパク質を含むベクター構築物は、標的細胞中で活性なプロモーター配列を有さなければならない。必要に応じて、および好ましくは、構築物はエンハンサー、転写ターミネーター、および選択マーカーを含む。このようなベクターは、トランスフェクトされた細胞の種または組織の型に適切であるように選択される。起源において、細胞は、哺乳動物、鳥類、または他の真核細胞（酵母を含む）であり得る。本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞には、特に、COS（ATCC番号CRL 1 650）、BHK（ATCC番号CRL 6281）、CHO（ATCC番号CCL 61）、HeLa（ATCC番号CCL 2）、293（ATCC番号1573）、NS-1（ATCC番号T1B18）、およびHep G2（ATCC番号 HB 8065）が含まれる。広範な種々のプロモーターは、本発明の文脈中で使用され得る。プロモーターの選択は、トランスフェクションのためのレシピエント細胞株に少なくとも一部依存する。例示のために、上記のSV40プロモーターのようなプロモーター、MoMu LV LTR、RSV LTR、アデノウイルスプロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーターまたは後期プロモーターが使用され得る。標的細胞中で活性化される限り、組織特異的プロモーターもまた使用し得る。例えば、免疫グロブリンプロモーターを、Ｂリンパ球中で遺伝子を発現させるために使用し得る。好ましいプロモーターは、高レベルでリーダーレスタンパク質を発現する。リーダーレスタンパク質、分泌タンパク質、およびサイトゾルタンパク質を検出するためのアッセイには、パルスチェイス手順において標識したタンパク質の免疫沈降、ELISA、ビオチン化された細胞表面タンパク質のアビジン沈澱、ウェスタンブロット、生物学的アッセイ、およびファゴカイネティックトラクト(pha gokinetic tract)が含まれる。これら全てのアッセイにおいて、リーダーレスタンパク質を発現しそして輸送する試験細胞を、候補のインヒビターとともにおよびこれを伴わずにインキュベートする。免疫沈降は、阻害を測定するための好ましいアッセイである。簡単に述べれば、免疫沈降のために、導入したベクター構築物由来のリーダーレスタンパク質を発現する細胞を、メチオニンおよびシステインを含まない細胞培養培地中で、短期間（代表的には、１５分間）³⁵S-メチオニンまたは³⁵S-システインで標識する。リーダーレスタンパク質がヘパリン結合である場合、パルス標識の後、細胞を過剰の非標識メチオニンおよびシステイン＋ヘパリンを補充した培地で洗浄する。次いで、細胞を同一のチェイス培地中で種々の期間培養する。候補インヒビターを、種々の濃度で培養物に添加する。培養上清を回収し、そして明澄化する。上清を、抗FGF-2免疫血清またはモノクローナル抗体とともにインキュベートし、その後S 心分離でペレット化し、１％NP-40および0.5％デオキシコレート、EGTA、PMSF、アプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチンを含む緩衝液で洗浄する。次いで、沈殿物をリン酸ナトリウム（pH 7.2）、デオキシコレート、NP-40、およびSDSを含む緩衝液で洗浄する。免疫複合体を、SDSゲルサンプル緩衝液中に溶出し、そしてSDS-PAGEによって分離する。ゲルを、蛍光光度法のために処理し、乾燥し、そしてＸ線フィルムに曝露する。あるいは、ELISAを用いて、細胞上清中のFGF-2または他のリーダーレスタンパク質の量を検出し、そして定量する。簡単に述べれば、FGF-2が試験リーダーレスタンパク質である場合、96ウェルプレートを抗FGF-2抗体で被覆し、洗浄し、そして上清をウェルに添加する。インキュベーションおよび洗浄後、FGF-2に二次抗体を添加する。さらなるインキュベーション後、発色試薬を添加し、そして ELISAプレートリーダーを用いてFGF-2の量を測定する。代表的には、発色試薬は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合した抗アイソタイプ抗体であり、これは比色定量反応を生じる基質と反応する。酵素に結合した二次抗体を使用するよりもむしろ、FGF-2抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼまたは他の等価な検出試薬に直接結合され得ることが認められる。必要であれば、細胞上清を、検出レベルを上げるために濃縮し得る。あるいは、濃縮した上清を、SDS-PAGEゲルで電気泳動し得、そして固体支持体（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）に移し得る。次いで、リーダーレスタンパク質を、アイソトープ性または非アイソトープ性レポーター基を含むリーダーレスタンパク質に対する抗体を用いて、イムノブロット（Harlow，Antibo dies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988）によって検出する。これらのレポーター基には、酵素、補因子、色素、ラジオアイソトープ、発光分子、蛍光分子、およびビオチンが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、レポーター基は、¹²⁵Iまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これは、2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸とのインキュベートにより検出され得る。本明細書中に議論したように、輸送されたリーダーレスタンパク質は、細胞膜に会合し得る。例えば、FGF-2を発現するベクターを用いて安定に形質転換されたCOS細胞はFGF-2を輸送するが、培養培地中にタンパク質を放出しない。細胞表面会合リーダーレスタンパク質を、細胞表面タンパク質を検出するために設計または適応された任意の方法（例えば、蛍光タグ化抗体染色法）または表面タンパク質のビオチン化後のアビジンまたはストレプトアビジン沈降によってアッセイし得る。簡単に述べれば、ビオチン化のために、細胞を、付加(adducting)させ得るビオチン（例えば、NHS-ss-ビオチン；Pierce Chemicals）とともに短時間暗所でインキュベートし、洗浄し、そして溶解する。次いで、溶解物をストレプトアビジンとともに一晩インキュベートする。ストレプトアビジン複合体を、遠心分離によって回収し得、そしてアクリルアミドゲルにおいて電気泳動する。細胞内タンパク質を、上清中に回収し得、そして本明細書中に記載のように処理し得る。ビオチンの代わりに、対応する抗体または結合分子を有する他の任意の反応性化合物を使用し得る。別のアッセイであるバイオアッセイを、細胞培地中に輸送されるリーダーレスタンパク質の量を定量するために行い得る。例えば、18kD FGF-2の生物活性を、増殖アッセイ（例えば、トリチウム化したチミジンの取り込み）によって測定し得る。簡単に述べれば、FGF-2を含む発現ベクターでトランスフェクトした細胞を、約30時間培養し、その間候補インヒビターを添加する。インキュベーション後、細胞を低血清培地に移し、さらに16時間インキュベートする。培地を回収し、そして遠心分離によって明澄化する。プロテアーゼインヒビターを含む溶解緩衝化し、そして1.0M NaClで非FGF-2タンパク質を溶出した後、3.0M NaClで溶出する。次いで、FGF-2の生物活性を、種々の量の溶出物を静止状態の培養した3T3細胞に添加することによって測定する。トリチウム化したチミジンを培地に添加し、そして約24時間後にTCA沈殿性のカウントを測定する。標準のために、精製した組換えヒトFGF-2を使用し得る。細胞運動性を生じるリーダーレスタンパク質（例えば、FGF-2）のために、ファゴカイネチックトラクトアッセイ（Phagokinetic tract assay）を用いて輸送されたリーダーレスタンパク質の量を測定し得る（Mignattiら、J．Cellular Ph ysiol．151：81-93，1992）。このアッセイにおいて、細胞を遊走させ、そして顕微鏡のカバーガラスをコロイド状の金で被覆する。暗視野照度下で、金の粒子が暗いバックグランド上に光度に屈折した粒子の均質の層として現れる。細胞が基質上で遊走する場合、細胞は金粒子を端へ押し、暗い痕跡を残す。画像分析装置を使用し、痕跡の長さを測定し得る。条件下で、細胞運動性は細胞によって産生されたFGF-2の量に直接的に相関する。バイオアッセイの選択は、少なくとも一部において、試験されるリーダーレスタンパク質に依存する。これらの任意のアッセイにおいて、インヒビターを用いずに行ったアッセイとの比較して、インヒビターを用いて行ったアッセイにおいて、細胞外で検出されたタンパク質の量において統計的に有意な減少が存在する場合、強心性配糖体またはアグリコン誘導体は輸送を阻害する。好ましくは、インヒビターは、リーダーレスタンパク質の輸送を少なくとも50％減少させ、よりいっそう好ましくは80 ％以上減少させ、そしてまた好ましくは、用量依存様式で減少させる。さらに、分泌タンパク質またはサイトゾルタンパク質のいずれかの出現に対する統計的に有意な効果が存在すべきでない。好ましくは、これら２つのタンパク質の出現における増加または減少は、10％より少ない。投与上記のように、リーダーレスタンパク質の輸送のインヒビターは、数ある用途の中で、腫瘍の処置、細胞（再狭窄を起こす平滑筋細胞を含む）増殖の阻害、および糖尿病の合併症の処置に有用である。処置とは、症状を軽減し得るか、または疾患もしくは病状の進行を停止するか遅延し得ることを意味する。処置すべき細胞を、強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体に治療的有効投与量で接触させる。接触は、エクスビボまたはインビボにおける細胞のインキュベートによって（例えば、局所的処置、特異的キャリアによる送達、または血管供給によって）、達成され得る。本明細書におけるコンジュゲートは、局所、局部、静脈内、および全身適用に適切な薬学的組成物中に処方され得る。時間放出処方物もまた所望される。１つ以上のコンジュゲートの有効な濃縮物を、適切な薬学的キャリアまたはビヒクルと混合する。有効であるコンジュゲートの濃度または量は、投与の際、症状を改善するかまたは疾患を処置する量の送達を必要とする。代表的には、組成物を、単回投薬投与のために処方する。治療的有効濃度および治療的有効量を、公知のインビトロおよびインビボ系（例えば、本明細書中に記載の系）においてコンジュゲートを試験することによって経験的に決定し得る；次いで、ヒトまたは他の動物のための投与量を、それらから推測し得る。本明細書中に記載の処置のための候補となる腫瘍には、FGFのレセプターを有する腫瘍が含まれる。このような腫瘍には、メラノーマ、奇形癌、卵巣癌、膀胱癌、および神経芽細胞腫が含まれる。他の疾患、障害、および症候群が処置に適切である。糖尿病の合併症（例えば、糖尿病性網膜症、再狭窄、多発性嚢胞腎疾患、およびアテローム性動脈硬化症）もまた、このような処置の候補である。糖尿病において冒される眼、腎臓、および末梢神経中の細胞を、本明細書中に記載のコンジュゲートで処置し得る。本明細書中で提供されるコンジュゲートの投与に適切な薬学的キャリアまたはビヒクルには、投与の特定の様式に適切であることが当業者に公知の任意のキャリアが含まれる。さらに、インヒビターを組成物中の唯一の薬学的有効成分として処方し得るか、または他の有効成分と組み合わせ得る。本発明の組成物を、種々の異なる経路による投与のために調製し得る。強心性配糖体またはアグリコン誘導体の局部投与が好ましい。インヒビターを、適切な賦形剤（例えば、塩、緩衝液、安定化剤など）と混合し得る。皮膚および粘膜へのような局所的に適用する場合、インヒビターは、ゲル、クリーム、およびローションの形態であり得る。特に、眼科的用途のために意図されたこのような溶液を、適切な塩を含む0.01％〜10％等張溶液（pH約５〜７）として処方し得る（例えば、米国特許第5,116,868号を参照のこと）。非経口、皮内、皮下、または局所適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の任意の成分が含まれ得る：滅菌希釈物（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））；緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびリン酸緩衝液）；および毒性の調整剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口調製物を、ガラス、プラスチック、または他の適切な材料のアンプル、使い捨てのシリンジ、または複数回投与のバイアルに封入し得る。静脈内に投与する場合、適切なキャリアには、生理学的生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、ならびに濃縮剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール）を含む溶液、およびその混合物が含まれる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして適切であり得る。これらは、当業者に公知の方法に従って調製され得る。インヒビターを、身体からの迅速な排出に対してインヒビターを保護するキャリア（例えば、時間放出処方物またはコーティング）とともに調製し得る。このようなキャリアには、制御放出処方物（例えば、移植物およびマイクロカプセル化送達系が含まれるがこれらに限定されない）、生分解性、生物適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）が含まれる。例えば、組成物を、スポンジ（例えば、市販の手術用スポンジ）を使用して、手術中に適用し得る（例えば、米国特許第3, 956,044号および同第4,045,238号を参照のこと）。インヒビターを、液体、半液体、または固体の形態で、適切な任意の経路（例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、または局所的）によって投与し得、そして投与の各経路に適切な様式で処方し得る。投与の好ましい様式は、処置される適応症に依存する。皮膚科および眼科指標適応症は、代表的には、局部的に処置される；一方、腫瘍および再狭窄は、代表的には、全身様式、皮内様式、または筋肉内様式の投与によって処置される。インヒビターは、所望でない副作用の非存在下で、治療的に有用な効果を働かせるのに十分な量で薬学的に受容可能なキャリア中に含まれる。副作用の数および程度はコンジュゲートが投与される病状に依存することが理解される。例えば、特定の毒性および所望でない副作用は、生命を脅かす疾患（例えば、腫瘍）を処置する場合許容され、結果のより軽い障害を処置する場合、許容されない。組成物中のコンジュゲートの濃度は、吸収、不活化およびその排出速度、投薬スケジュール、および投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。インヒビターを一度に投与し得るか、または多数のより少ない投与量に分割して時間の間隔をおいて投与され得る。正確な投与量および処置の継続時間は処置される疾患の関数であり、そして公知の試験プロトコルを用いるかまたはインビボもしくはインビトロ試験データからの推定によって経験的に決定され得ることが理解される。濃度および投薬値はまた、緩和すべき病状の重篤度に伴って変化し得ることを留意すべきである。任意の特定の被験体において、特定の投薬レジメが個々の必要性および組成物を投与するまたはその投与を監督する人間の専門の判断に従って経時的に調節すべきであり、そして本明細書中に記載の濃度範囲が単に例示であり、そして特許請求された組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されない。実施例１ FGF-2を発現するプラスミドの構築 FGF-2の18kDイソ型を含む発現ベクターを、以下のように構築する。ヒトFGF-2 の18kDイソ型の配列は、プラスミド18dx（FlorkiewiczおよびSommer、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 86:3978-3981，1989）によって提供される。このベクターは、18kDイソ型のみを発現する。なぜなら、18kD FGF-2イソ型の翻訳を開始するAT Gコドンの11bp 5'に位置するApaI部位の上流配列が欠失したからである。簡単に述べれば、プラスミドp18dxを、ApaIで線状化し、そしてXhoI部位を含むオリゴヌクレオチドアダプターを、プラスミドに連結する。FGF-2を含むXhoI制限フラグメントを精製し、そしてpJC119（Spragueら、前出）のXhoI部位にサブクローン化し、一過性トランスフェクションのためのプラスミドを生成する。細胞の安定な形質転換に適切なプラスミドもまた構築する。FGF2のコード領域を、プラスミドp18dxからXho I/Not Iフラグメントとして切り出し、そしてSV40 oriおよびβ-gal遺伝子の除去後のpCMVβ（Clontech，Palo，Alto，CA）中のCM V即時初期プロモーター/エンハンサーの3'末端におけるXho I/Not I部位に挿入する。このプラスミドを、pCMV18と呼ぶ。TKプロモーターの制御下におけるneo 遺伝子を、Xho I/Sal IフラグメントとしてpMCI Neo Poly Aプラスミド（Strata gene，San Diego，CA）から切り出し、そしてFGF2遺伝子に対して反対方向にpCM V18のSal I部位に挿入する。このプラスミドを、pCMV18 Neoと呼ぶ。 hCG-αをコードする発現ベクター（Carolyn Machamer博士（Dept．of Cell Bi ology，Johns Hopkins Medical School）から提供された）は、Guanらに記載のベクター（J．Biol．Chem．263: 5306-5313，1988）と同一である。実施例２細胞培養、トランスフェクション、および代謝標識 COS-1細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC CRL 1650）から得、そして10％ウシ胎児血清、２mM L-グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、および100U/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で培養する。COS-1細胞を、１mlのトランスフェクション緩衝液（140mM NaCl、３mM KCl、１mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂、0.9mM Na₂HPO₄、25mM Tris（pH7.4））中の10 μgのCsCl精製プラスミドDNAを用いてトランスフェクトする。プラスミド18dxを、pMAMneo（Clontech，Palo Alto，CA）（これは、選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含む）とともに同時トランスフェクトする。２ μgのp18dxを10μgのpMAMneoとともに同時トランスフェクトする場合、免疫蛍光顕微鏡法によって決定されるように、トランスフェクトされた細胞の70％より多くがFGF-2およびneoの両方を発現する。 DNAトランスフェクションの40〜48時間後、COS-1細胞を、１mlのメチオニンおよびシステインを含まないDMEM中で100μCiの³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システイン（Trans ³⁵S-標識、ICN Biomedicals，Irvine，CA）を用いて15分間代謝的にパルス標識する。標識後、細胞の単層を、過剰の（10mM）非標識メチオニンおよびシステイン＋25μg/mlヘパリンを補充したDMEMで１度洗浄する。次いで、細胞を２mlのこの培地で示された時間培養する。示された培養については、チェイス培地に、示された濃度のウアバインを補充する。 COS細胞を、pCMV18 Neoで安定にトランスフェクトする。この手順において、精製したプラスミドDNAを、上記のような標準的なリン酸カルシウム法によってC OS細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの前日に、３×10⁵のCOS 細胞を60mmのディッシュにプレートする。リン酸カルシウム沈殿物としてプラスミドDNA（10μg）を添加し、そして細胞を８時間インキュベートし、次いで、洗浄しそして一晩培養する。次いで、細胞を100mmディッシュにつき５×10⁴細胞の密度でプレートし、そして700μgのgeneticin（G418; Sigma Chemical Co.，St ．Louis，MO）の存在下で、12日間培養する。個々のコロニーを、クローニングシリンダーを用いて回収し、そして48ウェル形式に移動する。実施例３免疫沈降およびウェスタンブロット分析細胞および馴化培地画分を、微量遠心分離機における15分間の遠心分離による明澄化後、培地画分に400μlの溶解緩衝液（１％NP-40、0.5％デオキシコレート、20mM Tris（pH 7.5）、５mM EDTA、２mM EGTA 0.01mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10ng/mlアプロチニン、10ng/mlロイペプチン、10ng/mlペプスタチン(peptstatin)）を添加した以外は本質的に以前に記載（Florkiewiczら、Gro wth Factors 4: 265-275，1991:Florkiewiczら，Ann．N.Y．Acad．Sci．638:109 -126）のように免疫沈降するために調製する。細胞または培地画分を、モルモット抗FGF-2免疫血清（1:200）とともに21℃で40分間インキュベートする。GammaB in さらに30分間インキュベートした。免疫複合体を、微量遠心分離機の遠心分離によってペレット化し、そして溶解緩衝液で３回洗浄し、そして氷冷免疫沈降洗浄緩衝液（0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム（pH 7.2）、１％デオキシコレート、１％NP-40、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）で４回洗浄した。免疫複合体を、SDSゲルサンプル緩衝液（125mM Tres（pH 6.8）、４％SDS、10％グリセロール、0.004％ブロモフェノールブルー、２mM EGTA）中に溶出し、そして12％SDS-PA GEで分離した。ゲルを蛍光間接撮影法のために処理し、乾燥し、そして-70℃でＸ線フィルムに曝露した。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを免疫沈降した場合、ウサギ抗NPT抗体（5Prime-3Prime，Boulder，CO）を使用した。ウェスタンブロット分析のために、冷緩衝液（25mM 3-[ジメチル（ヒドロキシメチル）メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（pH 9.5）、20％メタノールを含む）中で、0.4アンペアで90分間12％SDS-PAGEゲルからニトロセルロースメンブレン（ポアサイズ0.45μm）にタンパク質を移した。10mM Tris（pH 7 .5）、150mM NaCl、５mM NaN₃、0.35％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、および５％脱脂粉乳（Carnation Co.，Los Angeles，CA）中、室温で１時間メンブレンをブロッキングした。ブロッキング緩衝液中、４℃で16時間0.3 μg/mlのモノクローナル抗FGF-2抗体（Transduction Laboratories，Lexington ，KY）とともにメンブレンをインキュベートした。インキュベーション後、室温で、緩衝液（150mM NaCl、500mMリン酸ナトリウム（pH 7.4）、５mM NaN₃、および0.05％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含む）を10回交換してメンブランを洗浄した。次いで、メンブレンを、１μg/mlウサギ抗マウスIgG（H +L，affinipure，Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA）を含むブロッキング緩衝液中で、室温で30分間インキュベートした。続いて、メンブレンを1Lの上記緩衝液で洗浄し、そして15μCi ¹²⁵I-プロテイン A（ICN Bioc hemicals，Costa Mesa，CA）を含む100mlのブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートし、そして１lの緩衝液で洗浄した。ラジオシグナルを、オートラジオグラフィーによって視覚化した。実施例４ FGF-2バイオアッセイ FGF-2の生物活性を、チミジン取り込みアッセイにおいて測定し得る。上記のようにFGF-2でトランスフェクトした細胞を、30時間インキュベートする。この時、培養培地を0.5％FBSを含む６mlのDMEM（低血清培地）で16時間置換する。培地を取り出し、４℃で15分間、微量遠心分離機における遠心分離によって明澄化合物を４℃で２時間振盪させながらインキュベートする。Sepharoseをペレット化し、そして溶解緩衝液で３回洗浄し、その後HS洗浄緩衝液（20mM Tris（pH 7. 4）、５mM EDTA、２mM EGTA＋プロテアーゼインヒビター、0.5M NaCl）で３回洗浄し、そして１M NaClを含むHS洗浄緩衝液で３回洗浄した。Sepharoseに結合したままのタンパク質を、３M NaClを含むHS洗浄緩衝液中に溶出した。 DNA合成の刺激を、以前に記載された（witteら、J．Cell Physiol．137: 86-9 4，1988; FlorkiewiczおよびSommer Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 3978-398 1，1989）ように、静止状態のSwiss 3T3細胞（クローンNR-6）において測定した。簡単に述べれば、細胞を低密度でプレートし、そして0.1％FBSを含む１mlの培地中で72時間培養することによって増殖を停止させた。種々の量の３M NaCl HS 溶出物を培養培地に直接添加し、そしてTCA沈澱性のカウント中への[³H]-チミジン取り込みのレベルを、20〜24時間後に測定した。コントロールとして、1pg〜1 ngの組換えヒトFGF-2を同様の様式で細胞に添加した。実施例５ FGF-2のブレフェルジン耐性輸送 BrefeldinＡは、ERおよびGolgiからのタンパク質の分泌を阻害する。それに対して、リーダーレスタンパク質の輸送は、BrefeldinAを用いる処理によって阻害されない。 COS-1細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得、そして10％ウシ胎児血清（Gemini Bioproducts，Inc.）、２mM L-グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、100単位/mlペニシリン、および100単位/m lストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM，Universit y of California San Diego Core Facility）中で培養する。複数のFGF-2イソ型（24、23、22、および18kD）をコードする野生型（ヒト）cDNAを含むプラスミド SV-40に基づく発現ベクターは、以前に記載されている（FlorkiewiczおよびSomm er、前出）。60mm組織培養ディッシュ中の約３×10⁵個のCOS-1細胞を、1.0mlのトランスフェクション緩衝液（140mM NaCl、３mM KCl、１mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂ 、0.9mM Na₂HPO₄、25mM Tris（pH 7.4））と混合した10μgのCsCl精製プラスミドDNAを用いてトランスフェクトする。２μgのp18dx+10μg pMAMneoを用いたこれらの同時トランスフェクション条件下で、免疫蛍光顕微鏡法により決定されるように、トランスフェクションされた細胞の70％より多くが、両方のタンパク質を発現する。プラスミドDNAの比を、結果において大きな変化を伴うことなく変化し得る。DNAトランスフェクションの40〜48時間後、COS-1細胞を、1.0mlのメチオニンおよびシステインを含まないDMEM中で、100μCiの³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システイン（Trans³⁵S-label，ICN Biomedicals，Inc.）を用いて15分間代謝的にパルス標識する。パルス標識後、細胞単層を、過剰の（10mM）非標識化メチオニンおよびシステインを補充したDMEMで１回洗浄し、次いで、示された時間1.0mlの同一の培地（チェイス）中で培養する。BrefeldinＡで処理した培養物は、チェイス培地中に15μg/mlのBrefeldinＡを含む。チェイス培地にはまた、2 5μg/mlのヘパリンを補充する。ヘパリンはFGF-2輸送を定性的に検出するために必要ではないが、このアッセイにおいてFGF-2の輸送を定量的に検出するために必要である。 NaClを含まない400μlの溶解緩衝液（１％NP-40、0.5％デオキシコレート、20 mM Tris（pH 7.5）、５mM EDTA、２mM EGTA、0.01mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10ng/mlアプロチニン、10ng/mlロイペプチン、および10ng/mlペプスタチン）を、免疫血清を添加する前に４℃で15分間の微量遠心分離機の遠心分離によって明澄化した培地画分に添加すること以外は、細胞および培地の画分を、本質的に以前に記載のように（Florkiewiczら、1991）免疫沈降のために調製する。細胞および培地画分の両方を、モルモット抗FGF-2免疫血清の１:200希釈物（発明者らの研究室で調製した）とともに21℃で40分間インキュベートし、次い（Pharmacia LKB Biotechnology）を添加する。G-Sepharoseに結合した免疫複合体をペレット化し、溶解緩衝液で３回洗浄し、そして水冷の免疫沈降洗浄緩衝液（0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム（pH 7.2）、１％デオキシコレート、１％NP-40、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）で４回洗浄する。免疫複合体をSDSゲルサンプル緩衝液中に直接溶出し、そして12％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離する。ゲルを、蛍光間接撮影法のために処理し、乾燥し、そして-70℃でＸ線フィルムに曝露する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPT）を含む免疫沈降のために、ウサギ抗NPT抗体（5Prime-3Prime，Inc .，Boulder，CO）を使用した。図５に示されるように、18kD FGF-2の輸送は、BrefeldinＡ耐性であり、そしてエネルギー依存性である。サンプルＡは培地のみでチェイスし、サンプルＢは 25μg/ml BrefeldinＡを補充した培地でチェイスし、そしてサンプルＣは、50mM 2-デオキシ-D-グルコースおよびNaN₃を補充した培地でチェイスした。図５に示されるように、FGF-2を２時間までに培地に輸送される。BrefeldinＡは、この輸送に対して実質的な効果を有さなかった。しかし、代謝インヒビターであるNaN₃ が存在する場合、輸送は実質的に減少する。それに対して、hCG-αは、培地中に４時間までに分泌され、そしてBrefeldin感受性であり、そしてエネルギー依存性である。hCG-αは、疎水性リーダー（シグナル）配列を含み、結果としてERおよびGolgiを介して分泌される。実施例６一過性にトランスフェクトされた細胞におけるリーダーレスタンパク質の阻害 COS細胞を、上記のように、FGF2、hCG-α、またはネオマイシンを発現するプラスミドとともに同時トランスフェクトする。チェイス期間中、対数増加においてインヒビターを10nM〜１mMで添加する以外は、代謝的標識化を上記のように行う。チェイスの終わりに、細胞および細胞培地を回収し、そして上記のように免疫沈降のために処理する。ウアバインおよびジゴキシンは、FGF-2の輸送を阻害したが、ヒトコリオゴナドトロピンαの輸送を阻害しない。ウアバインは、約0.1μMで50％の輸送を阻害し、そしてジゴキシン（digoin）は、約５μMで阻害した。ウアバインを用いるさらなる実験により、阻害が時間依存性であり（図２）、hCG-αの分泌に影響を与えず（図３）、そして用量依存性様式においてFGF-2の輸送を阻害する（図４）ことが示される。以下の表に示されるように、トランスフェクトされたCOS細胞由来のFGF-2の輸送に対する30の異なる強心性配糖体およびアグリコン誘導体の効果を決定する。 COS細胞を、FGF-2を発現する構築物を用いてトランスフェクトする。トランスフエクションの40〜48時間後、細胞を0.1M炭酸ナトリウム（pH 11.4）で１〜２分間１回洗浄し、そして吸引する。25μg/mlヘパリンを含む0.5％FBSを含有する培地で細胞を洗浄する。化合物を約24時間添加する。上清を回収し、そして明澄化する。FGF2の量をELISAアッセイによって決定し、そして化合物で処理していない細胞に対して処理した細胞によって輸送されたFGF2のレベルを比較することによって阻害％を決定する。本質的に全ての試験した化合物は、50μMの濃度で輸送を実質的に阻害する。実施例７安定な形質転換細胞中でのリーダーレスタンパク質の阻害 COS細胞を、pCMV18 Neo（FGF-2を発現するプラスミド）を用いて上記のように安定に形質転換し、そして輸送されたタンパク質をアッセイする。輸送されたFG F-2のほとんど（全てではないとしても）が細胞膜に会合しているので、ビオチン化の後、ストレプトアビジンを用いる沈降によってFGF2を単離する。この方法において、プレーティングの１日後、COS細胞をダルベッコPBSで１回洗浄し、細胞表面タンパク質を除去するために２mlの炭酸緩衝液（pH 11.4）で90秒間インキュベートし、続いてPBSで洗浄し、そして10μMウアバインの存在下または非存在下で0.5％FBSを含むDEME中で48時間インキュベートする。ビオチン化のために、細胞のディッシュを氷上に置き、そして１mM MgCl₂および0.1mM CaCl₂を含むP BS（PBS Ca/Mg）で２回洗浄する。NHS-ss-ビオチン（Pierce Chemicals）（150m M NaCl、10mMトリエタノールアミン（pH 9.0）、および２mM CaCl₂中1.5mg/ml）を、４℃で30分間暗所で細胞に添加する。次いで、細胞を100mMグリシンを含むP BS Ca/Mg中で１回洗浄し、そして同一の緩衝液で20分間インキュベートする。次いで、細胞を溶解し、明澄化し、そしてストレプトアビジンとともに16時間インキュベートする。ストレプトアビジン複合体を、遠心分離によって細胞内タンパク質から分離する。いくつかの適用のために、細胞内タンパク質を含む上清を、ヘパリン-セファロースクロマトグラフィーによってさらに富化する。ストレプトアビジン複合体を、溶解緩衝液中で３回洗浄し、そしてストレプトアビジン結合ビオチン化タンパク質を、SDSゲルサンプル緩衝液中で直接溶出する。ゲル中のタンパク質を、ニトロセルロースに移す。FGF-2タンパク質を、上記のようにウェスタンブロットアッセイで検出する。全部で39クローンを、首尾良く細胞株に拡大する。トランスフェクトされていないCOS細胞と比較して、ほとんど全てのこれらのクローンがFGF-2を過剰発現した。しかし、馴化培地において、非常に低い量のFGF-2のみが検出される。クローンが一過性にp18dxでトランスフェクトされる場合、FGF-2は、55±４ng/mlの濃度で馴化培地中で検出される。このような輸送は、ウアバインに感受性である。安定な形質転換体を上記のように、ビオチン化し、そして処理する場合、FGF- 2は、細胞表面上で検出される（図６）。図６に示すように、約30％のFGF-2がCF 18細胞の表面上で見出され、これは、例示的なクローンである。さらに、この輸送はウアバイン感受性である。CF18細胞の表面上のFGF-2を炭酸洗浄によって除去する。48時間後、上記のように、細胞をビオチン化し、そして処理する。図7A および図7Bに示すように、細胞表面／細胞内のFGF-2の比は、コントロールより4 0％増加する（p＜0.002）。さらに、10μMウアバインの存在は、ウアバインなしと比較して、細胞表面へのFGF-2の輸送を完全に妨げる(p<0.002)。実施例８軟骨細胞におけるFGF-2の阻害正常な軟骨細胞を、サブコンフルエントまで培養物中で増殖させる。10^-7〜10^-10 Mのウアバイン用量を、上記のように培養物に添加する。図８に示すように、 FGF-2輸送は、（ウアバインを添加していないコントロールと比較して）10^-10M 濃度で50％阻害される。実施例９ IL-1輸送のウアバイン感受性 IL-1α遺伝子を含むベクターを、COS細胞にトランスフェクトする。細胞を代謝的に標識し、そしてタンパク質を抗IL-1α抗体を用いて沈降させる。図9A、9B 、10、12、および14に示すように、IL-1αは、培地画分（Ｍ）中に輸送される。この輸送は、５mMウアバインとともにインキュベーションすることにより阻害される（図I1、13、および14）。FGF-2の輸送とは対照的に、IL-1輸送の速度はより遅く、24時間より大きいＴ_1/2を有する。しかし、FGF-2のように、輸送はウアバイン感受性である。さらに、IL-1αを、抗α1サブユニット抗体を用いて、同時トランスフェクトしたCOS細胞（IL-1αおよびNa/K ATPaseのα1サブユニットでトランスフェクトした）から免疫沈降し得る。上記から、本発明の特定の実施態様が本明細書中において例示の目的で記載されてきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが認識される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によるもの以外で制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質を発現する細胞由来のリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する方法であって、該細胞を強心性配糖体に接触させる工程を包含する、方法。２．前記強心性配糖体が、ジゴキシン、ストロファンチンＫ、ジギトキシン、ラナトシドＡ、ウアバイン、ジギトキソース、ギトキシン、オレアンドリン、およびアコベノシドＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。３．前記強心性配糖体がウアバインである、請求項１に記載の方法。４．前記強心性配糖体がジゴキシンである、請求項１に記載の方法。５．タンパク質を発現する細胞由来のリーダーレスタンパク質の輸送を阻害する方法であって、該細胞を強心性配糖体のアグリコン誘導体に接触させる工程を包含する、方法。６．前記アグリコン誘導体が、ストロファンチジン、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、およびウザリゲニンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。７．前記アグリコン誘導体がジゴキシゲニンである、請求項５に記載の方法。８．前記リーダーレスタンパク質が、FGF-1、FGF-2、IL-1α、IL-1β、PD-ECGF 、CNTF、チモシン、パラチモシンおよび第XIIIa因子、精管タンパク質、坐骨神経成長促進活性、トランスグルタミナーゼ、L-14レクチン、チオレドキシン様タンパク質、HIV tat、およびint-2からなる群より選択される、請求項１または５のいずれかに記載の方法。９．前記リーダーレスタンパク質がFGF-2である、請求項１または５のいずれかに記載の方法。１０．前記リーダーレスタンパク質がIL-1である、請求項１または５のいずれかに記載の方法。１１．前記リーダーレスタンパク質がHIV tatである、請求項１または５のいずれかに記載の方法。１２．FGF-2を発現する細胞由来のFGF-2の輸送を阻害する方法であって、該細胞を強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体に接触させる工程を包含する、方法。１３．患者におけるFGF媒介性病態生理学的状態を処置するために用いる組成物であって、該組成物は治療的有効量の強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体を含み、ここで、該組成物を患者に投与したとき輸送されるFGF-2の量が減少される、組成物。１４．FGFレセプターを有する細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体に接触させる工程を包含する、方法。１５．糖尿病の合併症を処置するために用いる組成物であって、該組成物は治療的有効量の強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体を含み、ここで、該強心性配糖体または強心性配糖体のアグリコン誘導体は、FGFまたは他のリーダーレスタンパク質を輸送する細胞に接触させられるように処方されている、組成物。１６．前記強心性配糖体が、ジゴキシン、ストロファンチンＫ、ジギトキシン、ラナトシドＡ、ウアバイン、ジギトキソース、ギトキシン、オレアンドリン、およびアコベノシドＡからなる群より選択される、請求項１２または１４に記載の方法または請求項１３または１５に記載の組成物。１７．前記強心性配糖体がウアバインである、請求項１２または１４に記載の方法または請求項１３または１５に記載の組成物。１８．前記強心性配糖体がジゴキシンである、請求項１２または１４に記載の方法または請求項１３または１５に記載の組成物。１９．前記アグリコン誘導体が、ストロファンチジン、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、およびウザリゲニンからなる群より選択される、請求項１２または１４に記載の方法または請求項１３または１５に記載の組成物。２０．前記アグリコン誘導体がジゴキシゲニンである、請求項１２または１４に記載の方法または請求項１３または１５に記載の組成物。２１．前記病態生理学的状態が、メラノーマ、卵巣癌、奇形癌、および神経芽細胞腫からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。２２．細胞を以下からなる群より選択される化合物で処置する工程を包含する、リーダーレスタンパク質の輸送を阻害する、方法：式Ｉ：ここで、R=（ジギトキソース） ₃ -D-グルコース＋アセチル、（ジギトキソース） ₃ -D-グルコース、（ジギトキソース） ₃ ＋アセチル、または（ジギトキソース） ₃ ；式II：ここで、R=（ジギトキソース） ₃ -D-グルコース＋アセチル、（ジギトキソース） ₃ -D-グルコース、または（ジギトキソース） ₃ ；式III：ここで、R=シマロース-β-Dグルコース-α-Dグルコース、またはシマロース-β- D-グルコース；式IV：ここで、R=L-ラムノース；および式V：ここで、R=L-ラムノース、またはL-ラムノース-D-グルコース。