JPH11235173A - キメラセリンプロテアーゼ - Google Patents
キメラセリンプロテアーゼInfo
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- JPH11235173A JPH11235173A JP10343777A JP34377798A JPH11235173A JP H11235173 A JPH11235173 A JP H11235173A JP 10343777 A JP10343777 A JP 10343777A JP 34377798 A JP34377798 A JP 34377798A JP H11235173 A JPH11235173 A JP H11235173A
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 血液ホメオスタシスに有用なキメラセリンプ
ロテアーゼを提供することを課題とする。 【解決手段】 第一セリンプロテアーゼの第一ドメイン
・ハーフに相当する第一ドメイン・ハーフと、第二セリ
ンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフに相当する第二
ドメイン・ハーフとの、βシート構造の２つのドメイン
・ハーフ（ハーフ・サイド）を含むプロテアーゼ・ドメ
インを有するキメラセリンプロテアーゼが提供され、該
キメラセリンプロテアーゼは、改良された性質を有し、
結晶化が容易である。
ロテアーゼを提供することを課題とする。 【解決手段】 第一セリンプロテアーゼの第一ドメイン
・ハーフに相当する第一ドメイン・ハーフと、第二セリ
ンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフに相当する第二
ドメイン・ハーフとの、βシート構造の２つのドメイン
・ハーフ（ハーフ・サイド）を含むプロテアーゼ・ドメ
インを有するキメラセリンプロテアーゼが提供され、該
キメラセリンプロテアーゼは、改良された性質を有し、
結晶化が容易である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キメラセリンプロ
テアーゼ、好ましくはキモトリプシン・ファミリーのサ
ブグループに由来するキメラセリンプロテアーゼに関し
（Rawlings,N.D.et al.,Methods Enzymol.244(1994)19-
61）、さらにタンパク質のプロテアーゼ分解のためのそ
れらの使用に関する。
テアーゼ、好ましくはキモトリプシン・ファミリーのサ
ブグループに由来するキメラセリンプロテアーゼに関し
（Rawlings,N.D.et al.,Methods Enzymol.244(1994)19-
61）、さらにタンパク質のプロテアーゼ分解のためのそ
れらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト・セリンプロテアーゼおよび哺乳動
物由来のセリン・プロテアーゼは、多数の生理学的過程
に関与している（Barrett,A.J., Methods in Enzymolog
y, Vol.244(1994) Academic Press, New York; Twinin
g,S.S., Crit.Revs.Biochem.Mol.Biol.29(1994) 315-38
3）。血液凝固（Davie,E.W.et al., Biochemistry 20(1
991) 10363-10370）、受精（Baba,T., FEBS Letters 27
(1989) 296-300）、プログラム細胞死、および免疫反応
における補体活性化（Goldberger,G.et al., J.Biol.Ch
em.262(1987) 10065-10071）は、本質的にタンパク質分
解である。さらに、昆虫細胞由来（Gay,N.J.et al., Bi
ochim.Biophys.Acta 1132(1992) 290-296）、ウイルス
由来（Allaire,M.et al., Nature 369(1994) 72-76）、
および原核生物由来のセリンプロテアーゼも知られてい
る。原核生物由来のセリンプロテアーゼとしては、例え
ば、ズブチリシン（Kraut,J.,in The Enzymes(Boyer,P.
D.編）第3巻,547-560(1971) Academic Press,New York
and London）、カルボキシペプチダーゼII（Liao,D.et
al., Biochemistry 31(1992) 9796-9812）、およびスト
レプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）
トリプシン（Read,R.J.and James,M.N.G., J.Mol.Biol.
200(1988) 523-551）などが挙げられる。
物由来のセリン・プロテアーゼは、多数の生理学的過程
に関与している（Barrett,A.J., Methods in Enzymolog
y, Vol.244(1994) Academic Press, New York; Twinin
g,S.S., Crit.Revs.Biochem.Mol.Biol.29(1994) 315-38
3）。血液凝固（Davie,E.W.et al., Biochemistry 20(1
991) 10363-10370）、受精（Baba,T., FEBS Letters 27
(1989) 296-300）、プログラム細胞死、および免疫反応
における補体活性化（Goldberger,G.et al., J.Biol.Ch
em.262(1987) 10065-10071）は、本質的にタンパク質分
解である。さらに、昆虫細胞由来（Gay,N.J.et al., Bi
ochim.Biophys.Acta 1132(1992) 290-296）、ウイルス
由来（Allaire,M.et al., Nature 369(1994) 72-76）、
および原核生物由来のセリンプロテアーゼも知られてい
る。原核生物由来のセリンプロテアーゼとしては、例え
ば、ズブチリシン（Kraut,J.,in The Enzymes(Boyer,P.
D.編）第3巻,547-560(1971) Academic Press,New York
and London）、カルボキシペプチダーゼII（Liao,D.et
al., Biochemistry 31(1992) 9796-9812）、およびスト
レプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）
トリプシン（Read,R.J.and James,M.N.G., J.Mol.Biol.
200(1988) 523-551）などが挙げられる。
【０００３】血液ホメオスタシス、即ち血液凝固と線溶
との平衡は、相互に影響し合う、いくつかの極めて複雑
な系により確保されている。これに関して、プロテアー
ゼは、血液凝固、フィブリン形成による創傷治癒におい
ても、線溶、即ち血餅溶解においても役割を果たす。傷
害後、「傷害シグナル」は、血液凝固を開始する酵素を
活性化する不活型プロ酵素の連続的な活性化（特異的な
プロテアーゼ分解）により増幅され、迅速な創傷治癒を
確実なものにする。血液凝固（止血）は2つの経路によ
り開始されうる。それら2つの経路とは、全てのタンパ
ク質成分が血中に存在する内因性の経路と、膜タンパク
質、いわゆる組織因子が重要な役割を果たす外因性の経
路とである。血液ホメオスタシスの分子的メカニズムお
よびこれに関与している成分は、いくつかの総説に包括
的に開示されている（Furie,B.etal., Cell 53(1988) 5
05-518; Davie,E.W.et al., Biochem.30(1991) 10363-1
0379; Bergmeyer,H.U.編: Methods of Enzymatic Analy
sis,第V巻,第3章,第3版,Academic Press,New York（198
3））。
との平衡は、相互に影響し合う、いくつかの極めて複雑
な系により確保されている。これに関して、プロテアー
ゼは、血液凝固、フィブリン形成による創傷治癒におい
ても、線溶、即ち血餅溶解においても役割を果たす。傷
害後、「傷害シグナル」は、血液凝固を開始する酵素を
活性化する不活型プロ酵素の連続的な活性化（特異的な
プロテアーゼ分解）により増幅され、迅速な創傷治癒を
確実なものにする。血液凝固（止血）は2つの経路によ
り開始されうる。それら2つの経路とは、全てのタンパ
ク質成分が血中に存在する内因性の経路と、膜タンパク
質、いわゆる組織因子が重要な役割を果たす外因性の経
路とである。血液ホメオスタシスの分子的メカニズムお
よびこれに関与している成分は、いくつかの総説に包括
的に開示されている（Furie,B.etal., Cell 53(1988) 5
05-518; Davie,E.W.et al., Biochem.30(1991) 10363-1
0379; Bergmeyer,H.U.編: Methods of Enzymatic Analy
sis,第V巻,第3章,第3版,Academic Press,New York（198
3））。
【０００４】血液ホメオスタシスの均衡（血液凝固：線
溶）が崩れ、血液の凝固傾向が増加すると、例えば、深
静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および発作のよう
な、様々な血栓性の疾患／病気が起こりうる（Mustard,
J.F.et al.,In: Haemostasis and Thrombosis. Bloom,
A.L.and Thomas,D.P.編,第2版,Churchill-Livingstone,
Edinburgh,(1987) 618-650頁）。血友病A（VIII因子の
欠損）および血友病B（IX因子の欠損）のような、出血
を伴う血液凝固障害は、血液の凝固傾向の減少の結果起
こりうる。
溶）が崩れ、血液の凝固傾向が増加すると、例えば、深
静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および発作のよう
な、様々な血栓性の疾患／病気が起こりうる（Mustard,
J.F.et al.,In: Haemostasis and Thrombosis. Bloom,
A.L.and Thomas,D.P.編,第2版,Churchill-Livingstone,
Edinburgh,(1987) 618-650頁）。血友病A（VIII因子の
欠損）および血友病B（IX因子の欠損）のような、出血
を伴う血液凝固障害は、血液の凝固傾向の減少の結果起
こりうる。
【０００５】従って、血液凝固および線溶の系に影響を
及ぼすことのできる物質が、医療において必要とされて
いる。血液から単離された、または組換え作製されたVI
II因子もしくはIX因子、または最近ではVII因子も、例
えば血友病AおよびBの治療に使用されている。tPA（組
織型プラスミノーゲン・アクチベーター）およびストレ
プトキナーゼ（細菌由来のプラスミノーゲン・アクチベ
ーター）は、例えば心筋梗塞後に血餅を溶解するために
使用される。例えば、ヒルジン（65アミノ酸からなるペ
プチド、特異的なトロンビン阻害剤; Maraganore,J.M.,
Thrombosis and Haemostasis 70(1993) 208-211）、ヘ
パリン（ヘテログリカン、内因性阻害剤の補因子; Barr
owcliffe,T.W.et al.,In:Haemostasis and Thrombosis.
Bloom,A.L.et al.編;第3版,Churchill-Livingstone,Ed
inburgh(1994),第2巻,1417-1438頁）、および経口ビタ
ミンKアンタゴニスト（γ-カルボキシル化の阻害剤；Gl
aドメインのGlu残基; Hirsh,J.et al.,In:Hemostasis a
nd Thrombosis, Basic Principles and Clinical Praxi
s, Colman,R.W.et al.編,第3版, Lippincott,Philadelp
hia,(1994)1567-1583頁）のような抗血栓性物質（Harke
r,L.A.et al., In:Hemostasis and Thrombosis:Basic P
rinciples and Clinical Praxis,Colman, R.W.et al.
編,第3版,Lippincott,Philadelphia,(1994)1638-1660
頁）は、血液凝固を阻害するために使用される。しか
し、利用可能な物質は、未だに非常に高価であったり
（タンパク質因子）、かつ／または医学的な適用に関し
ては理想的でなかったり、かなりの副作用をもたらすこ
とが多い。
及ぼすことのできる物質が、医療において必要とされて
いる。血液から単離された、または組換え作製されたVI
II因子もしくはIX因子、または最近ではVII因子も、例
えば血友病AおよびBの治療に使用されている。tPA（組
織型プラスミノーゲン・アクチベーター）およびストレ
プトキナーゼ（細菌由来のプラスミノーゲン・アクチベ
ーター）は、例えば心筋梗塞後に血餅を溶解するために
使用される。例えば、ヒルジン（65アミノ酸からなるペ
プチド、特異的なトロンビン阻害剤; Maraganore,J.M.,
Thrombosis and Haemostasis 70(1993) 208-211）、ヘ
パリン（ヘテログリカン、内因性阻害剤の補因子; Barr
owcliffe,T.W.et al.,In:Haemostasis and Thrombosis.
Bloom,A.L.et al.編;第3版,Churchill-Livingstone,Ed
inburgh(1994),第2巻,1417-1438頁）、および経口ビタ
ミンKアンタゴニスト（γ-カルボキシル化の阻害剤；Gl
aドメインのGlu残基; Hirsh,J.et al.,In:Hemostasis a
nd Thrombosis, Basic Principles and Clinical Praxi
s, Colman,R.W.et al.編,第3版, Lippincott,Philadelp
hia,(1994)1567-1583頁）のような抗血栓性物質（Harke
r,L.A.et al., In:Hemostasis and Thrombosis:Basic P
rinciples and Clinical Praxis,Colman, R.W.et al.
編,第3版,Lippincott,Philadelphia,(1994)1638-1660
頁）は、血液凝固を阻害するために使用される。しか
し、利用可能な物質は、未だに非常に高価であったり
（タンパク質因子）、かつ／または医学的な適用に関し
ては理想的でなかったり、かなりの副作用をもたらすこ
とが多い。
【０００６】全ての抗血栓性物質が、血液凝固カスケー
ドの一つ、または通常はいくつかの標的を阻害する。抗
血栓性物質により止血系が部分的に不活化されることに
伴う必然的な代償は、出血の危険性が増大することであ
る。経口で利用可能なビタミンKアンタゴニストは、例
えば血清プロテアーゼFVII、FIX、FX、およびトロンビ
ンのような、γ-カルボキシル化により翻訳後修飾を受
けるGlaドメインを有するビタミンK依存性凝固因子を全
て阻害する。従って、この抗血栓治療は、極めて非特異
的であり、内因性止血系にも外因性止血系にも影響を及
ぼす。ビタミンKアンタゴニストと同様に、ヘパリン
も、血液凝固カスケード内のいくつかの標的を阻害す
る。その抗血栓作用は、天然の阻害剤であるアンチトロ
ンビンIIIとの複合体形成速度を増加させることによ
る、例えばトロンビン、FIXa、およびFXaの不活化の増
強による。特異的なトロンビン阻害剤である、ヒルに由
来するヒルジンですら、出血の頻度が高いため、臨床試
験では成功していない。したがって、副作用に対して有
益性の比率が高い、選択的で副作用の少ない新規な抗血
栓性物質が必要とされている。これに関して、FXaによ
り媒介されるプロトロンビンからトロンビンへの活性化
の、特異的なFXa阻害剤による阻害は、魅力的な標的で
あると考えられる。
ドの一つ、または通常はいくつかの標的を阻害する。抗
血栓性物質により止血系が部分的に不活化されることに
伴う必然的な代償は、出血の危険性が増大することであ
る。経口で利用可能なビタミンKアンタゴニストは、例
えば血清プロテアーゼFVII、FIX、FX、およびトロンビ
ンのような、γ-カルボキシル化により翻訳後修飾を受
けるGlaドメインを有するビタミンK依存性凝固因子を全
て阻害する。従って、この抗血栓治療は、極めて非特異
的であり、内因性止血系にも外因性止血系にも影響を及
ぼす。ビタミンKアンタゴニストと同様に、ヘパリン
も、血液凝固カスケード内のいくつかの標的を阻害す
る。その抗血栓作用は、天然の阻害剤であるアンチトロ
ンビンIIIとの複合体形成速度を増加させることによ
る、例えばトロンビン、FIXa、およびFXaの不活化の増
強による。特異的なトロンビン阻害剤である、ヒルに由
来するヒルジンですら、出血の頻度が高いため、臨床試
験では成功していない。したがって、副作用に対して有
益性の比率が高い、選択的で副作用の少ない新規な抗血
栓性物質が必要とされている。これに関して、FXaによ
り媒介されるプロトロンビンからトロンビンへの活性化
の、特異的なFXa阻害剤による阻害は、魅力的な標的で
あると考えられる。
【０００７】血液凝固、線溶およびホメオスタシスの新
規な調節剤（活性化剤、阻害剤）の探索は、物質ライブ
ラリーをスクリーニングし、選択的に、同定されたリー
ド構造を薬物モデリングにより改良することにより実施
することができる。これに関して、本発明に係るセリン
プロテアーゼは結晶型で利用可能であることが必要であ
る。
規な調節剤（活性化剤、阻害剤）の探索は、物質ライブ
ラリーをスクリーニングし、選択的に、同定されたリー
ド構造を薬物モデリングにより改良することにより実施
することができる。これに関して、本発明に係るセリン
プロテアーゼは結晶型で利用可能であることが必要であ
る。
【０００８】血液ホメオスタシスにおける魅力的な標的
は、例えば活性型セリンプロテアーゼである、トロンビ
ン、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、カリクレイン
（血液凝固）、tPA、ウロキナーゼ、プラスミン（線
溶）、および活性型プロテインC（血液凝固制御調節因
子）、ならびにそれらの不活型前駆体（チモーゲン）で
ある。さらに、血液ホメオスタシスにおいて、血漿プロ
テアーゼと補因子との相互作用により形成される複合
体、例えばFXa::FVa、FIXa::FVIIIa、トロンビン::トロ
ンボモジュリン、FVII/FVIIa::組織因子なども、標的と
して重要である。
は、例えば活性型セリンプロテアーゼである、トロンビ
ン、FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa、カリクレイン
（血液凝固）、tPA、ウロキナーゼ、プラスミン（線
溶）、および活性型プロテインC（血液凝固制御調節因
子）、ならびにそれらの不活型前駆体（チモーゲン）で
ある。さらに、血液ホメオスタシスにおいて、血漿プロ
テアーゼと補因子との相互作用により形成される複合
体、例えばFXa::FVa、FIXa::FVIIIa、トロンビン::トロ
ンボモジュリン、FVII/FVIIa::組織因子なども、標的と
して重要である。
【０００９】セリンプロテアーゼは、バイオテクノロジ
ー法により組換え作製することができる。その例は、ヒ
ト組織プラスミノーゲン・アクチベーター、ウロキナー
ゼ、およびズブチリシンである。しかし、天然起源から
単離されたセリンプロテアーゼ、および組換え作製され
たセリンプロテアーゼは、治療への適用に必要とされ
る、またはバイオテクノロジー作製法において融合タン
パク質の分解に使用される際の、基質特異性、安定性、
および純度に関して要件を完全に満たさない。特に、セ
リンプロテアーゼXa因子およびケキシン（kexin）（Kex
2）は極めて不安定である。例えば、トリプシン、トロ
ンビン、IXa因子、およびXa因子のような、動物および
／またはヒトの原材料から単離されたプロテアーゼに
は、例えばウイルスおよび／またはプリオンのようなヒ
トの病原体が混入している可能性があるため、治療への
適用、または治療薬の製造工程への適用には問題があ
る。
ー法により組換え作製することができる。その例は、ヒ
ト組織プラスミノーゲン・アクチベーター、ウロキナー
ゼ、およびズブチリシンである。しかし、天然起源から
単離されたセリンプロテアーゼ、および組換え作製され
たセリンプロテアーゼは、治療への適用に必要とされ
る、またはバイオテクノロジー作製法において融合タン
パク質の分解に使用される際の、基質特異性、安定性、
および純度に関して要件を完全に満たさない。特に、セ
リンプロテアーゼXa因子およびケキシン（kexin）（Kex
2）は極めて不安定である。例えば、トリプシン、トロ
ンビン、IXa因子、およびXa因子のような、動物および
／またはヒトの原材料から単離されたプロテアーゼに
は、例えばウイルスおよび／またはプリオンのようなヒ
トの病原体が混入している可能性があるため、治療への
適用、または治療薬の製造工程への適用には問題があ
る。
【００１０】さらに、動物および／または微生物の原材
料から単離されたプロテアーゼには、望ましくない宿主
細胞のプロテアーゼがさらに混入していることが極めて
多い。このため、インスリンの加工に使用されている動
物原材料由来のトリプシンは、これらの調製物中のキモ
トリプシン活性を阻害するため、L-1-トシルアミド-2-
フェニル-エチル-クロロメチルケトン（TPCK）（Kemmle
r,W.et al., J.Biol.Chem.246(1971) 6786-6791）で処
理される。Xa因子調製物には、通常、トロンビンが混入
している。リソバクター（lysobacter）由来のリシル・
エンドプロテイナーゼの精製においては、極めて複雑な
工程により、α-溶菌プロテアーゼを分離しなければな
らない。
料から単離されたプロテアーゼには、望ましくない宿主
細胞のプロテアーゼがさらに混入していることが極めて
多い。このため、インスリンの加工に使用されている動
物原材料由来のトリプシンは、これらの調製物中のキモ
トリプシン活性を阻害するため、L-1-トシルアミド-2-
フェニル-エチル-クロロメチルケトン（TPCK）（Kemmle
r,W.et al., J.Biol.Chem.246(1971) 6786-6791）で処
理される。Xa因子調製物には、通常、トロンビンが混入
している。リソバクター（lysobacter）由来のリシル・
エンドプロテイナーゼの精製においては、極めて複雑な
工程により、α-溶菌プロテアーゼを分離しなければな
らない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、血液ホメオスタシスに有用なキメラセリンプロテア
ーゼを提供することを課題とする。
は、血液ホメオスタシスに有用なキメラセリンプロテア
ーゼを提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明により、プロテア
ーゼ・ドメインがβシート構造（βバレル構造（β-bar
rel architecture））を有する2つのドメイン・ハーフ
（ハーフ・サイド）を含み、第一ドメイン・ハーフが第
一セリンプロテアーゼの第一ドメイン・ハーフに相当
し、第二ドメイン・ハーフが第二セリンプロテアーゼの
第二ドメイン・ハーフに相当する、キメラセリンプロテ
アーゼが提供される。
ーゼ・ドメインがβシート構造（βバレル構造（β-bar
rel architecture））を有する2つのドメイン・ハーフ
（ハーフ・サイド）を含み、第一ドメイン・ハーフが第
一セリンプロテアーゼの第一ドメイン・ハーフに相当
し、第二ドメイン・ハーフが第二セリンプロテアーゼの
第二ドメイン・ハーフに相当する、キメラセリンプロテ
アーゼが提供される。
【００１３】本発明において、第一ドメイン・ハーフと
はN末端側に位置するドメイン・ハーフ、第二ドメイン
・ハーフとはC末端側に位置するドメイン・ハーフと理
解される。
はN末端側に位置するドメイン・ハーフ、第二ドメイン
・ハーフとはC末端側に位置するドメイン・ハーフと理
解される。
【００１４】驚くべきことに、両方のプロテアーゼ・ド
メイン・ハーフが、異なるセリンプロテアーゼに由来す
るキメラセリンプロテアーゼは、本質的に、混合された
基質および結合活性、C末端側ハーフ・サイドにより決
定されるP1特異性、N末端側ハーフ・サイドにより決定
されるP2特異性、ならびにNおよび／またはC末端側ハー
フ・サイドにより決定されるP3およびP4特異性を示す。
2つの異なる完全なプロテアーゼ・ドメイン・ハーフ
（ハーフ・サイド）を組み合わせると、機能的なサブド
メイン（S1、S2、S3、およびS4結合ポケット）を確実に
形成することができる（Perona,J.J.et al., Protein S
cience 4(1995) 337-360）。
メイン・ハーフが、異なるセリンプロテアーゼに由来す
るキメラセリンプロテアーゼは、本質的に、混合された
基質および結合活性、C末端側ハーフ・サイドにより決
定されるP1特異性、N末端側ハーフ・サイドにより決定
されるP2特異性、ならびにNおよび／またはC末端側ハー
フ・サイドにより決定されるP3およびP4特異性を示す。
2つの異なる完全なプロテアーゼ・ドメイン・ハーフ
（ハーフ・サイド）を組み合わせると、機能的なサブド
メイン（S1、S2、S3、およびS4結合ポケット）を確実に
形成することができる（Perona,J.J.et al., Protein S
cience 4(1995) 337-360）。
【００１５】さらに、片方または両方の元のプロテアー
ゼと比較して、より容易に結晶化することができ、従っ
て極めて容易に構造を調べることができるキメラ・プロ
テアーゼが、本発明により得られることが明らかになっ
た。例えば、ヒトおよび動物のトリプシンは結晶化しや
すいことが知られている。
ゼと比較して、より容易に結晶化することができ、従っ
て極めて容易に構造を調べることができるキメラ・プロ
テアーゼが、本発明により得られることが明らかになっ
た。例えば、ヒトおよび動物のトリプシンは結晶化しや
すいことが知られている。
【００１６】トリプシンの単独または阻害剤との複合体
としての結晶化は、最先端の技術である（Protein Data
Base(PDB); Bernstein,F.C.et al., J.Mol.Biol.112(1
977)535-543; Kurinov,I.V.et al., Protein Science 5
(1996) 752-758; Stubbs,M.et al. FEBS Letters 375(1
995) 103-107; Von der Saal,W.et al., "Archiv der P
harmazie"329(1996) 73-82を参照のこと）。ウシ・トリ
プシン（Huber,R.etal., J.Mol.Biol.89(1974) 73-10
1）、ブタ・トリプシン（Huang,Q.et al., J.Mol.Biol.
229(1993) 1022-1036）、ラット・トリプシン（Perona,
J.J.et al., J.Mol.Biol.230(1993) 919-933）、および
ヒト・トリプシンI（Gaboriaud,C.et al., J.Mol.Biol.
259(1996) 995-1010）など、多数のトリプシンの構造が
高解像度で明らかになっている。
としての結晶化は、最先端の技術である（Protein Data
Base(PDB); Bernstein,F.C.et al., J.Mol.Biol.112(1
977)535-543; Kurinov,I.V.et al., Protein Science 5
(1996) 752-758; Stubbs,M.et al. FEBS Letters 375(1
995) 103-107; Von der Saal,W.et al., "Archiv der P
harmazie"329(1996) 73-82を参照のこと）。ウシ・トリ
プシン（Huber,R.etal., J.Mol.Biol.89(1974) 73-10
1）、ブタ・トリプシン（Huang,Q.et al., J.Mol.Biol.
229(1993) 1022-1036）、ラット・トリプシン（Perona,
J.J.et al., J.Mol.Biol.230(1993) 919-933）、および
ヒト・トリプシンI（Gaboriaud,C.et al., J.Mol.Biol.
259(1996) 995-1010）など、多数のトリプシンの構造が
高解像度で明らかになっている。
【００１７】血液凝固因子Xa（FXa）は、トロンビンと
同様に、血液凝固を調節する物質、および特に抗血栓効
果のある物質を探索するためのスクリーニングの極めて
重要な標的である。
同様に、血液凝固を調節する物質、および特に抗血栓効
果のある物質を探索するためのスクリーニングの極めて
重要な標的である。
【００１８】例えば、一次スクリーニングにより同定さ
れた低分子量FXa阻害剤リード構造を、構造に基づく薬
物設計により特異的に最適化するために必要な条件は、
FXaリード構造複合体の調製および三次元構造の決定で
ある。
れた低分子量FXa阻害剤リード構造を、構造に基づく薬
物設計により特異的に最適化するために必要な条件は、
FXaリード構造複合体の調製および三次元構造の決定で
ある。
【００１９】FXa（Gla FXa）の短縮型の3D構造は、最
近、直接的にも（Padmanabhan,K.et al., J.Mol.Biol.2
32(1993) 947-966）、阻害剤DX-9065aとの複合体として
間接的にも（Brandstetter,H.et al., J.Biol.Chem.271
(1996) 29988-29992）解明されたが、FXaの結晶化／共
結晶化は極めて複雑で、手間がかかり、再現性が低いた
め、過去に行われた、より包括的な他のFXa阻害剤（リ
ード構造）との共結晶化実験は失敗に終わっている。
近、直接的にも（Padmanabhan,K.et al., J.Mol.Biol.2
32(1993) 947-966）、阻害剤DX-9065aとの複合体として
間接的にも（Brandstetter,H.et al., J.Biol.Chem.271
(1996) 29988-29992）解明されたが、FXaの結晶化／共
結晶化は極めて複雑で、手間がかかり、再現性が低いた
め、過去に行われた、より包括的な他のFXa阻害剤（リ
ード構造）との共結晶化実験は失敗に終わっている。
【００２０】驚くべきことに、Xa因子のプロテアーゼ・
ドメイン1およびトリプシンのプロテアーゼ・ドメイン2
を含む本発明に係るキメラ・プロテアーゼは、再生可能
で、酵素活性を有しており、基質特異性（kcat/km）に
関してはFXaに類似しており、トリプシンと同様に、リ
ガンド（例えばFXa阻害剤など）との複合体として容易
に結晶化される。
ドメイン1およびトリプシンのプロテアーゼ・ドメイン2
を含む本発明に係るキメラ・プロテアーゼは、再生可能
で、酵素活性を有しており、基質特異性（kcat/km）に
関してはFXaに類似しており、トリプシンと同様に、リ
ガンド（例えばFXa阻害剤など）との複合体として容易
に結晶化される。
【００２１】従って、本発明は、 i）調節剤（活性化剤および阻害剤）のスクリーニン
グ、または ii）キメラ・プロテアーゼと調節剤とを含む結晶および
／もしくは共結晶の調製を目的とする、本発明に係るキ
メラ・プロテアーゼの使用に関する。このような結晶お
よび／または共結晶は、X線構造解析および／または構
造に基づく薬物設計に有利に使用することができる。
グ、または ii）キメラ・プロテアーゼと調節剤とを含む結晶および
／もしくは共結晶の調製を目的とする、本発明に係るキ
メラ・プロテアーゼの使用に関する。このような結晶お
よび／または共結晶は、X線構造解析および／または構
造に基づく薬物設計に有利に使用することができる。
【００２２】多くのセリンプロテアーゼの三次元構造
が、「Lesk,A.M.et al., J.Mol.Biol.258(1996) 501-53
7」および「Perona,J.J.et al., Protein Science 4(19
95) 337-360」に詳細に開示されている。それらによる
と、セリンプロテアーゼ・ドメインは、遺伝子重複およ
び修飾により形成されたと推測されている、2つの相同
構造（ハーフ・サイド、プロテアーゼ・ドメイン・ハー
フ）からなる。これらの2つのドメイン（ハーフ・サイ
ド、プロテアーゼ・ドメイン・ハーフ）は、通常、セリ
ンプロテアーゼ内に対称的に含まれており、触媒性結合
部位はこれらの2つのドメインの間に位置する。これら
のドメインのそれぞれは、βバレル構造を有している。
ドメインは、通常、6〜10本の逆平行βシート鎖からな
り、それがβバレルへと折り畳まれている（Murzin,A.
G.et al., J.Mol.Biol.236(1994) 1369-1381および1382
-1400）。A.M.Lesk（1996）は、これらのセリンプロテ
アーゼのN末端ドメインをドメイン1と呼び、C末端ドメ
インをドメイン2と呼んでいる。Lesk,A.M.ら（1996）
も、いくつかの例示的なセリンプロテアーゼについてド
メインの組成を開示している。
が、「Lesk,A.M.et al., J.Mol.Biol.258(1996) 501-53
7」および「Perona,J.J.et al., Protein Science 4(19
95) 337-360」に詳細に開示されている。それらによる
と、セリンプロテアーゼ・ドメインは、遺伝子重複およ
び修飾により形成されたと推測されている、2つの相同
構造（ハーフ・サイド、プロテアーゼ・ドメイン・ハー
フ）からなる。これらの2つのドメイン（ハーフ・サイ
ド、プロテアーゼ・ドメイン・ハーフ）は、通常、セリ
ンプロテアーゼ内に対称的に含まれており、触媒性結合
部位はこれらの2つのドメインの間に位置する。これら
のドメインのそれぞれは、βバレル構造を有している。
ドメインは、通常、6〜10本の逆平行βシート鎖からな
り、それがβバレルへと折り畳まれている（Murzin,A.
G.et al., J.Mol.Biol.236(1994) 1369-1381および1382
-1400）。A.M.Lesk（1996）は、これらのセリンプロテ
アーゼのN末端ドメインをドメイン1と呼び、C末端ドメ
インをドメイン2と呼んでいる。Lesk,A.M.ら（1996）
も、いくつかの例示的なセリンプロテアーゼについてド
メインの組成を開示している。
【００２３】通常、ドメイン1はおよそアミノ酸122±5
位までである（番号付けは、J.Greer, Proteins Struc
t.Funct.Genet.7(1990) 317-334の番号付けに従う）。
ドメイン2は、およそアミノ酸122±5位から開始する。
ドメインの境界は、実際にはドメイン1にもドメイン2に
も帰属することができる短い中間領域が存在するように
なっている。
位までである（番号付けは、J.Greer, Proteins Struc
t.Funct.Genet.7(1990) 317-334の番号付けに従う）。
ドメイン2は、およそアミノ酸122±5位から開始する。
ドメインの境界は、実際にはドメイン1にもドメイン2に
も帰属することができる短い中間領域が存在するように
なっている。
【００２４】X因子 X因子は、複合グリコシル化プロテアーゼである。メカ
ニズム的に、セリンプロテアーゼ・ファミリーに属す
る。FXは肝臓で不活型プロ酵素（チモーゲン）として合
成され、血中に分泌され、必要時に特異的なプロテアー
ゼ分解により活性化される。タンパク質ドメインの配置
に関して、X因子の構造はVII因子、IX因子、およびプロ
テインCの構造と類似している。さらに、これらの4つの
プロテアーゼのアミノ酸配列は極めて相同性が高い（ア
ミノ酸配列同一性：約40％）。これらは、IX6因子ファ
ミリーというプロテアーゼ・サブファミリーとして統合
されている。
ニズム的に、セリンプロテアーゼ・ファミリーに属す
る。FXは肝臓で不活型プロ酵素（チモーゲン）として合
成され、血中に分泌され、必要時に特異的なプロテアー
ゼ分解により活性化される。タンパク質ドメインの配置
に関して、X因子の構造はVII因子、IX因子、およびプロ
テインCの構造と類似している。さらに、これらの4つの
プロテアーゼのアミノ酸配列は極めて相同性が高い（ア
ミノ酸配列同一性：約40％）。これらは、IX6因子ファ
ミリーというプロテアーゼ・サブファミリーとして統合
されている。
【００２５】Furie,B.およびFurie,B.C.によると、IX因
子ファミリーのプロテアーゼ（VII因子、IX因子、X因
子、およびプロテインC）は、以下のドメインからな
る： − プロペプチド − GLAドメイン − 芳香族アミノ酸に富むドメイン − 2つのEGFドメイン（EGF1およびEGF2） − チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド、A
P）、および − 触媒性プロテアーゼ・ドメイン（CD）。
子ファミリーのプロテアーゼ（VII因子、IX因子、X因
子、およびプロテインC）は、以下のドメインからな
る： − プロペプチド − GLAドメイン − 芳香族アミノ酸に富むドメイン − 2つのEGFドメイン（EGF1およびEGF2） − チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド、A
P）、および − 触媒性プロテアーゼ・ドメイン（CD）。
【００２６】さらに、血漿プロテアーゼは、分泌中に以
下のような翻訳後修飾を受ける： − 11-12ジスルフィド架橋 − N-グリコシル化および／またはO-グルコシル化（GLA
ドメインおよび活性化ペプチド）（Bharadwaj,D.et a
l., J.Biol.Chem.270(1995) 6537-6542, Medved,L.V.et
al., J.Biol.Chem.270(1995) 13652-13659） − プロペプチドの分解 − Glu残基のγ-カルボキシル化（GLAドメイン） − Asp残基のβ-水酸化（EGFドメイン）。
下のような翻訳後修飾を受ける： − 11-12ジスルフィド架橋 − N-グリコシル化および／またはO-グルコシル化（GLA
ドメインおよび活性化ペプチド）（Bharadwaj,D.et a
l., J.Biol.Chem.270(1995) 6537-6542, Medved,L.V.et
al., J.Biol.Chem.270(1995) 13652-13659） − プロペプチドの分解 − Glu残基のγ-カルボキシル化（GLAドメイン） − Asp残基のβ-水酸化（EGFドメイン）。
【００２７】1つまたは2つのペプチド結合の特異的な分
解（活性化ペプチドの分解）によるチモーゲン（タンパ
ク質の前駆体型）の活性化の後、酵素活性プロテアーゼ
は、その分子量から重鎖および軽鎖と呼ばれる2本鎖か
らなるようになる。IX因子プロテアーゼ・ファミリーに
おいては、これらの2つの鎖は、EGF2ドメインとプロテ
アーゼ・ドメインとの間の分子内ジスルフィド架橋によ
り互いに結合されている。チモーゲン酵素の構造変化
（活性化）は、プロテアーゼ・ドメイン内の高次構造を
変化させる。これにより、プロテアーゼ活性にとって必
要な重要な塩架橋が、プロテアーゼ・ドメインのN末端
アミノ酸のα-NH3 +基とFXaプロテアーゼ・ドメイン内の
Asp残基との間に形成される。N末端領域は、このサブグ
ループのセリンプロテアーゼにとって極めて重要であ
り、修飾を受ける必要がある。そのことによって初め
て、触媒三つ組残基、Ser、Asp、およびHisを含む、セ
リンプロテアーゼの典型的な活性部位が形成されるよう
になる（Blow,D.M.: Acc.Chem.Res.9(197) 145-152; Po
lgar,L.: In:Mechanisms of protease action.Boca Rat
on,Florida,CRC Press,第3章(1989)）。
解（活性化ペプチドの分解）によるチモーゲン（タンパ
ク質の前駆体型）の活性化の後、酵素活性プロテアーゼ
は、その分子量から重鎖および軽鎖と呼ばれる2本鎖か
らなるようになる。IX因子プロテアーゼ・ファミリーに
おいては、これらの2つの鎖は、EGF2ドメインとプロテ
アーゼ・ドメインとの間の分子内ジスルフィド架橋によ
り互いに結合されている。チモーゲン酵素の構造変化
（活性化）は、プロテアーゼ・ドメイン内の高次構造を
変化させる。これにより、プロテアーゼ活性にとって必
要な重要な塩架橋が、プロテアーゼ・ドメインのN末端
アミノ酸のα-NH3 +基とFXaプロテアーゼ・ドメイン内の
Asp残基との間に形成される。N末端領域は、このサブグ
ループのセリンプロテアーゼにとって極めて重要であ
り、修飾を受ける必要がある。そのことによって初め
て、触媒三つ組残基、Ser、Asp、およびHisを含む、セ
リンプロテアーゼの典型的な活性部位が形成されるよう
になる（Blow,D.M.: Acc.Chem.Res.9(197) 145-152; Po
lgar,L.: In:Mechanisms of protease action.Boca Rat
on,Florida,CRC Press,第3章(1989)）。
【００２８】FX活性化ペプチドのプロセシングは、既
に、分泌中に細胞内で開始する（EGF2ドメインと活性化
ペプチドの間の最初の分解）。その後、FXは、補因子FV
IIIaまたは組織因子との複合体として、膜上で、FIXaま
たはFVIIaにより触媒される二次分解を受け、FXaへと活
性化される（Mann,K.G.et al., Blood 76(1990) 1-1
6）。
に、分泌中に細胞内で開始する（EGF2ドメインと活性化
ペプチドの間の最初の分解）。その後、FXは、補因子FV
IIIaまたは組織因子との複合体として、膜上で、FIXaま
たはFVIIaにより触媒される二次分解を受け、FXaへと活
性化される（Mann,K.G.et al., Blood 76(1990) 1-1
6）。
【００２９】FXaの触媒ドメインは、254アミノ酸からな
り、グリコシル化されておらず、4つのジスルフィド架
橋を形成する。構造的には、2つのバレル様βシート、
いわゆるハーフ・サイドからなる。第一のハーフ・サイ
ドは、キモトリプシンの番号付けによると、アミノ酸19
5位から301位までであり、第二のハーフ・サイドは、ア
ミノ酸302位から448位までである（Greer,J.,Proteins
Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334; McLachlan,A.D.,
J.Mol.Biol.128(1979)49-79; Lesk,A.D.et al.,J.Mol.B
iol.258(1996)501-537）。
り、グリコシル化されておらず、4つのジスルフィド架
橋を形成する。構造的には、2つのバレル様βシート、
いわゆるハーフ・サイドからなる。第一のハーフ・サイ
ドは、キモトリプシンの番号付けによると、アミノ酸19
5位から301位までであり、第二のハーフ・サイドは、ア
ミノ酸302位から448位までである（Greer,J.,Proteins
Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334; McLachlan,A.D.,
J.Mol.Biol.128(1979)49-79; Lesk,A.D.et al.,J.Mol.B
iol.258(1996)501-537）。
【００３０】対応する遺伝子を大腸菌で発現させ、その
後再生させ、不活型プロテアーゼ・タンパク質をインビ
トロで活性化することにより、EGF2ドメイン、活性化ペ
プチド（AP）、および触媒ドメイン（CD）を含む、IX因
子ファミリー（VII因子、IX因子、X因子、およびプロテ
インC）の翻訳後修飾されていない短縮型血漿プロテア
ーゼ変異体を組換え作製する方法は、PCT/EP97/03027に
包括的に開示されている。
後再生させ、不活型プロテアーゼ・タンパク質をインビ
トロで活性化することにより、EGF2ドメイン、活性化ペ
プチド（AP）、および触媒ドメイン（CD）を含む、IX因
子ファミリー（VII因子、IX因子、X因子、およびプロテ
インC）の翻訳後修飾されていない短縮型血漿プロテア
ーゼ変異体を組換え作製する方法は、PCT/EP97/03027に
包括的に開示されている。
【００３１】トリプシン トリプシン・プロテアーゼは、膵臓の外分泌腺房細胞に
おいて、不活型のプロ酵素（チモーゲン）、いわゆるト
リプシノーゲンとして合成される。4つの異なるトリプ
シノーゲン（トリプシノーゲンI、II、III、およびIV）
が、ヒト膵液から単離され、酵素学的に特徴決定され、
アミノ酸配列が決定されている。最も強く発現する2つ
のトリプシノーゲン遺伝子、TRYI（トリプシノーゲン
I）およびTRYII（トリプシノーゲンII）が知られてい
る。それらは、対応するcDNAのクローニングにより単離
された（Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310）。ヒト
・トリプシノーゲン遺伝子TRYIおよびTRYIIは、分泌タ
ンパク質であることと一致して、15アミノ酸からなる共
通のシグナル配列をコードする。この後に、トリプシノ
ーゲン遺伝子に特徴的なプロセグメントが続く。このプ
ロセグメントは、ヒト・トリプシノーゲンIおよびIIの
場合には、N末端活性化ペプチドAlaProPheAspAspAspAsp
Lys（配列番号：13）からなる（Guy,O.et al.,Biochem.
17(1978)1669-1675）。このプロセグメントは、エンテ
ロキナーゼにより認識される。エンテロキナーゼは、小
腸の粘膜細胞から小腸へ分泌されカルシウム存在下で分
解される糖プロテアーゼであり、不活型トリプシノーゲ
ンを活性型であるトリプシンへ変換する。トリプシノー
ゲン活性化の一部は、自己触媒により起こる。しかし、
エンテロキナーゼによる分解は1000倍以上速い。
おいて、不活型のプロ酵素（チモーゲン）、いわゆるト
リプシノーゲンとして合成される。4つの異なるトリプ
シノーゲン（トリプシノーゲンI、II、III、およびIV）
が、ヒト膵液から単離され、酵素学的に特徴決定され、
アミノ酸配列が決定されている。最も強く発現する2つ
のトリプシノーゲン遺伝子、TRYI（トリプシノーゲン
I）およびTRYII（トリプシノーゲンII）が知られてい
る。それらは、対応するcDNAのクローニングにより単離
された（Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310）。ヒト
・トリプシノーゲン遺伝子TRYIおよびTRYIIは、分泌タ
ンパク質であることと一致して、15アミノ酸からなる共
通のシグナル配列をコードする。この後に、トリプシノ
ーゲン遺伝子に特徴的なプロセグメントが続く。このプ
ロセグメントは、ヒト・トリプシノーゲンIおよびIIの
場合には、N末端活性化ペプチドAlaProPheAspAspAspAsp
Lys（配列番号：13）からなる（Guy,O.et al.,Biochem.
17(1978)1669-1675）。このプロセグメントは、エンテ
ロキナーゼにより認識される。エンテロキナーゼは、小
腸の粘膜細胞から小腸へ分泌されカルシウム存在下で分
解される糖プロテアーゼであり、不活型トリプシノーゲ
ンを活性型であるトリプシンへ変換する。トリプシノー
ゲン活性化の一部は、自己触媒により起こる。しかし、
エンテロキナーゼによる分解は1000倍以上速い。
【００３２】Xa因子と同様に、トリプシンはセリンプロ
テアーゼ・ファミリーに属する。この場合にも、N末端
活性化ペプチドの分解によりトリプシノーゲンが活性化
されると、遊離N末端が含まれているプロテアーゼ・ド
メインの高次構造が変化し（トリプシンのN末端アミノ
酸のα-NH3 +基とプロテアーゼ・ドメイン内のAsp194残
基との間の不可欠な塩架橋の形成）、それにより触媒三
つ組残基、Ser、Asp、およびHisを含むセリンプロテア
ーゼの典型的な活性部位の形成が可能になる。
テアーゼ・ファミリーに属する。この場合にも、N末端
活性化ペプチドの分解によりトリプシノーゲンが活性化
されると、遊離N末端が含まれているプロテアーゼ・ド
メインの高次構造が変化し（トリプシンのN末端アミノ
酸のα-NH3 +基とプロテアーゼ・ドメイン内のAsp194残
基との間の不可欠な塩架橋の形成）、それにより触媒三
つ組残基、Ser、Asp、およびHisを含むセリンプロテア
ーゼの典型的な活性部位の形成が可能になる。
【００３３】最も強く発現しているヒト・トリプシノー
ゲンI遺伝子（TRYI）は、15アミノ酸からなるシグナル
配列と8アミノ酸からなる活性化ペプチドとを含む247ア
ミノ酸をコードしている。成熟トリプシンIイソ酵素
は、従って、224アミノ酸残基からなる。それは、5つの
ジスルフィド架橋を形成する10個のシステイン残基を含
む（Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310）。FXa因子と
同様に、トリプシンの触媒ドメインは、構造的には、2
つの「バレル様」βシートからなる。第一のハーフ・サ
イドは、キモトリプシノーゲンの番号付けによると、ア
ミノ酸16位から121位までであり、第二のハーフ・サイ
ドは、アミノ酸122位から246位までである（Greer,J.,P
roteins Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334; Lesk,A.
D.et al.,J.Mol.Biol.258(1996)501-537）。
ゲンI遺伝子（TRYI）は、15アミノ酸からなるシグナル
配列と8アミノ酸からなる活性化ペプチドとを含む247ア
ミノ酸をコードしている。成熟トリプシンIイソ酵素
は、従って、224アミノ酸残基からなる。それは、5つの
ジスルフィド架橋を形成する10個のシステイン残基を含
む（Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310）。FXa因子と
同様に、トリプシンの触媒ドメインは、構造的には、2
つの「バレル様」βシートからなる。第一のハーフ・サ
イドは、キモトリプシノーゲンの番号付けによると、ア
ミノ酸16位から121位までであり、第二のハーフ・サイ
ドは、アミノ酸122位から246位までである（Greer,J.,P
roteins Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334; Lesk,A.
D.et al.,J.Mol.Biol.258(1996)501-537）。
【００３４】ヒト・トリプシン・イソ酵素Iは、ヒト・
トリプシン・イソ酵素IIと89％の配列相同性を有し、ウ
シ・トリプシンとは約75％の配列相同性を有し、ヒトXa
因子の触媒ドメインとは約43％の配列相同性を有する。
トリプシン・イソ酵素IIと89％の配列相同性を有し、ウ
シ・トリプシンとは約75％の配列相同性を有し、ヒトXa
因子の触媒ドメインとは約43％の配列相同性を有する。
【００３５】キメラX因子／トリプシン・プロテアーゼ
（rFXT） FX、トリプシノーゲン、およびキメラrFXTプロテアーゼ
の概略を図1に示す。ハイブリッドrFXTプロテアーゼの
基本型は、アミノ酸217位から320位まで（アミノ酸配列
の番号付けは、Kaul,R.K.らの文献（Gene 41(1986)311-
314）に従う）の触媒FXaドメインのN末端ハーフ・サイ
ドと、アミノ酸127位から247位まで（アミノ酸配列の番
号付けは、Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310の文献
に従う）の触媒トリプシン・ドメインのC末端ハーフ・
サイドとを含む。FXT遺伝子は、さらに、アミノ酸配列M
HHHHDDDDK（配列番号：14）を有するN末端プロセグメン
トをコードする。それは、ATG開始コドンで開始し、そ
の後4個のヒスチジン残基からなるポリHisが続き、短縮
型トリプシン活性化ペプチド（エンテロキナーゼ分解部
位）で終結する。rFXTa基本型のN末端ハーフ・サイド
（FXa）およびC末端ハーフ・サイド（トリプシン）は、
さらに変異を導入することにより、よりトリプシン様ま
たはFXa様になるよう構築された。本発明により、以下
のような修飾を行った（FXaハーフ・サイド：QE20YN、C
27V；トリプシン・ハーフ・サイド：W141F、YPGK172SSF
I、S190A、D217E、V227I、およびKNTIAANS239DRSMKTR；
キモトリプシノーゲンの番号付けは、Greer,J.,Protein
s Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334に従う）。
（rFXT） FX、トリプシノーゲン、およびキメラrFXTプロテアーゼ
の概略を図1に示す。ハイブリッドrFXTプロテアーゼの
基本型は、アミノ酸217位から320位まで（アミノ酸配列
の番号付けは、Kaul,R.K.らの文献（Gene 41(1986)311-
314）に従う）の触媒FXaドメインのN末端ハーフ・サイ
ドと、アミノ酸127位から247位まで（アミノ酸配列の番
号付けは、Emi,M.et al.,Gene 41(1986)305-310の文献
に従う）の触媒トリプシン・ドメインのC末端ハーフ・
サイドとを含む。FXT遺伝子は、さらに、アミノ酸配列M
HHHHDDDDK（配列番号：14）を有するN末端プロセグメン
トをコードする。それは、ATG開始コドンで開始し、そ
の後4個のヒスチジン残基からなるポリHisが続き、短縮
型トリプシン活性化ペプチド（エンテロキナーゼ分解部
位）で終結する。rFXTa基本型のN末端ハーフ・サイド
（FXa）およびC末端ハーフ・サイド（トリプシン）は、
さらに変異を導入することにより、よりトリプシン様ま
たはFXa様になるよう構築された。本発明により、以下
のような修飾を行った（FXaハーフ・サイド：QE20YN、C
27V；トリプシン・ハーフ・サイド：W141F、YPGK172SSF
I、S190A、D217E、V227I、およびKNTIAANS239DRSMKTR；
キモトリプシノーゲンの番号付けは、Greer,J.,Protein
s Struct.Funct.Genet.7(1990)317-334に従う）。
【００３６】本発明に係るキメラセリンプロテアーゼに
おいては、（１）プロテアーゼ・ドメインがβシート構
造を有する２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイド）
を含み、第一ドメイン・ハーフが第一セリンプロテアー
ゼの第一ドメイン・ハーフに相当し、第二ドメイン・ハ
ーフが第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフ
に相当する、キメラセリンプロテアーゼであることを特
徴とする。
おいては、（１）プロテアーゼ・ドメインがβシート構
造を有する２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイド）
を含み、第一ドメイン・ハーフが第一セリンプロテアー
ゼの第一ドメイン・ハーフに相当し、第二ドメイン・ハ
ーフが第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフ
に相当する、キメラセリンプロテアーゼであることを特
徴とする。
【００３７】また、本発明に係るセリンプロテアーゼに
おいては、（２）第一ドメイン・ハーフがＸａ因子に相
当し、第二ドメイン・ハーフがトリプシンに相当する、
上記(１)記載のセリンプロテアーゼであることを特徴と
する。
おいては、（２）第一ドメイン・ハーフがＸａ因子に相
当し、第二ドメイン・ハーフがトリプシンに相当する、
上記(１)記載のセリンプロテアーゼであることを特徴と
する。
【００３８】また、本発明に係る方法においては、
（３）キメラセリンプロテアーゼをコードする核酸を原
核生物または真核生物の宿主細胞において発現させ、宿
主細胞または上清からタンパク質を回収し単離する、上
記(１)または(２)記載のセリンプロテアーゼの組換えに
よる製造方法であることを特徴とする。
（３）キメラセリンプロテアーゼをコードする核酸を原
核生物または真核生物の宿主細胞において発現させ、宿
主細胞または上清からタンパク質を回収し単離する、上
記(１)または(２)記載のセリンプロテアーゼの組換えに
よる製造方法であることを特徴とする。
【００３９】また、本発明に係るキメラセリンプロテア
ーゼにおいては、（４）結晶型である、上記(１)または
(２)記載のキメラセリンプロテアーゼであることを特徴
とする。
ーゼにおいては、（４）結晶型である、上記(１)または
(２)記載のキメラセリンプロテアーゼであることを特徴
とする。
【００４０】また、本発明に係る方法においては、
（５）上記(１)または(２)記載のキメラセリンプロテア
ーゼを結晶化させ、これらの結晶から構造データを決定
することにより、Ｘａ因子またはトリプシンの結晶構造
データを得るための方法であることを特徴とする。
（５）上記(１)または(２)記載のキメラセリンプロテア
ーゼを結晶化させ、これらの結晶から構造データを決定
することにより、Ｘａ因子またはトリプシンの結晶構造
データを得るための方法であることを特徴とする。
【００４１】また、本発明に係る方法においては、
（６）上記(１)または(２)記載のキメラセリンプロテア
ーゼを標的物質に接触させ、該セリン・プロテアーゼの
活性に対する標的物質の効果を決定し、標的物質が該セ
リン・プロテアーゼの活性を阻害する場合、標的物質を
単離し、その組成を同定し、このようにして同定された
標的物質を治療に適用するために充分な量合成する、抗
血栓作用を有する物質の製造のための方法であることを
特徴とする。
（６）上記(１)または(２)記載のキメラセリンプロテア
ーゼを標的物質に接触させ、該セリン・プロテアーゼの
活性に対する標的物質の効果を決定し、標的物質が該セ
リン・プロテアーゼの活性を阻害する場合、標的物質を
単離し、その組成を同定し、このようにして同定された
標的物質を治療に適用するために充分な量合成する、抗
血栓作用を有する物質の製造のための方法であることを
特徴とする。
【００４２】本発明は、以下の実施例、文献、配列プロ
トコル、および図面によりさらに明らかにされる。本発
明の保護される範囲は、特許請求の範囲から得られる。
記載された方法は、修飾後であっても、本発明の主題を
さらに開示するための具体例であることを理解された
い。
トコル、および図面によりさらに明らかにされる。本発
明の保護される範囲は、特許請求の範囲から得られる。
記載された方法は、修飾後であっても、本発明の主題を
さらに開示するための具体例であることを理解された
い。
【００４３】
【発明の実施の形態】方法組換えＤＮＡ技術 DNA操作には、「Sambrook,J.et al.,(1989)In:Molecula
r cloning:A laboratory manual.Cold Spring Harbor L
aboratory Press,Cold Spring Harbor,New York」に記
載されている標準的な方法を使用した。分子生物学的試
薬は、製品説明書に従い使用した。
r cloning:A laboratory manual.Cold Spring Harbor L
aboratory Press,Cold Spring Harbor,New York」に記
載されている標準的な方法を使用した。分子生物学的試
薬は、製品説明書に従い使用した。
【００４４】タンパク質決定 プロテアーゼ変異体のタンパク質濃度は、アミノ酸配列
に基づき計算されたモル吸光係数を用いて、280nmにお
ける光学濃度（OD）を測定することにより決定した。
に基づき計算されたモル吸光係数を用いて、280nmにお
ける光学濃度（OD）を測定することにより決定した。
【００４５】発現ベクター キメラrFXTプロテアーゼの発現ベクターは、コア・スト
レプトアビジンの発現ベクターpSAM-COREを基本とする
ものである。プラスミドpSAM-COREの調製および説明
は、特許公開公報第93/09144号に開示されている。pSAM
-COREベクター中のコア・ストレプトアビジン遺伝子
を、所望のプロテアーゼ変異体遺伝子と交換した。
レプトアビジンの発現ベクターpSAM-COREを基本とする
ものである。プラスミドpSAM-COREの調製および説明
は、特許公開公報第93/09144号に開示されている。pSAM
-COREベクター中のコア・ストレプトアビジン遺伝子
を、所望のプロテアーゼ変異体遺伝子と交換した。
【００４６】Xa因子 FX遺伝子のクローニングおよびプラスミドpFX-EK-CD（F
XT遺伝子の構築のための基本ベクター）の構築は、PCT/
EP97/03027に詳細に開示されている。プラスミドpFX-EK
-CD上のFX発現ユニットは、N末端アミノ酸配列MHHHHDDD
DK（配列番号：14−短縮型トリプシン活性化ペプチドを
含むプロセグメント）およびヒトXa因子の触媒ドメイン
をコードする。
XT遺伝子の構築のための基本ベクター）の構築は、PCT/
EP97/03027に詳細に開示されている。プラスミドpFX-EK
-CD上のFX発現ユニットは、N末端アミノ酸配列MHHHHDDD
DK（配列番号：14−短縮型トリプシン活性化ペプチドを
含むプロセグメント）およびヒトXa因子の触媒ドメイン
をコードする。
【００４７】実施例１．ヒト・トリプシノーゲンI遺伝
子のクローニング（プラスミド：pTRYI）PCRプライマー
N1（配列番号：1）およびN2（配列番号：2）、 NcoI N1: 5'-AAAAAACCＡＴＧGATGATGATGACAAGATCGTTGGG-3' MetAspAspAspAspLysIleValGly HindIII N2: 5'-AAAAAAAAGCTTCAＴＴＡGCTATTGGCAGCTATGGTGTTC-3' 並びに商業的に入手可能なストラタジーン社（Stratage
ne Company）（La Jolla,CA,U.S.A.）のヒト肝臓cDNA遺
伝子バンク（ベクター：ラムダZAP（登録商標）II）を
使用して、Mullis,K.B.らの方法（Method Enzymol.155,
(1987)350-355）に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
で、アミノ酸19位から247位までのトリプシノーゲンIを
コードするbp61位から750位までのトリプシノーゲンI c
DNAを、鋳型DNAとして増幅した（cDNA配列およびアミノ
酸配列の番号付けは、Emi,M.らの文献（Gene 41(1986)3
05-310）に従う）。PCRプライマーにより、コード領域
の5'末端に単独のNcoI分解部位およびATG開始コドンを
導入し、コード領域の3'末端に単独のHindIII分解部位
を導入した。
子のクローニング（プラスミド：pTRYI）PCRプライマー
N1（配列番号：1）およびN2（配列番号：2）、 NcoI N1: 5'-AAAAAACCＡＴＧGATGATGATGACAAGATCGTTGGG-3' MetAspAspAspAspLysIleValGly HindIII N2: 5'-AAAAAAAAGCTTCAＴＴＡGCTATTGGCAGCTATGGTGTTC-3' 並びに商業的に入手可能なストラタジーン社（Stratage
ne Company）（La Jolla,CA,U.S.A.）のヒト肝臓cDNA遺
伝子バンク（ベクター：ラムダZAP（登録商標）II）を
使用して、Mullis,K.B.らの方法（Method Enzymol.155,
(1987)350-355）に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
で、アミノ酸19位から247位までのトリプシノーゲンIを
コードするbp61位から750位までのトリプシノーゲンI c
DNAを、鋳型DNAとして増幅した（cDNA配列およびアミノ
酸配列の番号付けは、Emi,M.らの文献（Gene 41(1986)3
05-310）に従う）。PCRプライマーにより、コード領域
の5'末端に単独のNcoI分解部位およびATG開始コドンを
導入し、コード領域の3'末端に単独のHindIII分解部位
を導入した。
【００４８】約715bp長のPCR産物を制限エンドヌクレア
ーゼNcoIおよびHindIIIで分解し、アガロースゲル電気
泳動により精製した後、約700bp長のNcoI/HindIIIトリ
プシノーゲンI断片を、約2.55kbp長のNcoI/HindIII-pSA
M-COREベクター断片とライゲートした。プラスミドpSAM
-COREの調製および説明は、特許公開公報第93/09144号
に開示されている。所望のプラスミドpTRYIを制限マッ
ピングにより同定し、PCRにより単離されたTRPIのcDNA
配列をDNA配列決定により確認した。
ーゼNcoIおよびHindIIIで分解し、アガロースゲル電気
泳動により精製した後、約700bp長のNcoI/HindIIIトリ
プシノーゲンI断片を、約2.55kbp長のNcoI/HindIII-pSA
M-COREベクター断片とライゲートした。プラスミドpSAM
-COREの調製および説明は、特許公開公報第93/09144号
に開示されている。所望のプラスミドpTRYIを制限マッ
ピングにより同定し、PCRにより単離されたTRPIのcDNA
配列をDNA配列決定により確認した。
【００４９】実施例２．キメラ・プロテアーゼ遺伝子FX
Tの構築（プラスミド：pFXT） キメラFX/トリプシン・プロテアーゼの基本型（名称：
プロテアーゼrFXT；図2）は、アミノ酸配列MHHHHDDDDK
（ATG開始コドン、ポリHis配列、および短縮型トリプシ
ン活性化ペプチド（エンテロキナーゼ分解部位））を有
するプロセグメント、触媒FXaドメインのN末端ハーフ・
サイドおよび触媒トリプシン・ドメインのC末端ハーフ
・サイドからなる。さらに2つの修飾を導入することに
より（QE20YN、C27V；キモトリプシノーゲンの番号付け
は、Greer,J.,Proteins Struct.Funct.Genet.7(1990)31
7-334に従う）、N末端FXaハーフ・サイドを、よりトリ
プシン様にした。
Tの構築（プラスミド：pFXT） キメラFX/トリプシン・プロテアーゼの基本型（名称：
プロテアーゼrFXT；図2）は、アミノ酸配列MHHHHDDDDK
（ATG開始コドン、ポリHis配列、および短縮型トリプシ
ン活性化ペプチド（エンテロキナーゼ分解部位））を有
するプロセグメント、触媒FXaドメインのN末端ハーフ・
サイドおよび触媒トリプシン・ドメインのC末端ハーフ
・サイドからなる。さらに2つの修飾を導入することに
より（QE20YN、C27V；キモトリプシノーゲンの番号付け
は、Greer,J.,Proteins Struct.Funct.Genet.7(1990)31
7-334に従う）、N末端FXaハーフ・サイドを、よりトリ
プシン様にした。
【００５０】この目的のため、PCRプライマーN3（配列
番号：3）およびN4（配列番号：4）、 NsiI N3: 5'-AAAAAAATGCATCACCACCACGACGATGACGACAAGATCGTGGGAGGC MetHisHisHisHisAspAspAspAspLysIleValGlyGly TAcaAcTGCAAGGACGGGGAGgtaCCCTGGCAGGCCCTGCTCATC-3' TyrAsnCysLysAspGlyGluValProTrpGlnAlaLeuLeuIle Van91I N4: 5'-AAAAAAＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡG GCAGGCGCCACGTTCATGCG-3' ならびにプラスミドpFX-EK-CD（調製および説明につい
てはPCT/EP97/03027を参照のこと）を使用して、アミノ
酸217位から320位までの触媒FXaドメインのN末端ハーフ
・サイドをコードするDNAを、鋳型DNAとして増幅した
（アミノ酸配列の番号付けは、Kaul,R.K.らの文献（Gen
e 41(1986)311-314）に従う）。5'末端に単独のNsiI分
解部位を含むプロセグメントMHHHHDDDDKをコードするDN
A配列を、PCRプライマーN3の5'突出末端により導入し
た。さらに、2つの所望の変異QE20YNおよびC27Vをプラ
イマーN3に導入した。プライマー内の変異は、下方に記
載された塩基により示されている。PCRプライマーN4に
より、FXa DNAをトリプシンDNA配列に連結させた。N4プ
ライマーの5'突出ヌクレオチド配列は、Emi,M.らの文献
（Gene 41(1986)305-310）に従うと、5'末端に単独のVa
n91I分解部位を有するトリプシンDNA配列bp385位から41
3位までからなる。
番号：3）およびN4（配列番号：4）、 NsiI N3: 5'-AAAAAAATGCATCACCACCACGACGATGACGACAAGATCGTGGGAGGC MetHisHisHisHisAspAspAspAspLysIleValGlyGly TAcaAcTGCAAGGACGGGGAGgtaCCCTGGCAGGCCCTGCTCATC-3' TyrAsnCysLysAspGlyGluValProTrpGlnAlaLeuLeuIle Van91I N4: 5'-AAAAAAＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡG GCAGGCGCCACGTTCATGCG-3' ならびにプラスミドpFX-EK-CD（調製および説明につい
てはPCT/EP97/03027を参照のこと）を使用して、アミノ
酸217位から320位までの触媒FXaドメインのN末端ハーフ
・サイドをコードするDNAを、鋳型DNAとして増幅した
（アミノ酸配列の番号付けは、Kaul,R.K.らの文献（Gen
e 41(1986)311-314）に従う）。5'末端に単独のNsiI分
解部位を含むプロセグメントMHHHHDDDDKをコードするDN
A配列を、PCRプライマーN3の5'突出末端により導入し
た。さらに、2つの所望の変異QE20YNおよびC27Vをプラ
イマーN3に導入した。プライマー内の変異は、下方に記
載された塩基により示されている。PCRプライマーN4に
より、FXa DNAをトリプシンDNA配列に連結させた。N4プ
ライマーの5'突出ヌクレオチド配列は、Emi,M.らの文献
（Gene 41(1986)305-310）に従うと、5'末端に単独のVa
n91I分解部位を有するトリプシンDNA配列bp385位から41
3位までからなる。
【００５１】約390bp長のPCR産物を制限エンドヌクレア
ーゼNsiIおよびVan91Iで分解し、約380bp長のNsiI/Van9
1I N末端ハーフ・サイド断片をアガロースゲル電気泳動
で精製した。
ーゼNsiIおよびVan91Iで分解し、約380bp長のNsiI/Van9
1I N末端ハーフ・サイド断片をアガロースゲル電気泳動
で精製した。
【００５２】アミノ酸127位から247位までの触媒トリプ
シン・ドメインのC末端ハーフ・サイドをコードするDNA
（アミノ酸配列の番号付けは、Emi,M.et al.,Gene 41(1
986)305-310の文献に従う）を、約360bp長のVan91I/Hin
dIII断片として、プラスミドpTRYI（実施例1）から単離
した。その後、NsiI/Van91I-FXaハーフ・サイド断片
を、Van91I/HindIIIトリプシン・ハーフ・サイド断片と
ライゲートし、3断片ライゲーションで、約2.55kbp長の
NsiI/HindIII-pFX-EK-CDベクター断片（調製および説明
についてはPCT/EP97/03027を参照のこと）へと挿入し
た。制限マッピングにより所望のプラスミドpFXTを同定
し、PCRにより増幅されたDNA配列をDNA配列決定により
確認した。
シン・ドメインのC末端ハーフ・サイドをコードするDNA
（アミノ酸配列の番号付けは、Emi,M.et al.,Gene 41(1
986)305-310の文献に従う）を、約360bp長のVan91I/Hin
dIII断片として、プラスミドpTRYI（実施例1）から単離
した。その後、NsiI/Van91I-FXaハーフ・サイド断片
を、Van91I/HindIIIトリプシン・ハーフ・サイド断片と
ライゲートし、3断片ライゲーションで、約2.55kbp長の
NsiI/HindIII-pFX-EK-CDベクター断片（調製および説明
についてはPCT/EP97/03027を参照のこと）へと挿入し
た。制限マッピングにより所望のプラスミドpFXTを同定
し、PCRにより増幅されたDNA配列をDNA配列決定により
確認した。
【００５３】実施例３．キメラ・プロテアーゼ遺伝子FX
T-Mの構築（プラスミド：pFXT-M） 6個の変異（W141F、YPGK172SSFI、S190A、D217E、V227
I、およびKNTIAANS239DRSMKTR；キモトリプシノーゲン
の番号付けは、Greer,J.,Proteins Struct.Funct.Gene
t.7(1990)317-334に従う）を導入することにより、キメ
ラrFXTプロテアーゼのC末端トリプシン・ハーフ・サイ
ドを、よりFXa様にした。
T-Mの構築（プラスミド：pFXT-M） 6個の変異（W141F、YPGK172SSFI、S190A、D217E、V227
I、およびKNTIAANS239DRSMKTR；キモトリプシノーゲン
の番号付けは、Greer,J.,Proteins Struct.Funct.Gene
t.7(1990)317-334に従う）を導入することにより、キメ
ラrFXTプロテアーゼのC末端トリプシン・ハーフ・サイ
ドを、よりFXa様にした。
【００５４】酵素合成されたDNA断片（PCR技術）および
化学合成されたDNA断片（アダプター）を使用して、2断
片ライゲーションおよび3断片ライゲーションで、FXT遺
伝子に所望の変異を導入した（プラスミドpFXT、実施例
2）。DNAアダプターは、5'末端および3'末端に単独の制
限分解部位を有する。それは、2つの相補的なオリゴヌ
クレオチドからアニーリングにより調製された（反応緩
衝液：12.5mmol/lトリス塩酸、pH7.0、および12.5mmol/
l MgCl2；オリゴヌクレオチド濃度：それぞれ1pmol/60m
l）。
化学合成されたDNA断片（アダプター）を使用して、2断
片ライゲーションおよび3断片ライゲーションで、FXT遺
伝子に所望の変異を導入した（プラスミドpFXT、実施例
2）。DNAアダプターは、5'末端および3'末端に単独の制
限分解部位を有する。それは、2つの相補的なオリゴヌ
クレオチドからアニーリングにより調製された（反応緩
衝液：12.5mmol/lトリス塩酸、pH7.0、および12.5mmol/
l MgCl2；オリゴヌクレオチド濃度：それぞれ1pmol/60m
l）。
【表１】 変異 オリゴヌクレオチド クローニング分解部位 断片長 ──────────────────────────────────── QE20YN N3 実施例2参照 NsiI/Van91I 約380bp N4 C27V N3 実施例2参照 NsiI/Van91I 約380bp N4 W141F N5 Van91I/SapI 約283bp D217E N6 V227I N7 アダプター SapI/HindIII 約71bp KNTIAANS239DRSMKTR N8 YPGK172SSFI N5 Van91I/SapI 約157bp N9 S190A N10 SapI/HindIII 約198bp N11 N5:（配列番号：５） Van91I 5'-AAAAAACCAGCCACTGGCACGAAGTGCCTCATCTCTGGCTtcGGCAACACTGCGCAGCTCTGGCG-3' N6:（配列番号：６） SapI 5'-AAAAAAGCTCTTCCTCCAGGCTTGTTCTTCTGGCACAGCCtTCACCCCAGGAGACAACTCCTTG-3' N7:（配列番号：７） SapI 5'-AAAAAAGCTCTTCTGGAaTCTACACCAAGGTCTACAACTACGTGAAATGGATTgaccgt TyrThrLysValTyrAsnTyrValLysTrpIleAspArg HindIII tCtatgaaaaCCcgTtaatgAAGCTTTTTTTT-3' SerMetLysThrArg****** N8:（配列番号：８） HindIII 5'-AAAAAAAAGCTTcattaAcgGGttttcataGaacggtcAATCCATTTCACGTAGTTGTA SapI GACCTTGGTGTAGAtTCCAGAAGAGCTTTTTT-3' N9:（配列番号：９） SapI 5'-AAAAAAGCTCTTCCACAGAACATGTTGCTGGTAATgaTgaaggaagAGGAGGCTTCACAC TTAGCCTGGC-3' N10:（配列番号：１０） SapI 5'-AAAAAAGCTCTTCCTGTGTGGGCTTCCTTGAGGGAGGCAAGGATgCtTGTCAGGG TGATTCTGGTGG-3' N11:（配列番号：１１） HindIII 5'-AAAAAAAAGCTTCATTAACGGGTTTTCATAGAACGGTCAATCCATTTCACGTAG-3'
【００５５】制限マッピングにより、所望の中間構築物
およびpFXT-M最終構築物を同定した。FXT-M変異遺伝子
（最終構築物）の所望のDNA配列をDNA配列決定により確
認した。
およびpFXT-M最終構築物を同定した。FXT-M変異遺伝子
（最終構築物）の所望のDNA配列をDNA配列決定により確
認した。
【００５６】実施例４．a）キメラFXTプロテアーゼ遺伝
子の大腸菌における発現 FXT遺伝子を発現させるため、大腸菌K12株（例えば、UT
5600、Grodberg,J.etal.,J.Bacteriol.170(1988)1245-1
253）を、実施例2および3に記載の発現プラスミドpFXT
およびpFXT-M（アンピシリン耐性）のいずれか、および
lacIqリプレッサー・プラスミドpUBS520（カナマイシン
耐性、調製および説明については、Brinkmann,U.et a
l.,Gene 85(1989)109-114を参照のこと）で形質転換し
た。
子の大腸菌における発現 FXT遺伝子を発現させるため、大腸菌K12株（例えば、UT
5600、Grodberg,J.etal.,J.Bacteriol.170(1988)1245-1
253）を、実施例2および3に記載の発現プラスミドpFXT
およびpFXT-M（アンピシリン耐性）のいずれか、および
lacIqリプレッサー・プラスミドpUBS520（カナマイシン
耐性、調製および説明については、Brinkmann,U.et a
l.,Gene 85(1989)109-114を参照のこと）で形質転換し
た。
【００５７】発現プラスミドpFXTおよびpFXT-Mで形質転
換されたUT5600/pUBS520/細胞を、50〜100mg/l アンピ
シリンおよび50mg/l カナマイシンを含むDYT培地（1％
（w/v）酵母抽出物、1％（w/v）バクト・トリプトン（D
ifco）、および5％ NaCl）中での振盪培養において、55
0nmにおける光学濃度（OD550）が0.6〜0.9になるまで37
℃で培養し、次に、IPTG（最終濃度1〜5mmol/l）で誘導
を行った。37℃で4〜8時間の誘導期の後、細胞を遠心分
離（Sorvall RC-5B遠心分離器、GS3ローター、6000rp
m、15分間）により収集し、50mmol/l トリス塩酸緩衝液
pH7.2で洗浄し、その後の処理まで-20℃で保存した。1l
の振盪培養液からの細胞収量は、4〜5gであった（湿重
量）。
換されたUT5600/pUBS520/細胞を、50〜100mg/l アンピ
シリンおよび50mg/l カナマイシンを含むDYT培地（1％
（w/v）酵母抽出物、1％（w/v）バクト・トリプトン（D
ifco）、および5％ NaCl）中での振盪培養において、55
0nmにおける光学濃度（OD550）が0.6〜0.9になるまで37
℃で培養し、次に、IPTG（最終濃度1〜5mmol/l）で誘導
を行った。37℃で4〜8時間の誘導期の後、細胞を遠心分
離（Sorvall RC-5B遠心分離器、GS3ローター、6000rp
m、15分間）により収集し、50mmol/l トリス塩酸緩衝液
pH7.2で洗浄し、その後の処理まで-20℃で保存した。1l
の振盪培養液からの細胞収量は、4〜5gであった（湿重
量）。
【００５８】b）発現解析 プラスミドpFXTおよびpFXT-Mで形質転換されたUT5600/p
UBS520/細胞の発現を解析した。この目的のため、それ
ぞれ1mlの培養培地から遠心分離された細胞ペレット
を、0.25mlの10mmol/l トリス塩酸、pH7.2に再懸濁さ
せ、ブランソン社（Branson Company）（Heusenstamm,G
ermany）のソニファー・セル・ディスラプチャーB15（S
onifier（登録商標）Cell Disrupture B15）を用いた超
音波処理（50％の強度で30秒間のパルスを2回）によ
り、細胞を溶解させた。不溶性の細胞成分を沈殿させ
（Eppendorf 5415遠心分離器,14000rpm,5分間）、1/5容
量（vol）の5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50m
mol/l トリス塩酸、pH6.8、1％ SDS、1％ メルカプトエ
タノール、10％ グリセロール、0．001％ ブロモフェノ
ールブルー）を上清に添加した。不溶性の細胞破砕画分
（ペレット)を、6〜8M尿素を含む0.3ml１×SDS試料緩衝
液に再懸濁し、該試料を95℃で5分間インキュベート
し、再び遠心分離にかけた。その後、タンパク質をSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.
K.,Nature 227(1970)680-685）により分離し、クーマシ
ー・ブリリアント・ブルーR色素で染色した。
UBS520/細胞の発現を解析した。この目的のため、それ
ぞれ1mlの培養培地から遠心分離された細胞ペレット
を、0.25mlの10mmol/l トリス塩酸、pH7.2に再懸濁さ
せ、ブランソン社（Branson Company）（Heusenstamm,G
ermany）のソニファー・セル・ディスラプチャーB15（S
onifier（登録商標）Cell Disrupture B15）を用いた超
音波処理（50％の強度で30秒間のパルスを2回）によ
り、細胞を溶解させた。不溶性の細胞成分を沈殿させ
（Eppendorf 5415遠心分離器,14000rpm,5分間）、1/5容
量（vol）の5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50m
mol/l トリス塩酸、pH6.8、1％ SDS、1％ メルカプトエ
タノール、10％ グリセロール、0．001％ ブロモフェノ
ールブルー）を上清に添加した。不溶性の細胞破砕画分
（ペレット)を、6〜8M尿素を含む0.3ml１×SDS試料緩衝
液に再懸濁し、該試料を95℃で5分間インキュベート
し、再び遠心分離にかけた。その後、タンパク質をSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.
K.,Nature 227(1970)680-685）により分離し、クーマシ
ー・ブリリアント・ブルーR色素で染色した。
【００５９】大腸菌で合成されたプロテアーゼ変異体は
均一であり、完全に不溶性細胞破砕画分（封入体、IB）
に見出された。発現収率は、全大腸菌タンパク質に対し
て10〜50％であった。
均一であり、完全に不溶性細胞破砕画分（封入体、IB）
に見出された。発現収率は、全大腸菌タンパク質に対し
て10〜50％であった。
【００６０】実施例５．細胞の溶解、キメラrFXTプロテ
アーゼの可溶化および再生 a）細胞溶解および封入体（IB）の調製 3lの振盪培養液から得られた細胞ペレット（湿重量で約
15g）を75mlの50mmol/l トリス塩酸、pH7.2に再懸濁さ
せた。懸濁液を、0.25g/mlのリゾチームと混合し、0℃
で30分間インキュベートした。2mmol/l MgCl2および10m
g/ml DNaseI（Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番
号104159）を添加した後、SLMアミコ社（SLM Amico Com
pany）（Urbana,IL,USA）のフレンチ・プレス（French
（登録商標）Press）で、高圧分散により機械的に細胞
を破壊した。次に、DNAを室温（RT）で30分間分解し
た。37.5mlの50mmol/l トリス塩酸、pH7.2、60mmol/l E
DTA、1.5mmol/l NaCl、6％ Triton X-100を調製物に添
加し、RTでさらに30分間インキュベートし、ソーバル
（Sorvall）RC-5B遠心分離器（GSAローター、12000rp
m、15分間）で遠心分離した。上清を捨て、100mlの50mm
ol/l トリス塩酸、pH7.2、20mmol/l EDTAをペレットに
添加し、4℃で攪拌しながら30分間インキュベートし、
再び沈殿させた。最後の洗浄工程を反復した。精製され
たIB（湿重量で1.5〜2.0g、25〜30％乾燥質量、100〜15
0mgプロテアーゼ）は、その後の処理まで-20℃で保存し
た。
アーゼの可溶化および再生 a）細胞溶解および封入体（IB）の調製 3lの振盪培養液から得られた細胞ペレット（湿重量で約
15g）を75mlの50mmol/l トリス塩酸、pH7.2に再懸濁さ
せた。懸濁液を、0.25g/mlのリゾチームと混合し、0℃
で30分間インキュベートした。2mmol/l MgCl2および10m
g/ml DNaseI（Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番
号104159）を添加した後、SLMアミコ社（SLM Amico Com
pany）（Urbana,IL,USA）のフレンチ・プレス（French
（登録商標）Press）で、高圧分散により機械的に細胞
を破壊した。次に、DNAを室温（RT）で30分間分解し
た。37.5mlの50mmol/l トリス塩酸、pH7.2、60mmol/l E
DTA、1.5mmol/l NaCl、6％ Triton X-100を調製物に添
加し、RTでさらに30分間インキュベートし、ソーバル
（Sorvall）RC-5B遠心分離器（GSAローター、12000rp
m、15分間）で遠心分離した。上清を捨て、100mlの50mm
ol/l トリス塩酸、pH7.2、20mmol/l EDTAをペレットに
添加し、4℃で攪拌しながら30分間インキュベートし、
再び沈殿させた。最後の洗浄工程を反復した。精製され
たIB（湿重量で1.5〜2.0g、25〜30％乾燥質量、100〜15
0mgプロテアーゼ）は、その後の処理まで-20℃で保存し
た。
【００６１】b）IBの可溶化および誘導体化 精製されたIBを、6mol/l グアニジウム塩酸、100mmol/l
トリス塩酸、20mmol/l EDTA、150mmol/l GSSG、および
15mmol/l GSH、pH8.0中5〜10mg/mlタンパク質に相当す
る100mg IBペレット（湿重量）／mlの濃度で室温で1か
ら3時間で溶解させた。その後、pHをpH5.0に調整し、不
溶性成分を遠心分離（Sorvall RC-5B遠心分離器、SS34
ローター、16000rpm、10分間）で分離した。上清を、10
0容量の4〜6mmol/l グアニジウム塩酸、pH5.0に対し
て、4℃で24時間透析した。
トリス塩酸、20mmol/l EDTA、150mmol/l GSSG、および
15mmol/l GSH、pH8.0中5〜10mg/mlタンパク質に相当す
る100mg IBペレット（湿重量）／mlの濃度で室温で1か
ら3時間で溶解させた。その後、pHをpH5.0に調整し、不
溶性成分を遠心分離（Sorvall RC-5B遠心分離器、SS34
ローター、16000rpm、10分間）で分離した。上清を、10
0容量の4〜6mmol/l グアニジウム塩酸、pH5.0に対し
て、4℃で24時間透析した。
【００６２】c）再生 0.5ml IB可溶化物／誘導体を、50mlの50mmol/l トリス
塩酸、0.5mmol/l アルギニン、20mmol/l CaCl2、1mmol/
l EDTA、および0.5mmol/l システイン、pH8.5に4℃で添
加し、次に4℃で48時間インキュベートすることを24時
間間隔で繰り返すことにより（例えば3回）、6mmol/l
グアニジウム塩酸で可溶化されGSSG/GSHで誘導体化され
たプロテアーゼ変異体を再生させた。再生反応の完了
後、不溶性成分を、セイツ社（Seitz Company）（Bad K
euznach,Germany）のディープ・ベッド・フィルター（d
eep bed filter）K250を取り付けたサトリウス社（Sato
rius Company）（Gaettingen,Germany）の濾過装置で濾
過することにより分離した。
塩酸、0.5mmol/l アルギニン、20mmol/l CaCl2、1mmol/
l EDTA、および0.5mmol/l システイン、pH8.5に4℃で添
加し、次に4℃で48時間インキュベートすることを24時
間間隔で繰り返すことにより（例えば3回）、6mmol/l
グアニジウム塩酸で可溶化されGSSG/GSHで誘導体化され
たプロテアーゼ変異体を再生させた。再生反応の完了
後、不溶性成分を、セイツ社（Seitz Company）（Bad K
euznach,Germany）のディープ・ベッド・フィルター（d
eep bed filter）K250を取り付けたサトリウス社（Sato
rius Company）（Gaettingen,Germany）の濾過装置で濾
過することにより分離した。
【００６３】d）再生調製物の濃縮および透析 プロテアーゼを含む透明な上清を、フィルトロン社（Fi
ltron Company）（Karlstein,Germany）のミニセット
（Minisette）（メンブレンタイプ:Omega 10K）を用い
て、クロスフロー濾過により10〜15倍に濃縮し、グアニ
ジウム塩酸およびアルギニンを除去するため、100容の2
0mmol/l トリス塩酸および50mmol/l NaCl、pH7.2に対し
て、4℃で24時間透析した。沈殿したタンパク質を遠心
分離（Sorvall RC-5B遠心分離器、SS34ローター、16000
rpm、20分間）で除去し、透明な上清を、ナルゲ社（Nal
ge Company）（Rochester,NY,USA）のナルゲン（Nalgen
e）（登録商標）ディスポーザブル濾過ユニット（孔
径：0.2mm）で濾過した。
ltron Company）（Karlstein,Germany）のミニセット
（Minisette）（メンブレンタイプ:Omega 10K）を用い
て、クロスフロー濾過により10〜15倍に濃縮し、グアニ
ジウム塩酸およびアルギニンを除去するため、100容の2
0mmol/l トリス塩酸および50mmol/l NaCl、pH7.2に対し
て、4℃で24時間透析した。沈殿したタンパク質を遠心
分離（Sorvall RC-5B遠心分離器、SS34ローター、16000
rpm、20分間）で除去し、透明な上清を、ナルゲ社（Nal
ge Company）（Rochester,NY,USA）のナルゲン（Nalgen
e）（登録商標）ディスポーザブル濾過ユニット（孔
径：0.2mm）で濾過した。
【００６４】実施例６．再生された不活型キメラrFXTプ
ロテアーゼの精製 再生調製物に含まれる不活型rFXTプロテアーゼは、必要
に応じて、当業者に公知のクロマトグラフィー法により
さらに精製することができる。
ロテアーゼの精製 再生調製物に含まれる不活型rFXTプロテアーゼは、必要
に応じて、当業者に公知のクロマトグラフィー法により
さらに精製することができる。
【００６５】Q-セファロースffにおけるイオン交換クロ
マトグラフィーによるキメラrFXTプロテアーゼの精製 20mmol/l トリス塩酸および50mmol/l NaCl、pH8.0に対
して透析された、濃縮された再生調製物を、ファルマシ
ア・バイオテク社（Pharmacia Biotech Company）（Fre
igurg,Germany）の、同緩衝液で平衡化されたQ-セファ
ロースffカラム（1.5×11cm、V=20ml；負荷容量：10mg
タンパク質／mlゲル）（2カラム容量／時間、2CV7h）に
供し、溶出液の280nmにおける吸光度が緩衝液のブラン
ク値に達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。結合した物
質を、20mmol/l トリス塩酸、pH8.0（2CV/h）中50〜500
mmol/l NaClの勾配により溶出した。プロテアーゼは、1
00〜150mmol/lのNaCl濃度で溶出させた。プロテアーゼ
を含む画分を非還元および還元SDS PAGEで同定し、溶出
ピークをプールした。
マトグラフィーによるキメラrFXTプロテアーゼの精製 20mmol/l トリス塩酸および50mmol/l NaCl、pH8.0に対
して透析された、濃縮された再生調製物を、ファルマシ
ア・バイオテク社（Pharmacia Biotech Company）（Fre
igurg,Germany）の、同緩衝液で平衡化されたQ-セファ
ロースffカラム（1.5×11cm、V=20ml；負荷容量：10mg
タンパク質／mlゲル）（2カラム容量／時間、2CV7h）に
供し、溶出液の280nmにおける吸光度が緩衝液のブラン
ク値に達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。結合した物
質を、20mmol/l トリス塩酸、pH8.0（2CV/h）中50〜500
mmol/l NaClの勾配により溶出した。プロテアーゼは、1
00〜150mmol/lのNaCl濃度で溶出させた。プロテアーゼ
を含む画分を非還元および還元SDS PAGEで同定し、溶出
ピークをプールした。
【００６６】実施例７．エンテロキナーゼによるキメラ
rFXTプロテアーゼの活性化 キメラrFXTプロテアーゼを、25℃で、0.5〜2.0mg/mlの
濃度、および50mmol/lトリス塩酸、pH8.0中、50：1から
100：1の基質／プロテアーゼ比（エンテロキナーゼ、ウ
シ小腸由来の制限プロテアーゼ、ベーリンガー・マンハ
イム（Boehringer Mannheim）（Mannheim,Germany））
で分解した。酵素によるrFXT活性化の時間経過を、分解
が完了するまで（プラトー、最大活性化）、色原性色素
基質（実施例9bを参照）を用いた活性の測定によりモニ
ターした。2時間にわたり、この試料（10から100ml）を
5〜10分間隔で反応混合液から採取し、生成したrFXTa活
性を測定した。活性プラトーに達した後、エンテロキナ
ーゼ分解物をベンズアミダイン・セファロースにおける
アフィニティ・クロマトグラフィーにより精製した。
rFXTプロテアーゼの活性化 キメラrFXTプロテアーゼを、25℃で、0.5〜2.0mg/mlの
濃度、および50mmol/lトリス塩酸、pH8.0中、50：1から
100：1の基質／プロテアーゼ比（エンテロキナーゼ、ウ
シ小腸由来の制限プロテアーゼ、ベーリンガー・マンハ
イム（Boehringer Mannheim）（Mannheim,Germany））
で分解した。酵素によるrFXT活性化の時間経過を、分解
が完了するまで（プラトー、最大活性化）、色原性色素
基質（実施例9bを参照）を用いた活性の測定によりモニ
ターした。2時間にわたり、この試料（10から100ml）を
5〜10分間隔で反応混合液から採取し、生成したrFXTa活
性を測定した。活性プラトーに達した後、エンテロキナ
ーゼ分解物をベンズアミダイン・セファロースにおける
アフィニティ・クロマトグラフィーにより精製した。
【００６７】実施例８．活性型キメラrFXTaプロテアー
ゼの最終精製 分解混合液を、ファルマシア・バイオテク社（Pharmaci
a Biotech Company）（Freigurg,Germany）の、20mmol/
l トリス塩酸、200mmol/l NaCl、pH8.0で平衡化された
ベンズアミダイン・セファロースCL-6Bカラム（1.0×10
cm、V=8ml；負荷容量：2〜3mgタンパク質／mlゲル）へ
と供し（2CV/h）、溶出液の280nmにおける吸光度が緩衝
液のブランク値に達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。
結合した物質を、20mmol/l トリス塩酸、200mmol/l NaC
l、10mmol/l ベンズアミダイン、pH8.0（2CV/h）により
溶出させた。rFXTaプロテアーゼを含む画分を非還元お
よび還元SDS PAGE、ならびに活性の測定により同定し
た。
ゼの最終精製 分解混合液を、ファルマシア・バイオテク社（Pharmaci
a Biotech Company）（Freigurg,Germany）の、20mmol/
l トリス塩酸、200mmol/l NaCl、pH8.0で平衡化された
ベンズアミダイン・セファロースCL-6Bカラム（1.0×10
cm、V=8ml；負荷容量：2〜3mgタンパク質／mlゲル）へ
と供し（2CV/h）、溶出液の280nmにおける吸光度が緩衝
液のブランク値に達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。
結合した物質を、20mmol/l トリス塩酸、200mmol/l NaC
l、10mmol/l ベンズアミダイン、pH8.0（2CV/h）により
溶出させた。rFXTaプロテアーゼを含む画分を非還元お
よび還元SDS PAGE、ならびに活性の測定により同定し
た。
【００６８】20mmol/l トリス塩酸、200mmol/l NaCl、p
H8.0に対して透析することにより、溶出に使用されたセ
リンプロテアーゼ阻害剤ベンズアミダインを除去した。
H8.0に対して透析することにより、溶出に使用されたセ
リンプロテアーゼ阻害剤ベンズアミダインを除去した。
【００６９】実施例９．精製されたrFXTプロテアーゼ変
異体の特徴決定 a）SDS PAGE 分子内ジスルフィド架橋形成によるオリゴマーおよび凝
集体の形成、ならびに再生され活性化され精製されたrF
XTaプロテアーゼの均一性および純度を、非還元（メル
カプトエタノール不使用）および還元（メルカプトエタ
ノール使用）SDS PAGE（Laemmli,UK.,Nature 227(1970)
680-685）により調べた。
異体の特徴決定 a）SDS PAGE 分子内ジスルフィド架橋形成によるオリゴマーおよび凝
集体の形成、ならびに再生され活性化され精製されたrF
XTaプロテアーゼの均一性および純度を、非還元（メル
カプトエタノール不使用）および還元（メルカプトエタ
ノール使用）SDS PAGE（Laemmli,UK.,Nature 227(1970)
680-685）により調べた。
【００７０】b）活性の測定、反応動力学定数の決定 再生された活性化rFXTaプロテアーゼの活性を、色原性
基質クロモチーム（Choromozym）（登録商標）X（N-メ
トキシカルボニル-D-Nle-Gly-Arg-pNA、ベーリンガー・
マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ番号789763）、
クロモチーム（登録商標）U（Bz-β-Ala-Gly-Arg-pNA、
ベーリンガー・マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ
番号836583）、クロモチーム（登録商標）PK（Bz-Pro-P
he-Arg-pNA、ベーリンガー・マンハイムGmbH（Mannhei
m）、カタログ番号378445）、およびクロモチーム（登
録商標）TH（トシル-Gly-Pro-Arg-pNA、ベーリンガー・
マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ番号838268）を
用いて、組換えrFXa（rFX-EGF2-AP-CD；調製および説明
についてはPCT/EP97/03027を参照のこと）および天然の
ヒト・トリプシン（シグマ・アルドリッヒ・ケミエ（Si
gma-Aldrich Chemie）GmbH（Deisenhofen,Germany）、
カタログ番号T6424）と比較して測定した。略語：Bz、
ベンゾイル；pNA、p-ニトロアニリン。
基質クロモチーム（Choromozym）（登録商標）X（N-メ
トキシカルボニル-D-Nle-Gly-Arg-pNA、ベーリンガー・
マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ番号789763）、
クロモチーム（登録商標）U（Bz-β-Ala-Gly-Arg-pNA、
ベーリンガー・マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ
番号836583）、クロモチーム（登録商標）PK（Bz-Pro-P
he-Arg-pNA、ベーリンガー・マンハイムGmbH（Mannhei
m）、カタログ番号378445）、およびクロモチーム（登
録商標）TH（トシル-Gly-Pro-Arg-pNA、ベーリンガー・
マンハイムGmbH（Mannheim）、カタログ番号838268）を
用いて、組換えrFXa（rFX-EGF2-AP-CD；調製および説明
についてはPCT/EP97/03027を参照のこと）および天然の
ヒト・トリプシン（シグマ・アルドリッヒ・ケミエ（Si
gma-Aldrich Chemie）GmbH（Deisenhofen,Germany）、
カタログ番号T6424）と比較して測定した。略語：Bz、
ベンゾイル；pNA、p-ニトロアニリン。
【００７１】10〜100μlの試料を190-100μlの50mmol/l
トリス塩酸、150mmol/l NaCl、5mmol/l CaCl2、0.1％
PEG8000、pH8.0で200μlとし、20μlのクロモチーム
（登録商標）X、U、PK、およびTH（0.5〜40mmol/l）を
添加して、ELISAリーダーを用いて405nmの波長、RTで試
薬ブランク値に対して測定した。活性および反応動力学
定数を、ミカエリス・メンテンの式に従い、直線初期勾
配から決定した。
トリス塩酸、150mmol/l NaCl、5mmol/l CaCl2、0.1％
PEG8000、pH8.0で200μlとし、20μlのクロモチーム
（登録商標）X、U、PK、およびTH（0.5〜40mmol/l）を
添加して、ELISAリーダーを用いて405nmの波長、RTで試
薬ブランク値に対して測定した。活性および反応動力学
定数を、ミカエリス・メンテンの式に従い、直線初期勾
配から決定した。
【表２】 クロモチーム（登録商標）X（N-メトキシカルボニル-D-Nle-Gly-Arg-pNA） kcat（1/s） Km（μM） kcat/Km（1/μM/s） ──────────────────────────────────── rFXa 215 199 1.1 rFXTa 52 22 2.4 トリプシン 153 43 3.6
【表３】 クロモチーム（登録商標）U（Bz-β-Ala-Gly-Arg-pNA） kcat（1/s） Km（μM） kcat/Km（1/μM/s） ──────────────────────────────────── rFXa 66 134 0.5 rFXTa 68 49 1.4 トリプシン 225 208 1.1
【表４】 クロモチーム（登録商標）PK（Bz-Pro-Phe-Arg-pNA） kcat（1/s） Km（μM） kcat/Km（1/μM/s） ──────────────────────────────────── ─ rFXa 53 265 0.2 rFXTa 119 115 1 トリプシン 38 17 2.2
【表５】 クロモチーム（登録商標）TH（トシル-Gly-Pro-Arg-pNA） kcat（1/s） Km（μM） kcat/Km（1/μM/s） ──────────────────────────────────── ─ rFXa 107 149 0.7 rFXTa 39 23 1.7 トリプシン 95 13 7.3 Bz：ベンジル pNA：p-ニトロアニリン。
【００７２】実施例１０．キメラrFXTaプロテアーゼの
結晶化 活性化され精製された組換え作製rFXTaプロテアーゼ
を、4℃で6時間、2×100容量の5mmol/l HEPES、pH6.5に
対して透析し、次に、アミコン社（Amicon Company）
（Witten,Germany）のセントリコン（Centrikon）（登
録商標）10微量濃縮器で、5mg/mlの濃度まで濃縮した。
結晶化は、シッティング・ドロップ（sitting drop）に
おける蒸気拡散により行った。4mlのFXa特異的阻害剤DX
-9065a（Katakura,S.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm
un.197(1993)965-972）を、4mlの濃縮rFXTaプロテアー
ゼに添加し（阻害剤濃度：100mmol/l トリス塩酸、10％
ポリエチレングリコール6K（PEG 6K）、pH7.0中0.5mmo
l/l）、シッティング・ドロップにおける蒸気拡散によ
り4℃で平衡化した。結晶は、3〜7日後に成長した。
結晶化 活性化され精製された組換え作製rFXTaプロテアーゼ
を、4℃で6時間、2×100容量の5mmol/l HEPES、pH6.5に
対して透析し、次に、アミコン社（Amicon Company）
（Witten,Germany）のセントリコン（Centrikon）（登
録商標）10微量濃縮器で、5mg/mlの濃度まで濃縮した。
結晶化は、シッティング・ドロップ（sitting drop）に
おける蒸気拡散により行った。4mlのFXa特異的阻害剤DX
-9065a（Katakura,S.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm
un.197(1993)965-972）を、4mlの濃縮rFXTaプロテアー
ゼに添加し（阻害剤濃度：100mmol/l トリス塩酸、10％
ポリエチレングリコール6K（PEG 6K）、pH7.0中0.5mmo
l/l）、シッティング・ドロップにおける蒸気拡散によ
り4℃で平衡化した。結晶は、3〜7日後に成長した。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、改良された性質を有し、
結晶化が容易な、キメラセリンプロテアーゼが提供され
た。該キメラセリンプロテアーゼは、第一セリンプロテ
アーゼの第一ドメイン・ハーフに相当する第一ドメイン
・ハーフと、第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・
ハーフに相当する第二ドメイン・ハーフとの、βシート
構造を有する２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイ
ド）を含むプロテアーゼ・ドメインを有する。
結晶化が容易な、キメラセリンプロテアーゼが提供され
た。該キメラセリンプロテアーゼは、第一セリンプロテ
アーゼの第一ドメイン・ハーフに相当する第一ドメイン
・ハーフと、第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・
ハーフに相当する第二ドメイン・ハーフとの、βシート
構造を有する２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイ
ド）を含むプロテアーゼ・ドメインを有する。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER MANNHEIM GMBH <120> Chimeric serine proteases <130> RC-006 <150> EP 97121232.9 <151> 1997-12-3 <160> 14 <170> PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO) <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N1 for PCR <400> 1 aaaaaaccat ggatgatgat gacaagatcg ttggg 35 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N2 for PCR <400> 2 aaaaaaaagc ttcattagct attggcagct atggtgttc 39 <210> 3 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N3 for PCR <400> 3 aaaaaaatgc atcaccacca cgacgatgac gacaagatcg tgggaggcta caactgcaag 60 gacggggagg taccctggca ggccctgctc atc 93 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N4 for PCR <400> 4 aaaaaaccag tggctggagg ggcggtgggc agagaggcag gcgccacgtt catgcg 56 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N5 for PCR <400> 5 aaaaaaccag ccactggcac gaagtgcctc atctctggct tcggcaacac tgcgagctct 60 ggcg 64 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N6 for PCR <400> 6 aaaaaagctc ttcctccagg cttgttcttc tgggcacagc cttcacccca ggagacaact 60 ccttg 65 <210> 7 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Adaptor N7 <440> 7 aaaaaagctc ttctggaatc tacaccaagg tctacaacta cgtgaaatgg attgaccgtt 60 ctatgaaaac ccgttaatga agcttttttt t 91 <210> 8 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N8 for PCR <440> 8 aaaaaaaagc ttcattaacg ggttttcata gaacggtcaa tccatttcac gtagttgtag 60 accttggtgt agattccaga agagcttttt t 91 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N9 for PCR <400> 9 aaaaaagctc ttccacagaa catgttgctg gtaatgatga aggaagagga ggcttcacac 60 ttagcctggc 70 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N10 for PCR <400> 10 aaaaaagctc ttcctgtgtg ggcttccttg agggaggcaa ggatgcttgt cagggtgatt 60 ctggtgg 67 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer N11 for PCR <400> 11 aaaaaaaagc ttcattaacg ggttttcata gaacggtcaa tccatttcac gtag 54 <210> 12 <211> 725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: The nucleotide sequence of the FXT base gene. <400> 12 atgcatcacc accacgacga tgacgacaag atcgtgggag gccaggaatg caaggacggg 60 gagtgtccct ggcaggccct gctcatcaat gaggaaaacg agggtttctg tggtggaacc 120 attctgagcg agttctacat cctaacggca gcccactgtc tctaccaagc caagagattc 180 aaggtgaggg taggggaccg gaacacggag caggaggagg gcggtgaggc ggtgcacgag 240 gtggaggtgg tcatcaagca caaccggttc acaaaggaga cctatgactt cgacatcgcc 300 gtgctccggc tcaagacccc catcaccttc cgcatgaacg tggcgcctgc ctctctgccc 360 accgcccctc cagccactgg cacgaagtgc ctcatctctg gctggggcaa cactgcgagc 420 tctggcgccg actacccaga cgagctgcag tgcctggatg ctcctgtgct gagccaggct 480 aagtgtgaag cctcctaccc tggaaagatt accagcaaca tgttctgtgt gggcttcctt 540 gagggaggca aggattcatg tcagggtgat tctggtggcc ctgtggtctg caatggacag 600 ctccaaggag ttgtctcctg gggtgatggc tgtgcccaga agaacaagcc tggagtctac 660 accaaggtct acaactacgt gaaatggatt aagaacacca tagctgccaa tagctaatga 720 agctt 725 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> N_region <223> Description of Artificial Sequence: Prosegment with a Truncated Tr ypsin Activation Peptide <400> 14 Met His His His His Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 10
【参考文献】Allaire, M. et al., Nature 369(1994) 7
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on Kurinov, I.V. et al., Protein Science 5 (1996) 752
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993) 208-211 McLachlan, A.D., J.Mol.Biol. 128(1979) 49-79 Medved, L.V. et al., J.Biol.Chem. 270(1995) 13652-
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81 and 1382-1400 Mustard, J.F. et al., In: Haemostasis and Thrombos
is. Bloom, A.L. andThomas, D.P. (eds.), 2nd editio
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Press, Cold Spring Harbor, New York Stubbs, M. et al., FEBS Letters 375(1995) 103-107 Twining, S.S., Crit.Revs.Biochem.Mol.Biol. 29(199
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York (1983) Bernstein, F.C. et al., J.Mol.Biol.112(1977) 535-5
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370 Emi, M. et al., Gene 41(1986) 305-310 Furie, B. et al., Cell 53(1988) 505-518 Gaboriaud, C. et al., J.Mol.Biol. 259(1996) 995-10
10 Gay, N.J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1132(1992)
290-296 Goldberger, G. et al., J.Biol.Chem. 262(1987) 1006
5-10071 Greer, J., Proteins Struct. Funct. Genet. 7(1990)
317-334 Grodberg, J. et al., J.Bacteriol. 170(1988) 1245-1
253 Guy, O. et al., Biochem. 17(1978) 1669-1675 Harker, L.A. et al., In: Hemostasis and Thrombosi
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n. 197(1993) 965-972 Kaul, R.K. et al., Gene 41(1986) 311-314 Kemmler, W. et al., J.Biol.Chem. 246(1971) 6786-67
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-758 Laemmli, UK, Nature 227(1970) 680-685 Lesk, A.M. et al., J.Mol.Biol. 258(1996) 501-537 Liao, D. et al., Biochemistry 31(1992) 9796-9812 Mann, K.G. et al., Blood 76(1990) 1-16 Maraganore, J.M., Thrombosis and Haemostasis 70 (1
993) 208-211 McLachlan, A.D., J.Mol.Biol. 128(1979) 49-79 Medved, L.V. et al., J.Biol.Chem. 270(1995) 13652-
13659 Mullis, K.B. et al., Methods Enzymol. 155(1987) 35
0-355 Murzin, A.G. et al., J.Mol.Biol. 236(1994) 1369-13
81 and 1382-1400 Mustard, J.F. et al., In: Haemostasis and Thrombos
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a Raton, Florida, CRCPress, chapter 3 (1989) Protein Data Base (PDB) Rawlings, N.D. et al., Methods Enzymol. 244(1994)
19-61 Read, R.J. and James, M.N.G., J.Mol.Biol. 200(198
8) 523-551 Sambrook, J. et al., (1989) In: Molecular cloning:
A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory
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4) 315-383 Von der Saal, W. et al., Archiv der Pharmazie 329
(1996) 73-82 WO 93/09144
【図１】 X因子、トリプシン、ならびにトリプシノー
ゲンおよびFXから構築されたキメラrFXTプロテアーゼの
概略を示す図である。FXaの部分が黒で、トリプシンの
部分が白色で示されている。略語：AP、活性化ペプチ
ド；AA、芳香族アミノ酸に富むドメイン；CD、触媒ドメ
イン；EGF1、上皮成長因子様ドメイン；EGF2、上皮成長
因子様ドメイン；GLA、γ-カルボキシグルタミン酸残基
に富むドメイン。
ゲンおよびFXから構築されたキメラrFXTプロテアーゼの
概略を示す図である。FXaの部分が黒で、トリプシンの
部分が白色で示されている。略語：AP、活性化ペプチ
ド；AA、芳香族アミノ酸に富むドメイン；CD、触媒ドメ
イン；EGF1、上皮成長因子様ドメイン；EGF2、上皮成長
因子様ドメイン；GLA、γ-カルボキシグルタミン酸残基
に富むドメイン。
【図２】 FXT基本遺伝子のヌクレオチド配列および推
定アミノ酸配列を示す図である。N末端FXaハーフ・サイ
ドおよびC末端トリプシン・ハーフ・サイドに導入され
た付加的な変異を下線で示す（FXT-M変異体）。（ヌク
レオチド配列は、配列番号：12に示されている。） 配列番号：1〜11 プライマーN1〜N11 配列番号：12 FXT基本遺伝子のヌクレオチド配列
を示す（図2と一致） 配列番号：13 ヒト・トリプシン遺伝子IおよびII
の活性化ペプチド 配列番号：14 短縮型トリプシン活性化ペプチド
を含むプロセグメント。
定アミノ酸配列を示す図である。N末端FXaハーフ・サイ
ドおよびC末端トリプシン・ハーフ・サイドに導入され
た付加的な変異を下線で示す（FXT-M変異体）。（ヌク
レオチド配列は、配列番号：12に示されている。） 配列番号：1〜11 プライマーN1〜N11 配列番号：12 FXT基本遺伝子のヌクレオチド配列
を示す（図2と一致） 配列番号：13 ヒト・トリプシン遺伝子IおよびII
の活性化ペプチド 配列番号：14 短縮型トリプシン活性化ペプチド
を含むプロセグメント。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 598170752 116 Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓ ｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎ ｙ (72)発明者 リチャード エング ドイツ ウェスリング ハーストストラッ セ ４ (72)発明者 カール−ペーター ホフナー ドイツ ミュニッヒ ニューマークター ストラッセ 86ビー (72)発明者 ロバート ヒューバー ドイツ ガーメリング シュレザーストラ ッセ 13 (72)発明者 エルハード コペツキ ドイツ ペンツバーグ カストナーホフス トラッセ 21
Claims (4)
- 【請求項１】 プロテアーゼ・ドメインがβシート構造
を有する２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイド）を
含み、第一ドメイン・ハーフが第一セリンプロテアーゼ
の第一ドメイン・ハーフに相当し、第二ドメイン・ハー
フが第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフに
相当する、キメラセリンプロテアーゼ。 - 【請求項２】 第一ドメイン・ハーフがＸａ因子に相当
し、第二ドメイン・ハーフがトリプシンに相当する、請
求項１記載のセリンプロテアーゼ。 - 【請求項３】 キメラセリンプロテアーゼをコードする
核酸を原核生物または真核生物の宿主細胞において発現
させ、宿主細胞または上清からタンパク質を回収し単離
する、請求項１または２記載のセリンプロテアーゼの組
換えによる製造方法。 - 【請求項４】 結晶型である、請求項１または２記載の
キメラセリンプロテアーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121232.9 | 1997-12-03 | ||
| EP97121232 | 1997-12-03 |
Publications (2)
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