JPH10327884A - 新規ＬｉｃＤ２ - Google Patents

新規ＬｉｃＤ２

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JPH10327884A
JPH10327884A JP10090549A JP9054998A JPH10327884A JP H10327884 A JPH10327884 A JP H10327884A JP 10090549 A JP10090549 A JP 10090549A JP 9054998 A JP9054998 A JP 9054998A JP H10327884 A JPH10327884 A JP H10327884A
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JP
Japan
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polypeptide
polynucleotide
seq
licd2
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Withdrawn
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JP10090549A
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Michael A Lonetto
マイケル・アーサー・ロネット
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SmithKline Beecham Corp
Original Assignee
SmithKline Beecham Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規licＤ２ポリペプチドおよび該ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドが望まれている。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対
して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ドからなる単離ポリヌクレオチド；licＤ２ポリペプチ
ドおよびlicＤ２ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドおよび組換え技法により該ポリペプチドの製法を
提供するものである。さらには、抗菌化合物についてス
クリーニングするのにlicＤ２ポリペプチドを利用する
方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本願は１９９７年２月２８日付け出願の米
国仮特許出願６０／０３９２２５の優先権の利益を主張
するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造および
使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニ
スト、ならびにその使用に関する。特に、本発明は、li
cＤファミリー（以下、「licＤ２」と称する）の新規な
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００３】
【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトに，例
えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染の
ごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の疾患を引き起
こすことが知られている。ストレプトコッカス属の単離
から１００年以上も経過しているため、ストレプトコッ
カス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、
より詳細な研究が為された微生物の一つである。例え
ば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという初期の見解の
大部分は、この微生物を用いたGriffithならびに、Aver
y、MacleodおよびMcCartyの研究にて断言された。スト
レプトコッカス・ニューモニエに関する研究は膨大であ
るにも関わらず、この微生物の毒性に関しては多くの疑
問が残されている。抗生物質の開発のための標的として
ストレプトコッカス属の遺伝子および遺伝子産物を用い
るのはとりわけ好ましいことである。
【０００４】ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の
頻度は過去２、３０年間に劇的に上昇している。これは
多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人
の母集団の増加に起因している。いくつかのまたは全て
の標準的な抗生物質に対して耐性を有するストレプトコ
ッカス・ニューモニエ株を単離することはもはやめずら
しいことではない。この現象がこの生物に対する新しい
抗菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形
成した。
【０００５】抗生物質活性に関して化合物をスクリーニ
ングするために有用であるという利点を有した、本発明
のlicＤ２具体例のごとき因子に対する要望があること
は明白である。かかる因子はまた、感染、機能不全およ
び疾患の発生病理における役割を決定するのに有用であ
る。感染、機能不全および疾患を予防、改善または治癒
するための方法を見出すために、かかる因子ならびにそ
のアンタゴニストおよびアゴニストを同定および特徴づ
けする必要もある。本発明のある種のポリペプチドは、
既知のlicＤタンパク質とアミノ酸配列相同性を有す
る。ＮＣＢＩ非縮重性タンパク質データベース（gi/107
4969/pir//E64128およびgi/1574382（U32829）；ＴＩＧ
Ｒストレプトコッカス・ニューモニエ配列（http：//ww
w．tigr．org/，Entry4179；およびWeiserら、Infect I
mmun.，65（3），943-50（1997）を参照のこと。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、表１[配列番号２または４]に示すアミノ酸配列と、
licＤタンパク質などの他のタンパク質の既知のアミノ
酸配列（複数でも可）の間の相同性により、新規licＤ
２ポリペプチドと同定されたポリペプチドを提供するこ
とである。本発明のさらなる目的は、licＤ２ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書にお
いてlicＤ２と称するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のとりわけ好まし
い具体例では、該ポリヌクレオチドは、完全長の遺伝子
を含む、表１［配列番号１または３］に示す配列を有し
てなるlicＤ２ポリペプチドをコードする領域、または
その変種を有してなる。本発明の別の特に好ましい具体
例には、表１[配列番号２または４]のアミノ酸配列を有
してなるストレプトコッカス・ニューモニエに由来する
新規licＤ２タンパク質またはその変種がある。本発明
のさらなる態様として、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡを含め、licＤ２、特にストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ・licＤ２をコードする単離核酸分子を提供す
る。本発明のさらなる具体例は、生物学的、診断学的、
予防的、臨床的または治療的に有用なその変種、および
そのものを含んでなる組成物を包含する。
【０００８】本発明の別の態様によれば、治療または予
防目的で、特に遺伝的免疫における本発明のポリヌクレ
オチドの使用を提供する。本発明の特に好ましい具体例
には、licＤ２の天然の対立遺伝子変種およびそれによ
りコードされるポリペプチドがある。本発明の別の態様
として、本明細書でlicＤ２と称するストレプトコッカ
ス・ニューモニエの新規なポリペプチド、ならびに生物
学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用な
その変種、およびそのものを含んでなる組成物を提供す
る。本発明のとりわけ好ましい具体例には、licＤ２遺
伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるlicＤ２ポ
リペプチドの変種がある。本発明の好ましい具体例にお
いて、前記のlicＤ２ポリペプチドの製造方法を提供す
る。
【０００９】本発明のさらに別の態様によれば、例え
ば、抗体を含め、抗菌剤として有用な、かかるポリペプ
チドに対する阻害剤が提供される。本発明の特定の好ま
しい具体例によれば、licＤ２発現を評価し、疾病を治
療し、遺伝的変異を評価し、生物にlicＤ２ポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドを投与して細菌、特にストレ
プトコッカス・ニューモニエ細菌に対する免疫応答を生
じさせるための物質、組成物および方法が提供される。
本発明のこのおよび他の態様の特定の好ましい具体例に
よれば、licＤ２ポリヌクレオチド配列に、特にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チドが提供される。本発明の特定の好ましい具体例で
は、licＤ２ポリペプチドに対する抗体を提供する。
【００１０】本発明の他の具体例では、本発明のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドに結合し、そうでなけれ
ば相互作用し、その活性を阻害または活性化する化合物
を同定する方法であって、スクリーニングすべき化合物
が本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合
し、そうでなければ相互作用できる条件下で、該ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドを該化合物と接触させ
て、該化合物との結合まあは相互作用を評価し（かかる
結合または相互作用はポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドと化合物との結合または相互作用に応答して検出可
能なシグナルを提供できる２次成分に関連するものであ
る）；化合物と該ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
との結合または相互作用から生じるシグナルの有無を検
出することにより、化合物がポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドと結合するか、そうでなければ相互作用し、
その活性を活性化または阻害するかどうかを決定するこ
とからなる方法を提供する。
【００１１】本発明のさらに別の態様によれば、licＤ
２アゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくは静菌性
または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストを提供す
る。本発明のさらなる態様では、licＤ２ポリヌクレオ
チドまたはlicＤ２ポリペプチドを有してなる、細胞ま
たは多細胞生物に投与するための組成物が提供される。
【００１２】本発明のもう一つ別の態様において、配列
番号１または３の配列を有してなるポリヌクレオチド；
配列番号２または４の配列を有してなるポリペプチド；
少なくとも１つの配列が配列番号１または３の配列を有
してなる一連のポリヌクレオチド配列；少なくとも１つ
の配列が配列番号２または４の配列を有してなる一連の
ポリペプチド配列；配列番号１または３の配列を有して
なるポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配列番
号２または４の配列を有してなるポリペプチド配列をコ
ードするポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配
列番号１の配列を有してなるポリヌクレオチド；配列番
号２の配列を有してなるポリペプチド；少なくとも１つ
の配列が配列番号１の配列を有してなる一連のポリヌク
レオチド配列；少なくとも１つの配列が配列番号２の配
列を有してなる一連のポリペプチド配列；配列番号１の
配列を有してなるポリヌクレオチド配列を表すデータセ
ット；配列番号２の配列を有してなるポリペプチド配列
をコードするポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；からなる群より選択される要素をその上に記録した
コンピューター読み取り媒体が提供される。
【００１３】本発明のさらなる具体例は、相同性を同定
するためのコンピューターをベースとする方法であっ
て、配列番号１の配列を有してなるポリヌクレオチド配
列をコンピューター読み取り媒体に記録し、そのポリヌ
クレオチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程
からなる方法を提供する。本発明のさらなる具体例は、
相同性を同定するためのコンピューターをベースとする
方法であって、配列番号２の配列を有してなるポリペプ
チド配列をコンピューター読み取り媒体に記録し、その
ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチド
またはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工
程からなる方法を提供する。
【００１４】本発明のさらなる具体例は、ポリヌクレオ
チドのアセンブリーに関するコンピューターをベースと
する方法であって、配列番号１の配列を有してなる第１
のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み取り媒体
に記録し、その第１のポリヌクレオチド配列と第２のポ
リヌクレオチド配列の間にある少なくとも１つの重複領
域をスクリーニングする工程からなる方法を提供する。
開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更およ
び修飾は、以下の記載および本明細書のその他の部分を
読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００１５】
【発明の実施の態様】本発明は、以下により詳細に記載
されるような新規licＤ２ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドに関する。特に、本発明は、licＤポリペプチ
ドとアミノ酸配列相同性により関連付けられる、ストレ
プトコッカス・ニューモニエの新規licＤ２のポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特
に、各々、表１にて配列番号１および配列番号２で示さ
れるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するlicＤ２
に関する。
【００１６】表１ licＤ２ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
【００１７】 （Ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエlicＤ２ポリンクレオチド配列由来の 配列［配列番号１］ 5'-ATGCAATATTTAGAAAAAAAAGAAATTAAAGAAATTCAACTAGCCCTGCTGGACTATATT GATGAGACTTGTAAGAAACATGATATTCCTTATTTTCTCAGTTATGGAACCATGCTTGGA GCCATCCGCCACAAAGGTATGATTCCTTGGGATGATGATATTGATATTTCCCTTTATCGT GAGGATTATGAGCGTTTACTGAAGATTATTGAAGAAGAAAATCACCCTCGCTACAAGGTT CTTTCCTACGATACATCTTCTTGGTACTTCCATAATTTCGCATCGATTTTGGACACTTCT ACTGTTATAGAAGACCATGTTAAGTACAAGCGTCATGATACCAGCCTTTTCATCGATGTC TTCCCAATTGATCGATTTACAGACTTGAGCATTGTCGACAAGAGCTATAAGTATGTGGCT CTTCGTCAACTAGCTTATATCAAAAAATCACGAGCAGTTCACGGTGATAGCAAACTAAAA GATTTTCTTAGATTATGTAGCTGGTACGCTCTCCGATTTGTCAATCCTCGCTACTTTTAC AAGAAAATTGATCAACTAGTCAAAAATGCTGTAACCAACACTCCTCAATATGAAGGAGGA GTTGGGATCGGTAAGGAAGGGATGAAAGAAATCTTCCCAGTTGATACCTTTAAAGAACTG ATTTTAACTGAGTTTGAGGGCCGTATGTTGCCTGTTCCCAAAAAATATGACCAATTTTTA ACCCAGATGTATGGCGATTATATGACACCACCATCAAAAGAAATGCAAGAGTGGTATAGT CATAGCATTAAAGCTTATCGCAAAAACTGA -3'
【００１８】 （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列より推定されるストレプトコッカス・ニュ ーモニエ・licＤ２ポリペプチド配列［配列番号２］ NH2-MQYLEKKEIKEIQLALLDYIDETCKKHDIPYFLSYGTMLGAIRHKGMIPWDDDIDISLYR EDYERLLKIIEEENHPRYKVLSYDTSSWYFHNFASILDTSTVIEDHVKYKRHDTSLFIDV FPIDRFTDLSIVDKSYKYVALRQLAYIKKSRAVHGDSKLKDFLRLCSWYALRFVNPRYFY KKIDQLVKNAVTNTPQYEGGVGIGKEGMKEIFPVDTFKELILTEFEGRMLPVPKKYDQFL TQMYGDYMTPPSKEMQEWYSHSIKAYRKN -COOH
【００１９】 （Ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニエ・licＤ２・ＯＲＦ配列を有してなる ポリヌクレオチド配列［配列番号３］ 5'-ATGCAATATTTAGAAAAAAAAGAAATTAAAGAAATTCAACTAGCCCTGCTGGACTATATT GATGAGACTTGTAAGAAACATGATATTCCTTATTTTCTCAGTTATGGAACCATGCTTGGA GCCATCCGCCACAAAGGTATGATTCCTTGGGATGATGATATTGATATTTCCCTTTATCGT GAGGATTATGAGCGTTTACTGAAGATTATTGAAGAAGAAAATCACCCTCGCTACAAGGTT CTTTCCTACGATACATCTTCTTGGTACTTCCATAATTTCGCATCGATTTTGGACACTTCT ACTGTTATAGAAGACCATGTTAAGTACAAGCGTCATGATACCAGCCTTTTCATCGATGTC TTCCCAATTGATCGATTTACA -3'
【００２０】 （Ｄ）この表のポリヌクレオチドＯＲＦ配列より推定されるストレプトコッカス ・ニューモニエlicＤ２ポリペプチド配列［配列番号４］ NH2-MQYLEKKEIKEIQLALLDYIDETCKKHDIPYFLSYGTMLGAIRHKGMIPWDDDIDISLYR EDYERLLKIIEEENHPRYKVLSYDTSSWYFHNFASILDTSTVIEDHVKYKRHDTSLFIDV FPIDRFT -COOH
【００２１】寄託材料 ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３株を
含む寄託株を、１９９６年４月１１日に、スコットラン
ド、ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャードライブ
２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド
（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に、ＮＣＩＭＢ
受託番号４０７９４の下で寄託した。その寄託株は寄託
の際にストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９
３と命名された。１９９６年４月１７日に、同様に、エ
シェリキア・コリ中のストレプトコッカス・ニューモニ
エ０１００９９３ＤＮＡライブラリーがＮＣＩＭＢに寄
託され、受託番号４０８００が与えられた。このストレ
プトコッカス・ニューモニエ寄託株を、本明細書では
「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称する。
【００２２】寄託株は完全長のlicＤ２遺伝子を含んで
いる。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列ならび
にそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致も
調節するものである。寄託株の寄託は、特許手続き上の
微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下
で行われている。特許が発行されると何ら制限または条
件もなく、最終的に株は分譲される。寄託株は当業者の
便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の
下に要求されるような、寄託が実施可能要件であること
を承認するものではない。
【００２３】寄託株、それに由来の化合物を製造、使用
または販売するには、ライセンスが必要であるが、その
ようなライセンスはここで付与されるものではない。本
発明の一の態様は、寄託株に含まれるストレプトコッカ
ス・ニューモニエ０１００９９３株により発現可能な成
熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供するこ
とである。さらには、本発明は寄託株中のＤＮＡのlic
Ｄ２ヌクレオチド配列およびそれによりコードされるア
ミノ酸配列を提供する。また、本発明は寄託株より単離
されたlicＤ２ポリペプチド配列およびそれに由来のア
ミノ酸配列を提供する。
【００２４】ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、表１［配列番号２または４］
のポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプチド）ならび
に、特に、licＤ２の生物活性を有し、表１［配列番号
１または３］のポリペプチドまたはその該当部分と少な
くとも７０％の同一性、好ましくは表１［配列番号２ま
たは４］のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性、
より好ましくは表１［配列番号２または４］のポリペプ
チドと少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましく
は表１［配列番号２または４］のポリペプチドと少なく
とも９５％の同一性を有するポリペプチドおよびフラグ
メントを包含し、さらに、一般に、少なくとも３０個の
アミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０個のアミノ
酸を含むポリペプチドの部分を有するかかるポリペプチ
ドの部分も包含する。
【００２５】本発明はまた、
【数１】Ｘ−（R1）m−（R2）−（R3）n−Ｙ
【００２６】［式中、アミノ末端のＸは水素または金属
であり、カルボキシル末端のＹは水素または金属であ
り、R1およびR3はいずれかのアミノ酸残基であり、ｍは
１〜１０００の整数または０であり、ｎは１〜１０００
の整数または０であり、R2は本発明のアミノ酸配列、特
に表１のアミノ酸配列を意味する］で示されるポリペプ
チドを包含する。上記の式中、R2はアミノ末端残基がそ
の左側でR1に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右
側でR3に結合するように方向づけられる。ｍおよび／ま
たはｎが１より大きい場合、いずれかのＲ基で表される
アミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマ
ーのいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好まし
い。
【００２７】フラグメントは、その全体が、上記したポ
リペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが、一部と同
じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドであ
る。licＤ２ポリペプチドと同様、フラグメントは「自
立している」であるか、またはそれらが一の部分または
領域、最も好ましくは単一の連続した領域、単一のより
大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチド
の中に含まれていてもよい。
【００２８】好ましいフラグメントは、例えば、表１
［配列番号２または４］のアミノ酸配列または、アミノ
末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端
を含む連続した一連の残基のような、その変種の一部を
有する末端切断ポリペプチドを包含する。宿主細胞、特
に、ストレプトコッカス・ニューモニエ中の本発明のポ
リペプチドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリ
ックスおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシー
トおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形
成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水
領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可
変領域、界面形成領域、基質結合領域、および高抗原指
数領域を含んでなるフラグメントのような、構造的また
は機能的属性によって特徴づけられるフラグメントもま
た好ましいフラグメントである。
【００２９】生物学的に活性なフラグメントも好ましい
フラグメントである。生物学的に活性なフラグメント
は、類似活性または改良活性を有するもの、または望ま
しくない活性が減少したフラグメントを含め、licＤ２
の活性を媒介するフラグメントである。さらに、動物、
特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメ
ントも含まれる。特に好ましいものは、ストレプトコッ
カス・ニューモニエの生存に必須の機能または個体、特
に、ヒトにおける疾患の開始または原因維持能力を与え
る酵素群の受容体またはドメインからなるフラグメント
である。本発明のポリペプチドのフラグメントである変
種は、ペプチド合成法により対応する完全長のポリペプ
チドの製造に使用することができる。したがって、これ
らの変種は、本発明の完全長ポリペプチドを製造するた
めの中間体として使用できる。
【００３０】アミノ酸に関する標準的１文字および３文
字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘａａ」なる語もま
た、本発明のあるポリペプチドを記載するのに用いられ
る。「Ｘ」および「Ｘａａ」は、２０種の天然に存在す
るいずれかのアミノ酸がポリペプチド配列のそのような
指定する位置にあってもよいことを意味する。
【００３１】ポリヌクレオチド本発明のもう一つの態様
は、表１［配列番号２または４］の推定アミノ酸配列を
有するlicＤ２ポリペプチドをコードする単離ポリヌク
レオチド、それに密接に関連するポリヌクレオチドおよ
びそれらの変種に関する。表１［配列番号１または３］
に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の情報を
使用し、出発材料としてストレプトコッカス・ニューモ
ニエ０１００９９３を使用し、細菌からの染色体ＤＮＡ
フラグメントをクローニングし、配列決定し、つづいて
完全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリ
ーニング法を使用して、licＤ２ポリペプチドをコード
する本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。例
えば、表１［配列番号１または３］に示す配列のような
本発明のポリヌクレオチド配列を得るには、典型的に
は、エシェリキア・コリまたは他の適当な宿主中のスト
レプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３の染色体
ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分配列から由来
する放射標識したオリゴヌクレオチド、好ましくは１７
倍量以上の長さのオリゴヌクレオチドでプローブする。
ついで、該プローブと同じＤＮＡを有するクローンをス
トリンジェントな条件を使用して区別できる。該オリジ
ナル配列から設計された配列決定プライマーで同定され
た個々のクローンを配列決定することにより、該配列を
両方の方向に伸長し、完全長を決定することが可能であ
る。都合よくは、プラスミド・クローンから調製された
変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定を行う。適当
な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.およびSambrook
ら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd E
d.；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York（1989）（特に、ハイブリダイゼ
ーションによるスクリーニング１.９０および変性二本
鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）によ
り記載されている。例えば、表１［配列番号１または
３］に示すポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・
ニューモニエ０１００９９３から由来するＤＮＡライブ
ラリー中で見いだしたものである。
【００３２】表１［配列番号１または３］のＤＮＡ配列
は、表１［配列番号２または４］に示す概数のアミノ酸
残基を有し、公知のアミノ酸残基の分子量から計算でき
る推定分子量を有するタンパク質をコードするオープン
リーディングフレームを有する。ヌクレオチド番号１
と、配列番号１のヌクレオチド番号８０８で始まる停止
コドンの間の配列番号１のポリヌクレオチドが、配列番
号２のポリペプチドをコードする。本発明のlicＤ２
は、licＤファミリーの他のタンパク質に構造的に関連
付けられる。ＮＣＢＩ非縮重性タンパク質データベース
（gi/1074969/pir//E64128およびgi/1574382（U3282
9）；ＴＩＧＲストレプトコッカス・ニューモニエ配列
（http：//www．tigr．org/，Entry4179；およびWeiser
ら、Infect Immun.，65（3），943-50（1997）を参照の
こと
【００３３】本発明は、表１［配列番号１または３］の
コード配列と、その全長にわたって同一であるポリヌク
レオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟ポリペ
プチドまたはそのフラグメント用のコード配列自体なら
びにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロまたはプレプ
ロタンパク質配列をコードするコード配列のような他の
コード配列を有するリーディング・フレーム中の成熟ポ
リペプチドまたはフラグメントのコード配列を提供す
る。ポリヌクレオチドはまた、例えば、転写配列、非翻
訳配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ
を安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナ
ルおよび別のアミノ酸をコードする付加コード配列のよ
うな非コード５’および３’配列を含む、非コード配列
を含むが、これに限定するものではない。例えば、融合
ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードす
ることができる。本発明のある種の具体例において、マ
ーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）におい
て提供され、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（198
9）86：821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジ
ンペプチドであるか、またはＨＡタグである（Wilsoｎ
ら、Cell，37:767(1984)）。本発明のポリヌクレオチド
は、限定するものではないが、構造遺伝子および遺伝子
の発現を調節する天然に伴う配列からなるポリヌクレオ
チドを包含する。
【００３４】本発明の好ましい具体例は、表１の配列番
号１に示されるヌクレオチド１からヌクレオチド８０８
の直ぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレオチド
を含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドであ
り、それは共にlicＤ２ポリペプチドをコードする。
【００３５】本発明はまた、式：
【数２】Ｘ−（R1）m−（R2）−（R3）n−Ｙ
【００３６】［式中、分子の５’末端のＸは水素または
金属あるいはＹと一緒になって共有結合を形成し、分子
の３’末端のＹは水素または金属あるいはＸと一緒にな
って共有結合を形成し、R1およびR3は、各々、独立して
いずれかの核酸残基であり、ｍは１〜３０００の整数ま
たは０であり、ｎは１〜３０００の整数または０であ
り、R2は本発明の核酸配列、特に表１より選択される核
酸配列を意味する］で示されるポリヌクレオチドを包含
する。上記した式のポリヌクレオチド中、R2は５’末端
残基がその左側でR1に結合し、その３’末端残基がその
右側でR3に結合するように方向付けられる。ｍおよび／
またはｎが１より大きい場合、いずれかのＲ基で表され
る核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマー
のいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。
好ましい具体例において、ＸおよびＹが一緒になって共
有結合を形成する場合、前記した式のポリヌクレオチド
は閉鎖した環状ポリヌクレオチドであり、それはその式
が第２の鎖が相補性を有する第１の鎖を示す二本鎖ポリ
ヌクレオチドであり得る。もう一つ別の具体例におい
て、ｍおよび／またはｎは１と１０００の間の整数であ
る。
【００３７】本発明のポリヌクレオチドはストレプトコ
ッカス・ニューモニエから誘導されるのが最も好ましい
が、分類学上同じ属の生物より得ることも好ましい。ま
た、例えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。
本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド」なる用語は、本発明のポリペプチド、特
に、細菌性ポリペプチド、より詳しくは、表１［配列番
号２または４］に示すアミノ酸配列を有するストレプト
コッカス・ニューモニエ・licＤ２のポリペプチドをコ
ードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この
用語はコードおよび／非コード配列を含んでもよいさら
なる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一の連
続または非連続領域（例えば、組み込まれたファージま
たは挿入された配列またはエデティング（editing）に
より中断されている）を含むポリヌクレオチドを包含す
る。本発明はさらに、表１［配列番号２または４］の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードす
る、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関す
る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変
種は本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用でき
る。
【００３８】さらに好ましい具体例は、数個、わずか
な、５〜１０、１〜５、１〜３、２または１個あるいは
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加された表１［配列番号２または４］のli
cＤ２ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、licＤ２変
種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましく
は、licＤ２の特性、活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。
【００３９】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号２または４］に示すアミノ酸配列をを有する
licＤ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの
完全長にわたって少なくとも７０％の同一性を有するポ
リヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドに相
補性のポリヌクレオチドである。また、最も好ましいも
のは、licＤ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドと完全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有
する領域からなるポリヌクレオチドおよびそれと相補性
のポリヌクレオチドである。この点で、その同じものと
完全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するポ
リヌクレオチドが特に好ましく、中でも少なくとも９５
％の同一性を有するものが特に好ましい。さらには、少
なくとも９５％の同一性を有するものの中で少なくとも
９７％の同一性を有するものがより好ましく、中でも少
なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性を有す
るものが特に好ましい。少なくとも９９％の同一性を有
するものがより好ましい。好ましい具体例は、表１［配
列番号１または３］のＤＮＡによってコードされている
成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドである。
【００４０】さらに本発明は、本明細書にて上記した配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は特に、本明細書にて上記したポ
リヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用い
る場合、「ストリンジェントな条件」および「ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件」という語は、
ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５
％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ起こることを意味する。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件の一例として、５０％ホルムアル
デヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ ク
エン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（p
Ｈ７.６）、５ｘデンハート（Denhardt’s）溶液、１０
％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性切断サケ
精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、４２℃で一夜インキュ
ベーションし、ついでハイブリダイゼーション支持体を
０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙げられ
る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公知であ
り、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MA
NUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor, N.Y.（19
89）、特に、第11章に例示されている。
【００４１】本発明は、実質的に、配列番号１に示した
ポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブ
ラリーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下、配列番号１に示す該ポリヌクレオチド配列の配
列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリー
ニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得ること
ができるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ
ドを提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに
有用なフラグメントには、例えば、本明細書に記載する
プローブおよびプライマーが包含される。
【００４２】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ドの分析についてさらに説明するように、例えば、上記
したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーショ
ン・プローブとして使用し、licＤ２をコードする完全
長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、licＤ２遺
伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。そ
のようなプローブは、一般に、少なくとも１５塩基を有
してなるであろう。好ましくは、そのようなプローブは
少なくとも３０塩基からなり、少なくとも５０塩基を有
してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも３０
塩基を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、licＤ
２遺伝子のコード領域は、表１（配列番号１または３）
のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングしてオリゴヌク
レオチド・プローブを合成することにより単離できる。
ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する
標識したオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニング
し、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリ
ダイズするか決定する。
【００４３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、本明細書においてポリヌクレオチド分析に関し
てさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾
患に対する治療および診断の発見のための研究試薬およ
び研究材料として用いることができる。表１（配列番号
１または２または３または４）の配列から由来するオリ
ゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、本
明細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはＰＣＲ
に使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体
として、または部分的に感染組織において細菌中で転写
されるか否か測定する。そのような配列はまた、病因が
達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性
がある。
【００４４】また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるア
ミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟ポ
リペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運び、タンパク質の半減期を長くしたり、短くし
たり、あるいは分析または生産のためのタンパク質の操
作を容易にすることができる。インビボで一般的なよう
に、該付加アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパク質か
らプロセッシングにより除かれる。一またはそれ以上の
プロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前
駆体タンパク質は該ポリペプチドの不活性形でもよい。
プロ配列がそのような不活性前駆体から除かれると、一
般に活性化される。プロ配列の幾らかまたは全体を、活
性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプ
ロタンパク質と称される。
【００４５】核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を、本発明の特定のポ
リヌクレオチドを記載するのに用いることができる。
「Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作
用する場合、正確なリーディング・フレームを読み取る
場合で、Ｎがそのようなリディング・フレームにて成熟
前末端コドンを形成する効果を有する塩基でないことが
好ましい場合を除き、４種のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基の
いずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指定位置にあ
ることを意味する。
【００４６】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。
【００４７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの産生に関する。さらに無細胞翻訳系
を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して
かかるタンパク質を製造することができる。組換え体産
生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくは
それらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを取り
込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導
入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道
導入および感染のような、Davisら、BASIC METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY（1986）およびSambrookら、MOLECUL
AR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed. Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.
Y.（1989）のごとき複数の標準的研究室マニュアルに記
載されている方法によって行うことができる。
【００４８】適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（stre
ptococcus）、ブドウ球菌（staphylococcus）、腸球菌
（enterococcus）、大腸菌（E.coli）、ストレプトマイ
セス（streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtili
s）細胞のごとき細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギ
ルス（Aspergillus）細胞のごとき真菌細胞；ドロソフ
ィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodopte
ra）Ｓｆ９細胞のごとき昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C1
27、３T3、BHK、HEK293およびボーウェス（Bowes）メラ
ノーマ細胞のごとき動物細胞；および植物細胞を包含す
る。
【００４９】本発明のポリペプチド産生のために非常に
多様な発現系を使用することができる。かかる系は、と
りわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、
例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因
子由来、酵母染色体因子由来、バキュロウイルス、ＳＶ
４０のごときパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、
アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来の
ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプ
ラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベ
クターのごとき、それらの組み合わせに由来するベクタ
ーを包含する。発現系構築物は、発現を制御ならびに引
き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主に
おいてポリヌクレオチドを維持、増幅または発現し、お
よび／またはポリペプチドを発現するのに適した系また
はベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当
なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLON
ING，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術
のごとき、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかに
よって、発現系に挿入してもよい。
【００５０】翻訳されたタンパク質を、小胞体内腔、周
辺腔または細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シ
グナルを発現されるポリペプチドに挿入してもよい。こ
れらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。本発明
のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール
沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する、よく
知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および
精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフ
ィーが精製に使用される。ポリペプチドが単離および／
または精製の間に変性する場合、タンパク質を再生する
ための周知方法を用いて、再び活性な立体配座とするこ
とができる。
【００５１】診断および予後アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のli
cＤ２ポリヌクレオチドの使用にも関連付けられる。真
核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるlicＤ２
の検出は、疾患の診断のための診断方法を提供する。真
核生物（本明細書において「個体」とも称する）、とり
わけ哺乳動物、特にヒトがlicＤ２遺伝子を含む生物に
感染するか、または感染している恐れがあると、種々の
方法により核酸レベルで検出できる。
【００５２】診断に供する核酸は、感染した個体の細胞
および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚よ
り得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出する
のに使用できるか、または分析に付す前にＰＣＲもしく
はその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅でき
る。ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡも同じ方法に
て使用できる。増幅すると、個体に存在する原核生物の
種および株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により
特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型と比較
した増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入
を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したli
cＤ２ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすること
により同定できる。完全に対合した配列は、ＲＮase消
化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせ
んと区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤と共に
または無しでゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の
移動度の変化により、または直接的なＤＮＡの配列決定
により検出できる。例えば、Myersら、Science，230:12
42（1985）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化
はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えば、ＲＮase
およびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかに
することができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）を参照のこと。
【００５３】本発明の遺伝子中に変異または多型性（対
立遺伝子変異）を担持する細胞はまた、種々の技術によ
り、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで、例えばセロタイピン
グすることにより検出できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを
用いてＲＮＡの変異を検出することができる。ＲＴ−Ｐ
ＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて
用いるのが特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに
用いることができる。一例として、licＤ２をコードす
る核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定
および分析することができる。
【００５４】これらのプライマーを用いて、とりわけ、
個体に由来するサンプルから単離したlicＤ２ ＤＮＡを
増幅することができる。該プライマーを用いて、感染し
た個体から単離した遺伝子を増幅してもよく、ついで、
該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供す
ることができる。このように、ＤＮＡ配列における変異
を検出し、これを用いて感染を診断し、感染性物質をセ
ロタイプおよび／または分類することができる。
【００５５】本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニ
エによる感染の診断方法であって、表１［配列番号１ま
たは３］の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル
の上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴
とする方法を提供する。licＤ２ポリヌクレオチドの発
現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法とし
て当該分野で周知の方法である任意の方法、例えば増
幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブ
ロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法
を用いて測定できる。
【００５６】加えて、正常対照組織サンプルと比較して
licＤ２タンパク質の過剰発現を検出するための本発明
による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出
することができる。宿主由来のサンプル中のlicＤ２タ
ンパク質のレベルを決定するために用いることができる
アッセイ技法は、当業者に周知である。このようなアッ
セイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ
を包含する。
【００５７】本発明のポリヌクレオチド配列はまた、染
色体を同定するのに有用である。該配列は個々の微生物
の染色体、特にストレプトコッカス・ニューモニエの染
色体上の特定の位置を特異的に標的とし、それとハイブ
リダイズしうる。本発明にかかる染色体に関連する配列
の地図作成は、その配列を微生物病原性および疾患に付
随する遺伝子と、または生長、生存および／または生態
的地位に臨界的な染色体領域に相関付ける重要な第１工
程である。一旦、配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図の
データと相関させることができる。そのようなデータ
は、例えば、World Wide Webより入手可能な微生物のゲ
ノム配列にて見られる。ついで、遺伝子と微生物の病原
性の間の関係、または同じ染色体領域にマッピングされ
た生長、生存および／または生態的位置に対して臨界的
なゲノム領域との関係を、連鎖分析（物理的に隣接する
遺伝子の共同遺伝）などの、該遺伝子と別の遺伝子また
は表現型の間の遺伝的関係を特定する方法を用いて同定
する。
【００５８】表現型の異なる微生物の間のＲＮＡまたは
ゲノム配列における違いもまた測定できる。特定の表現
型の微生物のいくつかまたはすべての微生物にて配列の
変異が観察されるが、その表現型を欠くいずれの微生物
においても変異が観察されないならば、その配列の変異
が表現型の原因であると考えられる。このように、微生
物の病原性、生長特性、生存特性および／または生態的
位置特性を付与する染色体領域を同定することができ
る。
【００５９】ディファレンシャル発現 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはディフ
ァレンシャルスクリーニング法用試薬として用いること
ができる。当該分野にて公知の多数のディファレンシャ
ルスクリーニングおよびディファレンシャルディスプレ
イ法があり、その方法に本発明のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドを用いることができる。例えば、ディフ
ァレンシャルディスプレイ法は、Chuangら、J.Bacterio
l. １７５：２０２６−２０３６（１９９３）に記載さ
れている。この方法は無作為にプライムされたＲＴ−Ｐ
ＣＲを用いて存在するｍＲＮＡを同定することで生物に
て発現される遺伝子を同定するものである。感染の前後
の特徴を比較することにより、感染の間にアップレギュ
レートおよびダウンレギュレートした遺伝子を同定し、
ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、「不明」であるＯＲＦ
と適合させることができる。
【００６０】インビボ発現法（ＩＶＥＴ）が、Camilli
ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA.９１：２６３４−２
６３８（１９９４）に記載されている。ＩＶＥＴは、実
験室培養と比較した場合に、感染における重要な役割を
示唆する、感染の間にアップレギュレートした遺伝子を
同定する。この方法により同定されたＯＲＦは感染の確
立および／または維持にて有意な役割を有すると思われ
る。この方法では、標的生物のランダムな染色体フラグ
メントを、プラスミドベクター中のプロモータを欠くリ
コンビナーゼ遺伝子の上流にクローンする。この構築物
を側面にリソルバーゼ部位を付加した抗生物質耐性遺伝
子を有する標的生物に導入する。抗生物質の存在下での
増殖は、母集団からリコンビナーゼ遺伝子の転写を支持
する能力を有するプラスミドベクター中にクローンされ
たフラグメントを除去し、したがって、抗生物質耐性を
喪失させる。耐性株のプールを宿主に導入し、感染後の
種々の時期に、細菌を回収し、抗生物質耐性の存在につ
いて評価する。各抗生物質感受性細菌を有する染色体フ
ラグメントは、通常、感染の間にアップレギュレートし
たプロモータまたは遺伝子の一部を有するはずである。
リコンビナーゼ遺伝子の上流を配列決定することでアッ
プレギュレートした遺伝子の同定が可能となる。
【００６１】ＲＴ−ＰＣＲを用いて、遺伝子発現のパタ
ーンを分析することもできる。本発明のポリヌクレオチ
ドを用いるＲＴ−ＰＣＲでは、メッセンジャーＲＮＡ
を、例えば、４８時間ネズミ肺感染の、細菌感染の組織
より単離し、ランダム・ヘキサヌクレオチドでプライム
したＲＮＡサンプルを逆転写し、つづいて遺伝子特異的
プライマー対でＰＣＲに付すことで各ｍＲＮＡ種の量を
評価する。得られたＰＣＲ産物を定量することで個々の
ｍＲＮＡ種の存在および量を測定すると、感染組織にて
転写された細菌性遺伝子に関する情報が得られる。遺伝
子転写の分析を感染の種々の時点で行い、遺伝子産物が
新規な抗菌物質をスクリーンするための標的であること
のより明確な理解を可能とする細菌発生病理における遺
伝子の制御について詳細な知識を得ることができる。利
用するＰＣＲプライマーの遺伝子特異性のため、細菌性
ｍＲＮＡの調製には哺乳動物性ＲＮＡのないことを必要
としないことが理解されるであろう。これは研究者が感
染組織から簡易かつ迅速にＲＮＡを調製し、細菌中で極
めて短命（略２分程度の半減期）である、細菌性ｍＲＮ
Ａ種を得ることを可能とする。最適には、細菌性ｍＲＮ
Ａは、感染したネズミ肺組織を、極めて短期間、ＴＲＩ
zole（GIBCO-BRL)の存在下で機械的に破壊し、その後、
ＴＲＩzole試薬の製造者の指示に従って処理し、ＤＮＡ
ase処理に付し、夾雑しているＤＮＡを除去することに
より調製する。好ましくは、ノーザン（Northers）を適
宜標識化した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブで
プローブすることにより検出されるストレプトコッカス
・ニューモニエ１６SリボソームのＲＮＡが最大量で得
られる条件を見出すことで該方法を最適化する。典型的
には、５’ダイ標識化プライマーを、最適には８と２５
サイクルの間で終了する、ＰＣＲプライマー反応におけ
る各ＰＣＲプライマー対に用いる。ＰＣＲ産物をGeneSc
anner（ＡＢＩ製）を用いて６％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、検出および定量を行う。これらの技法
は、各々、個々の適用に応じて有利な点および不利な点
を有する。当業者であれば個々の目的に最も適する方法
を選択するであろう。
【００６２】抗体 本発明のポリペプチドもしくはその変種、またはそれら
を発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫特異
的な抗体を産生する免疫原として用いることができる。
本明細書で用いる「抗体」は、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体および
ヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブ
ラリーの生成物を含むＦａｂフラグメントを包含する。
本発明のポリペプチドに拮抗して得られる抗体は、ポリ
ペプチドあるいはエピトープが付いたフラグメント、ア
ナログまたは細胞を、好ましくはヒト以外の動物に、慣
用的プロトコルを用いて投与することにより得ることが
できる。モノクローナル抗体を調製する場合、連続的細
胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野にて
周知の技術を用いることができる。例えば、Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature，256：495−497（197
5）；Kozborら、Immunology Today, 4：72（1983）；Co
leら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Al
an R Liss,Inc.、77−96頁（1985）に記載されるような
種々の技法が挙げられる。
【００６３】一本鎖抗体を製造するための技術（米国特
許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポリペプチ
ドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の
哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。別法として、ファージディスプレイ（phage displa
y）技法を利用して、抗‐licＤ２の保持に関してスクリ
ーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子
のレパートリー由来の、または無処理のライブラリー由
来の、ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝
子を選択してもよい（McCafferty,Ｊ.ら、Nature 348:5
52-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-7
83(1992)）。これらの抗体の親和性はチェインシャフリ
ング（chain shuffling）により改善することもできる
（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。
【００６４】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは異なるエピトープに向けることができ、そ
れを「二特異性」抗体と称する。前記の抗体を用いてポ
リペプチドを発現するクローンを単離または同定するこ
とができ、アフィニティークロマトグラフィーにより該
ポリペプチドを精製することができる。従って、とりわ
け、licＤ２ポリペプチドに対する抗体を用いて、感
染、とりわけ細菌感染を治療することができる。
【００６５】ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様
を形成する、抗原的、エピトープ的または免疫学的に等
価な変種を包含する。本明細書で用いる「抗原的に等価
な誘導体」なる用語は、本発明に係るタンパク質または
ポリペプチドに対して誘起された場合、病原体および哺
乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害するあ
る種の抗体により特異的に認識されるポリペプチドまた
はその同等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的
に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を
誘起させるのに適した処方を用いた場合、抗体が病原体
および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨
害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含
する。
【００６６】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはその融合タンパク質は、マウスま
たは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用される。融合タンパク質はポリ
ペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合す
ることにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペ
ット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：Ｋ
ＬＨ）に結合させることができる。別法として、タンパ
ク質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もしくは
免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重
抗原性ペプチドは、免疫原性を改良するのに十分な抗原
性を有しており、キャリヤを使用しなくてすむ。
【００６７】抗体またはその変種を修飾し、個体におけ
る免疫原性を減少させることが好ましい。例えば、個体
がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」さ
れており；例えばJones,P.ら、Nature 321：522−525
（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されているように、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移
植されている。
【００６８】本発明のポリヌクレオチドの遺伝的免疫に
おける使用は、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋肉へ
の直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet 1：363（199
2）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther. 4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol Chem. 264：16985（1989））、
リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & R
eshef、PNAS USA 83：9551（1986））、種々の形態のリ
ポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243：3
75（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356：152
（1992）；Eisenbraunら、ＤＮＡ Cell Biol 12：791
（1993））およびクローン化レトロウイルスベクターを
用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS USA 81：5849（1
984））などの適当な送達方法を用いる。
【００６９】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 さらに、本発明のポリペプチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産
物の混合物中の、小分子基質とリガンドとの結合を評価
することもできる。これらの基質およびリガンドは天然
の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機
能上の擬似物質でもよい。例えば、Coliganら、Current
Protocols in Immunology 1（2）：第5章（1991）を参
照のこと。
【００７０】本発明はまた、licＤ２ポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用、特に静菌および／または殺
菌性である化合物の作用を亢進（アゴニスト）または遮
断（アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法を提供する。スクリーニング方
法には高処理量（high−throughput）技術が包含され
る。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリ
ーニングするために、licＤ２ポリペプチドおよびかか
るポリペプチドの標識基質またはリガンドを含んでなる
合成反応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁
のごとき細胞コンパートメント、またはそれらのいずれ
かの調製物を、licＤ２アゴニストまたはアンタゴニス
トであるかもしれない候補分子の存在下または不在下で
インキュベートする。候補分子がlicＤ２ポリペプチド
に作動または拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低
下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映され
る。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちlicＤ
２ポリペプチドの効果を誘起しない分子は、ほとんどの
場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基
質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニストで
ある。基質からの生成物の生成速度またはレベルの検出
はリポーターシステムを用いることにより増強できる。
この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に
転換される比色標識基質、licＤ２ポリヌクレオチドま
たはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝
子、および当該分野で公知の結合アッセイを包含する
が、これらに限定するものではない。
【００７１】licＤ２アンタゴニストのアッセイの別の
例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、licＤ２お
よび潜在的なアンタゴニストを、licＤ２結合分子、組
換えlicＤ２結合分子、天然基質もしくはリガンド、ま
たは基質もしくはリガンド擬似物質と混合する、競合ア
ッセイである。licＤ２を例えば放射活性または比色化
合物により標識し、結合分子に結合するか、または生成
物に変換したlicＤ２分子の数を正確に決定して、潜在
的なアンタゴニストの効果を評価できる。
【００７２】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それにより
その活性を阻害し、消滅させる小有機分子、ペプチド、
ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニ
ストはまた、licＤ２誘発活性を誘導しない結合分子の
ような、結合分子の同一部位に結合し、licＤ２を結合
より排除することによりlicＤ２の作用を妨げる、密接
に関連したタンパク質または抗体のような小有機分子、
ペプチド、ポリペプチドであってもよい。
【００７３】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合してその部位を占領し、それにより細
胞性結合分子との結合を防御して、正常な生物学的活性
を防御する小分子を包含する。小分子の例は、小有機分
子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、これらに
限定するものではない。その他の潜在的なアンタゴニス
トはアンチセンス分子を包含する（これらの分子につい
ての記載に関しては、Okano,J.，Neurochem. 56:560（1
991）；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBTORS
OF GENE EXPRESSION、ＣＲＣプレス、ボッカラート
ン、フロリダ州（1988）を参照のこと）。好ましい潜在
的アンタゴニストは、licＤ２に関連する化合物および
その変種を包含する。
【００７４】本明細書で得られるＤＮＡ配列は、各々、
抗菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現でコードされたタンパク質は、抗菌薬物をスクリーニ
ングするための標的として用いることができる。加え
て、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコード
するＤＮＡ配列あるいはシャイン・ガルガーノまたは他
の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的とす
るコーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列
を構築することができる。
【００７５】本発明はまた、感染の続発症に関与する、
病原体および哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を
妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオ
チドまたは阻害物質の使用を提供する。特に本発明の分
子は；細菌、特にグラム陽性菌が内在装置上の哺乳動物
細胞外マトリックスタンパク質、または創傷部の細胞外
マトリックスタンパク質に付着することを防御するの
に；例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのリン酸化を開
始することによる、licＤ２タンパク質介在の哺乳動物
細胞侵入を遮断するために(Rosenshineら、Infect.Immu
n. 60：2211(1992))；哺乳動物細胞外マトリックスタン
パク質と組織損傷を媒介する細菌性licＤ２タンパク質
との間の細菌付着を遮断するために；内在装置の埋め込
みまたは他の外科的手技以外により開始した感染におけ
る病因の通常の進行を遮断するために使用することがで
きる。
【００７６】本発明のアンタゴニストおよびアゴニスト
を用いて、例えば、疾患を阻害し、治療することができ
る。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter pylori）
（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌は、胃癌、
潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３分の１以上
の胃に感染している（国際癌研究機関（International
Agency for Research on Cancer）（1994）Schistomose
s，Liver Flukes and Helicobacter Pylori（Internati
onal Agency for Research on Cancer，Lyon，France；
http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．htm））。さ
らに、この国際癌研究機関は、最近になって、ヘリコバ
クター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その
細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発
明により提供されるスクリーン法を用いて見出された本
発明の好ましい抗菌化合物（licＤ２のアゴニストおよ
びアンタゴニスト）、特に広域スペクトルの抗生物質
は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療にて有用であ
る。このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性
癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はま
た胃潰瘍および胃炎も治癒する。
【００７７】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘発する方法であって、抗体および／または
Ｔ細胞免疫応答を生成するのに適当なlicＤ２、または
そのフラグメントもしくは変種を個体に接種し、該個体
を感染、特に細菌感染、最も好ましくはストレプトコッ
カス・ニューモニエ感染から防御することからなる方法
に関する。さらに、そのような免疫学的応答による細菌
複製を遅らせる方法も提供する。本発明のさらにもう一
つ別の態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方
法であって、インビボでlicＤ２またはそのフラグメン
トまたは変種を発現するために、該licＤ２またはその
フラグメントまたは変種の発現を指向する核酸ベクター
を該個体にデリバリーし、例えば、サイトカイン産生Ｔ
細胞または細胞毒性Ｔ細胞を含め、抗体および／または
Ｔ細胞免疫応答を生じさせるように免疫学的応答を誘発
し、該個体にて疾患が既に確立されているか、否かにか
かわらず該個体を疾患から保護することからなる方法に
関する。遺伝子を投与する一の方法は、粒子等のコーテ
ィングとして遺伝子を所望の細胞に投与することによる
ものである。このような核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、修飾核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからな
っていてもよい。
【００７８】本発明のさらなる態様は、その中に免疫学
的応答を誘発する能力を有するか、または誘発している
個体に導入されると、その個体においてlicＤ２または
それからコードされるタンパク質に対する免疫学的応答
を誘発する免疫学的組成物であって、該licＤ２または
それからコードされるタンパク質の抗原をコードし、発
現するＤＮＡを含む組換えlicＤ２またはそれからコー
ドされるタンパク質からなる組成物に関する。免疫学的
応答は、治療的および予防的に使用でき、抗体免疫また
はＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生ずるような細胞免
疫から得ることができる。
【００７９】licＤ２ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントは、それ自体抗体を産生しないが、第一タンパク質
の安定化ならびに免疫原性および保護特性を有するであ
ろう融合タンパク質の産生能を有する補タンパク質（co
−Protein）と融合させることができる。このような融
合組換えタンパク質は、好ましくは、さらに、ヘモフィ
ラス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae）から
のリポプロテインＤ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシダーゼのよう
な抗原性補タンパク質、タンパク質を可溶化し、その産
生および精製を容易にするような比較的大きい補タンパ
ク質からなる。さらに、補タンパク質は、免疫系の汎化
した刺激を与える上で、アジュバントとして作用しても
よい。補タンパク質は第一タンパク質のアミノまたはカ
ルボキシ末端のいずれかに結合してもよい。本発明は、
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび、
Sato，Y.ら，Science，273：352(1996)に記載されるよ
うな免疫刺激ＤＮＡ配列からなる組成物、特にワクチン
組成物および方法を提供する。
【００８０】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニエ感染の動物モデルにおけるそのような遺伝的
免疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞表
面タンパク質の非可変領域をコードすることが明らかに
された記載のポリヌクレオチドまたはその特定のフラグ
メントを使用する方法も提供するもので、予防的または
治療的免疫応答を起こさせることのできるタンパク質エ
ピトープの同定に特に有用である。この方法により、動
物、とりわけヒトにおける細菌感染、特にストレプトコ
ッカス・ニューモニエ感染の予防剤または治療剤の開発
のために、動物の必要な器官から感染の抵抗または除去
に特に有用なモノクローナル抗体を産生させることがで
きる。
【００８１】該ポリペプチドを宿主を免疫化するための
抗原として用い、例えば、損傷組織への細菌の付着を遮
断することにより、細菌の侵入を妨げる特異抗体を生じ
させることができる。組織損傷の例としては、例えば、
機械的、化学的または熱的損傷による、または内在装置
の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あるいは口、乳
腺、子宮または膣のような粘膜における傷が挙げられ
る。
【００８２】本発明はまた、本発明の免疫原性組換えタ
ンパク質と、適当な担体とからなるワクチン処方も包含
する。タンパク質は胃で破壊されうるので、非経口的投
与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包
含する）が望ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸
化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびその処方を個体の体液、
好ましくは血液と等張にする溶質を含有してもよい、水
性および非水性滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を
含有してもよい、水性および非水性滅菌懸濁液を包含す
る。処方は、単位投与または複数投与用コンテナ、例え
ば、密封されたアンプルおよびバイアルにて提供され、
使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥
状態で貯蔵することができる。ワクチン処方はまた、水
中油系のごとき処方の免疫原性を高めるアジュバント系
および当該分野において知られている他の系を有しても
よい。投与量はワクチンの比活性に依存し、慣用的実験
操作によって容易に決定できる。本発明をある種のlic
Ｄ２タンパク質について記載したが、この記載は天然の
タンパク質のフラグメントおよび組換えタンパク質の免
疫原性を実質的に変化させない付加、欠失または置換を
有する同様なタンパク質も包含することが理解されるで
あろう。
【００８３】組成物、キットおよび投与 本発明はまた、上記したポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニス
トからなる組成物に関する。本発明のポリペプチドは、
対象への投与に適した医薬担体のような細胞、組織また
は器官用の非滅菌または滅菌担体と組み合わせて使用で
きる。かかる組成物は、例えば、媒体添加または治療上
有効量の本発明のポリペプチドと、医薬上許容される担
体または賦形剤を含有してなる。かかる担体は、限定す
るものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わ
せを包含する。処方は投与方法に適していなければなら
ない。本発明は、さらには、上記した本発明の組成物の
一またはそれ以上の成分を充填した、一またはそれ以上
のコンテナを有してなる診断および医薬用パックおよび
キットに関する。
【００８４】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
を、単独で、または、治療用化合物などの他の化合物と
組み合わせて用いてもよい。該医薬組成物は、例えば、
とりわけ、局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、経鼻、経皮経路による投与を含む、
いずれかの有効な、都合のよい方法で投与される。治療
および予防において、活性成分は個体に注射用組成物、
例えば、好ましくは等張の滅菌水性分散液として投与さ
れる。
【００８５】また、組成物は、例えば、軟膏、クリー
ム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、マウスウォ
ッシュ、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態
の局所用処方とすることができ、適当な通常の添加剤、
例えば、保存料、薬剤浸透を助ける溶媒、軟膏やクリー
ムにおけるエモリエント等を含むことができる。そのよ
うな局所用処方はまた、適合する通常の担体、例えば、
クリームまたは軟膏基剤、ローション用のエタノールま
たはオレイルアルコールも含有することができる。この
ような担体は、処方の約１〜９８重量％を構成してもよ
く、より一般的には、処方の約８０重量％までを構成す
る。
【００８６】哺乳動物、特にヒトに投与するには、一日
の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／
ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにして
も、個体に最も適した実際の用量は医者により決定さ
れ、個体の年齢、体重および応答により変化する。上記
の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より
高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも
本発明の範囲内である。内在装置には外科移植、補綴お
よびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入され、そ
の位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、その
ような装置としては、人工関節、心臓弁、ペースメーカ
ー、血管グラフト、血管カテーテル、脊髄液シャント、
尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulat
ory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテルが挙
げられる。
【００８７】本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前
に関連する細菌に対する全身的効果を達成するために注
射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある
間継続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特
に、ストレプトコッカス・ニューモニエの傷汚染を防止
するために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張に
も使用できる。多くの整形外科医は、補綴関節を有する
ヒトは、菌血症を生じ得る歯の治療前に抗生物質による
予防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重篤
な合併症となり、時に、補綴関節の損失および著しい罹
病率、致死率を伴う。したがって、該活性物質を、この
状況の予防的抗生物質の代替品として使用することにま
で拡張することができる。
【００８８】上記した治療に加えて、本発明の組成物
は、一般に、傷組織に露出したマトリックス・タンパク
質への細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予
防に代え、あるいは共に、歯の治療における予防的用途
に使用できる。別法として、本発明の組成物は挿入直前
に内在装置を浸すのに使用できる。該活性物質は、好ま
しくは、傷または内在装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌ〜
１０mg／ｍｌの濃度で使用できる。
【００８９】ワクチン組成物は、都合よくは、注射剤の
形態である。通常のアジュバントを使用して免疫応答を
高めることができる。ワクチン用の適当な単位投与量は
抗体０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好まし
くは１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。指示した用
量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当な個
体への投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察されな
い。
【００９０】配列のデータベースおよびアルゴリズム 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、
研究分析に有用なデータベースならびに配列分析アルゴ
リズムの成分として特に有用である。この標記したデー
タベースおよびアルゴリズムに、およびこの関連する請
求の範囲に用いる場合、「本発明のポリヌクレオチド」
および「本発明のポリヌクレオチド配列」なる語は、コ
ンピューター読み取り形態、例えば、クロタトグラフィ
ック（chrotatographic）・スキャン・データまたはピ
ークデータ、写真データまたはベースと称される、その
スキャンデータ、および質量分析データなどに変形され
ているか、または変形されていてもよい、あるいはその
形態にて記録されている、本発明のポリヌクレオチドの
検出可能ないずれの化学的または物理的特性をも意味す
る。この標記したデータベースおよびアルゴリズムに、
およびこの関連する請求の範囲に用いる場合、「本発明
のポリペプチド」および「本発明のポリペペド配列」な
る語は、コンピューター読み取り形態、例えば、クロタ
トグラフィック・スキャン・データまたはピークデー
タ、写真データまたはそのスキャンデータ、および質量
分析データなどに変形されているか、または変形されて
いてもよい、あるいはその形態にて記録されている本発
明のポリペプチドの検出可能ないずれかの化学的または
物理的特性をも意味する。
【００９１】本発明は、本発明の配列をその上に保存し
ているコンピューター読み取り媒体を提供するものであ
る。例えば、本発明のポリヌクレオチドの配列を有して
なるポリヌクレオチド；本発明のポリペプチド配列の配
列を有してなるポリペプチド；少なくとも１つの配列が
本発明のポリヌクレオチド配列を有してなる一連のポリ
ヌクレオチド配列；少なくとも１つの配列が本発明のポ
リペプチド配列の配列を有してなる一連のポリペプチド
配列；本発明のポリヌクレオチド配列の配列を有してな
るポリヌクレオチド配列を表すデータセット；本発明の
ポリペプチド配列の配列を有してなるポリペプチド配列
をコードするポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；本発明のポリヌクレオチド配列の配列を有してなる
ポリヌクレオチド；本発明のポリペプチド配列の配列を
有してなるポリペプチド；少なくとも１つの配列が本発
明のポリヌクレオチド配列の配列を有してなる一連のポ
リヌクレオチド配列；少なくとも１つの配列が本発明の
ポリペプチド配列の配列を有してなる一連のポリペプチ
ド配列；本発明のポリヌクレオチド配列の配列を有して
なるポリヌクレオチド配列を表すデータセット；本発明
のポリペプチド配列の配列を有してなるポリペプチド配
列をコードするポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；からなる群より選択される要素をその上に記録した
コンピューター読み取り媒体が提供される。コンピュー
ター読み取り媒体は、例えば、市販されているフロッピ
ーディスク、テープ、ハードドライブ、コンパクトディ
スクおよびビデオデッキを含め、情報またはデータを記
録するのに使用されるいずれの構成体とすることもでき
る。
【００９２】また、本発明によって、特性配列、特に遺
伝的配列の分析のための方法が提供される。配列を分析
する好ましい方法として、配列の相同性を分析する方
法、例えば、同一および類似性分析、ＲＮＡ構造分析、
配列アセンブリー、分岐学的分析、配列モチーフ分析、
オープンリーディングフレーム決定、核酸塩基コーリン
グおよび配列決定クロマトグラム・ピーク分析方法が挙
げられる。
【００９３】相同性の同定を行うためのコンピューター
をベースとする方法が提供される。この方法は、本発明
のポリヌクレオチドの配列をコンピューター読み取り媒
体に提供し、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較し、
相同性を同定する工程からなる。また、相同性の同定を
行うためのコンピューターをベースとする方法が提供さ
れ、該方法は本発明のポリペプチドの配列からなるポリ
ペプチド配列をコンピューター読み取り媒体に提供し、
該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチド配列と比較し、相同性を同定する
工程からなる。
【００９４】その上さらに、ポリヌクレオチド・アセン
ブリーのためのコンピューターをベースとする方法が提
供され、その方法は、本発明のポリヌクレオチドの配列
を有してなる第１のポリヌクレオチド配列をコンピュー
ター読み取り媒体に提供し、その第１のポリヌクレオチ
ド配列と第２のポリヌクレオチド配列の間にある少なく
とも１つの重複領域をスクリーニングする工程からなる
ものである。本発明のさらなる具体例は、相同性を同定
するためのコンピューターをベースとする方法であっ
て、本発明のポリヌクレオチドの配列を有してなるポリ
ヌクレオチド配列をコンピューター読み取り媒体に提供
し、そのポリヌクレオチド配列を少なくとも１つのポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較し、相同性
を同定する工程からなる方法を提供する。
【００９５】本発明のさらなる具体例は、相同性を同定
するためのコンピューターをベースとする方法であっ
て、本発明のポリペプチドの配列を有してなるポリペプ
チド配列をコンピューター読み取り媒体に提供し、その
ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオチド
またはポリペプチド配列と比較し、相同性を同定する工
程からなる方法を提供する。本発明のさらなる具体例
は、ポリヌクレオチドをアセンブリーするためのコンピ
ューターをベースとする方法であって、本発明のポリヌ
クレオチドの配列を有してなる第１のポリヌクレオチド
配列をコンピューター読み取り媒体に提供し、その第１
のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列
の間にある少なくとも１つの重複領域をスクリーニング
する工程からなる方法を提供する。
【００９６】本明細書に開示の引例は出典明示によりそ
の内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張す
るいずれの特許出願もまた出典明示により本明細書の一
部とする。
【００９７】定義 本明細書中で頻繁に使用されるある種の用語をその理解
を容易にするために以下に定義する。「疾患（複数でも
可）」は、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静
脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感
染のごとき髄膜炎を含む、細菌の感染により引き起こさ
れるか、または該感染に関連する疾患を意味する。「宿
主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によって形質転
換またはトランスフェクトされた、あるいは形質転換ま
たはトランスフェクトされることのできる細胞である。
【００９８】「同一性」は、当該分野で公知であり、配
列の比較で測定されるような、２またはそれ以上のポリ
ペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同
一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって
測定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」
は、限定するものではないが、Computational Molecula
r Biology，Lesk，A.M.編，Oxford UniversityPress，N
ew York，1988；Biocomputing：Informatics and Genom
e Projects, Smith, D.W.編，Academic Press，New Yor
k，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part
I，Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編，Humana Pres
s，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular
Biology，Von Heinje,G．Academic Press，1987；およ
びSequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびDever
eux, J.編，M Stockton Press，New York，1991；およ
びCarllio,HおよびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.,
48：1073(1988)に記載されている方法を含め、公知方法
により容易に決定することができる。同一性を測定する
好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与え
るように設計されている。その上、同一性を測定する方
法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに組み込
まれている。２つの配列の間の同一性を測定する好まし
いコンピュータ・プログラム方法には、限定するもので
はないが、例えば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Deve
reux,J.ら，Nucleic Acids Research（1984）12（1）：
387）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S. F.ら,
J.Molec.Biol.（1990）215：403−410）が包含され
る。BLAST XプログラムはNCBIおよび他の源（BLAST Man
ual，Altshul, S．ら，NCBI NLM NIH Bethesda，MD2089
4；Altschul,S．ら，J．Mol．Biol.，215：403−410(19
90)）から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォ
ーターマン（SmithWaterman)アルゴリズムを用いて同一
性を測定することもできる。
【００９９】ポリペプチド配列を比較するためのパラメ
ータは、以下のパラメータを包含する： （１）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J．Mol
Biol．４８：４４３−４５３（１９７０）；（２）比較
マトリックス：HentikoffおよびHentikoff、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA ８９：１０９１５−１０９１９（１
９９２）のBLOSSUM６２；（３）ギャップ・ペナルテ
ィ：１２；および（４）ギャップ・レングス・ペナルテ
ィ：４。これらのパラメータを用いて有用なプログラム
は、ウィスコシン州、マジソン、Genetics Computer Gr
oupより「ｇａｐ」プログラムとして公に利用できる。
前記したパラメータはペプチドを比較するためのデフォ
ルト（default）パラメータ（エンドギャップについて
ペナルティのない）である。
【０１００】ポリヌクレオチドを比較するためのパラメ
ータは、以下のパラメータを包含する： （１）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J．Mol
Biol．４８：４４３−４５３（１９７０）；（２）比較
マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；
（３）ギャップ・ペナルティ：５０；および（４）ギャ
ップ・レングス・ペナルティ：３。ウィスコシン州、マ
ジソン、Genetics Computer Groupより「ｇａｐ」プロ
グラムとして利用できる。これらは核酸を比較するため
のデフォルト・パラメータである。
【０１０１】場合によっては、ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドを「同定」するための好ましい手段は、以
下の（１）および（２）で得られる。
【０１０２】（１）ポリヌクレオチドの例として、さら
に、配列番号１の対照配列と少なくとも５０、６０、７
０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同
一性を有するポリヌクレオチド配列を有してなる単離ポ
リヌクレオチドが挙げられる。ここで、該ポリヌクレオ
チド配列は配列番号１の対照配列と同一であってもよ
く、あるいはその対照配列と比較した場合にある整数ま
での数のヌクレオチドが変わっていてもよく、その変形
は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、転位および
転換を含む置換または挿入からなる郡より選択され、か
つその変形は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’
末端位置で、またはそれら末端位置の間のどこで起こっ
てもよく、対照配列中のヌクレオチド間に個々に、また
は対照配列内の一またはそれ以上の隣接する基において
点在してもよく、そのヌクレオチド変形の数は、配列番
号１のヌクレオチドの総数に同一性のパーセントを１０
０で割って定めた数を掛け、ついで配列番号１のヌクレ
オチドの総数からこの積を減じることにより、あるい
は、式：
【数３】ｎn≦Ｘn−（Ｘn・ｙ） ［式中、ｎnはヌクレオチド変形の数であり、Ｘnは配列
番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは５０％で０.
５０、６０％で０.６０、７０％で０.７０、８０％で
０.８０，８５％で０.８５、９０％で０.９０、９５％
で０.９５、９７％で０．９７または１００％で１.００
であり、・は乗算オペレーターの記号であり、Ｘnとｙ
の積が整数でない場合、それをＸnから減ずる前に端数
を切り捨て、最も近い整数にする］により決定される。
配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列の変形は、このコード配列にてノンセンス、ミス
センスまたはフレームシフト変異を形成し、それにより
そのように変形したポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドが変化する。
【０１０３】一例に、本発明のポリヌクレオチド配列
は、配列番号２の対照配列と同一であってもよく、すな
わち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列
と比較した場合にある整数までの数のアミノ酸が変わっ
ていてもよく、その結果として同一性のパーセントは１
００％同一よりも小さくなる。かかる変形は、少なくと
も１つの核酸の欠失、転位および転換を含む置換または
挿入からなる郡より選択され、かつその変形は、対照ポ
リヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、また
はそれら末端部位の間のどこで起こってもよく、対照配
列中の核酸の間に個々に、または対照配列内の一または
それ以上の隣接する基において点在してもよい。所定の
パーセントの同一性についての核酸の変形の数は、配列
番号２のアミノ酸の総数にその同一性のパーセントを１
００で割って定めた数を掛け、ついで配列番号２のアミ
ノ酸の総数からこの積を減じることにより、あるいは、
式：
【数４】ｎn≦Ｘn−（Ｘn・ｙ） ［式中、ｎnはアミノ酸変形の数であり、Ｘnは配列番号
２のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、７０％で
０.７０、８０％で０.８０，８５％で０.８５等であ
り、・は乗算オペレーターの記号であり、Ｘnとｙの積
が整数でない場合、それをＸnから減ずる前に端数を切
り捨て、最も近い整数にする］により決定される。
【０１０４】（２）ポリヌクレオチドの例として、さら
に、配列番号２のポリペプチドの対照配列と少なくとも
５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７また
は１００％の同一性を有するポリペプチドを有してなる
単離ポリペプチドが挙げられる。ここで、該ポリペプチ
ド配列は配列番号２の対照配列と同一であってもよく、
あるいはその対照配列と比較した場合にある整数までの
数のアミノ酸が変わっていてもよく、その変形は、少な
くとも１つのヌクレオチドの欠失、同類および非同類置
換を含む置換または挿入からなる郡より選択され、かつ
その変形は、対照ポリペプチド配列のアミノまたはカル
ボキシ末端位置で、またはそれら末端位置の間のどこで
起こってもよく、対照配列中のアミノ酸間に個々に、ま
たは対照配列内の一またはそれ以上の隣接する基におい
て点在してもよく、そのアミノ酸変形の数は、配列番号
２のアミノ酸の総数に同一性のパーセントを１００で割
って定めた数を掛け、ついで配列番号２のアミノ酸の総
数からこの積を減じることにより、あるいは、式：
【数５】ｎa≦Ｘa−（Ｘa・ｙ） ［式中、ｎaはアミノ酸変形の数であり、Ｘaは配列番号
２のアミノ酸の総数であり、ｙは５０％で０.５０、６
０％で０.６０、７０％で０.７０、８０％で０.８０，
８５％で０.８５、９０％で０.９０、９５％で０.９
５、９７％で０．９７または１００％で１.００であ
り、・は乗算オペレーターの記号であり、Ｘaとｙの積
が整数でない場合、それをＸaから減ずる前に端数を切
り捨て、最も近い整数にする］により決定される。
【０１０５】一例に、本発明のポリヌクレオチド配列
は、配列番号２の対照配列と同一であってもよく、すな
わち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列
と比較した場合にある整数までの数のアミノ酸が変わっ
ていてもよく、その結果として同一性のパーセントは１
００％同一よりも小さくなる。かかる変形は、少なくと
も１つのアミノ酸の欠失、同類および非同類置換を含む
置換または挿入からなる郡より選択され、かつその変形
は、対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末
端位置で、またはそれら末端位置の間のどこで起こって
もよく、対照配列中のアミノ酸の間に個々に、または対
照配列内の一またはそれ以上の隣接する基において点在
してもよい。所定のパーセントの同一性についてのアミ
ノ酸の変形の数は、配列番号２のアミノ酸の総数にその
同一性のパーセントを１００で割って定めた数を掛け、
ついで配列番号２のアミノ酸の総数からこの積を減じる
ことにより、あるいは、式：
【数６】ｎa≦Ｘa−（Ｘa・ｙ） ［式中、ｎaはアミノ酸変形の数であり、Ｘaは配列番号
２のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、７０％で
０.７０、８０％で０.８０，８５％で０.８５等であ
り、・は乗算オペレーターの記号であり、Ｘaとｙの積
が整数でない場合、それをＸnから減ずる前に端数を切
り捨て、最も近い整数にする］により決定される。
【０１０６】「単離された」とは、「ヒトの手によ
り」、その天然の状態から変えられること、すなわち、
天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あ
るいは両方されたことを意味する。例えば、生体に天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離された」ものではないが、その天然状態で共存する物
質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、本明細書で用いる用語としての「単離された」
ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作により、
またはいずれか他の方法により生物に導入されているポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは、まだ生物内にあ
り、その生物が生きているまたは死んでいるとしても、
「単離された」ものである。
【０１０７】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっ
てもよい。「ポリヌクレオチド」は、単鎖および二本鎖
ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖およ
び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖
ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、
および単鎖またはより典型的には二本鎖または三本鎖領
域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含有してなるハイブリッド分子
を包含するが、これに限定されない。加えて、本明細書
にて用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖
領域をいう。これらの領域の鎖は同じ分子からのもので
も、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら
分子の一またはそれ以上の全てを含んでもよいが、より
典型的には、分子の幾つかの領域のみを含む。三本螺旋
領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチドで
ある。本明細書にて用いる場合、ポリヌクレオチド（複
数でも可）なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾
された塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲＮＡを包含す
る。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格
を有するＤＮＡまたはＲＮＡも該用語が本明細書で意図
するところのポリヌクレオチド（複数でも可）である。
さらに、イノシンなどの通常でない塩基、またはトリチ
ル化された塩基などの修飾塩基を有してなるＤＮＡまた
はＲＮＡ（２つの例だけを示す）も、その用語を本明細
書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多種の修飾
がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、当業者に公知の
ように多くの有用な目的に使用されている。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、ポリヌクレオチ
ドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾され
た形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞
および複雑型細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲ
ＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド（複
数でも可）」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド（複
数でも可）と称される比較的短いポリヌクレオチドも包
含する。
【０１０８】「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプ
チド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合した２つ
またはそれ以上のアミノ酸を含有してなるいずれのペプ
チドまたはタンパク質をもいう。「ポリペプチド（複数
でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーと称される短い鎖、および一般にタンパク質
と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝
子コードされている２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を
含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、
プロセッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の
工程、または化学修飾技法のいずれかによって修飾され
たものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、お
よびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献
にて詳しく記載されており、それらは当業者に周知であ
る。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、いくつか
の部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいこ
とは明らかであろう。また、所定のペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。修飾は、ペプチド骨格、ア
ミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポ
リペプチドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド
化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また
は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの
共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有交差結合の形成、システインの形成、ピ
ログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマーカルボキ
シル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル
化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白
分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、糖鎖形成、リピド付加、硫酸化、グルタミン酸残基
のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤ
Ｐ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白質へのアミノ酸付加、およ
びユビキチン化を包含する。例えば、PROTEINS−STRUCT
URE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第２版，Ｔ.Ｅ.Ｃreig
hton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany，New York（199
3）およびＷold,Ｆ.，POSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS，Posttranslational Protein M
odifications：Perspectives and Prospects,pgs. 1−1
2，B.C.Johnson編，Academic Press，New York（198
3）；Seifterら,Meth Enzymol.（1990）182：626−64
6、およびRattanら, Protein Synthesis：Posttranslat
ional Modifications and Aging，Ann N.Y. Acad Sci
（1992）663：48-62を参照のこと。ポリペプチドは、分
枝してもよく、分枝と共にまたはなしで環状であっても
よい。環状、分枝化および分枝化環状ポリペプチドは、
翻訳後の天然の工程の結果であり、同様に全く合成的な
方法で合成できる。
【０１０９】本明細書中で使用される「変種」なる語
は、各々、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌク
レオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチド
の典型的な変種は、別の対照標準のポリヌクレオチドと
ヌクレオチド配列において異なっている。変種のヌクレ
オチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチ
ドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と
変わっていてもよいし、または変わっていなくてもよ
い。ヌクレオチドの変化は、後記するように、対照標準
の配列によってコードされたポリペプチドにおいて、ア
ミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をもたらしう
る。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準のポ
リペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一
般に、差異は、対照標準のポリペプチドとその変種の配
列が全体的に非常に類似しており、多くの領域において
は同一であるように限定される。変種および対照標準の
ポリペプチドは、一またはそれ以上の置換、付加、欠失
のいずれかの組み合わせによって、アミノ酸配列におい
て異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基
は、遺伝コードによってコードされたものであってもな
くてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変
種は、対立遺伝子変種のような天然に存在するものであ
ってもよく、または天然に存在することが知られていな
い変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの天然に存在しない変種は、変異誘発法または直
接合成あるいは当業者に公知の他の組換え法によって作
られてもよい。
【０１１０】
【実施例】以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以
外は、当業者に周知で慣用的な標準的な技法を用いて実
施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。
【０１１１】実施例１ 株の選択、ライブラリーの製
造および配列決定 表１（配列番号１または３）に示すＤＮＡ配列を有する
ポリヌクレオチドは、エシェリキア・コリ中のストレプ
トコッカス・ニューモニエの染色体ＤＮＡのクローンラ
イブラリーより得た。重複するストレプトコッカス・ニ
ューモニエＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクロ
ーンからの配列データを用いて、配列番号１の連続した
ＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例え
ば以下の方法１および２により製造してもよい。全細胞
ＤＮＡをストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９
９３より、標準法に従って単離し、以下に示す二つの方
法のいずれかによりサイズ分画する。
【０１１２】方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮ
Ａをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐま
での大きさのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼ
およびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端
切断し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメント
を、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺａｐＩＩ
に連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージ
ングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシ
ェリキア・コリを感染させる。ライブラリーを標準方法
により増幅させる。
【０１１３】方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングす
るための一連のフラグメントを得るのに適当な１つの制
限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓ
ｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分
解し、かかるフラグメントを標準的方法に従ってサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、次い
でそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、
ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラ
リーをパッケージングし、パッケージングしたライブラ
リーでエシェリキア・コリを感染させる。ライブラリー
を標準方法により増幅させる。
【０１１４】
【配列表】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ロネット，マイケル・エイ （ｉｉ）発明の名称： licＤ２ （ｉｉｉ）配列の数：４ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： デチャート・プライス＆ローズ （Ｂ）通り名： ４０００・ベル・アトランティック・
タワー、１７１７アーク・ストリート （Ｃ）都市名： フィラデルフィア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９１０３−２７９３ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ・バージョン２.０
用のＦａｓｔＳＥＱ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０３９２２５ （Ｂ）出願日：１９９７年２月２８日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：フォーク，ステファン・ティ （Ｂ）登録番号：３６,７９５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５００２０ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８ （Ｂ）テレファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
【０１１５】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８１０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGCAATATT TAGAAAAAAA AGAAATTAAA GAAATTCAAC TAGCCCTGCT GGACTATATT 60 GATGAGACTT GTAAGAAACA TGATATTCCT TATTTTCTCA GTTATGGAAC CATGCTTGGA 120 GCCATCCGCC ACAAAGGTAT GATTCCTTGG GATGATGATA TTGATATTTC CCTTTATCGT 180 GAGGATTATG AGCGTTTACT GAAGATTATT GAAGAAGAAA ATCACCCTCG CTACAAGGTT 240 CTTTCCTACG ATACATCTTC TTGGTACTTC CATAATTTCG CATCGATTTT GGACACTTCT 300 ACTGTTATAG AAGACCATGT TAAGTACAAG CGTCATGATA CCAGCCTTTT CATCGATGTC 360 TTCCCAATTG ATCGATTTAC AGACTTGAGC ATTGTCGACA AGAGCTATAA GTATGTGGCT 420 CTTCGTCAAC TAGCTTATAT CAAAAAATCA CGAGCAGTTC ACGGTGATAG CAAACTAAAA 480 GATTTTCTTA GATTATGTAG CTGGTACGCT CTCCGATTTG TCAATCCTCG CTACTTTTAC 540 AAGAAAATTG ATCAACTAGT CAAAAATGCT GTAACCAACA CTCCTCAATA TGAAGGAGGA 600 GTTGGGATCG GTAAGGAAGG GATGAAAGAA ATCTTCCCAG TTGATACCTT TAAAGAACTG 660 ATTTTAACTG AGTTTGAGGG CCGTATGTTG CCTGTTCCCA AAAAATATGA CCAATTTTTA 720 ACCCAGATGT ATGGCGATTA TATGACACCA CCATCAAAAG AAATGCAAGA GTGGTATAGT 780 CATAGCATTA AAGCTTATCG CAAAAACTGA 810
【０１１６】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２６９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Gln Tyr Leu Glu Lys Lys Glu Ile Lys Glu Ile Gln Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Thr Cys Lys Lys His Asp Ile Pro Tyr Phe 20 25 30 Leu Ser Tyr Gly Thr Met Leu Gly Ala Ile Arg His Lys Gly Met Ile 35 40 45 Pro Trp Asp Asp Asp Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Arg Glu Asp Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Ile Ile Glu Glu Glu Asn His Pro Arg Tyr Lys Val 65 70 75 80 Leu Ser Tyr Asp Thr Ser Ser Trp Tyr Phe His Asn Phe Ala Ser Ile 85 90 95 Leu Asp Thr Ser Thr Val Ile Glu Asp His Val Lys Tyr Lys Arg His 100 105 110 Asp Thr Ser Leu Phe Ile Asp Val Phe Pro Ile Asp Arg Phe Thr Asp 115 120 125 Leu Ser Ile Val Asp Lys Ser Tyr Lys Tyr Val Ala Leu Arg Gln Leu 130 135 140 Ala Tyr Ile Lys Lys Ser Arg Ala Val His Gly Asp Ser Lys Leu Lys 145 150 155 160 Asp Phe Leu Arg Leu Cys Ser Trp Tyr Ala Leu Arg Phe Val Asn Pro 165 170 175 Arg Tyr Phe Tyr Lys Lys Ile Asp Gln Leu Val Lys Asn Ala Val Thr 180 185 190 Asn Thr Pro Gln Tyr Glu Gly Gly Val Gly Ile Gly Lys Glu Gly Met 195 200 205 Lys Glu Ile Phe Pro Val Asp Thr Phe Lys Glu Leu Ile Leu Thr Glu 210 215 220 Phe Glu Gly Arg Met Leu Pro Val Pro Lys Lys Tyr Asp Gln Phe Leu 225 230 235 240 Thr Gln Met Tyr Gly Asp Tyr Met Thr Pro Pro Ser Lys Glu Met Gln 245 250 255 Glu Trp Tyr Ser His Ser Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Asn 260 265
【０１１７】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： ATGCAATATT TAGAAAAAAA AGAAATTAAA GAAATTCAAC TAGCCCTGCT GGACTATATT 60 GATGAGACTT GTAAGAAACA TGATATTCCT TATTTTCTCA GTTATGGAAC CATGCTTGGA 120 GCCATCCGCC ACAAAGGTAT GATTCCTTGG GATGATGATA TTGATATTTC CCTTTATCGT 180 GAGGATTATG AGCGTTTACT GAAGATTATT GAAGAAGAAA ATCACCCTCG CTACAAGGTT 240 CTTTCCTACG ATACATCTTC TTGGTACTTC CATAATTTCG CATCGATTTT GGACACTTCT 300 ACTGTTATAG AAGACCATGT TAAGTACAAG CGTCATGATA CCAGCCTTTT CATCGATGTC 360 TTCCCAATTG ATCGATTTAC A 381
【０１１８】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： Met Gln Tyr Leu Glu Lys Lys Glu Ile Lys Glu Ile Gln Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Asp Tyr Ile Asp Glu Thr Cys Lys Lys His Asp Ile Pro Tyr Phe 20 25 30 Leu Ser Tyr Gly Thr Met Leu Gly Ala Ile Arg His Lys Gly Met Ile 35 40 45 Pro Trp Asp Asp Asp Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Arg Glu Asp Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Ile Ile Glu Glu Glu Asn His Pro Arg Tyr Lys Val 65 70 75 80 Leu Ser Tyr Asp Thr Ser Ser Trp Tyr Phe His Asn Phe Ala Ser Ile 85 90 95 Leu Asp Thr Ser Thr Val Ile Glu Asp His Val Lys Tyr Lys Arg His 100 105 110 Asp Thr Ser Leu Phe Ile Asp Val Phe Pro Ile Asp Arg Phe Thr 115 120 125
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:46）

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリ
    ペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７
    ０％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる単離ポ
    リヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ストレプトコッカス・ニューモニエ（St
    reptococcus pneumoniae）に含まれるlicＤ２遺伝子に
    よって発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有す
    るポリヌクレオチドからなる単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも
    ７０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドからなる単離ポリヌクレオ
    チド。
  4. 【請求項４】 請求項１のポリヌクレオチドに対する相
    補性を有する単離ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ
    である請求項１記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 配列番号１に示される核酸配列からなる
    請求項１記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 配列番号１に示されるヌクレオチド１な
    いしヌクレオチド番号８０８より開始する停止コドンか
    らなる請求項１記載のポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリ
    ペプチドをコードする請求項１記載のポリヌクレオチ
    ド。
  9. 【請求項９】 請求項１記載のポリヌクレオチドを含む
    ベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載のベクターを含む宿主細
    胞。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載の宿主細胞からそのＤ
    ＮＡによってコードされるポリペプチドを発現させるこ
    とを特徴とするポリペプチドの製造法。
  12. 【請求項１２】 licＤ２ポリペプチドまたはフラグメ
    ントを産生するのに十分な条件下で、請求項１０記載の
    宿主を培養することを特徴とする該ポリペプチドまたは
    フラグメントの製造法。
  13. 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくと
    も７０％同一であるアミノ酸配列を有してなるポリペプ
    チド。
  14. 【請求項１４】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を
    有してなるポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
  16. 【請求項１６】 請求項１４記載のポリペプチドの活性
    または発現を阻害するアンタゴニスト。
  17. 【請求項１７】 licＤ２ポリペプチドの必要な個体の
    治療方法であって、請求項１４記載のポリペプチドの治
    療上有効量を該個体に投与することからなる治療方法。
  18. 【請求項１８】 licＤ２ポリペプチドの阻害の必要な
    個体の治療方法であって、請求項１６記載のアンタゴニ
    ストの治療上有効量を該個体に投与することからなる治
    療方法。
  19. 【請求項１９】 個体における請求項１４記載のポリペ
    プチドの発現または活性に関係する疾患の診断方法であ
    って、該個体から由来する試料中の（ａ）該ポリペプチ
    ドをコードする核酸配列を測定すること；および／また
    は（ｂ）該ポリペプチドの存在または量を分析すること
    からなる方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１４記載のポリペプチドと相互
    作用し、その活性を阻害または活性化する化合物の同定
    方法であって、 スクリーニングすべき化合物が該ポリペプチドと相互反
    応できる条件下、該ポリペプチドからなる組成物を該化
    合物と接触させて、該化合物の相互反応を評価し（かか
    る相互反応は該ポリペプチドと化合物の相互反応に応じ
    て検出可能なシグナルを与えることのできる第２の成分
    に関与する）；該ポリペプチドと化合物との相互反応か
    ら生じるシグナルの有無を検出して、該化合物が該ポリ
    ペプチドと相互反応し、その活性を活性化するか、阻害
    するかを測定することからなる方法。
  21. 【請求項２１】 哺乳動物において免疫応答を誘導する
    方法であって、請求項１４記載のlicＤ２ポリペプチド
    あるいは抗体および／またはＴ細胞の免疫応答を生じさ
    せるのに適当なそのフラグメントまたは変種を該哺乳動
    物に接種し、該動物を疾患から保護する方法。
  22. 【請求項２２】 哺乳動物において免疫応答を誘導する
    方法であって、請求項１４記載のlicＤ２ポリペプチド
    の発現を指向するための核酸ベクター、あるいは該lic
    Ｄ２ポリペプチドを発現するためのそのフラグメントま
    たは変種、またはインビボで免疫応答を誘発し、抗体お
    よび／またはＴ細胞の免疫応答を生じさせるためのその
    フラグメントまたは変種をデリバリーして該動物を疾患
    から保護する方法。
  23. 【請求項２３】 配列番号１または３の配列を有してな
    るポリヌクレオチド；配列番号２または４の配列を有し
    てなるポリペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号
    １または３の配列を有してなる一連のポリヌクレオチド
    配列；少なくとも１つの配列が配列番号２または４の配
    列を有してなる一連のポリペプチド配列；配列番号１ま
    たは３の配列を有してなるポリヌクレオチド配列を表す
    データセット；配列番号２または４の配列を有してなる
    ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を
    表すデータセット；配列番号１の配列を有してなるポリ
    ヌクレオチド；配列番号２の配列を有してなるポリペプ
    チド；少なくとも１つの配列が配列番号１の配列を有し
    てなる一連のポリヌクレオチド配列；少なくとも１つの
    配列が配列番号２の配列を有してなる一連のポリペプチ
    ド配列；配列番号１の配列を有してなるポリヌクレオチ
    ド配列を表すデータセット；配列番号２の配列を有して
    なるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配
    列を表すデータセット；からなる群より選択される要素
    をその上に記録したコンピューター読み取り媒体。
  24. 【請求項２４】 相同性の同定を行うためのコンピュー
    ターをベースとする方法であって、配列番号１の配列を
    有してなるポリヌクレオチド配列をコンピューター読み
    取り媒体に提供し、そのポリヌクレオチド配列を少なく
    とも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と
    比較して相同性を同定する工程からなる、コンピュータ
    ーをベースとする方法。
  25. 【請求項２５】 ポリヌクレオチドのアセンブリーに関
    するコンピューターをベースとする方法であって、配列
    番号１の配列を有してなる第１のポリヌクレオチド配列
    をコンピューター読み取り媒体に提供し、その第１のポ
    リヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列の間
    にある少なくとも１つの重複領域をスクリーニングする
    工程からなる、コンピューターをベースとする方法。
  26. 【請求項２６】 配列番号４のアミノ酸配列を有してな
    るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なく
    とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを有して
    なる単離ポリヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】 配列番号３のポリヌクレオチド配列と
    少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを
    有してなる単離ポリヌクレオチド。
JP10090549A 1997-02-28 1998-02-27 新規ＬｉｃＤ２ Withdrawn JPH10327884A (ja)

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JP2000508178A (ja) * 1996-05-14 2000-07-04 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規化合物
JP2000514308A (ja) * 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用

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