JPH11146784A - 生化学用反応容器および遺伝子増幅装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 多種類の遺伝子を同時に増幅、精製可能な遺
伝子増幅装置等に利用して、生化学反応液を効率良く反
応槽から取り出すことのできる反応容器およびこれを使
用した遺伝子増幅装置および遺伝子増幅方法を提供す
る。 【解決手段】 物理的圧力の印加により反応容器が圧縮
変形して内部の液体を流動させることを可能とした圧縮
変形可能な材質からなる生化学用反応容器、細胞不透過
性かつ核酸透過性の多孔質膜内層２ａおよび核酸吸着能
を有し且つ核酸を固定し得る多孔質膜外層２ｂの少なく
とも２層からなり蓋材または底材として働く多孔質積層
膜（Ａ）と複数のセルを形成した基材（Ｂ）とにより形
成される複数の反応槽を有する遺伝子増幅装置におい
て、上記基材（Ｂ）として上記生化学用反応容器を用い
る遺伝子増幅装置、および圧力印加により反応後の反応
液を取り出す遺伝子増幅方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、圧力の印加により
圧縮されて内部の反応液を移動させることが可能な生化
学用反応容器およびこの容器を基材として含有する多種
類の遺伝子を同時に増幅する装置および方法に関する。
更にこうして増幅された多種類の遺伝子を一度に解析す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、先に特願平９−２１１６
９４号において、多種類の遺伝子を同時に増幅する装置
を開示した。上記先願発明の遺伝子増幅装置は、細胞不
透過性かつ核酸透過性の多孔質膜内層および核酸吸着能
を有し且つ核酸を固定し得る多孔質膜外層の少なくとも
２層からなり蓋材または底材として働く多孔質積層膜
（Ａ）と複数のセルを形成した基材とにより形成される
複数の反応槽を有するものである。この装置を用いた遺
伝子の増幅方法では、複数の反応槽内で増幅された遺伝
子は、増幅装置に、遠心力を加える、多孔質積層膜に吸
水性材料を接触させる、多孔質積層膜側から真空吸引す
る、基材の上表面から加熱して反応槽内に含まれる空気
を熱膨張性させる等の方法により反応槽内にある遺伝子
を含む生化学反応溶液を多孔質積層膜の方へ流動させる
ことによって多孔質積層膜に吸着または固定していた。

【０００３】しかし、反応槽内部には大程の場合、反応
液以外にある程度の空気部分が存在し、そのため上記の
いずれの方法によっても反応液を効率良く且つ十分に多
孔質積層膜へ送り込むことはできなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、多種類の遺
伝子を同時に増幅、精製可能な遺伝子増幅装置等に利用
して、生化学反応液を効率良く反応槽から取り出すこと
のできる生化学用反応容器およびこれを使用した遺伝子
増幅装置および遺伝子増幅方法を提供することを目的と
する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、溶液中で生化
学反応を行う反応容器において、物理的圧力の印加によ
り反応容器が圧縮変形することによって反応容器内の液
体を移動させることを可能とした圧縮変形可能な材料か
らなる生化学用反応容器に関する。

【０００６】また、本発明は、細胞不透過性かつ核酸透
過性の多孔質膜内層２ａおよび核酸吸着能を有し且つ核
酸を固定し得る多孔質膜外層２ｂの少なくとも２層から
なり蓋材または底材として働く多孔質積層膜（Ａ）と複
数のセルを形成した基材（Ｂ）とにより形成される複数
の反応槽を有する遺伝子増幅装置において、上記基材
（Ｂ）として上記の生化学用反応容器を用いる遺伝子増
幅装置に関する。

【０００７】更に、本発明は、細胞不透過性かつ核酸透
過性の多孔質膜内層２ａおよび核酸吸着能を有し且つ核
酸を固定し得る多孔質膜外層２ｂの少なくとも２層から
なる多孔質積層膜（Ａ）およびそれに脱着可能に貼り合
わされた防水膜とからなる蓋材と複数のセルを形成した
上記基材（Ｂ）とにより形成された複数の反応槽を有す
る遺伝子増幅装置の各反応槽に、遺伝子を産生する細胞
を含む菌液を接種し、細胞培養、遺伝子の精製、増幅を
行った後、装置を上下反転しまたは反転しないで、防水
膜を剥がした後、反応容器に圧力を印加して反応容器を
圧縮することにより菌液を多孔質積層膜（Ａ）の方へ圧
流させ、分別濾過後遺伝子を上記多孔質膜２ｂに配列固
定する遺伝子増幅方法に関する。

【０００８】更に本発明は、上記本発明の遺伝子増幅方
法により得られた遺伝子が配列固定された多孔質膜２ｂ
上で相補性解析を用いることにより行われる遺伝子解析
方法に関する。

【０００９】本発明はまた、それぞれの反応槽と対応す
るように位置決めされた棒状突起を有する植菌用治具に
を用いて、反応槽中の遺伝子産生細胞を付着して別の容
器に接種し、同じ型の遺伝子増幅装置の各反応槽に植菌
複製を行う上記の遺伝子増幅方法に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の生化学用反応容器は、外
部からの圧力により圧縮変形可能な材質からなり、圧縮
変形されることにより、その内部に収容された生化学反
応溶液を移動させることができる特性を有することを特
徴とする。

【００１１】この生化学用反応容器は、免疫反応、ＰＣ
Ｒ反応、核酸抽出等溶液中で生化学反応を行う反応系に
使用することができ、圧力の印加により容器内の液に液
流を生ぜしめて濾過操作、混液操作、洗浄操作等を行う
に有用である。

【００１２】このような特性を有する本発明の反応容器
は、外力により圧縮変形する材料でできておればどのよ
うなどのようなものでもよく、変形に必要な圧力は特に
規定するものではなく、手動または簡単な器具および装
置により印加できる程度の圧力を意味している。あまり
に小さい外力で変形するような材料を使用したものは取
り扱いが不便であり、また過度の圧力でしか変形しない
ものは圧縮装置自体が過大となり取り扱いが容易でない
ばかりか高価な圧縮装置となり、また反応容器を使用し
ている他の部品が破損する恐れがあり、いずれも好まし
くない。

【００１３】ここで変形とは、これも特にその程度を限
定するものではなく、内部の液体に圧流を生じさせるよ
うな大きさであればよく、好ましくはその厚さが２／３
以下、より好ましくは１／２以下、特に好ましくは１／
３以下となるものである。

【００１４】上記の性能を有する圧縮変形可能な材料と
して、弾性材料、発泡弾性材料またはガラス転移温度が
使用温度以下である軟質プラスチック材料の発泡体を用
いることができるが、好ましくは弾性材料または弾性材
料からなる独立気泡発泡体である。材質としてはＤＮＡ
やタンパク質を吸着せず、反応系を阻害しないものであ
って、ＰＣＲ反応の高温度即ち、１００℃に近い高温に
耐えるものであればよい。使用できる高分子材料は、遺
伝子と結合したり吸着したりせず、且つ水に膨潤や溶解
をしないものであれば特に限定されない。このような高
分子材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リエステル類、ポリスチレン、ポリアミド類、ポリウレ
タン類、ＡＢＳ樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリ
デン等が例示できる。特に低密度ポリエチレンが成形
性、耐薬品性およびガラス転移温度の点から好ましい。
弾性材料としては通常の合成ゴム、天然ゴム、シリコン
ゴム、ポリウレタン弾性体等が挙げられる。発泡体の場
合は気泡が均一で微細なものほど好ましい。

【００１５】本発明の生化学用反応容器は、ひとつの有
用な用途として、図１〜図３に示す遺伝子増幅装置に於
ける基材Ｂとして用いることができる。この場合基材と
しての本発明の反応容器は底を有するセルが形成された
ものを用いることも、セルが隔壁だけから形成されたも
のも用いることもできる。

【００１６】また本発明の生化学用反応容器は１体の反
応容器の中に複数の反応槽（ウェル）が形成されている
ことが好ましい。反応槽は０.００１×０.００１ｍｍ〜
１０×１０ｍｍ（縦×横）、深さ０.００１〜１０ｍｍ
の範囲内で形成されるが、好ましくは２×２ｍｍ（縦×
横）程度で深さ０.１〜１０ｍｍのものである。反応槽
５の容積は１ｐｌ程度から形成し得るが、０.００１ｍ
ｌ〜２ｍｌ、より好ましくは０.１ｍｌ〜２ｍｌとす
る。

【００１７】上記のような多数の反応槽を有する反応容
器は種々の方法によって作製することができる。反応容
器は射出成型、押出成形、圧縮成形、真空成型、トラン
スファー成形等、公知のいずれの方法を用いてもよい。
また発泡体として成形する場合は発泡性高分子ビーズを
型に入れて発泡成形することもできる。以上のような直
接的な成形とは別に、弾性材料や発泡体のシートまたは
板状物から型の打ち抜き、ＮＣ旋盤加工、レーザー加工
またはウォーター加工を施して作製することもできる。
または、めっきやシリコンウエハーのエッチングにより
形成したものを鋳型として用いて成型してもよい。

【００１８】本発明の生化学用反応容器を基材として用
いた本発明の遺伝子増幅装置を図面に基づいて詳細に説
明する。図１は、本発明の遺伝子増幅装置の多孔質積層
膜（Ａ）が底材として働く場合の一例を示したものであ
る。この場合基材としての反応容器は底のない隔壁のみ
からなるセルを形成したものが用いられる。底材１は材
質の異なる少なくとも２層の多孔質膜２ａ（多孔質膜内
層）および２ｂ（多孔質膜外層）からなる多孔質積層膜
（Ａ）により形成される（以下、本発明においては、多
孔質積層膜が蓋材として用いられる場合であれ底材とし
て用いられる場合であれ、反応槽の内側として働く方の
多孔質膜を多孔質膜内層、多孔質内層と積層してその外
側に接して用いられる多孔質膜を多孔質膜外層と言
う）。

【００１９】本発明の遺伝子増幅装置においては、上記
多孔質積層膜（Ａ）を反応容器である基材（Ｂ）と組み
合わせることによって多数の反応槽５が形成される。多
孔質積層膜（Ａ）が底材として働く図１または図２の場
合には、基材（Ｂ）即ち反応容器はセルが底部のない隔
壁４だけから形成されたものが用いられる。反応槽は所
望の形状および所望の数をもって形成すればよい。

【００２０】反応容器のセルを区画する隔壁４は、各反
応槽５を仕切り、隣接する反応槽中の成分が相互に混合
しないように多孔質積層膜（Ａ）の上部に設置される。
隔壁は、あらかじめ隔壁のみを形成し、熱融着、接
着、粘着または成型品の凹凸嵌合のいずれかの手段で多
孔質膜上に設置しても、あるいは多孔質膜に適当な膜厚
のパターンを塗布することによって形成してもよい。隔
壁の成型方法として厚膜パターン塗布する場合には、弾
性材料をスクリーン印刷、ロールコーティング、ディス
ペンサーにより厚膜塗布することができる。また発泡性
のインクを多孔質積層膜上にスクリーン印刷、ロールコ
ーティング、ディスペンサーにより塗布した後熱処理等
により発泡させて形成してもよい。

【００２１】図２は多孔質積層膜（Ａ）が底材として用
いられる場合の本発明の遺伝子増幅装置の側面図を示し
ている。

【００２２】図９は多孔質積層膜（Ａ）が蓋材１'とし
て使用される場合の本発明の遺伝子増幅装置の１例を示
す。基材（Ｂ）としての反応容器は、図９（ａ）に図示
するように、そのセルが隔壁だけでなく底を有して形成
されたものが使用される。この底を有する基材３上に、
図９（ｂ）に示すように多孔質積層膜Ａが蓋１'として
覆せられて遺伝子増幅装置が構成される。

【００２３】底を有する基材３は、上記のように、セル
の底部と隔壁とが一体に形成されていてもよいが、また
底部を構成する基材上に隔壁を別に形成してもよい。例
えば、成形加工によりまたはシートを断裁して作製した
隔壁を底部を構成する材に接着等の方法で取り付けても
よいし、あるいは厚膜印刷等により底板上に隔壁を形成
してもよい。成形加工は射出成形、押出成形、圧縮成
形、真空成形、トランスファー成形、ブロー成形等を用
いることができる。シートの断裁には旋盤による加工、
金属製の治具によるシートの打ち抜き、レーザーによる
穴開け等の方法が使用できる。

【００２４】また厚膜印刷の手法としてはスクリーン印
刷、ロールコーティング、ディスペンサー塗布等が使用
できる。

【００２５】この場合、基材として用いられる反応容器
は、隔壁と底部の材料がともに圧縮変形可能な材質であ
ってもよいし、隔壁部分だけが圧縮変形可能な材質であ
ってもよいが、少なくとも隔壁部分には圧縮変形可能な
材質を使用する必要がある。

【００２６】多孔質積層膜Ａは、これを蓋材１'として
使用する場合も底材１として使用する場合も同じものを
用いることができる

【００２７】多孔質積層膜を構成する多孔質膜内層２ａ
としては、細胞フィルターとして機能するもの、即ち細
胞あるいは細胞の残渣を透過せず、遺伝子およびタンパ
ク質を透過することができる孔径の膜であればよい。具
体的な孔径としては０.２〜１.６μｍ、好ましくは０.
３〜０.８μｍのものが例示される。膜の材質としては
ＤＮＡおよび蛋白質を吸着しないものであれば特に限定
されないが、セルロース濾紙、ガラスフィルター、酢酸
セルロースメンブレン、再生セルロースメンブレン、ポ
リカーボネートメンブレン、必要に応じて表面修飾され
たナイロンメンブレン、ポリビニリデンフルオライドメ
ンブレンなどが例示される。

【００２８】多孔質膜外層２ｂとしては、核酸吸着能を
有し、核酸を膜上に吸着、固定化するものであればよ
く、材質としては特に限定されないが、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレ
ン、ジエチルアミノエタンセルロースメンブレン、プラ
スチャージ導入ナイロンメンブレン、ポリビニリデンフ
ルオライドメンブレン等が例示される。また、孔径とし
ては培養後核酸を吸着、固定化させる際に目詰まり等の
トラブルを生じさせない範囲であればよく、具体的には
０.１〜２.０μｍ、好ましくは０.２〜０.８μｍのもの
が例示される。

【００２９】本発明に使用する多孔質膜内層２ａは、Ｄ
ＮＡが透過可能な膜であるため、各反応槽に菌液を加え
て培養を行う場合に、ＤＮＡが多孔質膜内層２ａを介し
て隣り合う反応槽に漏れ入り、反応槽の内容物が汚染さ
れる問題が生じる。そのため、多孔質膜内層には、隔壁
と接する部分、即ち隔壁に相当する形に、その細孔を封
じて、隣り合う反応槽中の菌液またはその成分の一部が
混ざり合わないようにする必要がある。細孔を封じる方
法としては、熱または溶媒により膜を緻密化させたり、
固形分を含む液を含浸させたのち乾燥して細孔を閉塞す
る等の方法を用いることができる。細孔を封じる方法と
しては上記の方法を含め、どの方法を用いてもよいが、
多孔質膜内層がＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライ
ド）や酢酸セルロースのような熱可塑性の材料である場
合、熱溶融により膜を緻密化する方法が好ましい。この
場合ヒーターは金属製の治具を切削等により任意に凹凸
を設けることにより形成したものを用いることができ
る。熱溶融を行う場合の温度は材料により異なるが、Ｐ
ＶＤＦの場合は荷重が０.２〜２ｋｇ／ｃｍ²で２００〜
２７０℃の条件で１〜５秒、酢酸セルロースの場合は荷
重はＰＶＤＦと同様とし、温度２８０〜３５０℃の条件
で１〜５秒が好ましい。

【００３０】多孔質膜内層と多孔質膜外層との間には、
遺伝子および菌液の透過を確保するために全面に接着剤
等を使用して一体化することはできない。また両多孔質
膜は相互に剥離可能に一体化される必要がある。そのた
めに剥離可能な融着、粘着または接着剤を用いて、好ま
しくは、次に述べる多孔質膜内層と隔壁との接着と同
様、隔壁に相当する部分だけで接合することである。多
孔質膜内層と多孔質膜外層との一体化の状態を図１０
（ｃ）に示す。

【００３１】蓋材または底材としての多孔質積層膜Ａと
セルが隔壁部分だけから形成されている基材（Ｂ）との
一体化は、熱融着、粘着または接着剤により行うことが
できる。一体化は図１０（ｄ）に示すように、多孔質膜
内層の基材のセル隔壁と接する部分に熱融着剤、粘着剤
または接着剤が取り付けられる。多孔質積層膜を基材と
接合するまでは、図１０（ｃ）に示すように接着剤等の
表面には離型紙を取り付けておいてもよい。図１２
（ｄ）には、このようにして多孔質積層膜と基材の隔壁
部とが一体化された状態を示す。

【００３２】熱融着はそれぞれの熱融着材料の融点付近
もしくは融点以上の温度の加熱による圧着により接着す
る。熱融着を行う場合それぞれの熱融着材料の融点は接
近していることが望ましい。熱融着は多孔質積層膜を作
製してからそれを基材と接着してもよいし、多孔質膜内
層、多孔質膜外層および基材を３者同時に接着してもよ
い。

【００３３】粘着剤または接着剤は反応阻害がなければ
特に制限されない。接着剤としては、アクリル系、ウレ
タン系、エポキシ系、アミノ鎖導入エポキシ系接着剤が
好ましい接着剤として例示できる。また粘着剤としては
アクリル系の水性エマルジョンタイプが例示できる。

【００３４】粘着剤または接着剤を用いる場合、基材と
の密着性を向上させるため、基材にフレーム処理を施し
てもよい。

【００３５】また低融点のシーラントを塗布するか、熱
融着性シーラントメッシュを介して高分子材料が溶融し
ないような低融点で熱融着する方法を用いることもでき
る。この方法を用いれば、全面を加熱しても材料の物性
変化や変形が生じることもないので、パターン加熱、位
置合わせ等の工程を回避できる。

【００３６】また多孔質膜外層は、遺伝子増幅装置内で
の遺伝子増幅の後、この膜に固定された遺伝子をさらに
増幅させるため、またはハイブリダイゼーション解析に
用いるため、一連の工程の最後に剥離する必要がある。
そのため比較的緩和な条件での熱融着、接着剤により擬
似接着、または粘着されていることが好ましい。

【００３７】底材または蓋材としての多孔質積層膜は、
好ましくはその各層が独立して基材から着脱し得るよ
う、構成される。着脱可能とするためには、多孔質膜の
各層のいずれかに基材のセル隔壁の部位にそって粘着剤
をパターン塗布する、あるいは凹凸嵌合を設置する等、
いずれの方法によってもよい。多孔質膜は各反応槽単位
で独立して剥離し得るようにしてもよい。

【００３８】本発明の遺伝子増幅装置は、実験の都合に
より所望の形状の反応槽が所望の数含まれるよう、形成
すればよい。本発明の遺伝子増幅装置をシート状に成形
し、これを必要に応じて切り取って使用してもよい。

【００３９】本発明の遺伝子増幅装置は多孔質積層膜の
更に外側に着脱可能に防水性膜１４を設けてもよい。防
水性膜としては、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポ
リオレフィンフィルム、ＰＥＴフィルム、ポリ塩化ビニ
ルフィルム等の高分子フィルムが例示される。

【００４０】本発明の遺伝子増幅装置が防水性膜１４を
有する場合には、各反応槽５内へ培養液６を添加し、そ
れぞれの目的遺伝子を有する宿主細胞を接種してそのま
ま培養すればよい（図２）。

【００４１】本発明の遺伝子増幅装置において、防水性
膜を設けない場合は、本発明の遺伝子増幅装置を図３に
示すごとく、バット中で水中へ浸けて培養に用いればよ
い。防水性膜は、操作環境が湿潤で、底部分からの乾燥
が防止できる場合、あるいは多孔質膜下層２ｂのＤＮＡ
固定容量が十分であり、吸着されなかったＤＮＡが底部
分からリークしない場合には必要がない。

【００４２】いずれの場合にも、本発明の遺伝子増幅装
置に宿主細胞を接種し、増殖させる際、反応槽内部は図
４に示すごとくなる。

【００４３】本発明の遺伝子増幅装置を用いて得られる
遺伝子固定化膜を複製するため、本発明はさらに接種用
治具を提供する。接種用治具としては、図５に示すごと
き本発明の遺伝子増幅装置の反応槽の形状に位置決めさ
れた棒状突起を有する接種用治具１０が例示される。か
かる接種用治具を用いることによって、容易に遺伝子固
定化膜の複製を得ることができる。

【００４４】次いで、本発明の遺伝子増幅方法について
説明する。本発明の遺伝子増幅方法においては、本発明
の装置の反応槽内に目的遺伝子を有するベクターが導入
された細胞を接種し、この細胞を培養して、遺伝子の精
製、増殖を行う。本発明の方法により好適に増幅される
目的遺伝子としては、酵母ゲノム遺伝子、ラン藻ゲノム
遺伝子、ヒトゲノム遺伝子等が例示されるが、ベクター
に組み込み可能なサイズのものであれば、特に限定され
ない。

【００４５】目的遺伝子をベクターに導入する際、後の
ＰＣＲ反応を容易にするために、図６に示すごとく、目
的遺伝子の両端に共通のＰＣＲプライマー結合部位を導
入しておくことが好ましい。かかる目的遺伝子をベクタ
ーへ挿入させる方法、およびベクターを用いて宿主細胞
を形質転換する方法は、当業者によく知られている。

【００４６】本発明の遺伝子増幅方法において、用いる
宿主細胞−ベクター系は特に限定されず、遺伝子工学の
分野で用いられる大腸菌−Ｍ１３ファージ、大腸菌−Ｐ
ＵＣプラスミド、酵母−ＹＡＣプラスミド等がいずれも
好適に用いられる。これらは目的遺伝子の種類および解
析目的に応じて適当なものを選択すればよい。特に増殖
に伴いベクターが菌体外へ放出されるような種類の宿主
−ベクター系を用いれば、目的遺伝子を含むベクターが
増殖に伴って菌体外に放出されるため、後の操作が容易
である。かかる宿主−ベクター系としてはベクターにＭ
１３ファージを用い、宿主細胞に大腸菌を用いる方法が
例示される。Ｍ１３ファージは、増殖に伴い一本鎖のベ
クターが菌体外に放出されるため、後の精製工程が容易
となる。

【００４７】遺伝子産生細胞は、多連ディスペンサロボ
ットあるいは図５に示すごとき接種用治具１０等で各反
応槽５内へ接種すればよい。また、一旦接種、増殖させ
た細胞を、図５に示すごとくさらに、反応槽に対応する
接種用治具１０を用いて他の装置へ接種して複製を作成
してもよい。

【００４８】細胞の培養条件としては、それぞれの細胞
に最適な条件を採用すればよく、特に限定されない。通
常、遺伝子操作に使用される細胞についての好適な培養
条件は当業者にはよく知られている。培養は、所望の細
胞の増殖が得られるまで行えばよい。

【００４９】宿主細胞が所望の程度まで増殖した後、防
水性膜１４を設けた場合はこれを剥離し、多孔質積層膜
Ａが底材として使用された場合はそのまま、また多孔質
積層膜が蓋材として使用された場合は増幅装置を上下反
転した後、即ち、いずれの場合も多孔質積層膜Ａが下面
にある状態にしてから、培養液全体を多孔質積層膜を介
して外部へ放出させる。培養液を反応槽から多孔質積層
膜の方へ取り出すために、本発明では圧縮変形可能な材
質からなる反応容器を使用している基材の特性が利用さ
れる。即ち多孔質積層膜の底部に吸水性素材を接触させ
たのち、遺伝子増幅装置全体に上から圧力を印加し、基
材すなわち反応容器を圧縮して培養液を強制的に押し出
す方法が採られる。反応容器を圧縮する方法としてはこ
の目的が達成できるものであればどのような方法であっ
ても差し支えない。特に好ましくは装置全体を平面加圧
により同時均一に圧縮する方法またはロールにより端部
から逐次加圧していく方法である。こうして培養液を増
幅装置から排除するとともに遺伝子を多孔質膜外層２ｂ
上へ吸着させる。これらの操作により細胞成分は内部多
孔質膜上に保持されるが、遺伝子を含むベクターは底部
の外部多孔質膜に吸着される。所望により、熱処理によ
り細胞やタンパク質成分を凝固、沈殿してもよい。こう
して、産生された遺伝子は細胞と分離される。

【００５０】あるいは、用いた系が培養後にもベクター
を放出しない宿主−ベクター系である場合には、超音波
破砕、界面活性剤添加後に振とうなどの方法により細胞
を破壊した後に、上記方法により細胞残渣と核酸を分離
すればよい。

【００５１】次いで、遺伝子を吸着した多孔質膜外層２
ｂを剥離する。この膜は必要に応じて洗浄、ブロッキン
グ、熱処理を行った後、ＰＣＲ法による遺伝子のさらな
る増幅へ供することもできるし、この遺伝子の解析を行
うための供試体としてハイブリダイゼーションシートを
作製して利用することもできる。洗浄は、膜上の細胞残
渣等の夾雑物の除去のために行われる。ブロッキングに
よりベクターＤＮＡの膜以外への吸着が防止されると共
に、ＰＣＲにより産生されるＤＮＡの吸着を防止し、回
収率を向上させることができる。ブロッキングは、通常
行われている方法を用いればよく、例えばカゼイン、Ｂ
ＳＡ等の不活性タンパク質、トリトンＸ−１００、トゥ
イーン系界面活性剤によるメンブレン表面の吸着などの
方法が挙げられる。

【００５２】ベクターが宿主外へ放出される宿主−ベク
ター系の場合、遺伝子を吸着した多孔質膜外層２ｂを剥
離した後、細胞を保持している多孔質膜内層へ新たな多
孔質膜外層を設置し、細胞培養および遺伝子の分離、吸
着を繰り返してもよい。

【００５３】また、反応槽内での細胞培養後、各反応槽
に対応するように位置決めされた棒状の突起が集合した
接種用治具に各反応槽中の細胞を付着させ、新たな装置
に移植してもよい（図５参照）。その後、上記と同様に
して遺伝子の増幅、精製を行い、多孔質膜外層に遺伝子
を吸着させればよい。この方法によれば、同じ遺伝子の
配列を有する遺伝子固定化膜の複製が容易に得られる。

【００５４】遺伝子を吸着させた多孔質膜外層は、必要
に応じて洗浄、ブロッキング、熱処理した後、隔壁およ
び所望により防水性膜を再設置してＰＣＲ法に供すれば
よい。あるいは、多孔質膜外層を剥離することなく、反
応槽内を洗浄して細胞成分を除き、そのままＰＣＲ工程
に供してもよい。

【００５５】ＰＣＲ法は反応槽内へｔａｑポリメラーゼ
のごとき耐熱性のポリメラーゼ、増幅用プライマーおよ
びｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、マグネシ
ウム塩などの必要な成分を含む反応溶液を添加して行
う。増幅用プライマーとしては、増幅しようとする各遺
伝子の両端と相補的なオリゴヌクレオチドであり、上述
のごとく各ベクターへ共通するプライマー反応部位を挿
入しておけば、それぞれの反応槽内の遺伝子の増幅を同
時に行うことができる。ＰＣＲ法は当業者によく知られ
ている方法であり、所定量の反応溶液を添加した後、公
知の熱サイクルを繰り返すことにより、反応槽５内でそ
れぞれの遺伝子が増幅される。

【００５６】ＰＣＲ反応時にはさらに、ＤＮＡ合成の有
無を確認するため、エチジウムブロマイド等のインター
カレート性の蛍光試薬を添加してもよい。

【００５７】本発明の方法により増幅された各遺伝子
は、ピペッティングなどによって回収しても、別の多孔
質膜に写し取った後固定化してハイブリダイゼーション
等の解析に供してもよい。

【００５８】本発明により得られる遺伝子を吸着させた
多孔質膜は、乾燥状態で冷暗所、より好ましくは不活性
ガス充填雰囲気下で保存することにより長期保存するこ
とが可能であり、必要な際にＰＣＲ法により増幅させて
もよい。

【００５９】細胞の培養、遺伝子の増幅、精製等の各工
程における反応液の供給は一般には反応槽の開口部より
行う。しかし、防水性膜を有していない場合、あるいは
防水性膜を除いた後には底部分の多孔質膜を介して行っ
てもよい。また、吸水性素材を反応槽に充填することに
よって、反応液供給の効率を上げることもできる。

【００６０】

【実施例】以下実施例により本願をさらに詳細に説明す
る。実施例は本願を限定するものではない。実施例 １：多孔質積層膜を底材として用いる例 防水性膜１４を最下層とし、その上に孔径・材質の異な
る２層の多孔質膜（２ａ，２ｂ）が積層して形成される
底材１と、多孔質膜の上部に設けられた隔壁４とにより
形成される複数の反応槽５よりなる遺伝子増幅装置を用
い、以下のごとく本発明を実施した。多孔質膜内層２ａ
および多孔質膜外層２ｂにはそれぞれ平均孔径０.４５
μｍのＰＶＤＦメンブレン（商品名「デュラポアメンブ
レン」；ミリポア社製）およびナイロンメンブレン（商
品名「ハイボンドＮ⁺」；アマシャム社製）を用いた。
また基材Ｂとしては１２７×８３ｍｍ、深さ１０ｍｍの
セルを３８６個有する独立気泡を有するアクリロニトリ
ル-ブタジエンゴム発泡体からなる圧縮変形可能な反応
容器を使用した。図７および図８に遺伝子増幅方法の概
略を示した：

【００６１】ａ） 各反応槽に大腸菌培養用培地、大腸
菌（Ｋ１２株）、各種遺伝子を組み込んだＭ１３ファー
ジ（Ｍ１３ｍｐ１８）を加え、３７℃にて一晩培養す
る。場培養中、菌液が蒸発しないように、シリコンゴム
製の蓋を嵌め込んで取り付けた。ここで遺伝子を組み込
んだＭ１３ファージは図６に示すごとくプライマー認識
部位を組み込んだ遺伝子の両端に有するものである。

【００６２】ｂ） 最下層の防水性膜１４を除いた後、
吸水性濾紙９を重層した上にこれをのせ、その全体を更
に５ｍｍ厚のプラスチック板で挟んだ。これをプレス機
の上下プレス板に挟み、基材部分が１／４の厚さに圧縮
されるまで加圧した。これより培養液は吸水性濾紙９に
移行したが、その際、大腸菌７'は多孔質膜内層２ａに
残り、Ｍ１３ファージ８'は多孔質膜外層２ｂに吸着、
固定化された。

【００６３】ｃ） 多孔質膜外層２ｂを剥離してＭ１３
ファージ８’を固定化した膜を得た。

【００６４】ｄ） Ｍ１３ファージを固定化した膜上に
新たに隔壁４’のみからなるセルを形成した反応容器を
基材として設置して、反応槽５’を形成した、

【００６５】ｅ） ｄ）の遺伝子増幅装置を、ｔａｑポ
リメラーゼ、増幅用プライマー、ｄＮＴＰ、マグネシウ
ム塩、増幅確認用のエチジウムブロマイドを含むバッフ
ァーを加えたバッチ内へ浸漬した、

【００６６】ｆ） ９５℃、５０℃、６０℃の熱サイク
ル反応に供してＰＣＲ反応を進行させ、ＰＣＲ反応終了
後、各反応槽のエチジウムブロマイド蛍光強度を測定し
てＤＮＡの増幅の有無を調べた。増幅したＤＮＡを回収
した。

【００６７】実施例 ２：多孔質積層膜を蓋材として用
いる例 図９により、多孔質積層膜を蓋材として用いる遺伝子増
幅方法を説明する。基材３は隔壁と底部が一体化され
た、深さが１０ｍｍ、直径３.５ｍｍの反応槽を３８４
個有する本発明の生化学用反応容器を用いた。この反応
容器はシリコンゴムを用いて真空成形法により形成した
圧縮変形可能は独立気泡発泡体でできている。それぞれ
異なる酵母ゲノム遺伝子を連結したＭ１３ファージを感
染した大腸菌を含む菌液をそれぞれの反応槽に加え（図
９ａ）、基材の上から蓋材を被せて反応槽を密閉した
（図９ｂ）。蓋材は、ナイロンメンブレン（商品名「ハ
イボンドＮ⁺」；アマシャム社製）である多孔質膜外層
２ｂおよび平均孔径４μｍを有するＰＶＤＦメンブレン
（商品名「デュラポアメンブレン」；ミリポア社製）を
多孔質膜内層２ａとする多孔質積層膜Ａを用いた。多孔
質膜内層は、基材３のセル隔壁に相当する部分を熱板で
２４０℃で３秒間熱溶融して緻密化（図１０の１５で表
示）して菌液が反応槽間で混ざり合わないように処理を
行った。多孔質積層膜の上には更に再剥離可能な粘着剤
を塗布したポリエステル製の防水フィルム１４をその粘
着剤により最外層に覆せた。多孔質積層膜の上に遠心力
を加えて、菌液を底部分に寄せた後、蓋部分を上にした
状態で３７℃で２昼夜培養を行った。培養終了後、防水
膜を剥がし、増幅装置を上下反転した（図９ｃ）。底と
なった多孔質積層膜の下側に実施例１と同様に吸水性材
料を当て、やはり実施例１と同様にプレスにより基材を
圧縮して、反応槽中の菌液を多孔質積層膜を介して濾過
した。大腸菌はＰＶＤＦ膜にトラップされ、Ｍ１３ファ
ージがナイロン膜に吸着固定された。

【００６８】Ｍ１３ファージ吸着ナイロン膜を剥離し、
固定面の反対側から０.５Ｎ・ＮａＯＨ、１.５Ｎ・Ｎａ
Ｃｌ溶液をしみこませ、ファージの殻蛋白質を変性さ
せ、ＤＮＡをメンブレンに固定させた。２×ＳＳＣ、ト
リス-塩酸バッファー（ｐＨ７.４）で洗浄乾燥させ、ハ
イブリダイゼーションシートを得た。解析しようとする
酵母のｍＲＮＡより、³²Ｐで放射性ラベルしたｃＤＮＡ
を調製した。得られたハイブリダイゼーションシートで
サザンハイブリダイゼーションを行い、ＢＡＳ１０００
（富士フィルム社製）を用いて相補性の有無を検討し
た。

【００６９】

【発明の効果】本発明の圧縮変形可能な材質からなる生
化学用反応容器に多数の反応槽を形成したものを基材と
して使用した遺伝子増幅装置を用いる本発明の遺伝子増
幅方法によれば、多種類の遺伝子を、同時に増幅、精製
可能であることに加えて、増幅等の生化学反応液を効率
良く反応槽から取り出すことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の遺伝子増幅装置の一例を示す。

【図２】 本発明の遺伝子増幅装置の一例を示す。

【図３】 本発明の遺伝子増幅装置の一例を示す。

【図４】 本発明の遺伝子増幅装置の反応槽内の状態を
示す。

【図５】 本発明に有用な植菌用治具および複製方法を
示す。

【図６】 本発明において好適に用いられるベクターを
示す。

【図７】 本発明の実施例１の手順を示す。

【図８】 図９に続き本発明の実施例１の手順を示す。

【図９】 本発明の実施例２の手順を示す。

【図１０】 底材１または蓋材１'としての多孔質積層
膜の１例。

【符号の説明】

１：底材、１'：蓋材、２ａ：多孔質膜内層、２ｂ：多
孔質外層、３：底を有するセルを形成した基材、４、
４’：セルの隔壁、５、５’：反応槽、６：培養液、
７：宿主細胞、７’：大腸菌、８：ベクター、８’：Ｍ
１３ファージ、９：吸水性濾紙、１０：接種用治具、１
１：プライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、マグ
ネシウム塩、エチジウムブロマイドを含むバッファー、
１２：加熱ブロック、１３：増幅された遺伝子、１４：
防水性膜、１５：多孔質膜内層に形成された緻密部、１
６、１６'：接着剤、粘着剤または熱融着剤、１７：離形
紙、１８：加圧用当て板、１９：プレス機、Ａ：多孔質
積層膜、Ｂ：基材。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶液中で生化学反応を行う反応容器にお
   いて、物理的圧力の印加により反応容器が圧縮変形する
   ことによって反応容器内の液体を移動させることを可能
   とした圧縮変形可能な材料からなる生化学用反応容器。
2. 【請求項２】 平面内に形成された複数のセルがそれぞ
   れ反応槽として働く請求項１記載の生化学用反応容器。
3. 【請求項３】 各セルがセルを区画する隔壁と底面によ
   り形成される請求項２記載の生化学用反応容器。
4. 【請求項４】 各セルがセルを区画する隔壁のみにより
   形成される請求項２記載の生化学用反応容器。
5. 【請求項５】 圧縮変形可能な材料が弾性材料、発泡弾
   性材料または発泡軟質高分子材料である請求項１〜４の
   いずれかに記載の反応容器。
6. 【請求項６】 圧縮変形可能な材料の射出成形、押出成
   形、圧縮成形、真空成形またはトランスファー成形によ
   り形成される請求項１〜５のいずれかに記載の生化学用
   反応容器。
7. 【請求項７】 発泡性高分子材料のビーズ発泡成形によ
   り形成される請求項１〜５のいずれかに記載の生化学用
   反応容器。
8. 【請求項８】 圧縮変形可能な材料の打ち抜き、ＮＣ旋
   盤加工、レーザー加工またはウォータジェット加工によ
   り形成される請求項１〜５のいずれかに記載の生化学用
   反応容器。
9. 【請求項９】 セルの隔壁が底板上に圧縮変形可能な材
   料をスクリーン印刷、ロールコーティングまたはディス
   ペンサーにより厚膜塗布を行うことにより形成される請
   求項２〜５のいずれかに記載の生化学用反応容器。
10. 【請求項１０】 セルの隔壁が底板上に発泡性のインキ
    をスクリーン印刷、ロールコーティングまたはディスペ
    ンサーにより塗布した後熱処理等により発泡させること
    により形成される請求項２〜５のいずれかに記載の生化
    学用反応容器。
11. 【請求項１１】 セルの隔壁が可視光または紫外光によ
    り重合する材料をキャストコーティング、ロールコーテ
    ィングまたはスピンナーにより支持体に全面塗布した
    後、マスク露光する請求項２〜５のいずれかに記載の生
    化学用反応容器。
12. 【請求項１２】 セルの隔壁が、高分子樹脂板、シート
    またはシリコンウエハ上に圧縮変形可能な材料をレジス
    ト塗布後、マスクを設置し、露光、現像後エッチングを
    行うことにより形成される請求項２〜５のいずれかに記
    載の生化学用反応容器。
13. 【請求項１３】 圧縮変形可能な材料からなる請求項１
    〜１２のいずれかに記載の生化学用反応容器とその底面
    に重ねた濾過メンブレンとからなり、上面からの圧力印
    加により反応容器内の液体を濾過することのできる生化
    学用反応容器。
14. 【請求項１４】 細胞不透過性かつ核酸透過性の多孔質
    膜内層２ａおよび核酸吸着能を有し且つ核酸を固定し得
    る多孔質膜外層２ｂの少なくとも２層からなり蓋材また
    は底材として働く多孔質積層膜（Ａ）と複数のセルを形
    成した基材（Ｂ）とにより形成される複数の反応槽を有
    する遺伝子増幅装置において、上記基材（Ｂ）として請
    求項１〜１３のいずれかに記載の生化学用反応容器を用
    いる遺伝子増幅装置。
15. 【請求項１５】 多孔質積層膜（Ａ）が蓋材として働
    き、基材（Ｂ）が隔壁および底面を有する複数のセルを
    形成している請求項３記載の生化学用反応容器である請
    求項１４記載の遺伝子増幅装置。
16. 【請求項１６】 多孔質積層膜（Ａ）が底材として働
    き、基材（Ｂ）が隔壁のみからなる複数のセルを形成し
    ている請求項４記載の生化学用反応容器である請求項１
    ４記載の遺伝子増幅装置。
17. 【請求項１７】 多孔質積層膜（Ａ）を構成する少なく
    とも２層の多孔質膜２ａおよび２ｂが互いに着脱可能で
    ある請求項１４記載の遺伝子増幅装置。
18. 【請求項１８】 多孔質積層膜（Ａ）のさらに外側に、
    着脱可能な防水膜が設けられている請求項１４記載の遺
    伝子増幅装置。
19. 【請求項１９】 多孔質膜内層２ａの、基材として用い
    られる生化学用反応容器の各セルを区画する隔壁に接す
    る部分が、熱溶融、有機溶剤による溶着または細孔への
    樹脂等の固形物による充填により隔壁に相当する形状に
    非多孔質化された請求項１４記載の遺伝子増幅装置。
20. 【請求項２０】 多孔質膜２ａがセルロース濾紙、ガラ
    スフィルター、酢酸セルロースメンブレン、再生セルロ
    ースメンブレン、ポリカーボネートメンブレン、必要に
    応じて表面修飾されたナイロンメンブレンまたはポリビ
    ニリデンフルオライドメンブレンから選ばれ、多孔質膜
    ２ｂがガラスフィルター、ニトロセルロースメンブレ
    ン、ナイロンメンブレン、ジエチルアミノエタンセルロ
    ースメンブレン、プラスチャージ導入ナイロンメンブレ
    ンまたはポリビニリデンフルオライドメンブレンから選
    ばれる請求項１４記載の遺伝子増幅装置。
21. 【請求項２１】 蓋材および／または底材を構成する多
    孔質膜同士または多孔質膜と防水膜のそれぞれが接着
    剤、粘着剤または熱融着を用いた擬似接着により積層さ
    れており操作の過程で脱着可能である請求項１４記載の
    遺伝子増幅装置。
22. 【請求項２２】 蓋材および／または底材を構成するそ
    れぞれの多孔質膜および防水膜のそれぞれおよび多孔質
    積層膜（Ａ）の基材（Ｂ）のセル隔壁と接する側に、隔
    壁部分に相当する形状に、粘着剤をパターン塗布し、も
    しくは打ち抜き加工を施した粘着シートを貼り合わせて
    蓋材または底材としての多孔質積層膜（Ａ）が基材
    （Ｂ）のセル隔壁に接着された請求項１４記載の遺伝子
    増幅装置。
23. 【請求項２３】 基材（Ｂ）と蓋材または底材としての
    多孔質積層膜（Ａ）が相互に嵌合可能な成形品として形
    成され、相互間が密封および脱着可能な請求項１４記載
    の遺伝子増幅装置。
24. 【請求項２４】 細胞不透過性かつ核酸透過性の多孔質
    膜内層２ａおよび核酸吸着能を有し且つ核酸を固定し得
    る多孔質膜外層２ｂの少なくとも２層からなる多孔質積
    層膜（Ａ）およびそれに脱着可能に貼り合わされた防水
    膜とからなる蓋材と複数のセルを形成した基材（Ｂ）と
    により形成された複数の反応槽を有する請求項１５に記
    載の遺伝子増幅装置の各反応槽に、遺伝子を産生する細
    胞を含む菌液を接種し、細胞培養、増殖を行った後、装
    置を上下反転し、防水膜を剥がした後、吸水性材料を接
    触させ、圧力を印加して生化学用反応容器を圧縮するこ
    とにより菌液を多孔質積層膜（Ａ）の方へ圧流し多孔質
    膜内層２ａを介して遺伝子を濾過させ、遺伝子を上記多
    孔質膜２ｂに配列固定する遺伝子増幅方法。
25. 【請求項２５】 細胞不透過性かつ核酸透過性の多孔質
    膜内層２ａおよび核酸吸着能を有し且つ核酸を固定し得
    る多孔質膜外層２ｂの少なくとも２層からなる多孔質積
    層膜とそれに脱着可能に貼り合わされた防水膜とからな
    る底材、および基材（Ｂ）の隔壁とにより形成された複
    数の反応槽を有する請求項１６に記載の遺伝子増幅装置
    の各反応槽に、遺伝子を産生する細胞を含む菌液を接種
    し、細胞培養、増殖を行った後、防水膜を剥がしたの
    ち、反応容器に圧力を印加して反応容器を圧縮すること
    により菌液を多孔質膜を介して分別濾過、遺伝子を上記
    多孔質膜２ｂに配列固定する遺伝子増幅方法。
26. 【請求項２６】 防水膜を剥がしたのち、多孔質積層膜
    （Ａ）が下側にある状態で多孔質積層膜に吸水性材料を
    接触させた状態で反応容器に圧力を印加する請求項２２
    または２３に記載の遺伝子増幅方法。
27. 【請求項２７】 圧縮力の印加が平板を介した面圧によ
    る全面的加圧またはロールによる線圧の逐次的加圧を用
    いる請求項２２、２３または２４のいずれかに記載の遺
    伝子増幅方法。
28. 【請求項２８】 遺伝子産生細胞が、目的遺伝子を含む
    ベクターにて形質転換された宿主細胞である請求項２４
    から２５のいずれかに記載の遺伝子増幅方法。
29. 【請求項２９】 宿主細胞が大腸菌であり、目的遺伝子
    を含むベクターがＭ１３ファージであり、培養を３７℃
    で行う請求項２８記載の遺伝子増幅方法。
30. 【請求項３０】 請求項２４〜２９のいずれかに記載の
    遺伝子増幅方法により得られた遺伝子が配列固定された
    多孔質膜２ｂ上で遺伝子の増幅に必要な試薬を加えるこ
    とを特徴とする遺伝子増幅方法。
31. 【請求項３１】 請求項２４〜２９のいずれかに記載の
    遺伝子増幅方法により得られた遺伝子を多孔質膜２ｂへ
    固定化した後、多孔質膜を剥離し、その上に新たに請求
    項１〜１２のいずれかに記載の反応容器を基材として設
    置して請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法により
    各目的遺伝子を増幅させる遺伝子増幅方法。
32. 【請求項３２】 請求項１４〜１９のいずれかに記載の
    遺伝子増幅装置を用いて多種類の遺伝子を増幅するにお
    いて、それぞれの反応槽と対応するように位置決めされ
    た棒状突起を有する植菌用治具を用いて、反応槽中の遺
    伝子産生細胞を付着して別の容器に接種し、同じ型の遺
    伝子増幅装置の各反応槽に植菌複製を行う請求項２４〜
    ３１のいずれかに記載の遺伝子増幅方法。
33. 【請求項３３】 植菌用治具が射出成形、押出成形、圧
    縮成形、真空成形、トランスファー成形、ブロー成形に
    より形成される請求項３２記載の遺伝子増幅方法。
34. 【請求項３４】 請求項２４〜２９のいずれかに記載の
    遺伝子増幅方法により得られた遺伝子が配列固定された
    多孔質膜２ｂ上で相補性解析を用いることにより行う遺
    伝子解析方法。
35. 【請求項３５】 目的遺伝子を含むベクターにおいて、
    目的遺伝子の両末端にＰＣＲ反応のプライマーに認識さ
    れ得る共通の配列を有する請求項３４記載の遺伝子解析
    方法。
36. 【請求項３６】 請求項２４〜２９の遺伝子増幅方法に
    より作製されたサザンハイブリダイゼーションまたはノ
    ーザンハイブリダイゼーション用基板。