JPH11276179A - ウナギ種鑑定用核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種鑑定方法 - Google Patents
ウナギ種鑑定用核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種鑑定方法Info
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- JPH11276179A JPH11276179A JP10102209A JP10220998A JPH11276179A JP H11276179 A JPH11276179 A JP H11276179A JP 10102209 A JP10102209 A JP 10102209A JP 10220998 A JP10220998 A JP 10220998A JP H11276179 A JPH11276179 A JP H11276179A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 外見上区別がつかないシラスの段階において
もウナギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定
手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１又は４に示される塩
基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、
連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、Ｔは
Ｕであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の
塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を
有する核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマーを提供
した。
もウナギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定
手段を提供すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１又は４に示される塩
基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、
連続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、Ｔは
Ｕであってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の
塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を
有する核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマーを提供
した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウナギの種を鑑定
するために用いられる核酸プライマー及びそれを用いた
ウナギ種の鑑定方法に関する。
するために用いられる核酸プライマー及びそれを用いた
ウナギ種の鑑定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】日本産のウナギは、学名がAnguilla jap
onica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高
く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フラ
ンス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のある
A. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. aus
tralis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピ
ン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等があ
る。
onica であり、我が国の消費者の間では最も人気が高
く、価格も高い。一方、外国産のウナギとしては、フラ
ンス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のある
A. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. aus
tralis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピ
ン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等があ
る。
【０００３】養鰻業は、ウナギの稚魚（シラス）を養殖
することにより行われている。シラスは市販のものを購
入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販
売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入し
ている場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産
ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖し
ても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日
本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少
なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。
しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外
見上、区別がつかない。
することにより行われている。シラスは市販のものを購
入する場合が多い。日本産のウナギのシラスと称して販
売されているものの中に外国産ウナギのシラスが混入し
ている場合がある。日本産ウナギのシラスの中に外国産
ウナギのシラスが混入していると、経費をかけて養殖し
ても、外国産ウナギは成長が著しく悪いので、全てが日
本産ウナギの場合に比べ、同じ経費をかけても売上は少
なくなってしまい、養鰻業者が被害を被ることになる。
しかしながら、ウナギのシラスは、日本産も外国産も外
見上、区別がつかない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、外見上区別がつかないシラスの段階においてもウナ
ギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定手段を
提供することである。
は、外見上区別がつかないシラスの段階においてもウナ
ギの種を鑑定することができる、ウナギ種の鑑定手段を
提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、遺伝子増幅法を利用して、ウナギのミトコン
ドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定領域を増幅し、増幅
された断片を調べることによりウナギの種を鑑定するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
究の結果、遺伝子増幅法を利用して、ウナギのミトコン
ドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定領域を増幅し、増幅
された断片を調べることによりウナギの種を鑑定するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成る、第１の核酸プライ
マーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成る、第２の核酸プライ
マーを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１
の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマ
ーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅
法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを調べるこ
とによりウナギ種を鑑定することから成るウナギ種の鑑
定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第
１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライ
マーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増
幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡをＨｉｎ
ｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断片長を調べる
ことによりウナギがAnguilla japonica か否かを鑑定す
る方法を提供する。
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成る、第１の核酸プライ
マーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成る、第２の核酸プライ
マーを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第１
の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライマ
ーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増幅
法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを調べるこ
とによりウナギ種を鑑定することから成るウナギ種の鑑
定方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の第
１の核酸プライマーと、上記本発明の第２の核酸プライ
マーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用いる遺伝子増
幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡをＨｉｎ
ｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断片長を調べる
ことによりウナギがAnguilla japonica か否かを鑑定す
る方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の方法では、ウナギのミト
コンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定の領域を遺伝子
増幅法により増幅する。この増幅には、第１の核酸プラ
イマーと第２の核酸プライマーが用いられる。
コンドリアのチトクロムｂ遺伝子の特定の領域を遺伝子
増幅法により増幅する。この増幅には、第１の核酸プラ
イマーと第２の核酸プライマーが用いられる。
【０００８】第１の核酸プライマーは、配列表の配列番
号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよ
い。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程
度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号１に
示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同
じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳
型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することが
できる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換
したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素
部位を導入することも可能である。
号１、好ましくは配列番号２に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよ
い。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程
度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号１に
示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同
じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳
型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することが
できる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換
したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素
部位を導入することも可能である。
【０００９】第２の核酸プライマーは、配列表の配列番
号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよ
い。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程
度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号４に
示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同
じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳
型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することが
できる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換
したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素
部位を導入することも可能である。例えば、下記実施例
で具体的に記載される第２の核酸プライマーであるＴＷ
１１は、５' 末端から２７番目のアデニンを意図的にシ
トシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を導入してい
る。
号４、好ましくは配列番号５に示される塩基配列若しく
は該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５
塩基以上から成る塩基配列又は該配列のうち１０％以下
の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基
配列を有する核酸から成る。なお、核酸はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、従って、配列中のＴはＵであってもよ
い。核酸プライマーのサイズは、１５塩基〜５０塩基程
度が好ましい。核酸プライマーの配列は、配列番号４に
示される配列を有する核酸又はその相補鎖のいずれと同
じ配列であってもよい。また、１０％以下の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加された配列であっても、鋳
型核酸とハイブリダイズ可能であるので使用することが
できる。このことを利用して意図的に特定の塩基を置換
したものを用いることにより、意図的に特定の制限酵素
部位を導入することも可能である。例えば、下記実施例
で具体的に記載される第２の核酸プライマーであるＴＷ
１１は、５' 末端から２７番目のアデニンを意図的にシ
トシンに置換することによりＰｓｔＩ部位を導入してい
る。
【００１０】なお、第１の核酸プライマー及び第２の核
酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマ
ー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要があ
る。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示
される配列と同一又は相同な配列を有するプライマーを
用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号
４に示される塩基配列と同一又は相同な配列を有する核
酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配
列番号１に示される配列と同一又は相同な配列を有する
核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとし
ては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列を
有するプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸
鎖とその相補鎖は、バックボーンの５' →３' 方向が逆
になっており、一方、明細書における塩基配列は５' 側
を左側（上流側）に記載するように決められているか
ら、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する
場合、元の核酸鎖の下流側（３' 側）と相補的な領域が
上流側（５' 側）に記載される。
酸プライマーのいずれか一方をフォワード側プライマ
ー、他方をリバース側プライマーとして用いる必要があ
る。従って、第１のプライマーとして、配列番号１に示
される配列と同一又は相同な配列を有するプライマーを
用いる場合には、第２のプライマーとしては、配列番号
４に示される塩基配列と同一又は相同な配列を有する核
酸の相補鎖を用いる。逆に、第１のプライマーとして配
列番号１に示される配列と同一又は相同な配列を有する
核酸の相補鎖を用いる場合には、第２のプライマーとし
ては配列番号４に示される配列と同一又は相同な配列を
有するプライマーを用いる。なお、周知のように、核酸
鎖とその相補鎖は、バックボーンの５' →３' 方向が逆
になっており、一方、明細書における塩基配列は５' 側
を左側（上流側）に記載するように決められているか
ら、ある核酸鎖の相補鎖の塩基配列を明細書に記載する
場合、元の核酸鎖の下流側（３' 側）と相補的な領域が
上流側（５' 側）に記載される。
【００１１】本発明のウナギ種の鑑定方法では、上記第
１及び第２のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型Ｄ
ＮＡとして用いて遺伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの
一領域を増幅する。増幅される領域は、ウナギのミトコ
ンドリアのチトクロムｂ遺伝子内の領域である。本発明
の方法により増幅可能な、Anguilla japonica のミトコ
ンドリアのチトクロムｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番
号７に示す。また、各種ウナギの当該領域の塩基配列
と、制限酵素部位を図１及び図２に示す。なお、図１及
び図２中、A. japonica 以外のウナギの配列は、A. jap
onica と異なる部位のみ記載してある。また、制限酵素
の切断部位が矢印で示されていないものは、japonica以
外の種において制限酵素部位が存在するものである。図
２は図１の続きである。
１及び第２のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型Ｄ
ＮＡとして用いて遺伝子増幅法により、ウナギＤＮＡの
一領域を増幅する。増幅される領域は、ウナギのミトコ
ンドリアのチトクロムｂ遺伝子内の領域である。本発明
の方法により増幅可能な、Anguilla japonica のミトコ
ンドリアのチトクロムｂ遺伝子領域の塩基配列を配列番
号７に示す。また、各種ウナギの当該領域の塩基配列
と、制限酵素部位を図１及び図２に示す。なお、図１及
び図２中、A. japonica 以外のウナギの配列は、A. jap
onica と異なる部位のみ記載してある。また、制限酵素
の切断部位が矢印で示されていないものは、japonica以
外の種において制限酵素部位が存在するものである。図
２は図１の続きである。
【００１２】配列番号１に示される配列は、図１に示さ
れる第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）
〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により
塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したもの
である。また、配列番号４に示される配列は、図２に示
される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であ
り、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般
式として示したものである。第１及び第２のプライマー
を用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによっ
て挟まれた領域が増幅される。
れる第１番目の塩基（以下、「１ｎｔ」のように表示）
〜１４２ｎｔの領域の塩基配列であり、ウナギ種により
塩基が異なる部位を一般化して一般式として示したもの
である。また、配列番号４に示される配列は、図２に示
される２７９ｎｔ〜４１０ｎｔの領域の塩基配列であ
り、ウナギ種により塩基が異なる部位を一般化して一般
式として示したものである。第１及び第２のプライマー
を用いて遺伝子増幅を行うと、両方のプライマーによっ
て挟まれた領域が増幅される。
【００１３】ウナギのシラスから、遺伝子増幅法の鋳型
として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定
されず、公知のいずれの方法をも採用することができ
る。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げること
ができる。第１法では、先ず、シラスを液体窒素で凍結
し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase K
で例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常
法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈
殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。
第２法では、シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又
は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファ
ー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消
化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、
１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０
分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として
遺伝子増幅法に供する。なお、試料はシラスに限定され
るものではなく、成鰻や蒲焼き等、どのような成育段階
のものや加工された食品であっても構わない。
として用いるＤＮＡを調製する方法としては、特に限定
されず、公知のいずれの方法をも採用することができ
る。好ましい方法として次の２通りの方法を挙げること
ができる。第１法では、先ず、シラスを液体窒素で凍結
し、すりつぶし、ＳＤＳ含有バッファー中Proteinase K
で例えば５６℃で一夜消化する。得られた消化物を、常
法に従いフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈
殿したものをＤＮＡ試料として遺伝子増幅法に供する。
第２法では、シラスを１〜２ｃｍに細かく切断するか又
は液体窒素で凍結してすりつぶし、ＳＤＳ含有バッファ
ー中Proteinase Kで例えば５６℃で１５分間〜２時間消
化する。得られた消化物を遠心分離（例えば1000 rpm、
１０分間）し、上清の一部を取り、例えば９８℃で１０
分間加熱して酵素を失活させたものをＤＮＡ試料として
遺伝子増幅法に供する。なお、試料はシラスに限定され
るものではなく、成鰻や蒲焼き等、どのような成育段階
のものや加工された食品であっても構わない。
【００１４】遺伝子増幅法自体は、いくつかの方法がこ
の分野において周知であり、それらのいずれをも用いる
ことが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定
されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び
装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅
法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例に
も、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
の分野において周知であり、それらのいずれをも用いる
ことが可能である。代表的な方法としてポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を挙げることができるが、これに限定
されるものではない。遺伝子増幅法用の試薬キット及び
装置は市販されているので、それらを用いて遺伝子増幅
法自体は容易に行うことができる。なお、下記実施例に
も、ＰＣＲによる増幅の例が具体的に記載されている。
【００１５】次いで、増幅されたＤＮＡを分析すること
により、ウナギ種を鑑定する。図１及び図２に示すよう
に、ウナギの種類により、増幅領域の塩基配列が異なっ
ている。従って、例えば増幅領域の全塩基配列を決定す
ることにより、ウナギ種を容易に同定することができ
る。あるいは、増幅領域中には制限酵素部位が含まれる
ので、いわゆる制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法によ
り種の鑑定を行うことも可能である。さらに、日本産ウ
ナギと外国産ウナギの区別を行うことも重要な鑑定業務
であるが、例えば、１５６ｎｔや３７８ｎｔのようにja
ponicaのみが他の外国産の種と異なる塩基を有している
部位が存在するので、このような部位の塩基が何である
かを調べることによって日本産ウナギと外国産ウナギの
識別が可能になる。これは、ミスマッチプローブ又はミ
スマッチプライマーを用いた公知の点突然変異検出法に
より行うことができる。
により、ウナギ種を鑑定する。図１及び図２に示すよう
に、ウナギの種類により、増幅領域の塩基配列が異なっ
ている。従って、例えば増幅領域の全塩基配列を決定す
ることにより、ウナギ種を容易に同定することができ
る。あるいは、増幅領域中には制限酵素部位が含まれる
ので、いわゆる制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法によ
り種の鑑定を行うことも可能である。さらに、日本産ウ
ナギと外国産ウナギの区別を行うことも重要な鑑定業務
であるが、例えば、１５６ｎｔや３７８ｎｔのようにja
ponicaのみが他の外国産の種と異なる塩基を有している
部位が存在するので、このような部位の塩基が何である
かを調べることによって日本産ウナギと外国産ウナギの
識別が可能になる。これは、ミスマッチプローブ又はミ
スマッチプライマーを用いた公知の点突然変異検出法に
より行うことができる。
【００１６】上記のうち、ＲＦＬＰ法は、簡便、迅速
で、かつ、日本産と外国産の識別にも種の同定にも用い
ることができるので、好ましい方法である。以下、ＲＦ
ＬＰ法についてさらに説明する。
で、かつ、日本産と外国産の識別にも種の同定にも用い
ることができるので、好ましい方法である。以下、ＲＦ
ＬＰ法についてさらに説明する。
【００１７】図１及び図２に示されるように、増幅領域
には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩの制限酵素部
位が含まれるので、これらの制限酵素を用いてＲＦＬＰ
を行うことにより種の鑑定を行うことができる。また、
下記実施例で用いられるプライマーＴＷ１１は、japoni
caの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるように、上記の通
り人為的に塩基を置換している。これらのうち、Ｈｉｎ
ｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔＩは、japonica
の切断部位のみが外国産ウナギの切断部位と異なってい
るので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれか一方を用いる
ことにより、日本産と外国産との識別が可能である。ま
た、(1) ＨｉｎｆＩと、(2) ＭｂｏIIとＲｓａＩとをそ
れぞれ別個に用い、それぞれにおいて得られる消化断片
の大きさから種を同定することも可能である。例えば、
下記実施例において用いられる、配列番号３で示される
塩基配列を有する第１プライマー（ＴＷ６、配列番号７
の１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイズ）と、配列番号６
で示される第２プライマー（ＴＷ１１、配列番号７の３
７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハイブリダイズ）とを
用いて増幅を行った場合には、下記表１に示されるサイ
ズの断片を指標として種の同定を行うことができる。
には、ＨｉｎｆＩ、ＭｂｏII及びＲｓａＩの制限酵素部
位が含まれるので、これらの制限酵素を用いてＲＦＬＰ
を行うことにより種の鑑定を行うことができる。また、
下記実施例で用いられるプライマーＴＷ１１は、japoni
caの場合にのみＰｓｔＩ部位が生じるように、上記の通
り人為的に塩基を置換している。これらのうち、Ｈｉｎ
ｆＩ及びＴＷ１１を用いた場合のＰｓｔＩは、japonica
の切断部位のみが外国産ウナギの切断部位と異なってい
るので、ＨｉｎｆＩとＰｓｔＩのいずれか一方を用いる
ことにより、日本産と外国産との識別が可能である。ま
た、(1) ＨｉｎｆＩと、(2) ＭｂｏIIとＲｓａＩとをそ
れぞれ別個に用い、それぞれにおいて得られる消化断片
の大きさから種を同定することも可能である。例えば、
下記実施例において用いられる、配列番号３で示される
塩基配列を有する第１プライマー（ＴＷ６、配列番号７
の１ｎｔ〜３２ｎｔとハイブリダイズ）と、配列番号６
で示される第２プライマー（ＴＷ１１、配列番号７の３
７９ｎｔ〜４０８ｎｔの相補鎖とハイブリダイズ）とを
用いて増幅を行った場合には、下記表１に示されるサイ
ズの断片を指標として種の同定を行うことができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】表１からわかるように、ＨｉｎｆＩで消化
した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるの
は日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを
鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いる
ことができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎ
ｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用
いて調べ、外国産であることが判明した試料についての
みＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定す
ることもできる。
した場合に２２０ｂｐ及び１１８ｂｐの断片が現れるの
は日本産（japonica）のみであるから、日本産か否かを
鑑定するだけが目的であれば、ＨｉｎｆＩのみを用いる
ことができる。あるいは、先ず、日本産か否かをＨｉｎ
ｆＩのみ、又はＨｉｎｆＩと確認のためにＰｓｔＩを用
いて調べ、外国産であることが判明した試料についての
みＭｂｏIIとＲｓａＩを用いて消化を行い、種を同定す
ることもできる。
【００２０】なお、ＲＦＬＰ法自体はこの分野において
周知であり、例えば消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫
外線を照射して泳動バンドの位置を調べることにより、
消化断片のサイズを調べることができる。また、ゲル電
気泳動により消化産物のサイズを測定する場合、通常分
子量マーカーが用いられるが、本発明の方法では、予想
される泳動パターンが数種類しかないため、種のわかっ
ているウナギのＤＮＡを上記のように増幅し、消化した
ものを分子量マーカーに代えて対照として用いることも
できる。
周知であり、例えば消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫
外線を照射して泳動バンドの位置を調べることにより、
消化断片のサイズを調べることができる。また、ゲル電
気泳動により消化産物のサイズを測定する場合、通常分
子量マーカーが用いられるが、本発明の方法では、予想
される泳動パターンが数種類しかないため、種のわかっ
ているウナギのＤＮＡを上記のように増幅し、消化した
ものを分子量マーカーに代えて対照として用いることも
できる。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２２】実施例１ １．ＤＮＡ試料の調製 各種ウナギのシラスを液体窒素で凍結後、別個に乳鉢を
用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投
入した。洗浄用バッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5
ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M NaCl 1.0 ml、蒸留水45.5
ml を混合して調製）０．５ｍｌを加え、すりつぶし、
５分間遠心分離した。上澄み液をデカンテーションで捨
て、ＳＴＥバッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、
0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M NaCl 1.0 ml、10% SDS
0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合して調製）０．５ｍｌと
Proteinase K溶液（10 mg/ml) ４０μｌを加え、５６℃
で３０分間消化した。消化物をボルテックスミキサーで
撹拌後、５分間遠心分離し、１００μｌの上清を取り、
９８℃、１０分間加熱処理して酵素を失活させた。この
うち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
用いて細かくすりつぶし、エッペンドルフチューブに投
入した。洗浄用バッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5
ml、0.5M EDTA (pH8.0) 、5M NaCl 1.0 ml、蒸留水45.5
ml を混合して調製）０．５ｍｌを加え、すりつぶし、
５分間遠心分離した。上澄み液をデカンテーションで捨
て、ＳＴＥバッファー（1M Tris-HCl (pH8.0) 2.5 ml、
0.5M EDTA (pH8.0) 1.0 ml、5M NaCl 1.0 ml、10% SDS
0.5 ml、蒸留水45.0 ml を混合して調製）０．５ｍｌと
Proteinase K溶液（10 mg/ml) ４０μｌを加え、５６℃
で３０分間消化した。消化物をボルテックスミキサーで
撹拌後、５分間遠心分離し、１００μｌの上清を取り、
９８℃、１０分間加熱処理して酵素を失活させた。この
うち１μｌを取って、ＰＣＲに供した。
【００２３】２． ＰＣＲ 市販のＰＣＲキット及び装置を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライ
マーとしては、上記したＴＷ６及びＴＷ１１を用いた。
ＰＣＲ混合物の組成は次の通りであった。なお、プライ
マーとしては、上記したＴＷ６及びＴＷ１１を用いた。
【００２４】 蒸留水 14.8μｌ 10xGA バッファー（Mg2+ 1.5 mM) 2.0μｌ 2.5 mM dNTP 1.6μｌ 25μＭ 各プライマー 0.4μｌ Taq ポリメラーゼ（5U/ μｌ） 0.2μｌ ＤＮＡ 1.0μｌ
【００２５】ＰＣＲは、９５℃３０秒の変性工程、６０
℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工
程を３５サイクル行った。
℃３０秒のアニーリング工程及び７２℃３０秒の伸長工
程を３５サイクル行った。
【００２６】３． ＲＦＬＰ 各ＰＣＲ産物６μｌ、１０ｘバッファー１．５μｌ、各
制限酵素０．７５μｌ及び蒸留水６．７５μｌから成る
混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることによ
り消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％
アガロースゲル電気泳動にかけた。
制限酵素０．７５μｌ及び蒸留水６．７５μｌから成る
混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることによ
り消化を行った。次いで、常法により、各消化物を３％
アガロースゲル電気泳動にかけた。
【００２７】４． 結果 結果を図３ないし図５に示す。図３ないし図５より、Ｈ
ｉｎｆＩ又はＰｓｔＩで消化することにより、日本産か
外国産かを識別することができることがわかる。また、
ＭｂｏIIとＲｓａＩとで消化することにより、各種類に
応じて種々のパターンが得られ、これらとＨｉｎｆＩ消
化において得られる断片長の情報とを組み合わせること
により、８種のウナギ種の同定が可能であることがわか
る。
ｉｎｆＩ又はＰｓｔＩで消化することにより、日本産か
外国産かを識別することができることがわかる。また、
ＭｂｏIIとＲｓａＩとで消化することにより、各種類に
応じて種々のパターンが得られ、これらとＨｉｎｆＩ消
化において得られる断片長の情報とを組み合わせること
により、８種のウナギ種の同定が可能であることがわか
る。
【００２８】実施例２ 一尾のウナギシラスについて、制限酵素としてはＨｉｎ
ｆＩ及びＰｓｔＩだけを用い、かつ、電気泳動では分子
量マーカーを用いずにjaponicaのＤＮＡを同様に増幅、
消化したものを対照として用いること以外は実施例１と
同様な操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩ
いずれで消化した場合も対照のjaponicaと同じ位置に増
幅バンドが検出され、試料がjaponicaであることが鑑定
できた。
ｆＩ及びＰｓｔＩだけを用い、かつ、電気泳動では分子
量マーカーを用いずにjaponicaのＤＮＡを同様に増幅、
消化したものを対照として用いること以外は実施例１と
同様な操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩ
いずれで消化した場合も対照のjaponicaと同じ位置に増
幅バンドが検出され、試料がjaponicaであることが鑑定
できた。
【００２９】実施例３ 実施例２とは異なる一尾のウナギシラスについて、実施
例２と同じ操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、Ｐｓ
ｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaとは異なる
位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaではない
ことが鑑定できた。
例２と同じ操作を行った。その結果、ＨｉｎｆＩ、Ｐｓ
ｔＩいずれで消化した場合も対照のjaponicaとは異なる
位置に増幅バンドが検出され、試料がjaponicaではない
ことが鑑定できた。
【００３０】実施例４ 実施例３において、japonicaではないことがわかった試
料の増幅産物を、実施例１と同様にＭｂｏIIとＲｓａＩ
で消化し、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。ただ
し、分子量マーカーは用いず、japonica、marmorata 及
びanguillaのＤＮＡを同様に増幅し、消化したものを対
照として用いた。その結果、試料の泳動パターンはjapo
nicaと同じであった。このため、試料はreinhardtiであ
ることが同定できた。
料の増幅産物を、実施例１と同様にＭｂｏIIとＲｓａＩ
で消化し、３％アガロースゲル電気泳動にかけた。ただ
し、分子量マーカーは用いず、japonica、marmorata 及
びanguillaのＤＮＡを同様に増幅し、消化したものを対
照として用いた。その結果、試料の泳動パターンはjapo
nicaと同じであった。このため、試料はreinhardtiであ
ることが同定できた。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、外見的には区別できなか
ったシラス等を用いてウナギの種の鑑定を行うことが初
めて可能になった。従って、本発明は、養鰻分野に大い
に貢献するものと期待される。
ったシラス等を用いてウナギの種の鑑定を行うことが初
めて可能になった。従って、本発明は、養鰻分野に大い
に貢献するものと期待される。
【００３２】
配列番号：１ 配列の長さ：１４２ 配列の型：核酸 配列 ATGGCAARCC TACGAAAAAC CCACCCACTY CTAAAAATTG CTAAYGATGC CCTAGTGGAT 60 CTACCAACCC CMTCCAAYAT TTCAGCATGA TGAAATTTTG GCTCTCTYCT AGGAYTATGY 120 CTHATYTCDC AAATCVTYAC AG 142
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 配列 ATGGCAARCC TACGAAAAAC CCACCCACTY CTAAAAATTG CT 42
【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 TACGAAAAAC CCACCCACTT CT 22
【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 配列 YCTMTACCTN CACATTGCCC GAGGACTTTA CTACGGYTMA TAYCTTTACA WAGARACATG 60 AAACATYGGA GTYGTAYTAT TYCTATTAGT AATAATAACW GCATTCGTRG GRTAYGTRCT 120 YCCATGAGGA CA 132
【００３６】配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 配列 AATAATAACW GCATTCGTRG GRTAYGTRCT YCCATGAGGA CA 42
【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 配列 TCCTCATGGA AGTACATATC CTACGACTGC 30
【００３８】配列番号：７ 配列の長さ： 配列の型：核酸 配列 ATGGCAAACC TACGAAAAAC CCACCCACTT CTAAAAATTG CTAACGATGC CCTAGTGGAT 60 CTACCAACCC CATCCAACAT TTCAGCATGA TGAAATTTTG GCTCTCTCCT AGGACTATGC 120 CTTATTTCGC AAATCCTTAC AGGATTATTC CTAGCAATAC ACTACACATC AGACATTTCA 180 ACTGCCTTTT CCTCAGTAGC CCACATCTGC CGAGACGTTA ATTATGGATG ATTCATCCGA 240 AATTTACATG CAAACGGGGC CTCCTTCTTC TTTATCTGCC TCTACCTACA CATTGCCCGA 300 GGACTTTACT ACGGCTCATA CCTTTACAAA GAAACATGAA ACATCGGAGT CGTACTATTC 360 CTATTAGTAA TAATAACTGC ATTCGTAGGA TATGTACTCC CATGAGGACA 410
【図１】本発明の方法により増幅される、各種ウナギの
ミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵
素部位を示す図である。
ミトコンドリアＤＮＡの増幅領域の塩基配列及び制限酵
素部位を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】本発明の実施例において得られた、各種ウナギ
についての、ＨｉｎｆＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦ
ＬＰの結果を模式的に示す図である。
についての、ＨｉｎｆＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦ
ＬＰの結果を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施例において得られた、各種ウナギ
についての、ＰｓｔＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐの結果を模式的に示す図である。
についての、ＰｓｔＩで消化した場合のＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐの結果を模式的に示す図である。
【図５】本発明の実施例において得られた、各種ウナギ
についての、ＭｂｏII／ＲｓａＩで消化した場合のＰＣ
Ｒ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
についての、ＭｂｏII／ＲｓａＩで消化した場合のＰＣ
Ｒ−ＲＦＬＰの結果を模式的に示す図である。
Claims (13)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する
核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマー。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する
核酸から成る、請求項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 配列表の配列番号３に示される塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）を有する核酸から成
る請求項２記載のプライマー。 - 【請求項４】 配列表の配列番号４に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する
核酸から成る、ウナギ種鑑定用プライマー。 - 【請求項５】 配列表の配列番号５に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する
核酸から成る、請求項４記載のプライマー。 - 【請求項６】 配列表の配列番号６に示される塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）を有する核酸から成
る請求項５記載のプライマー。 - 【請求項７】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
のプライマーと、請求項４ないし６のいずれか１項に記
載のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用い
る遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮ
Ａを調べることによりウナギ種を鑑定することから成る
ウナギ種の鑑定方法。 - 【請求項８】 増幅された前記ＤＮＡを制限酵素で消化
し、消化により得られる制限断片長を調べることにより
行う請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記制限酵素は、ＨｉｎｆＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＭｂｏII及びＲｓａＩから成る群より選ばれる１又
は２以上の制限酵素である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 ＨｉｎｆＩによる消化と、ＭｂｏIIと
ＲｓａＩとによる消化を行い、各消化により生じる制限
断片長を調べる請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項３記載のプライマーをフォワー
ド側プライマーとして用い、請求項６記載の塩基配列を
有する核酸をリバース側プライマーとして用いて行う請
求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項１ないし３のいずれか１項に記
載のプライマーと、請求項４ないし６のいずれか１項に
記載のプライマーを用い、ウナギＤＮＡを鋳型として用
いる遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅し、増幅されたＤ
ＮＡをＨｉｎｆＩ又はＲｓａＩで消化し、生じる制限断
片長を調べることによりウナギがAnguilla japonica か
否かを鑑定する方法。 - 【請求項１３】 請求項３記載のプライマーをフォワー
ド側プライマーとして用い、請求項６記載のプライマー
をリバース側プライマーとして用いる請求項１２記載の
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10220998A JP4093630B2 (ja) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | ウナギ種鑑定用核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種鑑定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10220998A JP4093630B2 (ja) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | ウナギ種鑑定用核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種鑑定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11276179A true JPH11276179A (ja) | 1999-10-12 |
| JP4093630B2 JP4093630B2 (ja) | 2008-06-04 |
Family
ID=14321281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10220998A Expired - Fee Related JP4093630B2 (ja) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | ウナギ種鑑定用核酸プライマー及びそれを用いたウナギ種鑑定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4093630B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011000061A (ja) * | 2009-06-18 | 2011-01-06 | Hikari Corporation:Kk | 非ジャポニカ種ウナギ検出に利用可能なプライマーセット、非ジャポニカ種ウナギ混入の検査方法およびウナギ種同定方法 |
| JP2016140289A (ja) * | 2015-01-30 | 2016-08-08 | 株式会社光コーポレーション | ウナギの種の同定補助方法 |
| CN107130032A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-09-05 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法 |
| KR102656519B1 (ko) * | 2024-02-07 | 2024-04-15 | 국립군산대학교 산학협력단 | 토종 뱀장어 식별용 lamp 프라이머 세트 및 이를 이용한 토종 뱀장어의 신속, 정확 식별방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102098773B1 (ko) * | 2019-04-25 | 2020-04-08 | 티엔에스(주) | 뱀장어 Anguilla japonica(극동산 뱀장어) 종과 A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 Real-time PCR 검출 방법 |
-
1998
- 1998-03-30 JP JP10220998A patent/JP4093630B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011000061A (ja) * | 2009-06-18 | 2011-01-06 | Hikari Corporation:Kk | 非ジャポニカ種ウナギ検出に利用可能なプライマーセット、非ジャポニカ種ウナギ混入の検査方法およびウナギ種同定方法 |
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| CN107130032A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-09-05 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法 |
| CN107130032B (zh) * | 2017-05-23 | 2020-08-07 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 基于多条dna条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法 |
| KR102656519B1 (ko) * | 2024-02-07 | 2024-04-15 | 국립군산대학교 산학협력단 | 토종 뱀장어 식별용 lamp 프라이머 세트 및 이를 이용한 토종 뱀장어의 신속, 정확 식별방법 |
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| Publication number | Publication date |
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