JPH10500704A - タンパクおよびペプチドのための安定化溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示されているのは、タンパク質及びタンパク質のフラグメントを安定化させるための組成物である。該組成物は、緩衝剤、塩類、還元剤、キレート剤及び安定化タンパク質を含有する。該組成物は、高度に安定な診断用較正標準又は対照を調製するために使用することができ、トロポニン等のような心臓マーカーの較正標準又は対照として特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパクおよびペプチドのための安定化溶液本発明の分野 本発明は、一般的にはタンパク質およびペプチドを安定化するため水溶液に関 する。詳しくは、本発明はタンパク質およびペプチド、特にトロポニン，ミオグ ロビン，ＣＫ，ＣＫイソ酵素，ＬＤ，ＬＤイソ酵素およびミオシン、およびそれ らのフラグメント，最も特にトロポニンの合成および組換ペプチドを含むトロポ ニンおよびトロポニンフラグメントのための診断アッセイ用の水性較正および対 照溶液に関する。本発明の背景 多数の生理学的状態がＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ミオシンおよびトロポニン の上昇したレベルに関連する。上昇したレベルは一般に心筋梗塞および心筋傷害 を招来する他の症状に関連する。 主として急性心筋梗塞とこれらタンパク質の上昇したレベルの関連のため、急 性心筋梗塞（ＡＭＩ）のためのテストが体液中のこれらタンパク質レベルを測定 するために考案され、または考案されつつある。このためこれらタンパク質は心 臓マーカーとして知られている。 急性心筋梗塞は、特にアメリカ合衆国におい ては主要な病因および死因であり続けている。推定１５０万人の病院入院患者が 心筋梗塞の疑いまたは関連する心臓病へ帰属し得る。これらの患者のうち、大体 ２５％だけが実際にＡＭＩにかかっており、３０％は不安定アンギナで入院し、 ２０％は安定な冠動脈病（ＣＡ）を有し 、残りの２５％はＣＡＤを持っていない。直ちにケアおよび入院を必要とする患 者を危険でない患者から区別することは有効な医学的ケアを提供し、入院コスト を減らし、そして病院設備を有効に管理することにおいて大きな価値がある。現 在の研究は早期の介入が最適の治療対策にとって決定的であることを指示する。 これらの治療対策は、損傷した心筋への血流の回復、梗塞サイズの局限および それにより心機能を保存する可能性を有している。新しい治療介入機構、特にス トレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターのような血栓溶解 剤が心臓動脈血流を回復し、そして死亡頻度を減らすために利用可能である。大 多数の臨床医は介入はできるだけ早く行うべきであり、そして胸痛の発現後最初 の４時間以内でなければならないと信じている。 このため、理想的な心臓マーカーまたはマーカーの組合せは心臓組織に特異的 でなければならず、それはＡＭＩの開始後４時間以内の診断でなければならず、 それはＡＭＩ後少なくとも７日間いくらか上昇し続けるがしかし最初のＡＭＩの 最初の数日間でさえも再梗塞を検知しなければならない。 ＡＭＩの診断は現在異常な心電図（ＥＣＧ）、臨床症候および履歴、および上 昇した心臓酵素レベルに基づいている。現在ＣＫＭＢがしばしばＡＭＩに対する 決定的血清マーカーとして使用されている。 しかしながらＥＣＧおよび臨床的提示はしばしば心臓損傷の非結論的または矛 盾する予見を与える。ＣＫ−ＭＢテストは最終診断への貢献においていくつかの 制限を有する。骨格筋損傷および激しい運動は人工的にＣＫ−ＭＢレベルを上昇 することがあり、臨床図を 困乱し得る。加えて、ＣＫ−ＭＢはＡＭＩ後４〜６時間まで診断的に上昇しない 。加えて、ＣＫ−ＭＢレベルはＡＭＩ後４８〜７２時間診断できなくなる。 ＣＫ−ＭＢはこの検体の診断測定をモニターするための対照溶液中に調製され ている。しかしながらＣＫ−ＭＢはヒト血清中および通常の衝緩水溶液中では限 られた安定性を有する酵素である。米国特許No.４，９９４，３７５は安定な再 構成水系対照を開示する。現在ＣＫ−ＭＢレベルの測定のため市場で入手し得る Ｄａｄｅ Ｓｔｒａｔｕｓ ＣＫ−ＭＢ蛍光分析酵素イムノアッセイキットのよ うなイムノアッセイキットがある。これらキットの多くは較正液を含んでいる。 Ｄａｄｅ ＣＫ−ＭＢ／ミオグロビンイムノアッセイコントロールのようなＣＫ −ＭＢを含有する対照溶液も商業的に入手し得る。 ミオグロビンは骨格および心臓筋肉の両方に存在するマーカーである。ミオグ ロビンレベルはＡＭＩの２時間以内に上昇する。血清レベルは６〜８時間でピー クに達するが、２４〜３６時間後には非診断レベルへ復帰する。しかしながら血 清ミオグロビンレベルは骨格筋傷害後も増加する。ミオグロビンレベル測定のた めのＤａｄｅ Ｓｔｒａｔｕｓミオグロビン蛍光分析酵素イムノアッセイキット のような商業的に入手し得る少数のイムノアッセイキットがある。ミオグロビン 含有対照溶液はＤａｄｅ ＣＫ−ＭＢ／ミオグロビンイムノアッイセ対照のよう なソースから調製され、商業的に入手し得る。 トロポニンは筋組織の収縮メカニズムの調節機能を実行する、約８５ｋＤの分 子量を有するタンパク質複合体である。トロポニン複 合体を含むサブユニットのアミノ酸配列は決定されている。例えばＶａｌｌｉｎ ｓ Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕ ｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ，ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ：Ｖｏｌ． ２７０，Ｎｏ．１，Ｓｅｐ．２，１９９０を見よ。トロポニンは、カルシウムの 存在下筋肉内の収縮または弛緩のどちらかを制御するために協力する似た分子量 の三つのサブユニットよりなる。これら三つのサブユニットはトロポニンＴ，Ｃ およびＩと命名されている。心筋に含まれているＴおよびＩの両方は心臓に特異 的なアミノ酸配列を有する。このためトロポニンＴおよびトロポニンＩの両方が 心筋起源の損傷のテストにおいてすぐれた特異性のための可能性を持っている。 心臓組織への損傷はこれら収縮タンパク質を損害後急速に循環中へ放出させ、感 受性のための可能性を提供する。トロポニンはＡＭＩ後４〜６時間診断され、そ して４〜１４日間上昇し続ける。 トロポニンのような収縮装置のタンパクは不溶性タンパク質複合体の一部であ る。このため精製したトロポニンを血清に入れる時それを可溶化するのは困難で ある。加えて、精製したトロポニン調製物は非常に不安定であり、そのコンフォ メーションの見掛けの変化および／または容器表面への付着は分子の定量化を複 雑化する傾向を有する。このためトロポニンを安定化する水溶液を設計すること は非常に困難である。現在商業的に入手し得るトロポニンのための診断アッセイ に使用する較正液および対照は液体の形において非常に限られた安定性を有する 。 このためトロポニンを可溶化し、そして安定化するために有用な 水溶液に対して需要が存在する。そのような溶液はトロポニンおよび他の心臓マ ーカーのための、または可溶化および／または安定化が困難な他のタンパク質の ための診断対照または較正液マトリックスとして機能することができる。加えて 、該マトリックスは該タンパク質を貯蔵するために有用である。 トロポニン、またはトロポニンと同様に安定性または溶解性問題を有する他の タンパク質のための較正または対照ベースを処方する時にはいくつかの基準を満 たす必要がある。安定性問題が主要な関心事である。再現性および使用容易性の ため液状製品が好ましく、そして安定でなければならない。しかしもし製品が凍 結乾燥されるならば、復元後も安定でなければならない。以前のトロポニン較正 液はヒト血清由来製品に基づいており、そして組成物の安定性へは非常に僅かし か貢献しない。例えば、ベーリンガーマンハイム製ヒト血清系凍結乾燥トロポニ ンＴ較正および対照の公表されている日付記入は復元後２〜８℃においてたった ６時間であり、そして部分標本とし−２０℃で貯蔵するとき３月である。製品の 安定性を増加するマトリックスが高度に望まれる。 さらに、正常または処理したヒト血清の使用は臨床医および製造者の両方へ健 康問題を提供する。このため健康リスクを低減するマトリックスが高度に望まれ る。 合成マトリックス中の較正剤は正常ヒト血清を用いる応答曲線の系を真似しな ければならない。このことはマトリックスによって発生させた標準曲線から読取 った結果が実際の生物学的環境における結果と比較して正確であることを保証す るために重要である。 診断アッセイにおいては検体のテスト表面（例えば試験管、紙、 スライド等のような固相支持体）への非特異的結合は、較正を正確に保ちそして 矛盾した結果のリスクをなくすために最小化されなければならない。このためマ トリックス中の検体の非特異的結合は最小化されなければならず、サンプルの非 特異的結合と類似でなければならない。また、貯蔵中タンパク質またはタンパク 質フラグメントは認められる程貯蔵容器へ結合しないことも重要である。 実際の検体よりも検体類縁体の方が望ましい場合がある。もし検体類縁体が検 体の代わりに使用されるならば、類縁体の結合は検体の結合を模倣しなければな らない。類縁体の免疫結合は当該タンパク質のそれを模倣しなければならないた め、タンパク質のための類縁体を選定する時には特別の注意を使用しなければな らない。このため結合部位のためのタンパク質のコンフォメーション依存性が類 縁体において維持されなければならない。加えて、類縁体の安定性は検体のそれ と同じかまたはそれより大でなければならない。再びタンパク質検体の安定性は そのコンフォメーションに関係し得る。最後にもしある類縁体をある検体に置換 するならば、類縁体は検体より容易に入手可能であることが望ましい。本発明の概要 本発明は、心臓マーカーのようなある種の不安定および／または貧溶性タンパ ク質のための診断アッセイのために、そして診断アッセイの精度および正確性を モニターするための較正曲線の実行に使用すべき、安定化した臨床検査室非ヒト 血清誘導対照および／または較正剤マトリックスを提供する。特に、安定化した マトリックスはトロポニンＩ，トロポニンＴ，ＣＫ−ＭＢ，ミオグロビン，ミオ シンおよびこれらタンパク質または検体のフラグメントの可溶化お よび／または安定化のために有用である。 このマトリックスは正常ヒト血清中の検体の安定性と少なくとも等しくそして 好ましくはそれより良好な安定性を検体へ付与する成分の新規な混合物を使用す る。特に、緩衝剤、アルブミン、ゼラチン、キレート剤、還元剤および塩類の水 系混合物がすべて検体または検体アナログを安定化しそして可溶化するために微 酸性ないし中程度のアルカリ性ｐＨにおいて使用される。 このマトリックスを調製するための方法も開示される。図面の簡単な説明 図１は、種々のマトリックス中の組換全長トロポニンＩの２〜８℃における安 定性の比較を図示する。 図２は、種々のマトリックス中の組換え製造した８０アミノ酸ペプチドの２〜 ８℃における安定性の比較を図示する。 図３は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの１０ｎｇ／ｍ Ｌ較正剤の２〜８℃における安定性の比較を図示する。 図４は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの５０ｎｇ／ｍ Ｌ較正剤の２〜８℃における安定性の比較を図示する。 図５は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの３７℃におけ る安定性の比較を図示する。 図６は、すべてのマトリックスがプロテアーゼ阻害剤を含んでいる種々のマト リックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの３７℃における安定性の比較を図示 する。 図７は、本発明のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチド の異なるレベルの較正曲線を図示する。本発明の詳細な説明 心臓マーカーおよび他の不安定タンパク質のための臨床検査室非ヒト血清誘導 対照および／または較正剤マトリックスは、すべて微酸性ないし中程度アルカリ 性ｐＨにおいて、緩衝剤、アルブミン、卵アルブミン、カゼイン等のような安定 化タンパク質、キレート剤、還元剤および塩の水溶液を含む。 マトリックスはゼラチン、洗剤およびプロテアーゼ阻害剤のようなブロッキン グ剤を含むことができる。微生物発育を阻止するため保存剤を加えてもよい。心 臓マーカーまたは他の不安定なまたは比較的不溶性のタンパク質またはそのフラ グメントのような検体または検体アナログも添加される。もし較正剤または対照 が凍結乾燥または凍結されるならば、糖類または他の増嵩剤が添加される。 好ましい緩衝剤は、トリス緩衝剤およびリン酸塩緩衝剤のような緩衝剤を含む 。他の緩衝剤は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ），Ｎ −トリスヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）， ３−〔Ｎ−ビス（ヒドロキシメチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホ ン酸（ＤＩＰＳＯ），ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンス ルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ），トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、Ｎ− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−アミノエタンスルホン酸（ＨＥＰ ＥＳ），３−〔Ｎ−（トリス−ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロ キシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、および（２−アミノ−２−オキソエチ ル）アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を含む。最も好ましい緩衝剤はリン酸 ナトリウムのようなリン酸塩である。 緩衝剤の濃度は約１０ｍＭないし２００ｍＭでよい。好ましくは濃度は約２５ ｍＭないし１００ｍＭである。最も好ましくは濃度は約５０ｍＭである。 安定化タンパク質はアルブミン、卵アルブミン、カゼイン等である。安定化タ ンパク質は、他の成分と同様に、マトリックス中の検体の安定性を妨害する夾雑 物を実質上不含でなければならない。プロテアーゼのようなタンパク質構造を不 安定化または破壊し得る物質はそのような夾雑物の例である。アルブミンが好ま しい安定化タンパク質である。アミブミンの源は決定的ではない。アルブミンは 起源において天然でも組換物でもよい。天然アルブミンの最も入手し易い源はウ シアミブミンである。もし検体またはアナログがプロテアーゼ分解に服し得るな らば、アルブミンは実質上プロテアーゼ不含であることが最も好ましい。代わり にプロテアーゼ阻害剤を添加することができる。アルブミンの好ましい濃度は５ 〜２０％，８〜１２％、そして最も好ましくは約１０％である。 どんな特定の理論に拘束されることを望むものではないが、タンパク質安定剤 は検体または検体アナログに対して保護効果を提供するものと信じられる。 ブロッキング剤（すなわち表面への検体または検体アナログの非特異的結合を 最小化する剤）、例えばゼラチン、カゼイン、卵アルブミン等を添加してもよい 。ゼラチンが好ましいブロッキング剤である。ゼラチンは、もしウシ起源である ならば約０．０１ないし０．１５％，最も好ましくは０．１％の濃度において添 加される。もしゼラチンが他の起源のもの（例えば魚）であるならば、濃度は適 切に調節される。 キレート剤も添加される。好ましいキレート剤はエチレンビス（オキシエチレ ンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤ ＴＡ）、クエン酸ナトリウム、またはシュウ酸ナトリウム、カリウム、アンモニ ウムまたはリチウムのようなシュウ酸塩である。キレート剤の濃度は１ｍＭない し１５ｍＭ、そして最も好ましくは５ないし１０ｍＭである。 好ましくは還元剤はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。使用し得る他 の還元剤の例は２−アミノエタンチオール、２−メルカプトエタノール、２−メ ルカプトエチルアニリンおよびジチオスレイトールを含む。 還元剤の濃度は約０ないし５ｍＭでよく、好ましくは還元剤は約２ｍＭないし ３．５ｍＭ，最も好ましくは約２．６ｍＭである。 ｐＨは約５．０ないし８．０でよい。僅かに酸性のｐＨ値はトロポニンの非特 異的結合を低下させる。好ましいｐＨ範囲は５ないし７．５であり、そして最も 好ましくは約７．０である。 好ましい塩は塩化ナトリウムである。多数の他の塩を代替し得る。他の塩類の 例はカリウム塩、アンモニウム塩およびリチウム塩を含む。 もしプロテアーゼ阻害剤を添加するならば、アプロチニンおよびプロテアーゼ 阻害剤（シグマ）が有効であり、そして製造者の推奨濃度において使用し得る。 他のプロテアーゼ阻害剤の例は、（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ −５−メチルヘキサノイル〕−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（アマスタチン−シグマ ）、〔２Ｓ，３Ｒ〕−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−〔４−ニトロフェニル 〕−ブタノイル−Ｌ−ロイシン、アンチパイン、〔２Ｓ，３Ｒ〕−３−アミノ− ２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル〕−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（エピア マスタチン−シグマ），（〔２Ｒ，３Ｒ〕−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４− フェニルブタノイル）−Ｌ−ロイシン（エピベスタチン−シグマ）、フォロキシ ミチン、アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ａｌ（ロイペプチン−シグマ）、 ４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、Ｎ−（α−ラムノピラノ シルオキシ−ヒドロキシフォスフィニル）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐおよびフェニルメタ ンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む。 もし添加するならば、好ましい洗剤はＳＤＳおよびトリトンＸ−１００である 。他の洗剤はＴｗｅｅｎ−２０，ブリジ、ソルビチン、タージトールおよびノニ デットを含む。洗剤の濃度は０．０５％ないし０．３％でよい。好ましい範囲は ０．０５％ないし０．２％である。最も好ましい濃度は０．１％である。 保存剤は微生物およびカビ発育を防止するために添加してよい。保存剤は少な くとも０．０３％のクロトリマゾール、少なくとも０．０１７％のクロラムフェ ニコール、または少なくとも０．０５％のアジ化ナトリウムでよい。他の保存剤 はゲンタマイシン、マイコスタチン、チメラゾールおよびカソンの有効濃度を含 む。 マトリックスを調製するため、ポリプロピレンのようなプラスチックを使用し なければならない。これはガラスへの非特異性結合によるガラスへのタンパク質 の損失を最小化する。代わりにガラス系研究室器具を使用できるか、しかし使用 前シリコーン処理しなければならない。 もし較正剤または対照マトリックスを凍結乾燥または冷凍するならば、増嵩剤 が添加される。好ましい増嵩剤は３ないし１０％におけるトレハロースおよび約 １００ｍＭにおけるスクロースである。トレハロースの最も好ましい濃度は約５ 〜１０％である。他の増嵩剤はグルコース、スクロース、ガラクトース、マンノ ース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオース、メルビオ ース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マルトペンタオ ース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースを含む。 マトリックス１リットルは、ＢＳＡ約３０ｇ、ゼラチン約１ｇ、塩化ナトリウ ム約１５ｇ、ＥＤＴＡ約３ｇ、トレハロース約５０ｇ、保存剤、および検体また は検体アナログの臨床的に適切なレベルを０．５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 ７００ml中に溶解することによって調製することができる。すべての成分が溶解 した後、ｐＨが７．０へ調節され、その後リン酸ナトリウムのような緩衝液の適 量が体積を１．０リットルとするために加えられる。溶液は適当な容器へ無菌充 填され、そして凍結乾燥される。マトリックスを含む凍結乾燥した検体はＢＳＡ ６５ｇ，ＮａＣｌ２５ｇ，プロテアーゼ阻害剤およびＮＡＣ約０．４ｇを含んで いる希釈剤１リットルを加えることによって復元される。 代わりに、マトリックス１リットルは、ＢＳＡ約１００ｇ，ゼラチン約１ｇ， 塩化ナトリウム約４０ｇ，ＥＤＴＡ３ｇ，保存剤，ＮＡＣ０．４ｇ，および検体 または検体アナログの臨床的に適切なレベルを０．５０ｍＭリン酸ナトリウム７ ００ml中に溶解することによって調製することができる。すべての成分か溶解し た後、ｐＨ７ ．０へ調節され、次にリン酸ナトリウムのような緩衝液の適量が体積を１．０リ ットルとするために加えられる。液は部分標本化され、そして冷蔵または冷凍し て貯蔵される。もし液が冷凍されるならば、増嵩剤が加えられる。 驚くことにトロポニンＩ検体のために、トロポニンＩフラグメントも増加した 安定性を有する。これはトロポニンＩフラグメントの安定性はマトリックスが正 常ヒト血清である時全長トロポニンＩよりも低いことがわかっているので驚くべ きである。加えて、ある種のトロポニンＩフラグメントは全長トロポニンＩ分子 に比較する時アッセイに使用される抗トロポニン抗体に対して同様な結合を有し ていた。 このため、本発明は先行技術を上廻る多くの利益を有する。このマトリックス は非ヒト血清由来であり、これは使用者（および製造従事者）をヒト血液製品と の接触により伝播し得る多数の疾病への暴露から防止する。このマトリックスは 検体を液体の形で長期間安定に保つことができる。現行の処方物も凍結乾燥また は冷凍することができ、そして非常に少ない較正変動をもって少なくとも９ケ月 棚貯蔵まで信頼して復元または解凍することができる。復元または解凍後、検体 は２〜８℃において３週間までは安定である。マトリックス中への検体のスパイ キングはヒト血清曲線に密接に平行する較正曲線を得る。合成マトリックス中の 非特異性結合レベルも正常ヒト血清に見られるレベルに密接に平行する。さらに タンパク質の組換えまたは合成的に製造したペプチドフラグメントを全長タンパ ク質に代えて使用することができる。実際、組換えまたは合成的に製造したフラ グメントの入手性および再現性と組合せたそれらのマ トリックス中の安定性の故にこれらフラグメントが好ましい。検体アナログ（例 えばフラグメント）は全長マーカーと類似の結合特性を持たなければならない。 エピトープ部位を決定しそしてマップする方法は、特異性抗原に対する抗体を製 造する技術と同様に当業者には知られている。 本発明のマトリックスは多数の検体のために使用することができるが、しかし それは心臓マーカー，特にトロポニンおよびＣＫ−ＭＢのような検体が不安定で そして／または比較的不溶性のタンパク質である時に特に有用であることを理解 すべきである。 実施例１較正標準／対照マトリックスの調製 精製水約700ｍＬに、攪拌しつつ約３ｇのＥＤＴＡ（溶解するまで攪拌する） を、次いで約40.0ｇの塩化ナトリウム、約6.9ｇのリン酸一ナトリウム、約0.424 ｇのＮＡＣ、約50ｇのトレハロース、165ｍｇ／ｍＬの最終濃度を提供するため の約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐｍｓにするための約0 .75mＬのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液を加え、次い で緩やかに攪拌しつつ、約95ｇのプロテアーゼ不含牛血清アルブミンを、そして ２ｍＬの25％アジ化ナトリウムを加える。 実施例２凍結乾燥された較正標準／対照マトリックスの調製 精製水約700ｍＬに、攪拌しつつ約３ｇのＥＤＴＡ、約15ｇの塩化ナトリウム 、約７ｇのリン酸一ナトリウム、約50ｇのトレハロース、165ｍｇ／ｍＬの最終 濃度を提供するための約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐ ｍｓにするための約0.75ｍ Ｌのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液、そして約30ｇの 牛血清アルブミンを加える。ｐＨを5.5に調製し、精製水によって総量を１Ｌに 調節する。最終のマトリックスを濾過しそして凍結乾燥する。１Ｌの復元希釈液 を、水溶液中で約65ｇのアルブミン、25ｇの塩化ナトリウム及び0.4ｇのＮＡＣ （プロテアーゼ阻害剤）及び約２ｍＬの25％アジ化ナトリウム溶液を合わせるこ とによって調製する。 実施例３較正標準／対照マトリックスの調製 精製水約700ｍＬに、約５ｇのＥＤＴＡ、約50ｇの塩化ナトリウム、約７ｇの リン酸一ナトリウム、約0.14ｇのＮＡＣ、最終濃度165ｍｇ／ｍＬを与えるため の約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐｍｓを与えるための 約0.75ｍＬのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液、約95ｇ のプロテアーゼ不含牛血清アルブミンを加える。ｐＨを6.5に調整し、精製水に よって総量を１Ｌに調節する。最終マトリックスは、無菌濾過してよい。 実施例４組換えタンパク質を用いた較正標準の調製 約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照 を作るのに十分な量の組換えトロポニンＩを加えることにより、ポリプロピレン の実験器具中で、ヒト組換えトロポニンＩの原液を調製した。 １つの実験においては、トロポニンＩ溶液は、100μｇ／ｍＬの十分量の未精 製組換えトロポニンＩ溶液を次のマトリックスに加え ることによって調製した： 正常ヒト血清、血漿、及び実施例１に記載したのと同様なマトリックス。 各マトリックスにつき、組換えトロポニンＩの100ｎｇ／ｍＬ溶液の最終液量 は15ｍＬであった。組換えトロポニン１は、次の配列： ＭＡＤＧＳＳＤＡＡＲＥＰＲＰＡＰＡＰＩＲＲＲＳＳＮＹＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫ ＫＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫＱＥＬＥＲＥＡＥＥＲＲＧＥＫ ＧＲＡＬＳＴＲＣＱＰＬＥＬＴＧＬＧＦＡＥＬＱＤＬＣＲＱＬＨＡＲＶＤＫＶＤ ＥＥＲＹＤＩＥＡＫＶＴＫＮＩＴＥＩＡＤＬＴＱＫＩＦＤＬＲＧＫＦＫＲＰＴＬ ＲＲＶＲＩＳＡＤＡＭＭＱＡＬＬＧＡＲＡＫＥＳＬＤＬＲＡＨＬＫＱＶＫＫＥＤ ＴＥＫＥＮＲＥＶＧＤＷＲＫＮＩＤＡＬＳＧＭＥＧＲＫＫＫＫＦＥＥＳ（配列番 号１）を有し且つ、６個のヒスチジンのカルボキシ末端テールと、アミノ末端に ファージＴ６遺伝子10リーダー配列からの７個のアミノ酸配列とを含んでいる。 Vallins W.J．et al，Molecular cloning f human cardiac troponin I using p olymerase chain reaction ，FEBS LETTERS: Vol．270，No.1，2 September 1990 をも参照。 これら３つのトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃に貯蔵し、安定性 につき評価した。評価の各日において、各トロポニンＩ溶液の部分量を、Stratu s II Fluorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Anal yzerは、Dade International Inc．によって販売されている。この分析器の及び イムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国 特許第14,517,288及びGiegle et al，Clinical Chemistry 28: 18914-1898（198 2）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニ ンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定 される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗 体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ −抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体 は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含 有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分 （ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。 評価の結果は図１に見ることができる。図１に見ることができるように、本発 明のマトリックスは、正常ヒト血清又は血漿に比してトロポニンＩ分析対照に対 する一層の安定性を提供した。 実施例５組換えにより製造されたペプチドを用いた較正標準の調製 約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照 を作るのに十分な量の組換えトロポニンＩペプチドを加えることにより、ポリプ ロピレンの実験器具中でヒト組換えトロポニンＩペプチドの原液を調製した。 １つの実験においては、トロポニンＩの溶液は、配列 ＡＤＧＳＳＤＡＡＲＥＰＲＰＡＰＡＰＩＲＲＲＳＳＮＹＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫ ＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫＱＥＬＥＲＥＡＥＥＲＲＧＥＫＧ ＲＡＬＳＴＲＣＱ（配列番号２）を有し且つ、６個のヒスチジンのカルボキシ末 端テールと、アミノ末端に ファージＴ６遺伝子10リーダー配列からの７個のアミノ酸配列とを含んでいる組 換えトロポニンＩの組換え80アミノ酸ペプチド（Vallins W.J．et al，Molecula r cloning f human cardiac troponin I using polymerase chain reaction ，FE BS LETTERS: Vol．270，No.1，2 September 1990をも参照。）を、7500ｎｇ／ｍ Ｌで次のマトリックス： 正常ヒト血清、処理ヒト血漿、血漿及び実施例１に記載のものと同様のマトリ ックス に、各マトリックス中組換えトロポニンＩペプチドの100ｎｇ／ｍＬ溶液を与え るに十分な量で加えることによって調製した。 これら４種のトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃にて貯蔵し、安定 性につき評価した。評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II F luorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは 、Dade International Inc．によって販売されている。この分析器の及びイムノ アッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第 4,517,288及びGiegle et al，Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参 照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等の ような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。 トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫 学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロ ポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロ ポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基 質洗浄液が反応区域に加えられる。前面 蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変 化速度を測定する。 評価の結果は図２に見ることができる。図２に見ることができるように、本発 明のマトリックスは、正常ヒト血清（ＮＨＳ）、処理ヒト血漿（ＰＨＰ）又は血 漿に比してトロポニンＩ分析対照に対する一層の安定性を提供した。 実施例６合成ペプチドを用いた較正標準の調製 約０乃至50ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を 作るのに十分な量のペプチドを加えることによって、ポリプロピレンの実験器具 内でトロポニンＩの合成ペプチドの原液を調製する。 ある実験においては、原液濃度（精製水中）1.4ｍｇ／ｍＬの配列 ＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫＱＥＬ（ 配列番号３）を有するトロポニンＩの合成ペプチドを、次のマトリックス： 正常ヒト血清、血漿、処理ヒト血漿、合成マトリックス（ｐＨ7.6、100ｍＭト リス、150ｍＭ塩化ナトリウム、0.1％ゼラチン、２％ＢＳＡ、0.1％アジ化ナト リウム及び0.1％Ｚｏｎｙ１蛍光界面活性剤（ＤＸＭＣ）を含有する。）、及び 実施例１に記載したのと同様のマトリックスに、各マトリックス中50ｎｇ／ｍＬ のトロポニンＩ溶液及び10ｎｇ／ｍＬトロポニンＩ溶液を提供するに十分な量で 加えることによって調製した。 これら４種のトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃にて貯蔵し、安定 性につき評価した。評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II F luorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは 、Dade International Inc．によって販売されている。この分析器の及びイムノ アッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第 4,517,288及びGiegle et al，Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参 照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等の ような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。 トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫 学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロ ポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロ ポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基 質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。 評価の結果は図３及び４に見ることができる。図３及び４に見ることができる ように、本発明のマトリックスは、正常ヒト血清、処理ヒト血漿（ＰＨＰ）、合 成塩基ＤＸＭＣに比してトロポニンＩ分析対照類縁体に対する一層の安定性を提 供した。 実施例７合成ペプチドを用いた較正標準の調製 約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照 を与えるに十分な量のペプチドを加えることによって 、ポリプロピレンの実験器具内においてトロポニンＩの合成ペプチドの原液を調 製する。 ある実験においては、14.0μｇ／ｍＬのトロポニンＩ溶液が、配列： ＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫＱＥＬ（ 配列番号４）を有するトロポニンＩ配列を、次のマトリックス： 正常ヒト血清 、血漿、及び実施例１に記載したのと（マトリックスのｐＨを5.5に調製したこ とを除き）同様のマトリックスに、各マトリックス中3.0ｍＬの100ｎｇ／ｍＬの トロポニンＩ溶液を与えるに十分な量で加えることによって、調製された。加え て、約3.5ｍｇ／ｍＬの濃度でＥＤＴＡが各マトリックスに加えられた。 第２の組の溶液を、溶液が、680ｎｇ／ｍＬのペプスタチン(PEPSTATIN)及び20 8μｇ／ｍＬのフッ化アミノエチルベンゼンスルホニルよりなるプロテアーゼ阻 害剤カクテルをも含むことを除いて、上記と同様にして調製した。 これら６種のトロポニンＩの部分量を37℃に貯蔵し、安定性につき評価した。 評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II Fluorometric Analyz erによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade Internation al Inc．によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理 については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegl e et al，Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、 蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニン Ｉ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定さ れる。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体 へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ− 抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は 、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有 する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。 評価の結果は図５及び６に見ることができる。図５及び６に見ることができる ように、本発明のマトリックスは、プロテアーゼ阻害剤を含む又は含まない正常 ヒト血清、又は血漿に比してトロポニンＩ分析対照類縁体に対する一層の安定性 を提供した。 実施例８トロポニンＩ較正標準及び対照を用いたイムノアッセイの実施 約０乃至50ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を 与えるに十分な量のペプチドを加えることにより、ポリプロピレンの実験器具内 において、トロポニンＩの合成ペプチドの原液を調製する。 ある実施例においては、1.4ｍｇ／ｍＬの原液濃度の配列： ＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫＱＥＬ（ 配列番号５）を有するトロポニンＩの合成ペプチドを、実施例１に記載したのと 同様のマトリックスに、次の濃度を有するトロポニンＩ較正標準溶液を製造する に十分な量で加えることによって、調製した： ０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、15ｎｇ／ｍＬ、25ｎｇ／ｍＬ、 及び50ｎｇ／ｍＬ。 対照は、同様にして、約４ｎｇ／ｍＬ、20ｎｇ／ｍＬ及び35ｎｇ／ｍＬの対照 溶液を与えるように調製した。 各トロポニンＩ溶液の部分量を凍結貯蔵した。凍結した溶液を融解させ、そし て較正曲線を作った。上に論じたようにして調製した対照及び正常ヒト血漿から 調製した対照もまた評価した。正常ヒト血清対照は、低対照については2.1〜2.9 ｎｇ／ｍＬ、そして高対照については15.9〜21.5であった。各トロポニンＩ溶液 の各々について２つのサンプルをStratus II Fluorometric Analyzerによって分 析し、そして較正曲線を作った。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade I nternational Inc．によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイ の作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,28 8及びGiegle et al，Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この 分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分 析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニ ンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結 合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ 抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩ に結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液 が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として 指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。 ミリボルト／分（ｍｖｍ）で表した較正の結果を、表１に見ることができ、そ して較正曲線は図６に示されている。 対照の回収は表２に示されている。 実施例９ＣＫ−ＭＢ較正標準／対照の調製 約０乃至125ｎｇ／ｍＬの範囲のＣＫ−ＭＢ濃度を有する較正標準又は対照を 与えるのに十分な量のＣＫ−ＭＢを加えることによって、ＣＫ−ＭＢの原液を調 製する。 次の濃度： ０、４、10、25、60及び125ｎｇ／ｍＬを有するＣＫ−ＭＢの較 正溶液を与えるのに十分な量のＣＫ−ＭＢを、実施例１に記載されたのと同様の マトリックスに加えることによって、ＣＫ−ＭＢの溶液を調製する。対照を、同 様の仕方で調製する。 実施例１０トロポニンＴ較正標準／対照の調製 ０乃至1２ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＴ濃度を有する較正標準又は対照を 与えるに十分な量のトロポニンＴを加えることによって、トロポニンＴの原液を 調製する。 次の濃度： ０、１、２、４、８及び12ｎｇ／ｍＬを有するトロポニンＴの較 正標準溶液を与えるに十分な量のトロポニンＴを、実施例１に記載されたのと同 様のマトリックスに加えることによって、トロポニンＴの溶液を調製する。対照 を、同様の仕方で調製する。 実施例１１４℃における較正標準の安定性 実施例６において調製された較正標準と同様にして調製された較正標準の安定 性を決定するために試験を行った。イムノアッセイキット（較正標準を含む）を 調製し、約４℃にて貯蔵し、Stratus II Fluorometric Analyzerによって評価し た。対照及び患者プール（共に−70℃に貯蔵され使用前に新たに解凍した）が予 測される範囲 で回収されるか否かを決定するために、評価の各日に、未開封の較正標準及び対 照及び患者プールを用いて較正曲線を作った。対照及び患者プールの範囲は、各 対照レベル及び患者プールの少なくとも80の複製を得ることによって予め確立し てあった。対照限度は、＋／−２標準偏差又は平均の15％のうちの大きい方とし た。アッセイ要素の全て、従って較正標準は、対照及び患者プールの各々につい て２つの測定が12％以内であり且つこれら２つの測定の平均が計算された範囲内 に入るならば、許容し得ると決定された。アッセイキット、従って較正標準は、 少なくとも60日間は許容し得ることが見出された。同様にして実施した第２の試 験がこの結果を確認した。25 ℃における較正標準の安定性 キット試薬が４℃ではなく25℃にて貯蔵されたことを除き、実施例１１に記載 したのと同様にして２つの試験を実施した。キット、従って較正標準は、少なく とも７〜1４日間は安定であることが見出された。 実施例１３２乃至８℃／−70℃における較正標準の安定性 ２ｎｇ／ｍＬ及び25ｎｇ／ｍＬの較正標準が70℃でも貯蔵されたことを除き、 実施例１１に記載したのと同様にして試験を実施した。凍結した較正標準からの 回収が測定され、４℃で貯蔵された較正標準と比較された。２〜８℃／−70℃の 比率が求められた。−70℃における較正標準は、少なくとも60日間安定であるこ とが見出された。同様にして実施した第２の試験は、この結果を確認した。 別の試験において、−70℃にて貯蔵された較正標準から作られた 較正曲線に対して患者プール（上記実施例１１に記載したのと同様にして貯蔵さ れ使用され、やはり実施例１１に記載した回収範囲を有する）の回収を測定した 。較正標準は、少なくとも100日間安定であることが見出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チン，ブルース アメリカ合衆国33176フロリダ、マイアミ、 サウスウエス112アベニューサークル 11845 (72)発明者 バウアー，ロジャー アメリカ合衆国33326フロリダ、フォート ローダーデイル、フェアファックスコート 1225

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．緩衝剤； ｂ．還元剤； ｃ．安定化タンパク質； ｄ．キレート剤；および ｅ．塩 を含んでいるタンパク質およびタンパク質フラグメントまたは検体を安定化す るための液体組成物。 ２．検体は心臓マーカーまたはそのフラグメントである請求項１の組成物。 ３．検体はトロポニンまたはそのフラグメントである請求項１の組成物。 ４．検体はトロポニンＩまたはそのフラグメントである請求項１の組成物。 ５．検体は である請求項１の組成物。 ６．検体は である請求項１の組成物。 ７．ブロッキング剤をさらに含んでいる請求項１の組成物。 ８．増嵩剤をさらに含んでいる請求項１の組成物。 ９．凍結乾燥されている請求項８の組成物。 10．凍結されている請求項１の組成物。 11．タンパク質安定化剤はアルブミンである請求項１の組成物。 12．アルブミンはプロテアーゼ不含である請求項１１の組成物。 13．ブロッキング剤はゼラチンである請求項７の組成物。 14．増嵩剤は、トレハロース、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノ ース、マルトース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオー ス、メルビオース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マ ルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースよりなる群か ら選ばれる請求項８の組成物。 15．ａ．緩衝剤； ｂ．Ｎ−アセチルシステイン、２−アミノエタンチオール、２−メルカプト エタノール、２−メルカプトエチルアニリンおよびジチオスレイトールよりなる 群から選ばれた還元剤； ｃ．アルブミン、卵アルブミンおよびカゼインよりなる群から選ばれた安定 化タンパク質； ｄ．エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ），エ チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ），クエン酸塩またはシュウ酸塩よりなる 群から選ばれたキレート剤；および ｅ．塩 を含んでいるタンパク質およびタンパク質フラグメントまたは検体を安定化す るための組成物。 16．ブロッキング剤をさらに含んでいる請求項１５の組成物。 17．増嵩剤をさらに含んでいる請求項１５の組成物。 18．凍結乾燥されている請求項１７の組成物。 19．冷凍されている請求項１５の組成物。 20．タンパク質安定化剤はアルブミンである請求項１５の組成物。 21．アルブミンはプロテアーゼ不含である請求項２０の組成物。 22．ブロッキング剤はゼラチンである請求項１７の組成物。 23．増嵩剤はトレハロース、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノー ス、マルトース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオース 、メルビオース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マル トペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースよりなる群から 選ばれる請求項１７の組成物。 24．タンパク質またはタンパク質フラグメントを安定化するための非ヒト血清系 水溶液を調製する方法であって 緩衝剤、還元剤、安定化タンパク質、キレート 剤および塩の有効量を溶液中で混合することを特徴とする前記方法。 25．緩衝剤、還元剤、安定化タンパク質、キレート剤および塩の有効量を溶液中 で混合することよりなる方法によって調製された、タンパク質またはタンパク質 フラグメントを安定化するための非ヒト血清系溶液。