JPH10503525A - カンプトテシン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、カンプトテシン誘導体及び薬剤学的に許容されるその塩、製造方法及びこれを含有する抗癌剤に関するものである。本発明による化合物は、B環とE環が修飾されたカンプトテシン誘導体として、溶解度と抗癌効果が改善された。

Description

【発明の詳細な説明】 カンプトテシン誘導体及びその製造方法 技術分野 本発明は、下記構造式（I）で示されるカンプトテシン誘導体及び薬剤 学的に許容されるその塩、その製造方法及びこれを活性成分として含有する抗癌 剤に関するものである。 前記式で、 Rは水素或いは-(CH₂)₂-NR₁R₂(R₁は水素、或いは一般的なアミノ保護基 を示し、R₂は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルを示 し、また、R₂は隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができる )を示し； n=1或いは2であり； (R₇はメチル、エチル、またはCH₃OCH₂CH₂-を示す)を示す]であり； 前記式で、 n=2であり、かつR₄が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、n=2、かつR₃が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、Rが-CH₂CH₂NHCH₃である場合には、R3は水素ではない。 従来の技術 カンプトテシンは、ワル(Wall)等(J．Am．Chem．Soc.，1966，88，3888 )により中国で自生している木であるカムプトテカアクミナタ（Camptotheca acu minata）から分離されて以来、その合成に関する多くの研究があったが、1970年 に行った初めての臨床実験の結果、毒性が高いため抗癌剤としての開発は成功し ていなかった。 その後、リウ(Liu)等(1985)がトポイソメラーゼ Iを抑制するカンプト テシンの独特な作用機構を発表して以来、この化合物に対する関心が高まってき た。特に、トポイソメラーゼ Iの抑制剤自体が臨床的に使用されたことがなかっ たので、カンプトテシンは実際に開発すれば、作用機構が異なる他の抗癌化学療 法剤との複合療法に非常に適切であり得ることが期待された。 近年、カンプトテシンの毒性を軽減し、抗癌活性をさらに増大させるた めに、その誘導体に対する多くの研究が進行してきた。それらの研究のなかでも 、1986年に日本のヤクルト本社により合成されたCPT-11（Irinotecan）が臨床実 験の結果、優れた抗癌活性及び低い毒性を示すことが日本国の特開昭64-61482号 に開示されており、その他にもスミスクラインビーチャム(Smithkline Beecham) 社により開発されたトポテカン（Topotecan）と、グラクソ(Glaxo)社より開発さ れたMDO-カンプトテシンと、9-アミノカンプトテシン等が合成されたが、その中 でCPT-11が商品化された。特に、前記CPT-11化合物の場合、治療がとても難しい 肺癌などの固形腫瘍にも優れた抗癌効果を示すことが注目に値する。 いままで開発されたカンプトテシン誘導体の大部分は、カンプトテシン を化学的に修飾して得られた半合成物質であり、カンプトテシンを得ることに難 しさがあるばかりでなく、その化学的修飾にも限界があるので、多様な構造の誘 導体をつくることに問題がある。しかも、いままで報告されている全合成法は、 化学収率や光学収率の面から見れば、満足するような水準ではない。 発明の開示 本発明者らは、上記問題を鑑み、前記構造式（I）で示される一連の新 規化合物を全合成し、インビトロの実験を通じて、この新たな作用機構を有する 化合物が抗癌剤として使用し得ることを確認して本発明を完成した。 カンプトテシンは、縮合環系構造としてキノリン（AとB）に、順次にピ ロリジン環（C）とアルファ-ピリドン環（D）が縮合し、これにラクトン環（E） が縮合して、構成されている。 特に、カンプトテシンのトポイソメラーゼ I抑制機構および現在まで知 られた種々の誘導体の構造を綿密に分析して、カンプトテシンのB環およびE環へ の置換基を変化させる方向に合成を目指した。 既に開発されたカンプトテシン誘導体が、極めて低い水溶解性のため、 悪心、嘔吐、膀胱炎などの毒性を示すことを鑑み、溶解度を増加させるようにカ ンプトテシンB環へ置換基を導入した。そのため、アミノ基を含む側鎖をカンプ トテシンの7−位置に導入した。 クラウ(Crow)により提示された、カンプトテシンがトポイソメラーゼ I と共有結合を形成する作用機構[J．Med．Chem.，1992，35，4160-4164]を考慮し 、その反応性を高める方向を目指してカンプトテシンE環の分子修飾を行った。 本発明によるカンプトテシン誘導体及びその中間体の製造方法を以下で 詳細に説明する。 本発明の実施例による化合物は、次の図式１に明示される方法により製 造して得られ得る。 図式１ 前記式で、 R、n、およびR₃は前述と同様であり、R’は水素あるいは-(CH₂)₂-NR₁R₂ であり、R₁は一般的なアミノ保護基を示し、R₂は前述と同様である。アミノケト ン(II)とトリサイクリックケトン(III)をフリードレンデル反応[(Organic react ions，28，37-202，Wiley & Sons Inc.，New York(1932)]で縮合して一般式(I) を得る。 化合物(II)と化合物(III)との縮合反応は、一般的に酸の存在下で常温 或いは加熱する条件下で行う。 反応に影響を及ぼさないように、以下の不活性溶媒、例えば、トルエン 、ベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素；ジクロロメタン、クロロホルム、 1,1−ジクロロエタン、1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素；低級ア ルコール類；N,N-ジメチルホルムアミドなどのアミン類あるいは酢酸が使用され る。 塩酸、硫酸などの無機酸と、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンス ルホン酸、p−トルエンスルホン酸、酢酸などの有機酸を用いて反応が行われ得 る。 反応時間は１〜４８時間であり、反応温度は３０〜１５０℃である。 代表的な反応条件は、p−トルエンスルホン酸の存在下でトルエン中で 還流させることが一番望ましい。 一般式(I)の合成でRが-CH₂CH₂NHR₂(R₁が水素)である場合には、白金や パラジウムなどを使用する接触水素化を行ってアミノ保護基を除去する。 化合物(II)でR'が水素である場合には、化合物(II)のカルボニル基を公 知方法(Chem．Ber．76，1099(1943))でエチレングリコールでアセタール化する か、p-トルイジンでシッフ塩基を形成して保護した後、化合物(I)を製造する。 化合物(III)のR₃がOHである場合、R₃がOHである化合物(I)を得、これを 化合物(I)を得る。 特にR₆NCOの場合には、ジ-n-ブチルチンジアセテートなどの錫錯体(tin complex)を触媒量で使用して一般式(I)の化合物を得ることができる。 アミノケトン化合物(II)は図式２と同様の製造方法で製造することが出 来る。 図式２ 前記式で、R'、R₁、R₂は前述と同様である。 本発明による新規のアミノケトン化合物(II)は次のように製造する。 2'-ニトロアセトフェノンに、エチルアミン、プロピルアミン或いはイ ソプロピルアミンなどのモノアルキルアミン、ベンジルアミンなどのモノアリー ルアミン、モルホリン、ピペリジン或いはジエチルアミンなどのジアルキルアミ ンなどを、濃塩酸の存在下でパラホルムアルデヒドでマンニッヒ反応をさせて化 合物（IV）を製造する。 反応温度は３０〜８０℃であり、反応時間は１〜４８時間である。 化合物(IV)において、モノアルキルアミン或いはモノアリールアミンの 場合には、一般的なアミン保護基を導入して化合物(IV)を得る。 本発明によるアミン保護基はCbzが望ましい。 化合物(IV)を低級アルコール溶媒の中で亜ジチオン酸ナトリウムで処理 して化合物(II)を製造する。 反応条件は３０〜１００℃の環境化で、反応時間は１〜１０時間である 。 本発明の新たなトリサイクリックケトン(III)は図式3に明示されたよう に、公知化合物(IX)より製造し得る。 化合物(III)において、n=2かつR₃が水素であるトリサイクリックケトン は、公知化合物として公知方法[US特許4,894,456(1990)]により製造される。 図式３ 前記式で、R₃、n、R₅、R₆は前述と同様であり、R₈はヒドロキシ基の一般的な保 護基を意味する。 まず、α-アルキル化反応において、n=2である場合には、化合物(IX)を カリウムt-ブトキシド、水素化ナトリウムのような塩基と、N,N-ジメチルホルム アミド、または1,2-ジメトキシエタンなどの不活性溶媒中で反応させた後、テト ラヒドロピラニル、メトキシメチル或いはメトキシエトキシメチルにより保護さ れた2-ブロモエタノールと反応させて化合物(VIII)を得る。 反応は好適には、反応温度３０〜６０℃、反応時間は１８〜４８時間で 行われる。 一方、n=1である場合には、アルコール性溶媒中のホルムアルデヒドを 使用してα-ヒドロキシメチル化し、ヒドロキシ基を一般的ヒドロキシ保護基で 保護して化合物(VIII)を得る。 本反応で望ましい保護基は、メトキシメチル或いはメトキシエトキシメ チルである。 化合物(VIII)をラネーニッケルを触媒として、酢酸とその無水物の混合 溶媒中で還元させて化合物(VII)を製造した。 反応温度は３０〜８０℃であり、反応時間は１〜１０時間である。 ニトロソ化合物を経由する転位反応は、化合物(VII)を酢酸無水物と酢 酸の混合溶媒中、亜硝酸ナトリウムを使用して０〜５０℃の温度下で、１〜２４ 時間反応させて行われる。得られたこのニトロソ化合物を、四塩化炭素のような 溶媒により６０〜９０℃の温度下で、５〜１８時間還流させると化合物(VI)が得 られる。 n=1または2である場合には、ジエステル（VI）の反応経路がやや異なる 。n=2である場合には、化合物(VI)をメタノール中の水酸化リチウム、水酸化ナ トリウム、水酸化カリウムなどを含むアルカリ水溶液で加水分解した後、酢酸、 塩酸などの酸性水溶液により処理を行って化合物(Vc)を得る。 前記加水分解の条件は０〜５０℃の温度下で、30分〜5時間である。 酸性水溶液中のラクトン化の反応条件は０〜50℃の温度下で、１〜４８ 時間である。 化合物(Vc)をN,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミドの ようなアミン類溶媒の中でカリウムt-ブトキシドのような塩基により処理し、亜 リン酸トリエチル下で酸素をバブリング(bubbling)を用いて酸化すると、化合物 (V)を得る。 反応条件は-１０〜５０℃温度下で、反応時間は３０分〜５時間である 。 一方、化合物(VI)において、n=１である場合には、化合物(VI)をベンゼ ン、トルエン、キシレンなどのような芳香族炭化水素などの溶媒中、DBU，DBN、 トリエチルアミンのような有機塩基で処理を行って化合物(Va)を得る。 反応条件は０〜１００℃の温度下で、反応時間は１０分〜５時間である 。 化合物(Va)をピリジン溶媒下でOsO₄により処理すると、化合物(Vb)を得 る。反応条件は１０〜５０℃環境化で、反応時間は１〜１０時間である。化合物 (Vb)のラクトン化反応は前述と同様に行われる。 n=2の化合物(V)を酸処理して化合物(III)を得る。反応条件は１０〜８ ０℃の温度下で、反応時間は３０分〜１０時間である。化合物(V)において、 上記のような脱ケトン化反応を行って化合物(III)を製造する。 本発明による化合物(I)において、RがCH₂CH₂NR₁R₂である場合には、第 ２級アミン基を、塩酸、硫酸、燐酸などの無機酸あるいは酢酸などの有機酸の塩 に転化して生理学的に許容可能な塩を製造することが出来る。 図面の簡単な説明 図１は、実施例30で製造された化合物とカンプトテシンの各用量でのIL S(%)の差を示す。 図２は、本発明の実施例30で製造された化合物のマウス黒色腫細胞に対 する抑制効果を示す。 発明の最良の実施形態 以下、実施例および実験例によって本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれに局限されるものではない。 実施例１：３-モルホリノ-1-(2'-ニトロフェニル)プロパン-1-オンの調製 モルホリン(2.27g、0.026mol)のエタノール(10ml)溶液を濃塩酸(3ml)で 10分間処理してから、減圧下に濃縮させてモルホリン塩酸塩を生成させた。その 混合物に2'-ニトロアセトフェノン（3.3g、0.02mol）、パラホルムアルデヒド（ 0.8g、0.029mol）、濃塩酸(0.1ml)および無水エタノール（10ml）を加えた。反 応混合物を３０時間還流条件下で撹拌した。その反応混合液を常温に冷却させた 後、10％炭酸ナトリウム溶液でアルカリ化してジクロロメタン（3 X 50ml）で抽 出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得 た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（５％エタノール を含むジクロロメタン）で精製してオイル状の所望の生成物（1.5g、35%）を得 た。¹ H-NMR（CDCl₃）δ 3.1(m，3H)，3.5(m，4H)，3.75(m，3H)，3.99(m，2H)，7.85(m，3H),8.15(d，1H ，J=8Hz) 実施例２：３-ピペリジノ-1-(2'-ニトロフェニル)プロパン-1-オンの調製 ピペリジン（515mg、6.06mmol）、2'-ニトロアセトフェノン（1g、6.06 mmol）、パラホルムアルデヒド（260mg、8.67mmol）、濃塩酸（1ml）と無水エタ ノールを使用して実施例１と同様の方法で所望の生成物（458mg、29%）を得た。¹ H-NMR（CDCl₃）δ 1.5(m，6H)，2.38(t，4H，J=5Hz)，2.76(t，2H，J=6Hz)，3.00(t，2H，J=6Hz)， 3.99(m，2H)，7.40-7.75(m，3H)，8.13(d，1H，J=8Hz) 実施例３：３-ピロリジノ-1-(2'-ニトロフェニル)プロパン-1-オンの調製 ピロリジン（560mg、7.88mmol）、2'-ニトロアセトフェノン（1g、6.06 mmol）、パラホルムアルデヒド（260mg、8.67mmol）、濃塩酸（1ml）と無水エタ ノール（5ml）を使用して実施例１と同様の方法で所望の生成物（347mg、23%） を得た。 実施例４：３-(N-ベンジル-N-カルボベンジルオキシアミノ)-1-(2'-アミノフェ ニル)プロパン-1-オンの調製 ベンジルアミン（2.79g、0.026mol）のエタノール（10ml）溶液を濃塩 酸（3ml）で10分間処理してから、減圧下に濃縮させてベンジルアミン・塩酸塩 を生成させた。 その溶液に2'-ニトロアセトフェノン（3.3g、0.02mol）、パラホルムア ルデヒド（800mg、0.029mol）、濃塩酸(0.1ml)、および無水エタノール（10ml） を加えた。 反応混合物を３０時間還流条件下で撹拌した。その反応混合液を常温に 冷却させた後、10%炭酸ナトリウム溶液でアルカリ化してジクロロメタン（3 X 5 0ml）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮して 粗生成物を得た。得られた粗生成物をジクロロメタンに溶かして0℃に冷却した 。この溶液にトリエチルアミン（1.2g、0.012mol）を加えた後、クロロギ酸ベン ジル(2ml)を滴加した。反応混合液を0℃、窒素気流下で１時間撹拌して常温に加 温し、さらに５時間撹拌した。 溶媒を減圧下で除去した後、混合物をエチルアセテート(100ml)に溶か した。有機層を水(3 X 30ml)と飽和食塩水(30ml)で洗浄してから、無水硫酸ナト リウムで乾燥した。濾過した後、溶媒を除去して粗生成物を得た。得られた残留 物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン：エチルアセテート＝１ ：１０）で精製して所望の生成物（1.5g、36%）を得た。¹ H-NMR（CDCl₃）δ 3.0(m，2H)，3.70(t,2H，J=7Hz)，4.60(s，2H)，5.17(s，2H)，7.10-7.70(m,13H )，8.10(d，1H，J=8Hz) 実施例4と同様の方法で実施例５〜８の化合物を製造した。その結果は 次のようである。 実施例９：３-(N-2'-アセトキシエチル-N-カルボベンジルオキシアミノ)-1-(2'- ニトロフェニル)プロパン-1-オンの調製 ３-[(N)-2'-ヒドロキシエチル-N-カルボベンジルオキシアミノ)]-1-(2' -ニトロフェニル)プロパン-1-オン（40mg、0.107mmol）と4-ジメチルアミノピリ ジン（1.2mg、0.01mmol）の混合物を無水ジクロロメタン(２ml)に溶かし、トリ エチルアミン(0.02ml、0.160mmol)と無水酢酸(0.02ml、0.2l4mmol)を滴加した。 室温で３０分間撹拌して飽和塩化アンモニウム水溶液、水、塩水の順序で洗浄し 、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物 をカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：n-ヘキサン＝１：３）で精製 して黄色オイル状の所望の生成物（40mg、90%）を得た。¹ H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 8.123(d，1H，J=8.4Hz)，7.607-7.261(m，8H)，5.136(s，2H)，4.194(m，H)，3. 784-3.754(m，2H)，3.660-3.646(m，2H)，3.172(m，2H)，2.047(s，3H) 実施例１０：3-モルホリノ-1-(2'-アミノフェニル)プロパン-1-オンの調製 3-モルホリノ-1-(2'-ニトロフェニル)プロパン-1-オン(200mg、0.758mm ol)を10mlの９５％エタノールに溶かした溶液に亜ジチオン酸ナトリウム（660mg 、3.79mmol）を加えた。反応混合液を還流条件下で３時間にわたって撹拌し、減 圧下で濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（エタノール： ジクロロメタン：トリエチルアミン）で精製してオイル状の所望の生成物（174m g、89%）を得た。¹ H-NMR（CDCl₃）δ 3.20(m，3H)，3.50(m，3H)，3.5(m，4H)，3.99(m，2H)，7.5-7.8(m，3H),8.08(d ，1H，J=8Hz) 実施例１１：3-ピペリジノ-1-(2'-アミノフェニル)プロパン-1-オンの調製 実施例１０と同様の方法で実施例2の化合物(200mg、0.758mmol)と亜ジ チオン酸ナトリウム（660mg、3.79mmol）を使用して所望の生成物（174mg、89% ）を得た。 実施例１２：3-ピロリジノ-1-(2'-アミノフェニル)プロパン-1-オンの調製 実施例１０と同様の方法で実施例３の化合物(400mg)と亜ジチオン酸ナ トリウム（1.052g、6.05mmol）を使用して所望の生成物（235mg）を得た。 また、実施例１０と同様の方法で実施例１３〜１７の化合物を製造した 。 その結果は次のようである。 実施例１８：dl-7-[2-(N-ベンジル-N-カルボベンジルオキシアミハエチル]カン プトテシンの調製 3-(N-ベンジル-N-カルボベンジルオキシアミノ)-1-(2'-アミノフェニル )プロパン-1-オン（543mg、1.4mmol）と4-エチル-6-オキソ-1,4,7,8-テトラヒド ロ-4-ヒドロキシ-ピラノ[3,4-f]インドリジン-3,10(6H)-ジオン（263mg、1.0mmo l）の混合物をトルエン（50ml）に溶かし、反応混合液を還流条件下で３０分間 撹拌してp-トルエンスルホン酸(25mg、0.13mmol)を加えた。ディーン スターク( DEAN-STARK)トラップ中で前記反応混合液を還流条件下で９時間撹拌した。反応 溶媒を減圧下で除去してから、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ エチルアセテート：ジクロロメタン＝１：１）で精製して所望の生成物（507mg 、59%）を黄色粉末として得た。¹ H-NMR（CDCl₃）δ 1.04(t，3H，J=8Hz)，1.90(m，2H)，3.10-3.90(m，4H)，4.53(s，1/2×2H)，4.6 1(s，1/2×2H)，4.95(s，1/2×2H)，5.07(s，1/2×2H)，5.30(s，2H)，5.31(d， 1H，J=16Hz)，5.75(d，1H，J=16Hz)，7.20-8.20(m，15H) また、実施例１８と同様の方法で実施例１９〜２４の化合物を製造した 。その結果は次のようである。 実施例２５：dl-7-[2-(N-ヒドロキシエチル-N-カルボベンジルオキシアミノ)エ チル]カンプトテシンの調製 dl-7-[2-(N-アセトキシエチル-N-カルボベンジルオキシアミノ)エチル] カンプトテシン（28.2mg、0.05mmol）と炭酸カリウム（25mg、0.15mmol）をメタ ノール：水＝１：１（1.5ml）の混合溶液に溶かしてこの反応混合物の溶液を室 温で３時間撹拌した。反応混合物を1N塩酸溶液で酸性化して、ジクロロメタンで 抽出し、塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濾過した後 、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン： メタノール＝２０：１）で精製して所望の生成物（17mg、60%）を黄色固体とし て得た。¹ H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 8.171-7.762(m，10H)，5.710(d，2H，J=16.8Hz)，5.308(d，2H，J=16.8Hz)，5.3 01(s，2H)，5.207(s，2H)，3.868-3.466(m，8H)，1.926-1.832(m，2H)，1.033(t ，3H，J=7.6Hz) 実施例２６：dl-7-[2-(N-ベンジルアミノ)エチル]カンプトテシンの調製 dl-7-[2-(N-ベンジル-N-カルボベンジルオキシアミノ)エチル]カンプト テシン（50mg、0.08mmol）を氷酢酸（20ml）に溶かし、10%Pd/C（25mg）で処理 した。反応混合物を40psiの水素気流下で９時間撹拌し、触媒をセライト(CELLIT E)パッドを通じて減圧濾過して除去した後、濾液を減圧下で濃縮した。残留物を フラッシュカラムクロマトグラフィー（10%メタノール／ジクロロメタンで精製 して所望の生成物（24mg、63%）を黄色粉末として得た。¹ H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 0.89(t，3H，J=8Hz)，1.87(m，2H)，2.90(m，2H)，3.5(m，4H)，3.73(s，1H)，5 .33(s，2H)，5.43(s，2H)，6.52(s，1H)，7.25(m，6H)，7.70-8.30(m，4H) 実施例２７：dl-7-[2-(N-アセトキシエチルアミノ)エチル]カンプトテシンの調 製 実施例２６と同様の方法で合成した。¹ H-NMR（400MHz，CDCl₃+MeOH-d₄）δ 8.323(d，1H，J=8.8Hz)，8.138(d，1H，J=8.4Hz)，7.812(t，1H，J=6.8Hz)，7.6 75(t，1H，J=6.8Hz)，7.647(s，1H)，5.742(d，1H，J=16.4Hz)，5.324-5.284(m ，2H)，4.169-4.122(m，2H)，3.373(t，2H，J=7.6Hz)，3.108-3.040(m，4H)，2. 090(s，3H)，2.024(s，3H)，1.955-1.803(m，2H)，1.033(t，3H，J=7.6Hz) 実施例２８：dl-7-[2-(N-ヒドロキシエチルアミノ)エチル]カンプトテシンの調 製 実施例２６と同様の方法で合成した。¹ H-NMR（CDCl₃+MeOH-d₄） 8.284(d，1H，J=8.0Hz)，8.226(d，1H，J=8.8Hz)，7.863(t，1H，J=6.8Hz)，7.7 56(t，1H，J=6.8Hz)，7.730(s，1H)，5.682(d，1H，J=13.6Hz)，5.641(d，1H，J =13.6Hz)，5.130(s，2H)，3.800-3.190(m，8H),1.962-1.898(m，2H)，1.031(t， 3H，J=4.4Hz)，2.035(s，3H) 実施例２９：dl-7-[2-(N-エチルアミノ)エチル]カンプトテシンの調製 2'-アミノ-2-(N-カルボベンジルオキシ-N-エチルアミノ)プロピオフェ ノン（34mg，0.11mmol）と4-エチル-6-オキソ-1,4,7,8-テトラヒドロ-4-ヒドロ キシ-ピラノ[3,4-f]インドリジン-3,10(6H)-ジオン（34mg、0.1mmol）をトルエ ンに溶かし、３０分間還流した。p-トルエンスルホン酸(19.2mg、0.1mmol)を加 えた後、反応混合物をディーン スターク(DEAN-STARK)トラップ中で３時間還流 した。反応混合液を減圧下で濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ジク ロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製して所望の生成物（40mg、67%）を 固体として得た。¹ H-NMR（400MHz，DMSO-d₆）δ 8.280(d，1H，J=8.6Hz)，8.184(d，1H，J=7.4Hz)，7.873-7.753(m，2H)，7.471( d，2H，J=7.2Hz)，7.111(d，2H，J=7.2Hz)，7.356(s，1H)，6.523(s，1H)，5.43 9(s，2H)，3.534-2.753(m，6H)，2.217(s，3H),1.671-1.643(m，2H)，1.230(t， 3H，J=6.8Hz)，0.743(t，3H，J=7.2Hz) 実施例３０：dl-7-[2-(N-2-メチルエチルアミノ)エチル]カンプトテシンの調製 実施例２９と同様の方法で合成を行った。¹ H-NMR（400MHz，DMSO-d₆）δ 8.870-8.567(m，2H)，8.298-8.155(m，2H)，7.867(d，2H，J=7.6Hz)，7.741(s， 1H)，7.500(d，2H，J=7.6Hz)，5.828(s，2H)，5.795(s，2H)，3.958-3.820(m，2 H)，2.666(s，3H)，2.320-2.200(m，2H)，1.614(d，6H，J=6.4Hz)，1.533(t，2H )，1.267(t，3H) 実施例３１：dl-7-[2-(モルホリノ)エチル]カンプトテシン トリフルオロ酢酸塩 実施例２４と同様の方法で合成を行ったが、p-トルエンスルホン酸の代 わりにトリフルオロ酢酸を使用した。¹ H-NMR（200MHz，DMSO-d₆）δ 0.92(t，J=6Hz，3H)，1.94(m，2H)，2.90(m，4H)，3.30-3.65(m，8H)，5.47(s， 2H)，5.48(s，2H)，6.56(s，1H)，7.70-8.30(m，4H) 実施例３２：6-シアノ-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシカルボニル)-3 '-(メトキシメチルオキシプロピル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジ ンの調製 6-シアノ-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[(エトキシカルボニル)メチル]-5 -オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジン(608.6mg、2mmol)を無水ジメチルホ ルムアミド(3ml)に溶かして5℃に冷却し、カリウム t-ブトキシド(258.1mg、2. 3mmol)を加えた後、反応混合物を同じ温度で３０分間撹拌した。前記反応混合物 に2-ブロモエタノールメトキシメチルエーテル(1.352g、8mmol)を加えて45-50℃ で２０時間撹拌した。水(50ml)で希釈してジクロロメタン(100ml)で抽出し、有 機層を水（80ml）と塩水（80ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減 圧下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート：n-ヘ キサン＝２：１）で精製して所望の生成物（734.8mg、95%）を淡黄色固体として 得た。 IR(neat)2224，1734，1656 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.254(t，3H，J=6.8Hz)，1.987-2.020(m，1H)，2.410(t，2H，J=6.8Hz)，2.43-2 .449(m，1H)，3.447-3.485(m，1H)，3.564-3.603(m，1H)，4.117-4.201(m，7H) ，4.225(q，2H，J=7.6Hz)，4.584，4.609(ABq，2H，J=6.8Hz)，6.367(s，1H) MS(EI)m/e 392(M⁺)，377(M⁺-CH₃)，361(M⁺-OCH₃)，347(M⁺-C₂H₅O) 実施例３３：6-(アセトアミドメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキ シカルボニル)-3'-(メトキシメチルオキシプロピル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラ ヒドロインドリジンの調製 ラネーニッケル（50%水性スラリー）250滴を取り、水（5ml）と酢酸（1 0ml）で各々5回洗浄してパル瓶(parr bottle)に加えた。 この溶液に実施例３２で得た化合物（743.8mg，1.9mmol）、酢酸無水物 （30ml）、酢酸（10ml）を加えて圧力４５psi、４５〜５０℃の環境化で、３時 間水素化させた。触媒を濾過により除去して濾液を減圧下で濃縮した。残留物を カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）で精製し て所望の生成物（789.5mg、95%）を黄色オイルとして得た。 IR(neat)1733，1660，1635 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.214(t，3H，J=6.8Hz)，1.924(s，3H)，1.939-1.98(m，1H)，2.382(t，2H，J=6 .8Hz)，2.399-2.40(m,1H)，3.343(s，3H)，3.44-3.58(m，2H)，4.075-4.131(m， 7H)，4.145(q，2H)，4.34，4.39(d，d，2H)，4.571，4.592(ABq，2H，J=6.8Hz) ，6.306(s，1H)，6.61(brs，1H) MS(EI)m/e 438(M⁺)，423(M⁺-CH₃)，407(M⁺-OCH₃)，395(M⁺-COCH₃)，393(M⁺-C₂H₅O) 実施例３４：6-(アセトキシメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシ カルボニル)-3'-(メトキシメチルオキシプロピル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒ ドロインドリジンの調製 実施例３３で得られた化合物（789.5mg，1.8mmol）に酢酸無水物（15ml ）、酢酸（5ml）および亜硝酸ナトリウム（621.2mg、9mmol）を加えて５〜１０ ℃の環境下で、６時間撹拌した。生成された無機物を濾過により除去した後に、 濾液を減圧下で濃縮してニトロソ化合物を得た。この化合物に四塩化炭素（50m l）を加えて、この混合物を１８時間加熱還流した。反応混合液を水（10ml）と 塩水（10ml）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧下で濃縮した。残 留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）で 精製して所望の生成物（720mg、91%）を無色オイル状として得た。 IR(neat)1740，1733，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.217(t，3H，J=6.8Hz)，1.86-1.95(m，1H)，2.056(s，3H)，2.368(t，2H)，2.3 8-2.43(m，1H)，3.333(s，3H)，3.41-3.57(m，2H)，4.087-4.119(m，9H)，4.569 (s，2H)，5.259(s，2H)，6.304(s，1H) MS(EI)m/e 439(M⁺)，408(M⁺-OCH₃)，396(M⁺-COCH₃) 実施例３５：1,1-(エチレンジオキシ)-(5'-メトキシメチルオキシエチル-2'H,5' H,6'H-6-オキソピラノ)[3',4'-f]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジン の調製 水酸化リチウム・水和物（172mg，4.1mmol）を水（5ml）に溶かし、実 施例３４で得られた化合物（720mg、1.64mmol）とメタノール（15ml）の混合物 を加えて２５〜３０℃の環境下で、２時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮 してメタノールを除去した後、水（15ml）、ジクロロメタン（50ml）、酢酸(5ml )を加えて２５〜３０℃の環境化で、１０時間撹拌した。反応混合液により有機 層を分離し、水（10ml）と塩水（10ml）で洗浄して無水硫酸マグネシウムで乾燥 した。有機層を減圧下で濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロ メタン：メタノール＝３０：１）で精製して所望の生成物（720mg、91%）を白色 固体として得た。 IR(neat)1747，1662 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 2.178-2.216(m，2H)，2.404(t，2H，J=6.8Hz)，3.371(s，3H)，3.599-3.643(m， 2H)，3.701(t，1H，J=6.8Hz)，4.109-4.192(m，6H)，4.618(s，2H)，5.278，5.4 3(ABq，2H，J=16.4Hz)，6.169(s，1H) MS(EI)m/e 351(M⁺)，320(M⁺-OCH₃)，307(M⁺-CO₂) 実施例３６：1,1-(エチレンジオキシ)-(5'-メトキシメチルオキシエチル-5'-ヒ ドロキシ-2'H,5'H,6'H-6-オキソピラノ)[3',4'-f]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒド ロインドリジンの調製 実施例３５で得られた化合物（570.3mg、1.63mmol）を無水DMF（20ml） に溶かした混合物に、カリウムt-ブトキシド（273mg、2.43mmol）を加えて0〜5 ℃の環境下で、30分撹拌した。反応混合液を-10〜-5℃に冷却させ、亜リン酸ト リエチル（974μl、5.68mmol）を加えて酸素をバブリングしながら2.5時間撹拌 した。前記混合液に水（10ml）を加えて1N-塩酸でpH3.5に調節した後、ジクロロ メタン（30ml X 2回）で抽出し、水（20ml）と塩水（20ml）で洗浄して無水硫酸 マグネシウムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮し、残留物をカラムクロマトグ ラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝25：１）で精製して所望の生成物（41 6.4mg、69.8%）を白色固体として得た。 IR(neat)3503，1749，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.919-1.974(m，1H)，2.010-2.063(m，1H)，2.348(t，2H，J=6.8Hz)，3.30(s，3 H)，3.542-3.597(m，1H)，3.639-3.684(m，1H)，4.002-4.1541(m，7H)，4.516， 4.494(ABq，2H，J=6.4Hz)，5.111，5.557(ABq，2H，J=16Hz)，6.541(s，1H) MS(EI)m/e 367(M⁺)，336(M⁺-OCH₃)，323(M⁺-CO₂) 実施例３７：1,5-ジオキソ-(5'-ヒドロキシエチル-5'-ヒドロキシ-2'H,5'H,6'H- 6-オキソピラノ)[3',4'-f]-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジンの調製 実施例３６で得られた化合物（146.1mg、0.4mmol）にテトラヒドロフラ ン（200ml）、水（1ml）および6N-塩酸(2.5ml)の混合液を加えて50〜55℃の環境 下で、1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジアニオン（Dia nion^R）HP-20（三菱）（アセトニトリル：水＝４：１）で精製して減圧下濃縮し 所望の生成物（93.2mg、84%）を黒色樹脂状として得た。 IR(KBr)3470，1749，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.92-2.11(m，2H)，2.962(t，2H，J=6.0Hz)，3.674-3.86(m，2H)，4.326(t，2H ，J=6.0Hz)，5.259，5.627(ABq，2H，J=16.8Hz)，5.287(s，1H)，7.284(s，1H)M S(EI)m/e 279(M⁺)，261(M⁺-H₂O)，235(M⁺-C₂H₅OH) 実施例３８：dl-18-ヒドロキシカンプトテシンの調製 実施例３７で得られた化合物（85.2mg、0.3lmmol）に2-アミノベンズア ルデヒドエチレンアセタール（75.6mg、0.46mmol）とトルエン（８ml）の溶液を 加え、ディーン スターク（Dean-Stark）装置で１時間還流させた。反応混合液 にp-トルエンスルホン酸（触媒量）を加えて再び３時間還流させた。生成された 固体を濾過し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノー ル＝15：１）で精製して所望の生成物（57.8mg、52%）を淡褐色固体として得た 。 IR(neat)3400，1743，1658 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃:DMSO-d₆=3:1）δ 2.01-2.20(m，2H)，3.51-3.86(m，2H)，5.315(s，2H)，5.34，5.55(ABq，2H)，6 .418(s，1H)，7.557(s，1H)，7.676(t，1H)，7.83(t，1H)，8.03(d，1H)，8.18( d，1H)，8.570(s，1H) MS(EI)m/e 364(M⁺)，320(M⁺-CO₂) 実施例３９：dl-18-メトキシメチルオキシカンプトテシンの調製 dl-18-ヒドロキシカンプトテシン（20mg、0.05mmol）をジクロロメタン （２ml）に懸濁させ、塩化メトキシメチル（6μl、0.08mmol）とジイソプロピル エチルアミン（12μl、0.07mmol）を加えて25〜30℃の環境化で、48時間撹拌し た。 反応混合液にジクロロメタン（２５ml）を加え、飽和塩化アンモニウム 水溶液（１０ml）、水（１０ml）、10％硫酸水素カリウム水溶液（１０ml）、水 （１０ml）および塩水（１０ml）の順序で洗浄して有機層を無水硫酸マグネシウ ムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮し、得られた残留物をカラムクロマトグラ フィー（ジクロロメタン：メタノール＝３０：１）とPTLC（ジクロロメタン：メ タノール＝２０：１）で精製して所望の生成物（5mg、23%）を黄色固体として得 た。 IR(KBr)3566，1733，1652 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 2.15-2.34(m，2H)，3.387(s，3H)，4.08-4.22(m，2H)，4.604(d，d，2H)，5.313 (s，2H)，5.62，5.78(ABq，2H)，6.6(s，1H)，7.68(t，1H)，7.726(s，1H)，7.8 4(t，1H)，7.96(d，1H)，8.24(d，1H)，8.41(s，1H) MS(EI)m/e 408(M⁺) HRMS m/e M⁺Calcd; 408.1321，Obsd; 408.1336 実施例３９と同様の方法で製造してR＝H、n＝２である一般式（I）で表 される実施例40〜46の化合物を製造した。 実施例４７：6-シアノ-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシカルボニル)-2 '-ヒドロキシエチル]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジンの調製 6-シアノ-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[(エトキシカルボニル)メチル]-5 -オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジン(500mg、1.64mmol)に35%ホルムアル デヒド(30ml)、ジオキサン(50ml)、水（20ml）およびエタノール（20ml）の混合 液を加えて２５〜３０℃の環境化で、１５時間撹拌した。反応混合液にジクロロ メタン（１２０ml）を加え、水（120ml X ３回）と塩水（１２０ml）で洗浄し、 分離された有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮し 、 得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２ ５：１）で精製して所望の生成物（318mg、58%）を白色固体として得た。 IR(KBr)3310，2224，1735，1647 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.275(t，3H，J=7.2Hz)，2.407(t，2H，J=6.8Hz)，4.029-4.221(m，9H)，4.239( q，2H)，6.383(s，1H) MS(EI)m/e 334(M⁺)，316(M⁺-H₂O)，304(M⁺-CH₃OH) 実施例４８：6-シアノ-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシカルボニル)-2 '-(メトキシエトキシメチルオキシエチル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロイン ドリジン調製 実施例47で得られた化合物（51.6mg、0.15mmol）にジクロロメタン（0. 7ml）を加えて氷浴中で冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（30μl、0.17mmol ）とMEM-CL（35μl、0.31mmol）を徐々に加えて、２５〜３０℃の環境化で、２ ０時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン（１５ml）を加え、飽和重曹水溶 液（10ml X ２回）、水（10ml）、塩水（１０ml）で洗浄し、分離された有機層 を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮し、得られた残留物 をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２５：１）で精製 して所望の生成物（4lmg、62%）を白色固体として得た。 IR(neat)2224，1734，1661 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.289(t，3H，J=6.8Hz)，2.422(t，2H，J=6.8Hz)，3.410(s，3H)，3.548-3.598( m，2H)，3.653-3.680(m，1H)，3.725-3.748(m，1H)，3.912(dd，1H，J=10Hz，J= 6.8Hz)，4.098(dd，1H，J=10Hz，J=6.8Hz)，4.129-4.216(m，6H)，4.236(q，2H) ，4.336(t，1H，J=6.8Hz)，4.706，4.742(ABq，2H，J=6.8Hz)，6.441(s，1H) MS(EI)m/e 423(M⁺+H)，422(M⁺)，392(M⁺-OCH₃)，378(M⁺-C₂H₅O) 実施例４９：6-(アセトアミドメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキ シカルボニル)-2'-(メトキシエトキシメチルオキシエチル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾- テトラヒドロインドリジンの調製 実施例48で得られた化合物（39.6mg、0.09mmol）を使用して実施例33と 同様の方法で反応および処理した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロ ロメタン：メタノール＝２０：１）で精製して所望の生成物（42mg、96%）を無 色オイル状として得た。 IR(neat)1733，1661，1656 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.247(t，3H，J=7.2Hz)，1.943(s，3H)，2.393(t，2H，J=6.8Hz)，3.405(s，3H) ，3.546-3.569(m，2H)，3.660-3.686(m，2H)，3.809(dd，1H，J=6.4Hz，J=9.2Hz )，4.093-4.192(m，7H)，4.205(g，2H)，4.467(dq，2H，J=6.4Hz)，4.652(t，2H ，J=6.8Hz)，4.719，4.750(ABq，2H，J=6.8Hz)，6.349(s，1H)，6.658(s，1H) MS(EI)m/e 468(M⁺)，453(M⁺-CH₃)，425(M⁺-C₂H₅O) 実施例５０：6-(アセトキシメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシ カルボニル)-2'-(メトキシエトキシメチルオキシエチル)]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テ トラヒドロインドリジン 実施例49で得られた化合物（359mg、0.76mmol）を使用して実施例34と 同様の方法で反応および処理させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（ジク ロロメタン：メタノール＝３０：１）で精製して所望の生成物（234mg、65%）を 無色オイル状として得た。 IR(neat)733，1740，1661 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 1.230(t，2H，J=7.2Hz)，2.057(s，3H)，2.361(t，2H，J=6.8Hz)，3.381(s，3H) ，3.521-3.542(m，2H)，3.620-3.653(m，2H)，3.723(dd，1H，J=6.0Hz，J=9.6Hz )，4.082-4.209(m，8H)，4.225(5，2H)，4.716-4.675(ABq，2H，J=6.8Hz)，5.25 9(s，2H)，6.313(s，1H) MS(EI)m/e 469(M⁺)，426(M⁺-COCH₃) 実施例５１：6-(アセトキシメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシ カルボニル)ビニル]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジンの調製 実施例50で得られた化合物（522mg、1.1mmol）に無水ベンゼン（8ml） とDBU（416μl、2.78mmol）を加えて室温で3時間撹拌した。反応混合液にジクロ ロメタン（２０ml）を加え、飽和塩化アンモニウム水溶液(15ml X 2)と水（15ml ）で洗浄し、分離された有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を減 圧下で濃縮し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン： メタノール＝30：1）で精製して所望の生成物（363mg、90%）を黄色がかった白 色固体として得た。 IR(neat) 1729，1719，1655 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 6.551(s，1H)，6.109，5.773(s，s，1H×2)，5.008(s，2H)，4.243(q，2H，J=7. 2Hz)，4.104-4.161(m，6H)，2.398(t，2H，J=6.8Hz)，2.021(s，3H)，1.293(t， 3H，J=7.2Hz) MS(EI)m/e 363(M⁺)，320 実施例５２：6-(アセトキシメチル)-1,1-(エチレンジオキシ)-7-[1'-(エトキシ カルボニル)-1'-(ヒドロキシ)-2'-(ヒドロキシ)エチル]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テト ラヒドロインドリジンの調製 実施例51で得られた化合物（285mg、1.79mmol）にピリジン（3.9ml）を 加え、OsO₄（240mg、0.94mmol）（0.08Mトルエン溶液、11.8ml）を注入して遮光 下で、室温で4時間撹拌した。反応を完結させた後、硫酸水素ナトリウム(480mg) と水（7ml）の混合溶液を加えて１時間撹拌した。反応混合液をジクロロメタン （30ml X 5）で抽出し、合わせた有機層を塩水で洗浄して無水硫酸マグネシウム で乾燥した。 有機層を減圧下で濃縮し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー （ジクロロメタン：メタノール＝20：１）で精製して所望の生成物（280mg、90% ）を白色固体として得た。 IR(neat) 3307，1735，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 6.455(s，1H)，5.303(ABq，2H，J=11.7Hz)，4.611(s，1H)，4.085-4.611(m，9H) ，3.855，3.826(dd，1H，J=6.8，11.2Hz)，2.641(brt，1H，J=6.8Hz)，2.384(t ，2H，J=6.8Hz)，2.063(s，3H)，1.290(t，3H，J=6.8Hz) MS(EI)m/e 397(M⁺)，354 実施例５３：1,1(エチレンジオキシ)-(5'-ヒドロキシメチル-5'-ヒドロキシ-2'H ,5'H,6'H-6-オキソピラノ)[3',4'-f]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジ ンの調製 実施例52で得られた化合物（325mg、0.82mmol）を使用して実施例35と 同様の方法で反応および処理した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロ ロメタン：メタノール＝２０：１）で精製して所望の生成物（211mg、84%）を白 色固体として得た。 IR(neat) 3421，1750，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 6.599(s，1H)，5.564，5.255(ABq，2H，J=16.0Hz)，4.072-4.238(m，7H)，3.772 ，3.733(dd，2H，J=11.6Hz)，2.418(t，2H，J=6.8Hz) MS(EI)m/e 309(M⁺)，293，280，279，265 HRMS m/e(M⁺) Calcd：309，0849，Obsd：309，0.847 実施例５４：1,1-(エチレンジオキシ)-(5'-アセトキシメチル-5'-ヒドロキシ-2' H,5'H,6'H-6-オキソピラノ)[3',4'-f]-5-オキソ-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリ ジンの調製 実施例53で得られた化合物（119mg、0.38mmol）を無水ジクロロメタン （10ml）に加えて溶かし、ピリジン（93μl、1.15mmol）と酢酸無水物（47μl、 0.50mmol）を加えて室温で20時間撹拌した。反応液をジクロロメタン（20ml）で 希釈させ、10％硫酸水素カリウム水溶液（20ml）、水（20ml）、塩水（20ml）で 洗浄して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。 有機層を減圧下で濃縮し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー （ジクロロメタン：メタン＝２０：１）で精製して所望の生成物（127mg、94%） を白色固体として得た。 IR(neat) 3437，1751，1657 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 6.586(s，1H)，5.636，5.295(ABq，2H，J=16.4Hz)，4.302(d，1H，J=11.2Hz)，4 .116-4.215(m，7H)，4.004(s，1H)，2.427(t，2H，J=6.8Hz)，2.084(s，3H) 実施例55〜57の化合物は実施例54と同様の方法で製造し、その結果は次 のようである。 実施例５８：1,5-(ジオキソ)-(5'-アセトキシメチル-5'-ヒドロキシ-2'H,5'H,6' H-6-オキソピラノ)[3',4'-f]-△⁶⁽⁸⁾-テトラヒドロインドリジン 実施例54で得られた化合物（127mg、0.36mmol）に80%トリフルオロ酢酸 （1.3ml）を加えて室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し、塩水を加え てジクロロメタン（20ml X 3）で抽出して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有 機層を減圧下で濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン： メタノール＝２０：１）で精製して理論量の生成物を黄色固体として得た。 IR(KBr) 3412，1746，1660 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃）δ 7.318(s，1H)，5.687，5.388(ABq，2H，J=17.1Hz)，4.405(t，2H)，4.370(d，1H ，J=11.7Hz)，4.155(d，1H，J=11.7Hz)，3.007(t，2H，J=6.8Hz)，2.080(s，3H) MS(EI)m/e 307(M⁺) 実施例58と同様の方法で、R=H，n=2である一般式（II）で表される実施 例59〜61の化合物を製造した。 実施例６２：dl-20-デスエチル-20-アセトキシメチルカンプトテシンの調製 実施例58で得られた化合物（19mg、0.06mmol）とN-(2-アミノベンジリ デン)-p-トルイジン（20mg、0.09mmol）を使用して実施例38と同様の方法で反応 および処理し、PTLC（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）で精製して所望 の生成物（9mg、36%）を褐色固体として得た。 IR(CHCl₃) 3400，1749，1740，1654 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃+CD₃OD=4:1） 8.493(s，1H)，8.223(d，1H，J=8.4Hz)，7.988(d，1H，J=8.0Hz)，7.867(t，1H ，J=7.2Hz)，7.767(s，1H)，7.703(t，1H，J=7.2Hz)，5.697，5.433(ABq，2H，J =16.4Hz)，5.334(s，2H)，4.460(d，1H，J=11.2Hz)，4.330(d，1H，J=11.2Hz)， 2.087(s，3H) LRMS(EI)m/e 392(M⁺)，331，320，305 HRMS m/e(M⁺) Calcd：392.1008，Obsd：392.1006 実施例38と同様の方法で、R＝Hとn＝１である一般式（I）で表される実 施例63〜65の化合物を製造した。 実施例６６：dl-20-デスエチル-20-ヒドロキシメチルカンプトテシンの調製 dl-20-デスエチル-20-アセトキシメチルカンプトテシン（１４０mg、0. 36mmol）にメタノール（6ml）、水（２ml）および水酸化リチウム.水和物(LiOH H₂O)(33mg、0.78mmol)を加えて室温で1.5時間撹拌した。 反応液を減圧下で濃縮し、メタノールを除去して1N塩酸でpH3〜3.5で調 節されるまで、氷浴中で30分撹拌した。生成された固体を濾過し、水、イソプロ パノール、エーテルの順序で洗浄した後、P₂O₅下で３時間真空乾燥させて、所望 の生成物（83mg、66%）を黄色がかった白色固体として得た。 IR(KBr)3436，1743，1657 cm^{-1 1} H-NMR（400MHz，CDCl₃＋DMSO-d₆=1:1）δ 8.608(s，1HO，8.157(d，1H，J=8.0Hz)，8.106(s，1H)，8.050(d，1H，J=8.0Hz) ，7.829(t，1H，J=7.3Hz)，7.673(t，1H，J=7.3Hz)，6.741(s，1H)，5.441，5.3 60(ABq，2H，J=16.1Hz)，5.304(s，2H)，3.850-3.89(m，1H)，3.681-3.723(m，1 H) LRMS(EI)m/e 350(M⁺)，320，306 HRMS m/e（M⁺） Calcd：350.0903，Obsd：350.0917 実施例３９と同様の方法で、R＝Hとn＝１である一般式（I）で表される 実施例67〜69の化合物を製造した。 [実験例１：本発明による化合物の細胞毒性] １）実験材料 癌細胞株 L1210(ATCC CCL 219)，A172(ATCC CRL 1620)，A427(ATCC HTB 53)或い はA549(ATCC CCL185)，SK-NEP-1(ATCC HTB 48)，CAOV-3(ATCC HTB 75)，HEC-1-B (ATCC HTB 113)，DLD-1(ATCC CCL 221)，KATO-III(ATCC HTB 103)，CAKI-2(ATCC HTB 47)細胞株を米国のATCCより購入して、細胞毒性の測定のために、標的生物 として実験に使用した。 癌細胞培養用培地の調製 培地調製用のために蒸留水を使用した。１Lの粉末のRPMI１６４０培地 を蒸留水に溶解し、重曹2.0gを入れて撹拌した。溶液のpHを6.8〜7.4の間で調節 した後、0.22umフィルターで濾過した。牛胎児血清は、使用前に56℃の環境下で 、30分熱処理した。 試薬 癌細胞培養用であるRPMI１６４０培地、牛胎児血清、重曹、トリプシン -EDTA緩衝液はギブコ(GIBCO)社の製品を、MTT[(3,4,5-ジメチルチアゾール-2-イ ル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)]およびSRB(Sulforhodamine B)試 薬はシグマ(Sigma)社の製品を、その他の一般試薬はGR級の試薬を使用した。 試験物質 シグマ社より購入したカンプトテシンをジメチルスルホキシドに溶解し 、DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)を加えて、ジメチルスルホキシ ドの濃度が１０％になるように調節して使用した。合成した試験物質の場合もジ メチルスルホキシドの濃度が１０％になるようにジメチルスルホキシド中に溶解 し、その残りをDPBSで満たしてから使用した。癌細胞に加える最終ジメチルスル ホキシドの濃度は１％未満になるようにした。この濃度では癌細胞の成長に何ら かの影響を及ぼさない。 2)実験方法 癌細胞培養に使用した培地は10％(v/v)牛胎児血清(FBS)、50μg/mlゲン タマイシンおよび2g/L炭酸水素ナトリウムの添加されたRPMI１６４０培地であり 、細胞培養は５％CO₂、37℃の環境下で行われた。(培養フラスコに付着して成長 する足場依存細胞株の脱着のために)培地を除去してPBSで一度洗浄し、トリプシ ン-EDTA緩衝液２〜３mlを入れて癌細胞の単一層(monolayer)を全て覆った後、少 し放置した。培養された癌細胞の懸濁液を調製し、培地で希釈して96-ウェルプ レートに各細胞が以下の表１の数になるように接種した。 薬物液（対照ウェルにはPBS溶液）20μlを96-ウェルマイクロプレート に接種して３日間培養した。培養後、SRB法により抗癌活性を測定した[実験図式 １]。 L1210のような足場非依存性細胞においては、やはり表１の数になるよ うに細胞を接種して２日間培養した後、MTT法により細胞に対する細胞毒性を測 定した[実験図式２]。 吸光度は自動マイクロプレイト判読機を使用して測定し、細胞成長を50 ％抑制する濃度をGI₅₀で計算（コンピューター、PCS version 4.1を利用、プロ ビット(probit)分析法を利用）し、１回試験時に約２〜３ウェルの吸光度の平均 を計算に利用した。 実験図式１：SRB分析法 培地の中、180μl細胞懸濁液 ＋ 20μl薬物液あるいはPBS ↓ 5%二酸化炭素、37℃の環境化で３日間培養 ↓ TCAで沈殿 ↓ ４℃の環境下で１時間放置 ↓ 蒸留水で５回洗浄および乾燥 ↓ 0.4%SRB溶液で３０分間染色 ↓ １％HAc溶液で５回洗浄 ↓ １０mMトリス緩衝液で溶解 ↓ 520nmで吸光度の測定 ↓ GI₅₀の算出 実験図式２：MTT分析法 培地の中、180μl細胞懸濁液 ＋ 20μl薬物液あるいはPBS ↓ 5%二酸化炭素、37℃の環境下で２日間培養 ↓ 50μl MTT溶液（2mg/ml PBS溶液）を添加 ↓ ４時間培養 ↓ 2,000 rpmで１０分間遠心分離 ↓ 上層液の除去 ↓ DMSOでホルマザン結晶を溶解 ↓ 570nmで吸光度の測定 ↓ GI₅₀の算出 ３）実験結果 各細胞株に対する細胞毒性の結果は表２および表３のようである。 実験例２：本発明の化合物による抗癌活性 抗癌活性は、普通、人為的に癌を発生させた動物での寿命延長効果およ び固形腫瘍の増殖抑制効果を測定することにより立証され得る。 本実験では、L1210保有マウスに対する寿命延長効果、およびB16保有マ ウスに対する増殖抑制作用を実験して抗癌活性を判定した。L1210白血病に対す る抗癌活性を判定するために、インビトロの一定の数のL1210細胞を動物の腹腔 に接種して増殖させ、腫瘍移植後７日目に頚椎脱骨により致死させた動物の腹水 からL1210細胞を採取した。 B16黒色腫に対する腫瘍増殖抑制効果を研究するために、インビトロの 一定の数のB16細胞を動物の皮下に接種して増殖させ、腫瘍移植後１４日目に頚 椎脱骨により致死させた動物から腫瘍細胞を摘出した。 以下、抗癌活性に対する実験を詳細に説明する。 実験動物 本実験で使用された動物はBDF₁マウスであり、体重20g内外の雄マウス であった。飼育室は、ヘパフィルター下、温度23±2℃、相対湿度60±５℃で制 御され、特定病原体不在(specific pathogen free: SPF)の環境で維持された。 実験例２-１：L1210保有マウスに対する本発明の化合物による寿命延長効果 インビトロ状態で入手された5 X 10⁵個のL1210白血病細胞をBDF₁マウス の腹腔に接種して増殖させた。腫瘍移植後７日目に頚椎脱骨により致死させたBD F₁マウスから、無菌状態で腹水内のL1210癌細胞を採取した。 癌細胞は、実験前に少なくとも３回以上継代して使用した。 5 X 10⁵個の細胞をBDF₁マウスの腹腔に移植し(０日目)、薬剤は移植日 から１日、３日と５日目に体重10g当たり、0.1mlの用量で腹腔内投与した。各々 の実験群で使用された動物は６匹であった。 抗腫瘍活性はマウスの群の平均生存日数により評価され、そしてまたIL S(%)値と、移植の後１日目と５日目の平均体重でも判定された。 延命率 （ILS: increase life span） ILS（％）＝｛(薬物投与群のMST/溶媒投与群のMST)-1｝X 100 実験結果 腫瘍移植の後、１日、３日と５日目に実施例１８の化合物を総量で10mg /kg、５０mg/kg投与した時にL1210保有マウスの寿命ILSが各々３３％、６４％増 加した（表４）。 癌移植の後、１日、３日と５日目に実施例２６の化合物を総量で10mg/k g、５０mg/kgを投与した時にL1210保有マウスの寿命(ILS)が各々７２％、７５％ 増加した（表５）。 癌移植の後、１日、３日と５日目に実施例３０の化合物を総10mg/kg、 ５０mg/kgを投与した時にL1210保有マウスの寿命(ILS)が各々４２％、１１９％ を示した（表６）。 実施例30の化合物は他の化合物に比べて用量依存性およびILS(%)が優れ ていたので、もっと高い用量で実験して効能を示す用量範囲および最大効能用量 を調べようとした。 実施例30の化合物を移植の後、１日、３日と５日目に8.75，17.5，35， 70，140mg/kgを投与した時にILS(％)が各々58.7，79.7，92.4，143，110%を示し た（表７）。 腫瘍接種の後、１日、３日、および５日目に実施例30の化合物を投与し た場合、総投与量70mg/kgでILSが143％で一番高かった。 腹腔内移植されたL1210に対する、実施例30の化合物による抗癌活性を カンプトテシンに比べて図１に示す。実施例30の化合物はILS(%)が高く、そして 効力を示す用量範囲がずっと広い。 実験例2-2：B16保有マウスに対する本発明の化合物による腫瘍増殖抑制効果 インビトロ状態で入手されたB16黒色腫細胞１０⁶個をBDF₁マウスの皮下 に注射して増殖させた。B16黒色腫を１４日目に移植させた。頚椎脱骨で致死さ せた腫瘍保有マウスから、中心の壊死部分を除外した新鮮な腫瘍を無菌的に採取 した。 癌細胞は実験前に少なくとも３回以上継代して使用した。 皮下投与される腫瘍１gを最終的に1g/10ml濃度になるように無菌生理食 塩水液で均質化させた。1:10腫瘍懸濁液をすべてのBDF₁マウスの皮下にマウス１ 匹当たり0.2mlずつ皮下注射した。 組織均質液でマウスに皮下移植し、腫瘍移植の7-8日後に一定の大きさ で癌が増殖したマウスを選択して実験に使用した。各々の実験群は、癌移植の後 ８日目、１２日目および１６日目に体重10g当たり、0.1mlの試料を投与した。各 々の実験群で使用された動物は８匹であった。 腫瘍サイズは、腫瘍の直径を直接測定して、以下の式を用いて、計算し た。 腫瘍サイズ＝(a²b)/2 ここで、ｂは長径であり、ａはｂに垂直である直径であり、増殖曲線を このようにして得た（図２）。 腫瘍サイズに基づく腫瘍成長抑制率(inhibition rate)を以下に式によ って計算した。 IR（%）＝(1-TWt/TWc)X 100 TWtは薬物投与群の平均腫瘍容量（重量） TWcは対照群の平均腫瘍容量（重量） 実験結果 実施例30の化合物を癌移植の後、８日、12日と16日目に総量で35、70、 140mg/kgを投与した時にIR(%)は各々27、54.8、67.72%を示した（表８）。 また、実施例３０の薬物投与から２０日目に摘出された腫瘍重量に対す るIRは40、56、71.6%を示した 総投与量140mg／kgで、IRが67.72%で一番高かった。腫瘍容量の変化を 図２に示す。上記の結果から、実施例30の化合物は腹水腫瘍および固形腫瘍に対 する抗癌活性が優れているばかりではなく、カンプトテシンに比べて低い毒性を 有することが明らかに示される。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記一般式（I）で示されるカンプトテシン誘導体及び薬剤学的に許容され るその塩： 前記式で、Rは水素或いは-(CH₂)₂-NR₁R₂(R₁は水素或いは一般的なアミノ保護基 を示し、R₂は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルを示 し、またR₂は隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができる) を示し； n=1或いは2であり； (R₇はメチル、エチル、またはCH₃OCH₂CH₂-を示す)を示す]であり； 前記式で、 n=2であり、R₄が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、n=2、R₃が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、Rが-CH₂CH₂NHCH₃である場合には、R₃は水素ではない。 ２．下記一般式（II）で示されるカンプトテシン合成中間体： 前記式で、R’は−(CH₂)₂-NR₁R₂（R₁は一般的なアミノ保護基を示し、R₂ は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルを示し、R₂は 隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができる）を示す。 ３．下記一般式（III）で示されるカンプトテシン合成中間体： 前記式で、 l) ；CH₂OR₇(R₇＝メチル、エチル、または-CH₂OCH₂CH₃)]であり； 前記式で、 n=2であり、R₄が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、n=2、R₃が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、Rが-CH₂CH₂NHCH₃である場合には、R₃は水素ではない。 ４．下記一般式（II）の化合物を、下記一般式（III）の化合物と酸性条件下で 反応させる段階を含む下記一般式（I）化合物の製造方法 前記式で、 Rは水素或いは-(CH₂)₂-NR₁R₂（R₁は水素或いは一般的なアミノ保護基を 示し、R₂は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルを示し 、また、R₂は隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができる） を示し； R'は水素或いは-(CH₂)₂-NR₁R₂であり、R₁は一般的なアミノ保護基を示 し、R₂は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルであり、 また、R₂は隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができる； n=1、或いは2であり； R₆（R₆はイソプロピル、フェニル、-CH₂CH₂Clを示す）；CH₂OR₇(R₇はメチル、エ チル、CH₃OCH₂CH₂-を示す)を示す]であり； 前記式で、 n=2であり、R₄が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、n=2、R₃が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、Rが-CH₂CH₂NHCH₃である場合には、R₃は水素ではない。 ５．下記一般式（I）で示されるカンプトテシン誘導体及び薬剤学的に許容され るその塩を含有する抗癌剤： 前記式で、 Rは水素或いは-(CH₂)₂-NR₁R₂、（R₁は水素、或いは一般的なアミノ保護 基を示し、R₂は低級アルキル基、ヒドロキシエチル、或いはアセトキシエチルを 示し、また、R₂は隣接した窒素と結合してヘテロ環化合物を形成することができ る）を示し； n=1、或いは2であり； CH₂OR₇(R₇はメチル、エチル、CH₃OCH₂CH₂-を示す)を示す]であり； 前記式で、 n=2であり、R₄が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、n=2、R₃が水素である場合には、Rは水素ではなく； また、Rが -CH₂CH₂NHCH₃である場合には、R₃は水素ではない。