JPH11253185A

JPH11253185A - 新規ｍｕｔＹ

Info

Publication number: JPH11253185A
Application number: JP10344818A
Authority: JP
Inventors: Magdalena Zalacain; マグダレーナ・サラカイン; James Raymond Brown; ジェイムズ・レイモンド・ブラウン; David John Holmes; デイビッド・ジョン・ホームズ; Michael Terence Black; マイケル・テレンス・ブラック; John Edward Hodgson; ジョン・エドワード・ホッジソン; David Justin Charles Knowles; デイビッド・ジャスティン・チャールズ・ノウルズ; Michael A Lonetto; マイケル・アーサー・ロネット; Richard Oakly Nicholas; リチャード・オークリー・ニコラス; Robert King Stodola; ロバート・キング・ストドーラ
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-10-27
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 1999-09-21
Also published as: EP0913479A2; EP0913479A3; CA2248116A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ｍｕｔＹポリペプチドおよびｍｕｔＹポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み
換え法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに
抗細菌化合物のスクリーニングのためのｍｕｔＹポリペ
プチドの使用方法を提供する。【解決手段】配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれら
の製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニスト
およびアンタゴニスト、そしてそれらの使用に関する。
詳細には、これらの点および他の点に関して、本発明
は、ＮＹＨ／ＭＵＴＹファミリー（ａ／ｇ−特異的アデ
ニングリコシラーゼファミリー）の新規ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチド（以下、「ｍｕｔＹ」という）に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトにおい
て、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静
脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊
髄液の感染のごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の
疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から１００年以上も経過しているため、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究がなされた微生物の一つ
である。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという
初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffithな
らびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究において
述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関
する研究は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性
に関しては多くの疑問が残されている。抗生物質の開発
のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子およ
び遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことであ
る。ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の頻度は
過去２０年間に劇的に上昇している。これは多重抗生物
質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団の増
加に起因している。いくつかのまたは全ての標準的な抗
生物質に対して耐性を有するストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ株を単離することはもはやめずらしいことで
はない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワ
クチンおよび診断試験についての必要性を形成した。

【０００３】病原性に関連したある種のストレプトコッ
カスの因子、例えば、きょう膜多糖、ペプチドグリカ
ン、ニューモリシン、ＰｓｐＡ補体因子Ｈ結合成分、オ
ートリシン、ノイラミニダーゼ、ペプチドパーメアー
ゼ、過酸化水素、ＩｇＡ１プロテアーゼが同定されてい
るが、それらがすべてではない。さらに、哺乳動物宿主
における感染および疾病の進行中におけるかかる遺伝子
の一時的発現に関してはほとんどわかっていない。細菌
は感染の異なる段階、詳細には感染が確立された時に発
現される可能性がある細菌の遺伝子のセットを発見する
ことは、発症を妨害しうる新規抗微生物剤のスクリーニ
ングおよび特徴づけに関する重要な情報を提供する。か
かるアプローチは、既知蛋白についてのより十分な理解
を提供することのほかに、従来認識されていなかった標
的を同定するであろう。

【０００４】ＤＮＡの酸化グアニン前駆体は、ＤＮＡ複
製中に、Ａに対向してＤＮＡ中に誤って取り込まれる可
能性がある。この可能性を低下させるために、細胞は特
定の酵素ＭｕｔＴ蛋白を活用している。該蛋白は、ＤＮ
Ａ中に取り込まれる前に８−オキソＧＴＰを一リン酸形
態に変換する（Maki, H. and Sekiguchi, M. Nature,35
5, 273-275 (1992)）。ＤＮＡ中のＧが酸化された場
合、この変化した塩基は、ｍｕｔＭ遺伝子産物であるグ
リコシラーゼの基質である。８−オキソＧおよびＦａｐ
ｙを酸化的に損傷したＤＮＡから遊離させるのはＮ−グ
リコシラーゼ活性である。この蛋白はグリコシラーゼの
１つであり、ホスホジエステル骨格を切断する関連ＡＰ
エンドヌクレアーゼ活性も有している。ＭｕｔＭにより
生成したギャップのエキソヌクレアーゼプロセッシング
は、ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼにより修復され
うる基質を生成する。８−オキソＧを有する鋳型の複製
は、８−オキソＧに対向したＡの重大な誤った取り込み
を引き起こす可能性がある。グアニン酸化の結果に対す
るさらなる戦略として、イー・コリ（E. coli）はさら
なる酵素ＭｕｔＹ蛋白を有しており、該蛋白は関連ＡＰ
リアーゼ活性を伴うアデニンＤＮＡグリコシラーゼであ
り、Ａと８−オキソＧとのミスマッチを含むＤＮＡ構造
からＡを除去するように作用する（Michaels, M. L., T
chou, J., Grollman, A. P. and Miller, J. H. Bioche
mistry, 31, 10964-10968 (1992)）。この構造修復は、
８−オキソＧと対合したＣを有する構造を生成し、それ
はＭｕｔＭグリコシラーゼの基質である（Michaels, M.
L., Cruz, C., Grollman, A. P.and Miller, J. H. Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7022-7025 (1992)）。
イー・コリがグアニン酸化生成物を取り扱うために多重
的方法を活用しているという事実により明かなように、
酸化グアニンは細胞にとり重大な問題であるに違いな
い。それゆえ、このタイプのＤＮＡ修復に関与している
蛋白の阻害剤は、細菌が宿主感染を確立し維持すること
を妨害するので、抗細菌療法において有用である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物質活
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき
因子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能
不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるの
にも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改
善または修正において役割を果たしうる、かかる因子な
らびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストに対す
る必要性もある。

【０００６】本発明ポリペプチドは、エイチ・インフル
エンザエ（H. influenzae）の既知のｍｕｔＹ蛋白に対
するアミノ酸配列相同性を有する。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知ア
ミノ酸配列またはエイチ・インフルエンザエのｍｕｔＹ
蛋白のごとき他の蛋白配列との間の相同性により、新規
ｍｕｔＹポリペプチドであると同定されたポリペプチド
提供することが本発明の目的である。ｍｕｔＹポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には本明
細書でｍｕｔＹと命名されたポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらな
る目的である。本発明の特に好ましい具体例において、
ポリヌクレオチドは、表１（配列番号：１）に示す配列
を含むｍｕｔＹポリペプチドをコードする領域を含み、
全長遺伝子またはその変種が包含される。本発明のもう
１つの特に好ましい具体例において、表１（配列番号：
２）のアミノ酸配列を含むストレプトコッカス・ニュー
モニアエ由来の新規ｍｕｔＹ蛋白、またはその変種があ
る。本発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれ
るストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993株によ
り発現可能な成熟ポリペプチドをコードしている単離核
酸分子が提供される。

【０００８】本発明のさらなる態様は、ｍｕｔＹ、詳細
にはストレプトコッカス・ニューモニアエのｍｕｔＹを
コードしている単離核酸分子が提供され、それにはｍＲ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明の
さらなる具体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床
的もしくは治療的に有用なその変種、およびそれらを含
む組成物を包含する。本発明のもう１つの態様によれ
ば、治療または予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を
目的とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供され
る。本発明の特に好ましい具体例には、ｍｕｔＹの天然
に存在する対立遺伝子変種およびそれによりコードされ
るポリペプチドがある。

【０００９】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてｍｕｔＹと称されるストレプトコッカス・ニ
ューモニアエの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、
診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその
フラグメント、変種および誘導体、および前記したフラ
グメントおよびアナログの変種および誘導体、およびそ
れらを含む組成物が提供される。本発明の特に好ましい
具体例には、ｍｕｔＹ遺伝子の天然に存在する対立遺伝
子によりコードされるｍｕｔＹポリペプチドの変種があ
る。本発明の好ましい具体例において、上記ｍｕｔＹポ
リペプチドの製造方法がある。本発明のさらに別の態様
によれば、例えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用な
かかるポリペプチドの阻害剤が提供される。

【００１０】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
ｍｕｔＹ発現の評価、疾病の治療、例えば中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜
炎の治療、遺伝学的変異のアッセイ、ならびに細菌、特
にストレプトコッカス・ニューモニアエ細菌に対する免
疫学的応答を生起するための生物へのｍｕｔＹポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドの投与のための、製品、組
成物および方法が提供される。

【００１１】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でｍｕｔＹポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明の特定の好ましい具
体例において、ｍｕｔＹポリペプチドに対する抗体が提
供される。本発明の他の具体例において、本発明ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの結合、あるいは相互作
用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチド
またはポリヌクレオチドとの間の結合あるいは他の相互
作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触
させて、化合物との結合あるいは他の相互作用を評価し
（かかる結合または相互作用は、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応
答して検出可能なシグナルを提供することのできる第２
の化合物に関連している）、次いで、化合物とポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用か
ら生じるシグナルの存在または不存在を検出することに
より、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化また
は阻害するかどうかを決定することを含む。本発明のさ
らにもう１つの態様によれば、ｍｕｔＹのアゴニストお
よびアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌
性アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。本発
明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に
投与するための、ｍｕｔＹポリヌクレオチドまたはｍｕ
ｔＹポリペプチドを含む組成物が提供される。開示した
本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾
は、以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。

【００１２】用語以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によ
り形質転換もしくはトランスフェクションされた、また
は形質転換またはトランスフェクションすることのでき
る細胞である。

【００１３】当該分野にて周知であるように「同一性」
は、配列を比較して測定されるような、二つまたはそれ
以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上の
ポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野におい
て、「同一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの
鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意
味する。「同一性」および「類似性」はともに既知方法
により容易に算出できる（Computational Molecular Bi
ology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシテ
ィー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：
Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer
Analysisof Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.
およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージ
ャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular B
iology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SI
AM J., Applied Math., 48:1073(1988)があるがこれら
に限らない）。同一性を決定するための好ましい方法
は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように設
計される。同一性および類似性を測定する方法は、公に
利用できるコンピュータープログラムに集成されてい
る。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ま
しいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラム
パッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAcids Research 1
2(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atsch
ul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含
するが、これらに限定されるものではない。一例とし
て、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例
えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌク
レオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列
のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチド
の変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換える
と、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、
対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別の
ヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対照配
列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチ
ドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配
列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれら
の末端位置の間のいずれかの位置に存在していてもく、
対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるい
は対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となって
いてもよい。同様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列
に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポ
リペプチド配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のア
ミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み
うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対
照配列と同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ
酸の５％までが欠失または他のアミノ酸と置換していて
もよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっ
てもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミ
ノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在して
もよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存
在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、ある
いは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなし
ていてもよい。

【００１４】「単離」とは、「人の手によって」天然の
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。

【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するがこ
れらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域に
おける鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよ
い。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全
てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの分
子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書での
用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な
目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修
飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌク
レオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌ
クレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞
および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよび
ＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」
は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称
される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。

【００１６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペ
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Protei
n Synthesis：Posttranslational Modifications and A
ging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。

【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成、および当業者に知られた他の組み
換え法により製造できる。

【００１８】本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に
説明する、新規ｍｕｔＹポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。詳細には、本発明は、エイチ・インフ
ルエンザエのｍｕｔＹポリペプチドに対するアミノ酸配
列相同性により関連付けられる、ストレプトコッカス・
ニューモニアエの新規ｍｕｔＹのポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。特に本発明は、それぞれ表１
（配列番号：１）および表１（配列番号：２）に示すヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列を有するｍｕｔＹに
関し、さらに寄託株中のＤＮＡのｍｕｔＹヌクレオチド
配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列に関す
る。

【００１９】表１ｍｕｔＹポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 (A) ストレプトコッカス・ニューモニアエのｍｕｔＹポリヌクレオチド配列由来の配列 [配列番号：1]. 5'-1 ATGTTAGATT TGAAAGAATA CGGTATCGTC ATGTGGCCGG AGGAGAAAGT 51 CATTTCTTTC CGTGAGAAAC TTCTCGCTTG GTATGATGAA AACAAAAGAG 101 ATTTGCCTTG GAGGAGAAGT AAAAATCCTT ATCACATCTG GGTATCTGAA 151 ATCATGCTTC AGCAGACCAG GGTGGATACA GTTATCCCTT ACTACGAAAG 201 ATTTTTGGAC TGGTTTCCAA CTGTCGAAAG TCTGGCAACT GCGCCTGAGG 251 AGAGTTTACT GAAAGCTTGG GAGGGCTTGG GTTATTATTC TCGAGTTCGC 301 AATATGCAGG CTGCAGCCCA GCAGATTATG ACTGACTTTG GTGGCCAATT 351 TCCAAATACC TATGAAGGAA TTTCCAGCTT GAAAGGGATT GGACCTTACA 401 CAGCAGGAGC CATTTCCAGT ATTGCTTTTA ACTTGCCTGA GCCAGCTGTA 451 GATGGTAATG TCATGCGGGT CTTGGCGCGT CTGTTTGAAG TCAACCACGA 501 TATTGGGATT CCAAGTAATC GAAAAATTTT TCAGGCAATG ATGGAGATCT 551 TGATTAATCC AGATCGTCCG GGTGATTTTA ATCAAGCCTT GATGGACTTA 601 GGGTCTGATA TTGAGTCTCC TGTAAATCCC AGACCTGAAG AAAGCCCAGT 651 CAAGGACTTT AGTGCGGCAT ATCAGAATGG AACCATGGAC CGTTATCCAA 701 TTAAATCTCC TAAGAAAAAG CCGGTTCCTA TTTATCTTAA AGCCTTAGTT 751 GTGAAAAATT CTCAAGGACA ATTTTTACTT GAAAAAAATG AAAGCGAAAA 801 GCTCTTGGCA GGTTTTTGGC ATTTCCCCTT TATAGAAGTT GATAACTTTT 851 CGCAAGAAGA GCAGTTTGAC CTCTTTCATC AGGTTGCGGA AGAAAGTGTG 901 AACTCTGGCC CCAGTCCAGA AGAGAGTTTC CAGCAGGACT ATGACCTAGA 951 TGTTGATTGG CTTGATGTTT GTTTTGATAC AGTCCAGCAT GTTTTTAGTC 1001 ATCGAAAATG GCATGTACAG ATTGTAGCAG GTCAGGTGAG TGACTTCCAT 1051 GATTTTTCAG ATAGGGAAGT TCGTTGGCTT TCACCAGAAG AATTCAAGAA 1101 TTACCCACTT GCCAAACCCC AACAAAAAAT CTGGCAGGCT TATGCACAAG 1151 CCAACTTAGA CAGTAGCCAA GACTAG -3'

【００２０】 (B) この表中のポリヌクレオチド配列から推定されるｍｕｔＹポリペプチド配列 [配列番号：2]. NH₂-1 MLDLKEYGIV MWPEEKVISF REKLLAWYDE NKRDLPWRRS KNPYHIWVSE 51 IMLQQTRVDT VIPYYERFLD WFPTVESLAT APEESLLKAW EGLGYYSRVR 101 NMQAAAQQIM TDFGGQFPNT YEGISSLKGI GPYTAGAISS IAFNLPEPAV 151 DGNVMRVLAR LFEVNHDIGI PSNRKIFQAM MEILINPDRP GDFNQALMDL 201 GSDIESPVNP RPEESPVKDF SAAYQNGTMD RYPIKSPKKK PVPIYLKALV 251 VKNSQGQFLL EKNESEKLLA GFWHFPFIEV DNFSQEEQFD LFHQVAEESV 301 NSGPSPEESF QQDYDLDVDW LDVCFDTVQH VFSHRKWHVQ IVAGQVSDFH 351 DFSDREVRWL SPEEFKNYPL AKPQQKIWQA YAQANLDSSQ D -COOH

【００２１】 (C) ポリヌクレオチド配列の具体例 [配列番号：1]. X-(R1)n-1 ATGTTAGATT TGAAAGAATA CGGTATCGTC ATGTGGCCGG AGGAGAAAGT 51 CATTTCTTTC CGTGAGAAAC TTCTCGCTTG GTATGATGAA AACAAAAGAG 101 ATTTGCCTTG GAGGAGAAGT AAAAATCCTT ATCACATCTG GGTATCTGAA 151 ATCATGCTTC AGCAGACCAG GGTGGATACA GTTATCCCTT ACTACGAAAG 201 ATTTTTGGAC TGGTTTCCAA CTGTCGAAAG TCTGGCAACT GCGCCTGAGG 251 AGAGTTTACT GAAAGCTTGG GAGGGCTTGG GTTATTATTC TCGAGTTCGC 301 AATATGCAGG CTGCAGCCCA GCAGATTATG ACTGACTTTG GTGGCCAATT 351 TCCAAATACC TATGAAGGAA TTTCCAGCTT GAAAGGGATT GGACCTTACA 401 CAGCAGGAGC CATTTCCAGT ATTGCTTTTA ACTTGCCTGA GCCAGCTGTA 451 GATGGTAATG TCATGCGGGT CTTGGCGCGT CTGTTTGAAG TCAACCACGA 501 TATTGGGATT CCAAGTAATC GAAAAATTTT TCAGGCAATG ATGGAGATCT 551 TGATTAATCC AGATCGTCCG GGTGATTTTA ATCAAGCCTT GATGGACTTA 601 GGGTCTGATA TTGAGTCTCC TGTAAATCCC AGACCTGAAG AAAGCCCAGT 651 CAAGGACTTT AGTGCGGCAT ATCAGAATGG AACCATGGAC CGTTATCCAA 701 TTAAATCTCC TAAGAAAAAG CCGGTTCCTA TTTATCTTAA AGCCTTAGTT 751 GTGAAAAATT CTCAAGGACA ATTTTTACTT GAAAAAAATG AAAGCGAAAA 801 GCTCTTGGCA GGTTTTTGGC ATTTCCCCTT TATAGAAGTT GATAACTTTT 851 CGCAAGAAGA GCAGTTTGAC CTCTTTCATC AGGTTGCGGA AGAAAGTGTG 901 AACTCTGGCC CCAGTCCAGA AGAGAGTTTC CAGCAGGACT ATGACCTAGA 951 TGTTGATTGG CTTGATGTTT GTTTTGATAC AGTCCAGCAT GTTTTTAGTC 1001 ATCGAAAATG GCATGTACAG ATTGTAGCAG GTCAGGTGAG TGACTTCCAT 1051 GATTTTTCAG ATAGGGAAGT TCGTTGGCTT TCACCAGAAG AATTCAAGAA 1101 TTACCCACTT GCCAAACCCC AACAAAAAAT CTGGCAGGCT TATGCACAAG 1151 CCAACTTAGA CAGTAGCCAA GAC -(R2)n-Y

【００２２】 (D) ポリペプチド配列の具体例 [配列番号：2]. X-(R1)n-1 MLDLKEYGIV MWPEEKVISF REKLLAWYDE NKRDLPWRRS KNPYHIWVSE 51 IMLQQTRVDT VIPYYERFLD WFPTVESLAT APEESLLKAW EGLGYYSRVR 101 NMQAAAQQIM TDFGGQFPNT YEGISSLKGI GPYTAGAISS IAFNLPEPAV 151 DGNVMRVLAR LFEVNHDIGI PSNRKIFQAM MEILINPDRP GDFNQALMDL 201 GSDIESPVNP RPEESPVKDF SAAYQNGTMD RYPIKSPKKK PVPIYLKALV 251 VKNSQGQFLL EKNESEKLLA GFWHFPFIEV DNFSQEEQFD LFHQVAEESV 301 NSGPSPEESF QQDYDLDVDW LDVCFDTVQH VFSHRKWHVQ IVAGQVSDFH 351 DFSDREVRWL SPEEFKNYPL AKPQQKIWQA YAQANLDSSQ D -(R2)n-Y

【００２３】（Ｅ）本発明ｍｕｔＹと同種である、スト
レプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼ
由来のポリヌクレオチド配列（配列番号：３） 5'-ATGTTAGGATTTGAAAGAATACGGTATCGTCATGTGGCCGGAGGAGA
AAGTCATTTCTTTCCGGTGAGAAAACTTCTCGC TTGGTATGATGAAAACAAAAGAGATTTGCCTTGGAGGAGAAGTAAAAATC
CTTATCACATCTGGGTATCTGAAATCATGC TTCAGCAGACCAGGGTGGATACAGTTATCCCTTACTACGAAAGATTTTTG
GACTGGTTTCCAACTGTCGAAAGTCTGGCA ACTGCGCCTGAGGAGAGTTTACTGAAAGCTTGGGAGGGCTTGGGTTATTA
TTCTCGAGTTCGCAATATGCAGGCTGCAGC CCAGCAGATTATGACTGACTTTGGTGGCCAATTTCCAAATACCTATGAAG
GAATTTCCAGCTTGAAAGGGATTGGACCTT ACACAGCAGGAGCCATTTCCAGTATTGCTTTTAACTTGCCTGAGCCAGCT
GTAGATGGTAATGTCATGCGGGTCTTGGCG CGTCTGTTTGAAGTCAACCACGATATTGGGATTCCAAGTAATCGAAAAAT
TTTTCAGGCAATGATGGAGATCTTGATTAA TCCAGATCGTCCGGGTGATTTTAATCAAGCCTTGATGGACTTAGGGTCTG
ATATTGAGTCTCCTGTAAATCCCAGACCTG AAGAAAGCCCAGTCAAGGACTTTAGTGCGGCATATCAGAATGGAACCATG
GACCGTTATCCAATTAAATCTCCTAAGAAA AAGCCGGTTCCTATTTATCTTAAAGCCTTAGTTGTGAAAAATTCTCAAGG
ACAATTTTTACTTGAAAAAAATGAAAGCGA AAAGCTCTTGGCAGGTTTTTGGCATTTCCCCTTTATAGAAGTTGATAACT
TTTCGCAAGAAGAGCAGTTTGACCTCTTTC ATCAGGTTGCGGAAGAAAGTGTGAACTCTGGCCCCAGTCCCAGAAGAGAG
TTTCCAGCAGGACTATGACCTAGATGTTGA-3'

【００２４】（Ｆ）本発明ｍｕｔＹと同種である、スト
レプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼ
由来のポリペプチド配列（配列番号：４） NH₂-MLGFERIRYRHVAGGESHFFPVRKLLAWYDENKRDLPWRRSKNPYH
IWVSEIMLQQTRVDTVIPYYERFLDWFPTVESLA TAPEESLLKAWEGLGYYSRVRNMQAAAQQIMTDFGGQFPNTYEGISSLKG
IGPYTAGAISSIAFNLPEPAVDGNVMRVLA RLFEVNHDIGIPSNRKIFQAMMEILINPDRPGDFNQALMDLGSDIESPVN
PRPEESPVKDFSAAYQNGTMDRYPIKSPKK KPVPIYLKALVVKNSQGQFLLEKNESEKLLAGFWHFPFIEVDNFSQEEQF
DLFHQVAEESVNSGPSPRREFPAGLXPRC -COOH

【００２５】寄託物質ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカード
ライブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランド
に１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株を
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株とい
う。１９９６年４月１７日に、イー・コリ（E. coli）
中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮ
ＡライブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号
４０８００を付与された。ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または
「寄託株のＤＮＡ」という。寄託株は全長のｍｕｔＹ遺
伝子を含んでいる。寄託株中に含まれるポリヌクレオチ
ド配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は、本明細書の配列に関する任意の記載に
矛盾する事象において支配的である。寄託株の寄託は、
特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペス
ト条約の条件下でなされている。特許が発行されると何
らの制限または条件もなく、最終的に株は分譲される。
寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.
Ｃ.１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可
能要件であることを承認するものではない。寄託物を製
造、使用または販売するためにはライセンスが必要であ
るが、そのようなライセンスはここでは賦与されていな
い。

【００２６】ポリペプチド本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２］のポリペプ
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびにポリペプ
チドおよびフラグメント、詳細にはｍｕｔＹの生物学的
活性を有するものを包含し、さらに表１［配列番号：２
および４］のポリペプチドまたはその重要部分に対して
少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番号：２およ
び４］のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一
性を有するポリペプチドおよびフラグメント、より好ま
しくは表１［配列番号：２および４］のポリペプチドに
対して少なくとも９０％の類似性を有し（より好ましく
は、少なくとも９０％の同一性を有し）、さらにより好
ましくは表１［配列番号：２および４］のポリペプチド
に対して少なくとも９５％の類似性を有する（さらによ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）ポリ
ペプチドおよびフラグメント、さらに通常には少なくと
も３０個、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸
を含むかかるポリペプチドの部分を包含する。

【００２７】また本発明は表１（Ｄ）［配列番号：２］
に示す式のポリペプチドを包含し、式中のアミノ末端に
おいてＸは水素であり、カルボキシル末端においてＹは
水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残
基、ｎは１ないし１０００の整数である。いずれかのＲ
基（Ｒは１個よりも多い）により示されるアミノ酸残基
の伸長部分はヘテロポリマーであってもホモポリマーで
あってもよく、好ましくはヘテロポリマーである。

【００２８】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｍｕ
ｔＹポリペプチドについては、フラグメントは「独立し
て存在（free standing）」しているか、または一部分
もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプチ
ド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域、すなわち大型の単一ポリペプチドとして含ま
れる。好ましいフラグメントは、表１［配列番号：２お
おび４］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断され
たポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、そ
の例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、また
はカルボキシル末端を含む一連の残基を切断したものが
ある。宿主、とりわけストレプトコッカス・ニューモニ
アエにおける、本発明のポリペプチドの分解形態もまた
好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴づ
けられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスお
よびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよ
びベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領
域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性
領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、
可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原
性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。ｍｕｔ
Ｙ活性を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない
活性を減じられたフラグメントである生物学的に活性の
あるフラグメントも好ましい。動物、とりわけヒトにお
いて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれ
る。個体、特にヒトにおけるストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエの生存に必須の機能、あるいは疾病を開始
または維持する能力を付与する酵素の受容体またはドメ
インを含むフラグメントが特に好ましい。本発明ポリペ
プチドのフラグメントである変種を、ペプチド合成によ
る対応全長ポリペプチドの製造に使用してもよく、それ
ゆえ、これらの変種を全長のポリペプチド製造のための
中間体として用いてもよい。本発明ポリヌクレオチドの
フラグメントである変種を用いて本発明の全長のポリヌ
クレオチドを合成してもよい。

【００２９】ポリヌクレオチド本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するもの
であり、それには表１［配列番号：２および４］の推定
アミノ酸配列を有するｍｕｔＹポリペプチドをコードす
る全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオ
チドおよびそれらの変種が包含される。本明細書に提供
される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１および
３］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質スト
レプトコッカス・ニューモニアエ 0100993細胞からの染
色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定
するために用いるような標準的なクローニングおよびス
クリーニングを用いて、ｍｕｔＹポリペプチドをコード
している本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長
のクローンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオ
チド配列、例えば表１［配列番号：１および３］に示す
配列を得るために、イー・コリ（E.coli）またはいくつ
かの他の適切な宿主におけるストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ0100993の染色体ＤＮＡのクローンの典型的
なライブラリーを、部分的配列に由来する、好ましくは
１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌ
クレオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一
であるＤＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて
区別できる。元の配列から設計した配列決定プライマー
を用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定
することにより、両方向で配列が伸長できるようにな
り、全遺伝子配列を決定できる。このような配列決定は
便宜的にプラスミドクローンから調製した変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いて実施する。適切な技法については、Maniat
is,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecular Clon
ing，A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載され
ている（Screening By Hybridization 1.90およびSeque
ncing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.7
0参照）。本発明の典型例において、表１［配列番号：
１］に示すポリヌクレオチドが、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ 0100993由来のＤＮＡライブラリー中に
見いだされた。

【００３０】表１［配列番号：１］に示すＤＮＡ配列
は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸残基数とほぼ
同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を
含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知ら
れたアミノ酸の分子量を用いて算出できる。ヌクレオチ
ド番号１から１１７３の間の配列番号：１のポリヌクレ
オチドは配列番号：２のポリペプチドをコードする。停
止コドンは配列番号：１のヌクレオチド番号１１７４か
ら開始する。本発明ｍｕｔＹ蛋白は、寄託株のｍｕｔＹ
をコードしているＤＮＡの配列決定結果により示される
ように、ＮＹＨ／ＭＵＴＹファミリー（ａ／ｇ−特異的
アデニングリコシラーゼファミリー）の他の蛋白に構造
的に関連している。本発明蛋白は、知られた蛋白の中で
もエイチ・インフルエンザエの既知のｍｕｒＹ蛋白（SW
ISS-PROT受託番号P44320）に対して最大の相同性を示
す。表１［配列番号：２］のｍｕｔＹ蛋白は、エイチ・
インフルエンザエ由来のｍｕｔＹポリペプチドのアミノ
酸配列に対して、その全長にわたり約３５％の同一性、
そしてその全長にわたり約５４％の類似性を示す。

【００３１】本発明は、表１［配列番号：１］のコーデ
ィング配列に対して全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそれらのフラグメント、ならびにその他の
コーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチド
のコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリ
ーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列
をコードする配列も本発明により提供される。ポリヌク
レオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。

【００３２】本発明の好ましい具体例は、ｍｕｔＹポリ
ペプチドをコードいしている、表１の配列番号：１に示
すヌクレオチド１から１１７３または１１７６までを含
むポリヌクレオチドである。

【００３３】また本発明は、表１（Ｃ）［配列番号：
１］に示す式のポリヌクレオチドを包含し、式中の５’
末端においてＸは水素であり、３’末端においてＹは水
素または金属であり、Ｒ１およびＲ２は核酸残基、ｎは
１ないし１０００の整数である。いずれかのＲ基（Ｒは
１個よりも多い）により示される核酸残基の伸長部分は
ヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよ
く、好ましくはヘテロポリマーである。

【００３４】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・ニューモニアエのｍｕｔＹのポリペプチ
ドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含す
る。該用語は、コーディング配列および／または非コー
ディング配列を含んでいてもよいさらなる領域を伴っ
た、ポリペプチドをコードしている単一の連続領域また
は不連続領域（例えば、組み込まれたファージまたは配
列の挿入または配列の編集により分断されたもの）を含
むポリヌクレオチドを包含する。さらに本発明は、表１
［配列番号：２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チドの変種をコードする上記ポリヌクレオチドの変種に
も関する。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントであ
る変種を用いて本発明の全長ポリヌクレオチドを合成し
てもよい。

【００３５】さらに特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：２］のｍｕｔＹポリペプチドのアミノ酸配列を有
するｍｕｔＹ変種をコードするポリヌクレオチドであ
り、その中には、いくつか、少しの、５ないし１０、１
ないし５、１ないし３、２、１または０個のアミノ酸残
基を置換、欠失または付加を任意の組み合わせで施した
アミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましいもの
は、ｍｕｔＹの特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。

【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号：２および４］に示すアミノ酸配列を有する
ｍｕｔＹポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一
性があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるい
はまた、寄託株のｍｕｔＹポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。特に好ましい具体例は、表１［配列番号：１］
のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチドである。

【００３７】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてい
る。

【００３８】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１または配列番号：３に示すポ
リヌクレオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なラ
イブラリーを、配列番号：１に示す上記ポリヌクレオチ
ド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブ
でスクリーニングし、ＤＮＡ配列を単離することにより
得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的に含む
ポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌクレオチ
ドを得るために有用なフラグメントには、例えば本明細
書の別の箇所において説明するプローブおよびプライマ
ー等がある。

【００３９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドを、ｍｕｔＹをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するための、およびｍｕｔＹ遺
伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用することができる。このようなプ
ローブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なく
とも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプ
ローブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそ
れ以下である。例えば、ｍｕｔＹ遺伝子のコーディング
領域は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いてオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成してスクリーニングするこ
とにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に
相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのス
クリーニングに用い、プローブがライブラリーのいずれ
のメンバーにハイブリダイゼーションするのかを決定す
る。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または２
の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌク
レオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好
ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌ
クレオチドの全体または一部が感染した組織に転写され
るかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成し
た感染段階および感染型の診断にも有用であることが理
解される。

【００４１】また本発明は、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。要する
に、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配
列を加えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができ
る）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以
上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダ
ー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ
蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよ
く、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生成するプロセッシング段階で除去される。

【００４２】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。

【００４３】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。

【００４４】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。

【００４５】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。

【００４６】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。

【００４７】診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｍ
ｕｔＹポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｍｕｔＹの検出は、
疾患の診断のための診断法を提供する。ｍｕｔＹ遺伝子
を含む生物に感染した、あるいは感染のおそれのある真
核生物（本明細書において「個体」とも称する）とりわ
け哺乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベル
で検出できる。診断用の核酸は、感染した個体の細胞お
よび組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より
得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用して
もよく、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増
幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増
幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒト
に存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の
分析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝
子型と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、
欠失および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮ
Ａを標識化ｍｕｔＹポリヌクレオチド配列にハイブリダ
イズさせることにより同定できる。完全に対合した配列
はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、
誤対合二重らせんから区別できる。変性剤含有または不
含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変
化を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列
決定により、ＤＮＡ配列の差を検出してもよい。例えば
Meyersら、Science，230:1242（1985）参照。また、特
異的な位置での配列の変化を、ヌクレアーゼ保護アッセ
イ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断
法によって明らかにしてもよい。例えばCottonら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA， 85:4397-4401 （1985）参
照。

【００４８】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、ｍｕｔＹをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。典型的なプライ
マーの例を下表２に示す。

【００４９】表２ｍｕｔＹポリヌクレオチド増幅用プライマー配列番号：プライマー配列 5 5' GCAGCCCAGCAGATTATGACT -3' 6 5' AACCGGCTTTTTCTTAGGAG -3'

【００５０】本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。

【００５１】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはストレプトコッカス・ニューモニア
エによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜
炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１
［配列番号：１］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。ｍｕｔＹポリヌクレオチドの発現の増加ま
たは低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野
でよく知られたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティン
グおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測
定できる。

【００５２】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ｍｕｔＹ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診
断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のｍｕｔＹ蛋白のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。かかるアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００５３】抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cance
r Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。

【００５４】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−ｍｕｔＹを有することにつ
いてスクリーニングされたヒトから、あるいは無処理の
ライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有
する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty,
J.ら、Nature 348:552-554 （1990）； Marks, J.ら、B
iotechnology 10:779-783 （1992））。これらの抗体の
親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）に
より改善することもできる（Clackson, T.ら、Nature 3
52:624-628 （1991））。

【００５５】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。

【００５６】上記抗体を用いてポリペプチドを発現する
クローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親和
性クロマトグラフィーにより精製することができる。従
って、とりわけｍｕｔＹに対する抗体を、感染、とりわ
け細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜
炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例え
ば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の治療に
用いてもよい。

【００５７】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５８】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５９】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００６０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。

【００６１】また本発明は、ｍｕｔＹポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または
阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静菌性
および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物
のスクリーニング方法をも提供する。該スクリーニング
方法は高処理量の方法である。例えば、アゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングするために、合成反
応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごと
き細胞コンパートメント、またはｍｕｔＹポリペプチド
および標識基質もしくはかかるポリペプチドのリガンド
を含むそれらの調合物を、ｍｕｔＹゴニストまたはアン
タゴニストである可能性のある候補化合物の不存在下ま
たは存在下でインキュベーションする。候補分子がｍｕ
ｔＹポリペプチドにアゴナイズまたはアンタゴナイズす
る能力は、標識化リガンドの結合の低下またはこのよう
な基質からの生成物の産生の低下に反映される。結合し
ても影響を及ぼさない分子、すなわちｍｕｔＹの効果を
誘導しない分子は、最も良好なアンタゴニストである可
能性がある。結合性が良好で、基質からの生成物の生成
速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成
物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを用い
ることにより強調できる。この点に関して有用なリポー
ターシステムには、生成物に転換される比色測定用標識
化基質、ｍｕｔＹポリヌクレオチドまたはポリペプチド
活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分
野で周知の結合アッセイ等があるが、これらに限定する
ものではない。

【００６２】ｍｕｔＹンタゴニストのアッセイのもう１
つの例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適し
た条件下で、ｍｕｔＹおよび潜在的アンタゴニストを、
ｍｕｔＹ結合分子、組換えｍｕｔＹ結合分子、天然基質
もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣物
と混合する。例えば放射活性または比色測定用化合物に
よりｍｕｔＹを標識し、結合分子に結合した、または生
成物に変換されたｍｕｔＹ分子の数を正確に決定して、
潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。

【００６３】潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペ
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、ｍｕｔＹにより誘導される活性
を誘導せず、それゆえｍｕｔＹを結合から排除すること
によりｍｕｔＹの作用を妨害する。潜在的アンタゴニス
トには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれ
を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨害し
て、正常の生物学的活性を妨害する小型分子等がある。
小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子等があるが、これらに限定するものではな
い。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス分
子等がある（これらの分子についての記載に関してはOk
ano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucle
otides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、ｍｕ
ｔＹ関連化合物およびｍｕｔＹ変種等がある。

【００６４】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。

【００６５】本発明は、感染の続発症に関与する病因お
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、ｍｕｔＹ蛋白により媒介される哺乳動物細胞への
侵入のブロック（Rosenshine et al., Infect. Immuno
l. 60: 2211 (1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋
白と細菌ｍｕｔＹ蛋白との間の、組織ダメージを媒介す
る細菌付着のブロック；内在デバイスの移植または他の
外科的方法以外により開始される、感染における通常の
病状の進行のブロックに使用することができる。

【００６６】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄
膜炎のような疾病の抑制および治療に用いてもよい。

【００６７】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト）、特に広スペク
トルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療
に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロ
リ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる
治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。

【００６８】ワクチン本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および
／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分なｍｕｔＹ
またはそのフラグメントもしくは変種を個体に接種する
ことを特徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製を
遅らせる方法も提供される。本発明のさらにもう１つの
態様は、個体における免疫学的応答の誘導方法に関し、
該方法は、疾病が個体においてすでに確立されているか
否かにかかわらず、インビボでｍｕｔＹ、またはそのフ
ラグメントもしくは変種を発現させるためにｍｕｔＹま
たはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令する核
酸ベクターをかかる個体に送達して、例えば、抗体およ
び／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生
Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応
答を誘導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生さ
せることを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投
与する方法としては、粒子上にコーディングすること等
がある。かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾
核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいて
もよい。

【００６９】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、ｍｕｔＹまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えｍｕｔＹまたはそれに
よりコードされている蛋白を含み、ｍｕｔＹまたはそれ
によりコードされている蛋白に対する抗原をコードし発
現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防
的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞性免
疫の形態であってもよい。

【００７０】ｍｕｔＹポリペプチドまたはそれらのフラ
グメントを、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋
白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合
させてもよい。好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、
抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ
（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベー
ターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化
してそれらの産生および精製を促進する比較的大きな共
存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普
遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとし
て作用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミ
ノまたはカルボキシいずれの末端に結合していてもよ
い。

【００７１】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。

【００７２】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエに感染した動物モデルにおいて、かかる遺
伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表
面蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説
明したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグ
メントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的
または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピ
トープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけストレプト
コッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処
置の開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。

【００７３】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。

【００７４】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。

【００７５】本発明を特定のｍｕｔＹ蛋白に関して説明
したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実質的に
組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失または
置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含すること
が理解されよう。

【００７６】組成物、キットおよび投与本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。

【００７７】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。

【００７８】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防
御することもできる。

【００７９】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。

【００８０】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織において曝
露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。

【００８１】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。

【００８２】

【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のストレプトコッカス・
ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーから得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニ
アエのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮ
Ａ配列を構築した場合もある。通常の方法、例えば以下
の方法１および２によりライブラリーを製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0
100993から、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。

【００８３】方法１標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーでE. coli
を感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。

【００８４】方法２全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーでE. coliを感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。

【００８５】実施例２感染期間中のストレプトコッカス・ニューモニアエ由来
の遺伝子の発現の決定ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３で
の気道感染４８時間目のマウス切除肺を効果的に破砕
し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在
下で処理して動物および細菌のＲＮＡ混合物を得る。安
定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕
および処理の最適条件は、その後のノーザンブロット上
におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ１６Ｓ
ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドとのハ
イブリダイゼーションの使用にも用いる。得られたＲＮ
ＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、Ｄ
ＮＡおよび蛋白不含の調合物は、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ０１００９９３の各遺伝子の配列から設
計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。

【００８６】ａ）感染（肺）のマウス動物モデルからの
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３感
染組織の単離ウマ血液プレートまたはＡＧＣＨ培地のいずれかで、３
７℃、５％ＣＯ₂で一晩ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ０１００９９３を増殖させる。次いで、細菌を集
め、リン酸塩緩衝化セイライン中に再懸濁してＡ₆₀₀を
約０．４とする。イソフルオランでマウスを麻酔し、５
０ｍｌの細菌懸濁液（約２ｘ１０⁵個）をピペットマン
を用いて鼻腔内投与する。マウスを回復させ、エサおよ
び水を自由に取らせる。４８時間後、過剰量の二酸化炭
素によりマウスを安楽死させ、肺を無菌的に切除し、液
体窒素中で素早く凍結する。

【００８７】ｂ）感染組織試料からストレプトコッカス
・ニューモニアエ０１００９９３の単離２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を−８０℃
の貯蔵庫からドライアイス−エタノール浴中に取り出
す。微生物安全キャビネット中で試料を破砕し、残った
試料をドライアイス−エタノール浴中で保存する。組織
試料中の細菌を破砕するために、５０〜１００ｍｇの組
織をシリカ／セラミックマトリックス（BIO 101）を入
れたFastRNAチューブに移す。すぐに抽出試薬（FastRNA
試薬，BIO 101）１ｍｌを添加して試料対試薬の比を約
１対２０とする。６０００ｒｐｍの往復震盪機（FastPr
ep FR120, BIO 101）で２０〜１２０秒チューブを振盪
する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理イソプロパン−ル沈殿
溶液（Bio 101）で沈殿させる。必要ならば、−８０℃
においてＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中に
保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００ｇ、１０
分）、７５％（ＤＥＰＣ−処理水中ｖ／ｖ）エタノール
で洗浄し、５〜１０分風乾し、次いで、ＤＥＰＣ処理水
０．１ｍｌに再懸濁し、その後、５５℃で５〜１０分置
く。最後に、氷上に少なくとも１分置き、２００ユニッ
トのＲｎａｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合
物は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、
プロトコールの洗浄段階における７５％エタノール中の
ＲＮＡ沈殿は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１
％アガロースゲル上に試料を泳動することにより単離Ｒ
ＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴ
ＢＥゲルを用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織
からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、
２．２Ｍホルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N
（Amersham）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロ
ットを、ストレプトコッカス・ニューモニアの１６Ｓ
ｒＲＮＡに特異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプロー
ブ（５’AACTGAGACT GGCTTTAAGA GATTA３’［配列番
号：７］）とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリ
ダイゼーションしているバンドのサイズを、インビボ増
殖したストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９
９から単離された対照ＲＮＡのものとノーザンブロット
において比較する。全ＲＮＡ試料中において正しいサイ
ズの細菌１６ＳｒＲＮＡバンドが検出でき、ＴＢＥゲ
ル上で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示され
る。

【００８８】ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ
由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去最終体積５７μｌのバッファー中で２０ユニットのＲＮ
Ａａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GenHunter）を用いて３
７℃で３０分処理することにより、５０マイクログラム
のＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコ
ールに従ってTRIzol LS試薬（Gibco BRL, Life Technol
ogies）によりＤＮＡａｓｅを不活性化し除去した。Ｄ
ＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを上記Ｒｎａｓｉｎを添加し
たＤＰＥＣ処理水１００マイクロリットル中に再懸濁し
た。

【００８９】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料３マイクログラムを、First Strand cDNA合成キッ
ト用のSuperScript Preamplification System（Gibco B
RL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１５０
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScriptII逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。

【００９０】ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブ中にＰＣＲ反応物をセットアップする：４３マイク
ロリットルのPCR Master Mix（Advanced Biotechnologi
es Ltd.）；１マイクロリットルのＰＣＲプライマー
（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、類似のアニー
リング温度を有するように設計されたもの）（各プライ
マーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マイクロリットル
のｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600に
おいてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２分、次いでそれ
ぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０秒を５０サイク
ル、その後７２℃で７分、次いで、保持温度２０℃とす
る（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または欠乏を決定す
るためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ反応からの初
発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適には８〜３０
サイクル）。次いで、１０マイクロリットルの部分試料
を１％ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色す
る。ＰＣＲ生成物については、存在するならば、１００
ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）
との比較によりサイズを評価する。別法として、便利に
は、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末端を標識し
たもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識し、ＰＣＲ生成物
の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲルで泳動し、
適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、PerkinEl
merにより提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いたA
BI PrismTM 377 Sequencer）を用いてその存在および量
を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応
物、非転写ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１０
０９９３ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるように設
計された１６ＳｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特
異的プライマーペアーを含んでいてもよい。プライマー
ペアーの効率を試験するために、それらをストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用い
るＤＮＡＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアッ
プし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡ
を用いて上記のごとく反応を行う。ＤＮＡＰＣＲまた
はＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想サイズの生成物
を生じないプライマーペアーはＰＣＲ反応できず、その
ようなものとしては不均一である。ＤＮＡＰＣＲで正
しいサイズの生成物を生じるものは２つのクラスに分類
される：１．インビボで転写されない遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じる再現性がないも
の；および２．インビボで転写される遺伝子であって、
ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を再現性を
もって生じ、＋ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシ
グナル（生じた場合には）よりも強力なシグナルを生じ
るもの。

【００９１】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：SmithKline Beecham Corporation （Ｂ）通り名：（Ｃ）都市名：（Ｄ）州名：（Ｅ）国名：（Ｆ）郵便番号：（ｉｉ）発明の名称：新規ｍｕｔＹ（ｉｉｉ）配列の数：７（ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体タイプ：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）作動システム：Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｄ）Windows用FastSEQバージョン２．０ｂ（ｖ）現出願データ：（Ａ）出願番号：

【００９２】（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１７６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：２本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGTTAGATT TGAAAGAATA CGGTATCGTC ATGTGGCCGG AGGAGAAAGT CATTTCTTTC 60 CGTGAGAAAC TTCTCGCTTG GTATGATGAA AACAAAAGAG ATTTGCCTTG GAGGAGAAGT 120 AAAAATCCTT ATCACATCTG GGTATCTGAA ATCATGCTTC AGCAGACCAG GGTGGATACA 180 GTTATCCCTT ACTACGAAAG ATTTTTGGAC TGGTTTCCAA CTGTCGAAAG TCTGGCAACT 240 GCGCCTGAGG AGAGTTTACT GAAAGCTTGG GAGGGCTTGG GTTATTATTC TCGAGTTCGC 300 AATATGCAGG CTGCAGCCCA GCAGATTATG ACTGACTTTG GTGGCCAATT TCCAAATACC 360 TATGAAGGAA TTTCCAGCTT GAAAGGGATT GGACCTTACA CAGCAGGAGC CATTTCCAGT 420 ATTGCTTTTA ACTTGCCTGA GCCAGCTGTA GATGGTAATG TCATGCGGGT CTTGGCGCGT 480 CTGTTTGAAG TCAACCACGA TATTGGGATT CCAAGTAATC GAAAAATTTT TCAGGCAATG 540 ATGGAGATCT TGATTAATCC AGATCGTCCG GGTGATTTTA ATCAAGCCTT GATGGACTTA 600 GGGTCTGATA TTGAGTCTCC TGTAAATCCC AGACCTGAAG AAAGCCCAGT CAAGGACTTT 660 AGTGCGGCAT ATCAGAATGG AACCATGGAC CGTTATCCAA TTAAATCTCC TAAGAAAAAG 720 CCGGTTCCTA TTTATCTTAA AGCCTTAGTT GTGAAAAATT CTCAAGGACA ATTTTTACTT 780 GAAAAAAATG AAAGCGAAAA GCTCTTGGCA GGTTTTTGGC ATTTCCCCTT TATAGAAGTT 840 GATAACTTTT CGCAAGAAGA GCAGTTTGAC CTCTTTCATC AGGTTGCGGA AGAAAGTGTG 900 AACTCTGGCC CCAGTCCAGA AGAGAGTTTC CAGCAGGACT ATGACCTAGA TGTTGATTGG 960 CTTGATGTTT GTTTTGATAC AGTCCAGCAT GTTTTTAGTC ATCGAAAATG GCATGTACAG 1020 ATTGTAGCAG GTCAGGTGAG TGACTTCCAT GATTTTTCAG ATAGGGAAGT TCGTTGGCTT 1080 TCACCAGAAG AATTCAAGAA TTACCCACTT GCCAAACCCC AACAAAAAAT CTGGCAGGCT 1140 TATGCACAAG CCAACTTAGA CAGTAGCCAA GACTAG 1176

【００９３】（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３９１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Leu Asp Leu Lys Glu Tyr Gly Ile Val Met Trp Pro Glu Glu Lys 1 5 10 15 Val Ile Ser Phe Arg Glu Lys Leu Leu Ala Trp Tyr Asp Glu Asn Lys 20 25 30 Arg Asp Leu Pro Trp Arg Arg Ser Lys Asn Pro Tyr His Ile Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Met Leu Gln Gln Thr Arg Val Asp Thr Val Ile Pro Tyr 50 55 60 Tyr Glu Arg Phe Leu Asp Trp Phe Pro Thr Val Glu Ser Leu Ala Thr 65 70 75 80 Ala Pro Glu Glu Ser Leu Leu Lys Ala Trp Glu Gly Leu Gly Tyr Tyr 85 90 95 Ser Arg Val Arg Asn Met Gln Ala Ala Ala Gln Gln Ile Met Thr Asp 100 105 110 Phe Gly Gly Gln Phe Pro Asn Thr Tyr Glu Gly Ile Ser Ser Leu Lys 115 120 125 Gly Ile Gly Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Phe Asn 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Ala Val Asp Gly Asn Val Met Arg Val Leu Ala Arg 145 150 155 160 Leu Phe Glu Val Asn His Asp Ile Gly Ile Pro Ser Asn Arg Lys Ile 165 170 175 Phe Gln Ala Met Met Glu Ile Leu Ile Asn Pro Asp Arg Pro Gly Asp 180 185 190 Phe Asn Gln Ala Leu Met Asp Leu Gly Ser Asp Ile Glu Ser Pro Val 195 200 205 Asn Pro Arg Pro Glu Glu Ser Pro Val Lys Asp Phe Ser Ala Ala Tyr 210 215 220 Gln Asn Gly Thr Met Asp Arg Tyr Pro Ile Lys Ser Pro Lys Lys Lys 225 230 235 240 Pro Val Pro Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Val Val Lys Asn Ser Gln Gly 245 250 255 Gln Phe Leu Leu Glu Lys Asn Glu Ser Glu Lys Leu Leu Ala Gly Phe 260 265 270 Trp His Phe Pro Phe Ile Glu Val Asp Asn Phe Ser Gln Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asp Leu Phe His Gln Val Ala Glu Glu Ser Val Asn Ser Gly Pro 290 295 300 Ser Pro Glu Glu Ser Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Leu Asp Val Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asp Val Cys Phe Asp Thr Val Gln His Val Phe Ser His Arg Lys 325 330 335 Trp His Val Gln Ile Val Ala Gly Gln Val Ser Asp Phe His Asp Phe 340 345 350 Ser Asp Arg Glu Val Arg Trp Leu Ser Pro Glu Glu Phe Lys Asn Tyr 355 360 365 Pro Leu Ala Lys Pro Gln Gln Lys Ile Trp Gln Ala Tyr Ala Gln Ala 370 375 380 Asn Leu Asp Ser Ser Gln Asp 385 390

【００９４】（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９６０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：２本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATGTTAGGAT TTGAAAGAAT ACGGTATCGT CATGTGGCCG GAGGAGAAAG TCATTTCTTT 60 CCGGTGAGAA AACTTCTCGC TTGGTATGAT GAAAACAAAA GAGATTTGCC TTGGAGGAGA 120 AGTAAAAATC CTTATCACAT CTGGGTATCT GAAATCATGC TTCAGCAGAC CAGGGTGGAT 180 ACAGTTATCC CTTACTACGA AAGATTTTTG GACTGGTTTC CAACTGTCGA AAGTCTGGCA 240 ACTGCGCCTG AGGAGAGTTT ACTGAAAGCT TGGGAGGGCT TGGGTTATTA TTCTCGAGTT 300 CGCAATATGC AGGCTGCAGC CCAGCAGATT ATGACTGACT TTGGTGGCCA ATTTCCAAAT 360 ACCTATGAAG GAATTTCCAG CTTGAAAGGG ATTGGACCTT ACACAGCAGG AGCCATTTCC 420 AGTATTGCTT TTAACTTGCC TGAGCCAGCT GTAGATGGTA ATGTCATGCG GGTCTTGGCG 480 CGTCTGTTTG AAGTCAACCA CGATATTGGG ATTCCAAGTA ATCGAAAAAT TTTTCAGGCA 540 ATGATGGAGA TCTTGATTAA TCCAGATCGT CCGGGTGATT TTAATCAAGC CTTGATGGAC 600 TTAGGGTCTG ATATTGAGTC TCCTGTAAAT CCCAGACCTG AAGAAAGCCC AGTCAAGGAC 660 TTTAGTGCGG CATATCAGAA TGGAACCATG GACCGTTATC CAATTAAATC TCCTAAGAAA 720 AAGCCGGTTC CTATTTATCT TAAAGCCTTA GTTGTGAAAA ATTCTCAAGG ACAATTTTTA 780 CTTGAAAAAA ATGAAAGCGA AAAGCTCTTG GCAGGTTTTT GGCATTTCCC CTTTATAGAA 840 GTTGATAACT TTTCGCAAGA AGAGCAGTTT GACCTCTTTC ATCAGGTTGC GGAAGAAAGT 900 GTGAACTCTG GCCCCAGTCC CAGAAGAGAG TTTCCAGCAG GACTATGACC TAGATGTTGA 960

【００９５】（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３１９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： Met Leu Gly Phe Glu Arg Ile Arg Tyr Arg His Val Ala Gly Gly Glu 1 5 10 15 Ser His Phe Phe Pro Val Arg Lys Leu Leu Ala Trp Tyr Asp Glu Asn 20 25 30 Lys Arg Asp Leu Pro Trp Arg Arg Ser Lys Asn Pro Tyr His Ile Trp 35 40 45 Val Ser Glu Ile Met Leu Gln Gln Thr Arg Val Asp Thr Val Ile Pro 50 55 60 Tyr Tyr Glu Arg Phe Leu Asp Trp Phe Pro Thr Val Glu Ser Leu Ala 65 70 75 80 Thr Ala Pro Glu Glu Ser Leu Leu Lys Ala Trp Glu Gly Leu Gly Tyr 85 90 95 Tyr Ser Arg Val Arg Asn Met Gln Ala Ala Ala Gln Gln Ile Met Thr 100 105 110 Asp Phe Gly Gly Gln Phe Pro Asn Thr Tyr Glu Gly Ile Ser Ser Leu 115 120 125 Lys Gly Ile Gly Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Phe 130 135 140 Asn Leu Pro Glu Pro Ala Val Asp Gly Asn Val Met Arg Val Leu Ala 145 150 155 160 Arg Leu Phe Glu Val Asn His Asp Ile Gly Ile Pro Ser Asn Arg Lys 165 170 175 Ile Phe Gln Ala Met Met Glu Ile Leu Ile Asn Pro Asp Arg Pro Gly 180 185 190 Asp Phe Asn Gln Ala Leu Met Asp Leu Gly Ser Asp Ile Glu Ser Pro 195 200 205 Val Asn Pro Arg Pro Glu Glu Ser Pro Val Lys Asp Phe Ser Ala Ala 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Thr Met Asp Arg Tyr Pro Ile Lys Ser Pro Lys Lys 225 230 235 240 Lys Pro Val Pro Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Val Val Lys Asn Ser Gln 245 250 255 Gly Gln Phe Leu Leu Glu Lys Asn Glu Ser Glu Lys Leu Leu Ala Gly 260 265 270 Phe Trp His Phe Pro Phe Ile Glu Val Asp Asn Phe Ser Gln Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asp Leu Phe His Gln Val Ala Glu Glu Ser Val Asn Ser Gly 290 295 300 Pro Ser Pro Arg Arg Glu Phe Pro Ala Gly Leu Xaa Pro Arg Cys 305 310 315

【００９６】（２）配列番号：５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： GCAGCCCAGC AGATTATGAC T 21

【００９７】（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： AACCGGCTTT TTCTTAGGAG 20

【００９８】（２）配列番号：７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７： AACTGAGACT GGCTTTAAGA GATTA 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｔ 33/50 Ｐ 33/566 33/566 33/68 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:46） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニーＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュー・ホライズンズ・コート（番地の表示なし) (72)発明者マグダレーナ・サラカインアメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウエスト・チェスター、ウッドミント・ドライブ126番 (72)発明者ジェイムズ・レイモンド・ブラウンアメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バーウィン、ロビンズ・レイン９番 (72)発明者デイビッド・ジョン・ホームズアメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウエスト・チェスター、ウッドミント・ドライブ126番 (72)発明者マイケル・テレンス・ブラックフランス78110ル・ヴェシネ、ブールヴアール・ダングルテール47番 (72)発明者ジョン・エドワード・ホッジソンフランス75020パリ、クール・ドウ・ヴァンセンヌ35番 (72)発明者デイビッド・ジャスティン・チャールズ・ノウルズイギリス、アールエイチ１・６エルワイ、サリー、レッドヒル、クロンクス・ヒル・ロード45番、ダウンズビュー・ハウス (72)発明者マイケル・アーサー・ロネットアメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カレッジビル、ビクトリア・サークル18番 (72)発明者リチャード・オークリー・ニコラスアメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カレッジビル、カーメン・ドライブ355番 (72)発明者ロバート・キング・ストドーラアメリカ合衆国19031ペンシルベニア州フラワータウン、ホーズ・レイン309番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドコードしているポリヌクレオチドに対して少
なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ中
に含まれるｍｕｔＹ遺伝子により発現されるのと同じ成
熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対
して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
に対して相捕的であるポリヌクレオチド；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌク
レオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリ
ヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチ
ド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。
【請求項３】ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。
【請求項４】配列番号１に示す核酸配列を含む請求項
２のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号１に示すヌクレオチド１から１
１７３までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチ
ド。
【請求項７】請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
ター。
【請求項８】請求項７のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】請求項８の宿主細胞から上記ＤＮＡによ
りコードされているポリペプチドを発現させることを含
む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】ｍｕｔＹポリペプチドまたはフラグメ
ントの製造方法であって、該ポリペプチドまたはフラグ
メントの生成に十分な条件下で請求項８の宿主を培養す
ることを含む方法。
【請求項１１】配列番号：２のアミノ酸配列に対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド。
【請求項１２】配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
むポリペプチド。
【請求項１３】請求項１１のポリペプチドに対する抗
体。
【請求項１４】請求項１１のポリペプチドの活性また
は発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項１５】治療上有効量の請求項１１のポリペプ
チドを個体に投与することを含む、ｍｕｔＹポリペプチ
ドを必要とする個体の治療方法。
【請求項１６】治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
ニストを個体に投与することを含む、ｍｕｔＹポリペプ
チドの阻害を必要とする個体の治療方法。
【請求項１７】個体における請求項１１のポリペプチ
ドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であっ
て、（ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
すること、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該
ポリペプチドの存在または量について分析することを含
む方法。
【請求項１８】請求項１１のポリペプチドと相互作用
して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方
法であって、化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条
件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物と
を接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作
用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出
可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したもので
ある）、次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性
化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。
【請求項１９】哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応答
を生じさせて動物を疾病から防御するに十分な請求項１
１のｍｕｔＹポリペプチドまたはそのフラグメントもし
くは変種を哺乳動物に接種することを含む方法。
【請求項２０】哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、ｍｕｔＹポリペプチドまたはそのフ
ラグメントもしくは変種をインビボで発現させて、抗体
および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的応
答を誘導して該動物を疾病から防御するするために、請
求項１１のｍｕｔＹポリペプチドまたはそのフラグメン
トもしくは変種の発現を指令する核酸ベクターを送達す
ることを含む方法。