JPH11240879A - ピラゾールスルホニルウレアのポリクローナル抗体及び検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ピラゾールスルホニルウレアの免疫化学
的検出方法。 【解決手段】 式（Ｉ）： 【化１】 〔式中、（１）Ｒ¹が水素を表す場合、Ｒ²はメチル又は
エチル、Ｒ³は（ＣＨ₂） _nＣＯＯＨを表し、（２）Ｒ¹が
塩素、Ｒ²が水素又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す場合、
Ｒ³はメチルを表し、（３）Ｒ¹が塩素、Ｒ²がメチル又
はエチルを表す場合、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表
す。〕で表されるハプテン、そのハプテンに生体高分子
が結合した複合体、その複合体を用いて調製されるピラ
ゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチルに反応性
を示すポリクローナル抗体、及びそのポリクローナル抗
体を用いることを特徴とするピラゾスルフロンエチル又
はハロスルフロンメチルの免疫化学的検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、除草剤として使用
されているピラゾスルフロンエチル（一般名）又はハロ
スルフロンメチル（一般名）に反応性を示すポリクロー
ナル抗体及びその抗体を用いる免疫化学的検出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び課題】近年、環境アセスメントの一環
として環境中に残留する農薬のモニタリングに関心が持
たれている。モニタリングに必要とされる残留分析は分
析点数が多いため、精度面以外に簡便性や迅速性が求め
られ、また安価な分析法が求められており、そのひとつ
として、免疫化学的検出方法が検討されている。

【０００３】ピラゾスルフロンエチルの免疫化学的検出
方法としては、

【０００４】

【化３】 をハプテンとする方法が、日本農芸化学学会１９９７年
度大会講演要旨集第１２２頁、講演番号３Ｇａ９、「除
草剤ピラゾスルフロンエチルに対するモノクローナル抗
体の調製とその反応特性」にて報告されている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、式（Ｉ）：

【０００６】

【化４】 〔式中、Ｒ¹は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ²は水素
原子、メチル基、エチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表
し、Ｒ³はメチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、ｎ
は１から１０の整数を表す。但し、 （１）Ｒ¹が水素原子を表す場合、Ｒ²はメチル基又はエ
チル基を表し、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。 （２）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²が水素原子又は（ＣＨ
₂）_nＣＯＯＨを表す場合、Ｒ³はメチル基を表す。 （３）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²がメチル基又はエチル
基を表す場合、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。〕で
表されるハプテン、そのハプテンに生体高分子が結合し
た複合体、その複合体を用いて調製されるピラゾスルフ
ロンエチル又はハロスルフロンメチルに反応性を示すポ
リクローナル抗体、及びそのポリクローナル抗体を用い
ることを特徴とするピラゾスルフロンエチル又はハロス
ルフロンメチルの免疫化学的検出方法であり、さらに、
式（Ｉ’）：

【０００７】

【化５】 〔式中、Ｒ¹は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ²はメチ
ル基、エチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、Ｒ³は
メチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、ｎは１から１
０の整数を表す。但し、 （１）Ｒ¹が水素原子を表す場合、Ｒ²はメチル基又はエ
チル基を表し、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。 （２）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²が（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ
を表す場合、Ｒ³はメチル基を表す。 （３）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²がメチル基又はエチル
基を表す場合、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。〕で
表されるピラゾールスルホニルウレアである。

【０００８】

【発明の実施の形態】ハプテンとしては、表１に記載の
化合物があげられる。

【０００９】

【表１】表１ ――――――――――――――――――――――― No. Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ ――――――――――――――――――――――― 1 H CH₃ CH₂COOH 2 H CH₃ (CH₂)₂COOH 3 H CH₃ (CH₂)₃COOH 4 H CH₃ (CH₂)₄COOH 5 H CH₃ (CH₂)₅COOH 6 H CH₃ (CH₂)₆COOH 7 H CH₃ (CH₂)₇COOH 8 H CH₃ (CH₂)₈COOH 9 H CH₃ (CH₂)₉COOH 10 H CH₃ (CH₂)₁₀COOH 11 H C₂H₅ CH₂COOH 12 H C₂H₅ (CH₂)₂COOH 13 H C₂H₅ (CH₂)₃COOH 14 H C₂H₅ (CH₂)₄COOH 15 H C₂H₅ (CH₂)₅COOH 16 H C₂H₅ (CH₂)₆COOH 17 H C₂H₅ (CH₂)₇COOH 18 H C₂H₅ (CH₂)₈COOH 19 H C₂H₅ (CH₂)₉COOH 20 H C₂H₅ (CH₂)₁₀COOH 21 Cl CH₃ CH₂COOH 22 Cl CH₃ (CH₂)₂COOH ―――――――――――――――――――――――

【００１０】

【表２】表１（続き） ――――――――――――――――――――――― No. Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ ――――――――――――――――――――――― 23 Cl CH₃ (CH₂)₃COOH 24 Cl CH₃ (CH₂)₄COOH 25 Cl CH₃ (CH₂)₅COOH 26 Cl CH₃ (CH₂)₆COOH 27 Cl CH₃ (CH₂)₇COOH 28 Cl CH₃ (CH₂)₈COOH 29 Cl CH₃ (CH₂)₉COOH 30 Cl CH₃ (CH₂)₁₀COOH 31 Cl C₂H₅ CH₂COOH 32 Cl C₂H₅ (CH₂)₂COOH 33 Cl C₂H₅ (CH₂)₃COOH 34 Cl C₂H₅ (CH₂)₄COOH 35 Cl C₂H₅ (CH₂)₅COOH 36 Cl C₂H₅ (CH₂)₆COOH 37 Cl C₂H₅ (CH₂)₇COOH 38 Cl C₂H₅ (CH₂)₈COOH 39 Cl C₂H₅ (CH₂)₉COOH 40 Cl C₂H₅ (CH₂)₁₀COOH 41 Cl H CH₃ 42 Cl CH₂COOH CH₃ 43 Cl (CH₂)₂COOH CH₃ 44 Cl (CH₂)₃COOH CH₃ ―――――――――――――――――――――――

【００１１】

【表３】表１（続き） ――――――――――――――――――――――― No. Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ ――――――――――――――――――――――― 45 Cl (CH₂)₄COOH CH₃ 46 Cl (CH₂)₅COOH CH₃ 47 Cl (CH₂)₆COOH CH₃ 48 Cl (CH₂)₇COOH CH₃ 49 Cl (CH₂)₈COOH CH₃ 50 Cl (CH₂)₉COOH CH₃ 51 Cl (CH₂)₁₀COOH CH₃ ――――――――――――――――――――――― ピラゾスルフロンエチルに反応性を示すポリクローナル
抗体の調製に適するハプテンとしては、No.1からNo.20
があげられ、好ましくはNo.11からNo.20があげられ、特
に好ましくはNo.13があげられる。

【００１２】ハロスルフロンメチルに反応性を示すポリ
クローナル抗体の調製に適するピラゾールスルホニルウ
レアとしては、No.21からNo.51があげられ、好ましくは
No.21からNo.30があげられ、特に好ましくはNo.23があ
げられる。

【００１３】新規なピラゾールスルホニルウレアとして
は、上記の表からNo.41を除いたものがあげられる。

【００１４】本発明におけるポリクローナル抗体の調製
は常法、例えば、生化学実験法１１、「エンザイムイム
ノアッセイ」、東京化学同人（１９８９発行）に記載さ
れた方法により行うことができる。

【００１５】具体的には、式（Ｉ）で表されるハプテン
を合成し、生体高分子、例えば、ヘモシアニン（例え
ば、キーホールリンペットヘモシアニン）、血清アルブ
ミン（例えば、ウシ血清アルブミン）又は卵白アルブミ
ン等に、例えば、カルボジイミド法、活性化エステル法
又は混合酸無水物法等を用いて結合させ、複合体を作製
することができる。

【００１６】この複合体を免疫原とし、免疫原溶液を用
いて哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ
又はウマ等をイン・ビボ免疫法により免疫することがで
きる。例えば、免疫原溶液を等量の免疫賦括剤（アジュ
バント）、例えば、フロイントの完全アジュバント又は
不完全アジュバントと乳化混合し、ウサギの皮下に投与
し（第１回免疫）、以後、２〜４週間の間隔で同様の処
理を行い、数回免疫する。最終免疫から１〜２週間後全
採血を行い、得られた血液から抗血清を分離後、例え
ば、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩
ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、透析及び凍結乾燥等から選ばれる１以上の精製
法を用いることによりポリクローナル抗体を得ることが
できる。

【００１７】得られたポリクローナル抗体を用いて、従
来公知の免疫化学検出法、例えば、間接競合法や直接競
合法等がそのまま適用できる。以下に具体的に記載す
る。

【００１８】間接競合法による検出法： （１）ハプテンと生体高分子、例えば、ヘモシアニン、
血清アルブミン又は卵白アルブミンとの複合体（以下抗
原という）を固相、例えば、プラスチック、膜、濾紙、
ガラス、磁性体又は金属粒子に固定化する。 （２）これに被験試料、例えば、河川水と得られたポリ
クローナル抗体（以下第１抗体という）を加える。これ
により、被験試料内のピラゾスルフロンエチル又はハロ
スルフロンメチルと抗原とが第１抗体に対して競合的な
反応を起こす。 （３）固相化した抗原を分離する。分離法としては、例
えば、ろ過、遠心処理、洗浄又は磁力があげられる。 （４）これに標識化した抗ウサギ抗体（以下第２抗体と
いう）を加える。第２抗体の標識には公知の標識体、例
えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ及び¹⁴Ｃ等の¹⁴放射性同位体、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等の酵素、
ビオチン等のビタミン、ＦＩＦＣ等の蛍光物質、又はア
クリジウム及びルミノール等の化学発光物質等を用いる
ことができる。 （４）第１抗体と結合しなかった第２抗体を除去する。 （５）第１抗体と結合した第２抗体の標識から得られる
信号を検出又は測定する。

【００１９】直接競合法による検出法： （１）ピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチ
ルに反応性を示すポリクローナル抗体を固相、例えば、
プラスチック、膜、濾紙、ガラス、磁性体又は金属粒子
に固定化する。 （２）これに被験試料、例えば、河川水と標識化したピ
ラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチルを加え
る。標識としては、例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ及び¹⁴Ｃ
等の¹⁴放射性同位体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオ
キシダーゼ等の酵素、ビオチン等のビタミン、ＦＩＦＣ
等の蛍光物質、又はアクリジウム及びルミノール等の化
学発光物質等があげられる。これにより、被験試料内の
ピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチルと標
識化したピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメ
チルがポリクローナル抗体に対して競合的な反応が起こ
す。 （３）固相化したポリクローナル抗体を分離する。分離
法としては、例えば、ろ過、遠心処理、洗浄又は磁力が
あげられる。 （４）ポリクローナル抗体と結合しなかった標識化した
ピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチルを除
去する。 （５）ポリクローナル抗体と結合した標識化したピラゾ
スルフロンエチル又はハロスルフロンメチルの標識から
得られる信号を検出又は測定する。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００２１】〔実施例１〕ハプテンの合成 （１）２−アミノ−４−ベンジルオキシ−６−メトキシ
ピリミジンの合成 アセトニトリル（３５０ｍｌ）に２−アミノ−４−ヒド
ロキシ−６−メトキシピリミジン（２１．８ｇ、１５５
ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（２９．２ｇ、１７１ｍｍｏ
ｌ）と無水炭酸カリウム（３２．０ｇ、２３１ｍｍｏ
ｌ）を加え、７時間加熱還流した。室温まで冷却後、固
体を濾別し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホ
ルム（３００ｍｌ）に溶解し、５％水酸化ナトリウム水
溶液および水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾
燥した。溶媒留去して得られた残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム）にて精製
し、目的物８．８ｇを得た。

【００２２】（２）５−（（（（４−ベンジルオキシ−
６−メトキシピリミジン−２−イル）アミノ）カルボニ
ルアミノ）スルホニル）−１−メチルピラゾール−４−
カルボン酸エチルの合成 トルエン（２００ｍｌ）に５−（（メトキシカルボニル
アミノ）スルホニル）−１−メチルピラゾール−４−カ
ルボン酸エチル（１１．６ｇ、３９．９ｍｍｏｌ）と
２−アミノ−４−ベンジルオキシ−６−メトキシピリミ
ジン（９．３０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下
（４５０ｍｍＨｇ）、９５℃で８時間加熱還流しなが
ら、生成してくるメタノールを留去した。溶媒留去して
得られた残渣に少量のジエチルエーテルを加え、析出し
た固体を濾取、乾燥し、目的物１５．７ｇを得た。融点
１６７−１７２℃ （３）５−（（（（４−ヒドロキシ−６−メトキシピリ
ミジン−２−イル）アミノ）カルボニルアミノ）スルホ
ニル）−１−メチルピラゾール−４−カルボン酸エチル
の合成 テトラヒドロフラン（２００ｍｌ）に５−（（（（４−
ベンジルオキシ−６−メトキシピリミジン−２−イル）
アミノ）カルボニルアミノ）スルホニル）−１−メチル
ピラゾール−４−カルボン酸エチル（１０．０ｇ、１
０．４ｍｍｏｌ）と５％パラジウム炭素（１．０ｇ）を
加え、常圧下室温にて水素添加（約４００ｍｌ）した。
パラジウム炭素を濾別後、溶媒留去し、得られた残渣を
ジエチルエーテルにて洗浄、乾燥して目的物５．６ｇを
得た。融点１７１−１７４℃。

【００２３】（４）４−（２−（（Ｎ−（（４−エトキ
シカルボニル−１−メチルピラゾール−５−イル）スル
ホニル）カルバモイル）アミノ）−６−メトキシピリミ
ジン−４−イルオキシ）ブタン酸ベンジル アセトニトリル（１６ｍｌ）に５−（（（（４−ヒドロ
キシ−６−メトキシピリミジン−２−イル）アミノ）カ
ルボニルアミノ）スルホニル）−１−メチルピラゾール
−４−カルボン酸エチル（ １．０ｇ、２．５ｍｍｏ
ｌ）、４−ブロモブタン酸ベンジル（３．７ｇ、１４ｍ
ｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウン
デック−７−エン（２．５ｇ、１６ｍｍｏｌ）を加え、
６０℃にて４時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合
物を氷水にあけ、希塩酸を加えて酸性にした。酢酸エチ
ルで抽出し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル）で精製
し、さらに酢酸エチル／ ジイソプロピルエーテル混合
液（１／２）で洗浄することにより目的物０．１５ｇを
得た。融点２２４−２２５℃。

【００２４】（５）４−（２−（（Ｎ−（（４−エトキ
シカルボニル−１−メチルピラゾール−５−イル）スル
ホニル）カルバモイル）アミノ）−６−メトキシピリミ
ジン−４−イルオキシ）ブタン酸 テトラヒドロフラン（１５ｍｌ）に４−（２−（（Ｎ−
（（４−エトキシカルボニル−１−メチルピラゾール−
５−イル）スルホニル）カルバモイル）アミノ）−６−
メトキシピリミジン−４−イルオキシ）ブタン酸ベンジ
ル（ ０．１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）と５％パラジウム
炭素（０．０２ｇ）を加え、常圧下室温にて２４時間水
素添加した。パラジウム炭素を濾別後、溶媒留去し、得
られた残渣をクロロホルム／ジイソプロピルエーテル混
合液（１／２）で洗浄、乾燥して目的物０．０７ｇを得
た。融点１４６−１５０℃。

【００２５】〔実施例２〕ハプテンとキーホールリンペ
ットヘモシアニンとの複合体の製造法（活性エステル化
法） 実施例１で製造したハプテン、Ｎ−ヒドロキシサクシミ
イミド及びＮ−Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド
を乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、室温中一晩撹拌
した。これに、生体高分子であるキーホールリンペット
ヘモシアニンと緩衝液からなる溶液をゆっくりと滴下
し、室温中一晩撹拌した。生じた反応副産物をろ過によ
り除き、ろ液を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥するこ
とで目的の複合体を得た。

【００２６】〔実施例３〕ハプテンとウシ血清アルブミ
ンとの複合体の製造法 実施例２と同様にして、活性化エステル法によりハプテ
ンを生体高分子であるウシ血清アルブミンと結合し、目
的の複合体を得た。

【００２７】〔実施例４〕抗体価の確認 ９６穴マイクロプレートの各ウェルに実施例３で得られ
た複合体（ハプテン−ＢＳＡ複合体）を抗原として固定
化した。これに実施例２で得られた複合体（ハプテン−
ＫＬＨ複合体）を抗原としてウサギに免疫することで得
られた血清の希釈溶液を加えて反応させた（１次抗体反
応）。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ ＰＯＤ（ペルオキシダ
ーゼ）標識抗体を加え反応させた（２次抗体反応）。洗
浄後、これにＡＢＴＳ（２，２*-アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾーリンスルホン酸ジアンモニウム塩）及
び過酸化水素水を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定し
た。試薬はＫＰＬ社のキットを使用した。結果を表２に
示す。

【００２８】

【表４】 表２ 精製した抗体の抗体価（４１５ｎｍでの吸光度（ａｂｓ）） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 免疫前 精製抗体希釈倍率 (初期濃度約3.5mg/ml) 血清 100 400 1600 6400 25600 102400 409600 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ウサギ-1 0.0037 2.816 2.609 1.970 1.064 0.427 0.173 0.069 ウサギ-2 0.0035 2.767 2.463 1.550 0.923 0.325 0.107 0.058 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 表２より明らかなように、免疫前血清ではハプテン−Ｂ
ＳＡ複合体に反応する抗体がほとんど存在せず、免疫す
ることにより、ハプテン−ＢＳＡ複合体に反応する抗体
が調製されたことが確認された。また、希釈倍率と吸光
度に相関があり、高い希釈倍率でも反応することから、
この抗体をＥＬＩＳＡ法にて使用できる。

【００２９】〔実施例５〕ポリクローナル抗体の調製 実施例２で得られた複合体を生理食塩水に溶解し、等容
量のフロイントの完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ製）と
混合した後、クリーンウサギに皮下接種した。以後２週
間ごとに５回追加免疫した。２回目以降はフロイントの
不完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ製）を使用した。最終
免疫から１週間後全採血を行い、得られた血液から抗血
清を分離した。得られた抗血清を硫酸アンモニウムで塩
析後、プロテイン−Ａアガロースアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製し、目的のポリクローナル抗体
を得た。

【００３０】〔実施例６〕ポリクローナル抗体の調製 実施例３で得られた複合体を用いて、実施例５と同様に
して、目的のポリクローナル抗体を得た。

【００３１】〔実施例７〕間接競合法による検出 （１）ハプテン−ＢＳＡ複合体をコーティング液（ＫＰ
Ｌ社製）に溶解し、この溶液を９６穴マイクロプレート
（Maxisorp, Nalge Nunc社製）の各ウェルに入れた。約
１時間振とうし、固定化した。この溶液を除き各ウェル
を洗浄液（ＫＰＬ社製）にて洗浄した。 （２）各ウェルに希釈したブロッキング液（雪印乳業
製）を入れ、約３０分振とう後、この溶液を除き各ウェ
ルを洗浄液にて洗浄した。 （３）水に溶解したピラゾスルフロンエチル溶液を各ウ
ェルに入れた。実施例５で得られたピラゾスルフロンエ
チルに反応性を示すポリクローナル抗体を希釈したブロ
ッキング液に溶解し各ウェルに入れた。約37℃下約30分
間振とうし競合させた。この溶液を除き各ウェルを洗浄
液にて洗浄した。 （４）二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合
抗ウサギIg Gヤギ抗体（ＫＰＬ社製）を希釈したブロッ
キング液に溶解し各ウェルに入れた。約１時間振とう
後、この溶液を除き各ウェルを洗浄液（ＫＰＬ社製）に
て洗浄した。 （５）3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン（東京化成
製）のＤＭＳＯ溶液と過酸化水素水、クエン酸−酢酸緩
衝液を混合した溶液を各ウェルに入れ、約１０分間振と
うし発色させた。 （６）１規定硫酸を各ウェルに入れ、反応を停止させ
た。 （７）マイクロプレートリーダー（バイオラッド製）を
用いて450 nmの吸光度を測定した。結果を表３に示す。

【００３２】

【表５】 表３ 間接競合法での結果例 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ピラゾスルフロンエチル濃度（ppb） 0 1 10 100 1000 10000 100000 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 吸光度 0.871 0.855 0.897 0.830 0.764 0.653 0.490 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 表３により明らかなように、ピラゾスルフロンエチル濃
度の増加に伴い吸光度が低下し、濃度相関が確認され
た。

【００３３】〔実施例８〕ハプテンと西洋ワサビペルオ
キシダーゼとの複合体の製造法 実施例２と同様にして、活性化エステル法によりハプテ
ンを生体高分子である西洋ワサビペルオキシダーゼ（KP
L社製）と結合し、目的の複合体を得た。

【００３４】〔実施例９〕直接競合法による検出 （１）ピラゾスルフロンエチルに反応性を示すポリクロ
ーナル抗体をコーティング液に溶解し、この溶液を９６
穴マイクロプレート（Nalge Nunc社製）の各ウェルに入
れた。約１時間振とうし、固定化させた。この溶液を除
き各ウェルを洗浄液にて洗浄した。 （２）各ウェルに希釈したブロッキング液を入れ、約３
０分振とう後、この溶液を除き各ウェルを洗浄液にて洗
浄した。 （３）水に溶解したピラゾスルフロンエチル溶液を各ウ
ェルに入れた。ハプテンー西洋ワサビペルオキシダーゼ
複合体を希釈したブロッキング液に溶解し各ウェルに入
れた。約３７℃で約１時間振とうし競合させた。この溶
液を除き各ウェルを洗浄液にて洗浄した。 （４）3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン（東京化成
製）のＤＭＳＯ溶液と過酸化水素水、クエン酸−酢酸緩
衝液を混合した溶液を各ウェルに入れ、約１０分間振と
うし発色させた。 （５）１規定硫酸を各ウェルに入れ、反応を停止させ
た。 （６）マイクロプレートリーダー（バイオラッド製）を
用いて450 nmの吸光度を測定した。結果を表４に示す。

【００３５】

【表６】 表４ 直接競合法による結果例 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ピラゾスルフロンエチル濃度（ppb） 0 1 10 100 1000 10000 100000 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 吸光度 0.863 0.875 0.836 0.828 0.825 0.784 0.650 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 表４により明らかなように、ピラゾスルフロンエチル濃
度の増加に伴い吸光度が低下し、濃度相関が確認され
た。

【００３６】

【効果】本発明のポリクローナル抗体を用いる免疫化学
的検出方法により、ピラゾスルフロンエチル又はハロス
ルフロンメチルが精度よく分析できる。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 〔式中、Ｒ¹は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ²は水素
   原子、メチル基、エチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表
   し、Ｒ³はメチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、ｎ
   は１から１０の整数を表す。但し、 （１）Ｒ¹が水素原子を表す場合、Ｒ²はメチル基又はエ
   チル基を表し、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。 （２）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²が水素原子又は（ＣＨ
   ₂）_nＣＯＯＨを表す場合、Ｒ³はメチル基を表す。 （３）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²がメチル基又はエチル
   基を表す場合、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。〕で
   表されるハプテン。
2. 【請求項２】 Ｒ¹が水素原子を表し、Ｒ²がエチル基を
   表し、Ｒ³が（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す請求項１のハプ
   テン。
3. 【請求項３】 Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²がメチル基を
   表し、Ｒ³が（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す請求項１のハプ
   テン。
4. 【請求項４】 Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²が（ＣＨ₂）_n
   ＣＯＯＨを表し、Ｒ ³がメチル基を表す請求項１のハプ
   テン。
5. 【請求項５】 請求項１乃至請求項４のハプテンに生体
   高分子が結合した複合体。
6. 【請求項６】 生体高分子がヘモシアニン、血清アルブ
   ミン、卵白アルブミン又は免疫グロブリンである請求項
   ５の複合体。
7. 【請求項７】 請求項５又は請求項６の複合体を用いて
   調製される、ピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロ
   ンメチルに反応性を示すポリクローナル抗体。
8. 【請求項８】 請求項２のハプテンに生体高分子が結合
   した複合体を用いて調製される、ピラゾスルフロンエチ
   ルに反応性を示すポリクローナル抗体。
9. 【請求項９】 請求項３又は請求項４のハプテンに生体
   高分子が結合した複合体を用いて調製される、ハロスル
   フロンメチルに反応性を示すポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１乃至請求項４のハプテンに生
    体高分子を結合させて複合体を調製する方法。
11. 【請求項１１】 請求項５又は請求項６の複合体を用い
    て、ピラゾスルフロンエチル又はハロスルフロンメチル
    に反応性を示すポリクローナル抗体を調製する方法。
12. 【請求項１２】 請求項７のポリクローナル抗体を用い
    ることを特徴とする、ピラゾスルフロンエチル又はハロ
    スルフロンメチルの免疫化学的検出方法。
13. 【請求項１３】 請求項８のポリクローナル抗体を用い
    ることを特徴とする、ピラゾスルフロンエチルの免疫化
    学的検出方法。
14. 【請求項１４】 請求項９のポリクローナル抗体を用い
    ることを特徴とする、ハロスルフロンメチルの免疫化学
    的検出方法。
15. 【請求項１５】 式（Ｉ’）： 【化２】 〔式中、Ｒ¹は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ²はメチ
    ル基、エチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、Ｒ³は
    メチル基又は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表し、ｎは１から１
    ０の整数を表す。但し、 （１）Ｒ¹が水素原子を表す場合、Ｒ²はメチル基又はエ
    チル基を表し、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。 （２）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²が（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ
    を表す場合、Ｒ³はメチル基を表す。 （３）Ｒ¹が塩素原子を表し、Ｒ²がメチル基又はエチル
    基を表す場合、Ｒ³は（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨを表す。〕で
    表されるピラゾールスルホニルウレア。