JPH10262692A - ムタンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 工業製品としての規格もしくはムタナーゼ等
を使用した工業製品の品質管理等に耐え得る均質な品質
を有するムタンを比較的短時間で効率良く製造する。 【解決手段】 口腔連鎖球菌から培養法又は酵素法でム
タンを製造する際、ムタン生合成工程中にデキストラナ
ーゼを添加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、均質な品質を有
し、工業的に利用可能で、ムタナーゼ等を使用した工業
製品の品質管理に耐え得る基質ムタンを提供することが
可能な、ムタンを効率よく製造することができるムタン
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】う蝕予
防の手段として、歯垢形成抑制及び歯垢除去を行うこと
は広く一般に認知された方法である。この歯垢は、細菌
とグルカンからなり、グルカンはα−１，６結合を有す
るデキストランとα−１，３結合を有するムタンで構成
される。

【０００３】近年、う蝕予防歯磨としてこのデキストラ
ンを分解する酵素「デキストラナーゼ」を配合した商品
は上市されているが、ムタンを分解する酵素「ムタナー
ゼ」に関しては、う蝕予防に対して有効性があるという
報告は数多くある（特許登録第１０５５３６５号、口腔
衛生学会誌 ３９，１２４〜１２８（１９８９））もの
の、実際に製品化された例はまだない。

【０００４】上記のようなムタナーゼ及びムタンを利用
した技術の製品化を妨げている理由の一つには、現在ム
タンは上市されておらず、ムタンもしくはムタナーゼ開
発者は自らムタンを製造する必要があり、規格化された
ムタンの供給性が悪いという問題があった。

【０００５】この場合、α−１，３結合を有するグルコ
ースから構成される高分子多糖であるムタンの製造方法
としては、口腔連鎖球菌をショ糖存在下で培養すること
により得られるグルカン（α−１，３結合とα−１，６
結合の混合物）をデキストラナーゼで処理し、α−１，
６結合を切断除去する方法（培養法）が知られている。
また、上記菌株よりグルカン合成酵素（グルコシルトラ
ンスフェラーゼ）を取り出し、酵素反応でグルカンを合
成した後、デキストラナーゼで処理してα−１，６結合
を切断除去する方法（酵素法）も利用可能である。

【０００６】しかしながら、上記のようなデキストラナ
ーゼ処理を後から行う方法では、工業製品の規格化に耐
えられる高品質のムタンを工業的に有利に確保すること
は容易ではない。即ち、デキストラナーゼ処理を後から
行う従来の方法では、ムタンの製造工程においてデキス
トラナーゼ処理に長い日数を要するため、ランニングコ
ストがかかると同時に、雑菌のコンタミネーションなど
のリスクも大きかった。また、得られるムタンは、ロッ
トバラツキが大きく、工業製品としての規格もしくはム
タナーゼ等を使用した工業製品の品質管理に耐え得るも
のではなかった。なお、このデキストラナーゼ処理を後
から行う方法では、高度に枝分かれし複雑な構造を持つ
ムタンを合成した後からα−１，６結合のみを切断除去
することになるため、非常に非効率であると同時に酵素
が作用しづらい部分が残り、均一性に欠けたムタンとな
ってしまうものである。

【０００７】従って、上記問題点なく高品質のムタンを
製造し得る技術の開発が望まれていた。

【０００８】本発明は、上記事情に鑑みなされたもの
で、工業製品としての規格もしくはムタナーゼ等を使用
した工業製品の品質管理等に耐え得る均質な品質を有す
るムタンを効率良く製造することができるムタンの製造
方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討を行った結
果、口腔連鎖球菌から培養法又は酵素法でムタンを製造
する際、ムタン生合成工程中にデキストラナーゼを好ま
しくは１〜１０００Ｕ／ｍｌ／日の範囲で添加するこ
と、特に口腔連鎖球菌から培養法でムタンを製造する際
には、口腔連鎖球菌の培養工程中にデキストラナーゼを
１０〜１０００Ｕ／ｍｌ／日の範囲、また、口腔連鎖球
菌から酵素法でムタンを製造する際には、口腔連鎖球菌
から取り出したグルカン合成酵素を用いた酵素反応工程
中にデキストラナーゼを１〜１０００Ｕ／ｍｌ／日の範
囲で添加することにより、従来のムタン製造方法での問
題点を解決でき、雑菌のコンタミネーションやロット間
のバラツキがなく、工業製品としての規格もしくはムタ
ナーゼ等を使用した工業製品の品質管理等に耐え得る均
質な品質を有するムタンを比較的短時間で効率良く製造
することができることを知見し、本発明をなすに至っ
た。

【００１０】従って、本発明は、口腔連鎖球菌から培養
法又は酵素法でムタンを製造する際、ムタン生合成工程
中にデキストラナーゼを添加することを特徴とするムタ
ンの製造方法を提供する。

【００１１】以下、本発明につき更に詳細に説明する
と、本発明のムタンの製造方法で使用するムタンの生産
菌である口腔連鎖球菌としては、グルカンを生産するも
のであるならばいずれの菌でも差し支えないが、好まし
くはミュータンス連鎖球菌、特に生産性においてストレ
プトコッカス・ソブリナスもしくはストレプトコッカス
・ドネイが好適に使用され、これら菌株より分離調製し
たグルコシルトランスフェラーゼも当然使用することが
できる。また、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を
組み込んだ組み換え菌を用いた場合でもα−１，６鎖の
微量のコンタミネーションを防ぐ意味で本法は有効であ
る。

【００１２】上記ムタン生産菌からムタンを生合成する
方法としては、培養法と酵素法があり、培養法は口腔連
鎖球菌を培地培養することによりムタンを生合成する方
法であり、酵素法は口腔連鎖球菌から取り出したグルカ
ン合成酵素を用いた酵素反応によりムタンを生合成する
方法である。

【００１３】この場合、菌株培養に使用する培地として
は、上記口腔連鎖球菌が生育し得るものであればいずれ
の培地も使用可能であるが、具体的にはＢＨＩ（ブレイ
ン・ハート・インヒュージョン）培地、ＴＴＹ（トリプ
トース・トリプチケース・イースト・イクストラクト）
培地、ＴＨＢ（トッド・ヒューイット・ブロース）培地
等が好ましく、中でもＴＴＹ培地が特に好ましい。

【００１４】また、ムタンの培養法では、通常上記培地
にショ糖を添加するもので、ショ糖の添加量は、１〜１
５％重量濃度の範囲が好適である。なお、このショ糖
は、過度の糖濃度の上昇を避けるため分割して添加する
ことがより好適である。

【００１５】まず、培養法においては、上記培地を使用
してタンク培養でも培養瓶を用いた静置培養でも可能で
あり、一般に口腔連鎖球菌は嫌気状態を好むが、好気培
養でも問題は生じない。培養温度は２０〜４０℃、特に
３５〜４０℃が好適であり、製造日数は製造条件によっ
ても異なるが、通常の静置培養の場合で２〜１０日程度
である。

【００１６】更に、培養中のｐＨ制御は重要であり、グ
ルカン合成に関与するグルコシルトランスフェラーゼの
多くはｐＨ５．０〜６．０に至適ｐＨを持つため、ｐＨ
の低下は収量の低下につながる場合があることから、培
養中のｐＨは４〜７、特に５〜７に制御することが好ま
しい。

【００１７】また、酵素法では、上記口腔連鎖球菌を上
記培地で１晩程度培養した培養液から通常の方法で分取
したグルカン合成酵素をショ糖を添加した溶媒中で酵素
反応させる。

【００１８】この場合、溶媒としては緩衝液の使用が好
ましく、緩衝液としては酵素が作用するものであれば特
に制限はないが、例えばリン酸緩衝液が好ましく使用さ
れる。なお、溶媒ｐＨは、上記したようにグルカン合成
酵素の至適ｐＨからｐＨが４〜７の範囲が好適である。

【００１９】また、緩衝液に添加するショ糖の量は、１
〜１５％重量濃度となる範囲が望ましい。

【００２０】酵素反応条件は適宜調整できるが、通常２
０〜４０℃、特に３５〜４０℃で２〜５日であり、１日
の反応でも可能である。

【００２１】本発明の製造方法では、上記培養法又は酵
素法でムタンを製造する際、ムタン生合成工程中にデキ
ストラナーゼを添加するものであり、特に培養法でムタ
ンを製造する際は、口腔連鎖球菌の培養工程中に、ま
た、酵素法でムタンを製造する際は、口腔連鎖球菌から
取り出したグルカン合成酵素を用いた酵素反応工程中に
デキストラナーゼを添加する。

【００２２】この場合、デキストラナーゼとしては、公
知のものを使用することができ、例えばケトミウム属、
ペニシリウム属、アスペルギルス属に属する糸状菌やバ
チルス属、ラクトバチルス属に属する細菌等のデキスト
ラナーゼ生産菌を培養して調製したもの、もしくは動植
物から調製したものなどを使用できる。

【００２３】上記デキストラナーゼは、水又は適当な緩
衝液に溶解して添加しても、あるいは粉末のまま添加し
ても差し支えはない。

【００２４】デキストラナーゼの添加量は、基本的には
１Ｕ／ｍｌ／日以上の添加量が好ましく、これ以上であ
ればどれだけ添加してもよいが、より好ましくは１〜１
０００Ｕ／ｍｌ／日、更に好ましくは５０〜１０００Ｕ
／ｍｌ／日の範囲がよい。

【００２５】また、培養法でムタンを製造する場合は、
口腔連鎖球菌の培養工程中にデキストラナーゼを１０〜
１０００Ｕ／ｍｌ／日、特に１００〜１０００Ｕ／ｍｌ
／日の範囲で添加することが望ましい。添加量が１０Ｕ
／ｍｌ未満では十分な効果が発揮されない場合があり、
１０００Ｕ／ｍｌを超えて添加してもそれ以上の効果が
見られない場合がある。更に、酵素法でムタンを製造す
る場合は、口腔連鎖球菌から取り出したグルカン合成酵
素による酵素反応工程中にデキストラナーゼを１〜１０
００Ｕ／ｍｌ／日、特に５０〜１０００Ｕ／ｍｌ／日の
範囲で添加することが望ましい。

【００２６】上記いずれの場合も添加量が少なすぎると
十分な効果が発揮されず、デキストラナーゼを過度に添
加してもそれ以上の効果がみられない場合がある。

【００２７】更に、本発明では、デキストラナーゼの合
計添加量が１〜１００００Ｕ／ｍｌ、特に５０〜１００
００Ｕ／ｍｌの範囲であることが好ましい。

【００２８】なお、ここでいうデキストラナーゼ１単位
とは、デキストランを基質として反応を行った場合に１
分間当たりグルコース１μｇに相当する遊離還元糖を生
じる酵素量をいう。

【００２９】また、デキストラナーゼの添加方法は、ム
タン生合成中に定期的かつ連続して行うことが好適であ
り、添加開始時期は早い方が効率的であるが、ムタン生
合成の途中から添加しても十分量の酵素を添加すれば目
的を達成することはできる。

【００３０】上記方法で合成した後は、沈殿物を遠心分
離することで生成したムタンを回収することができる。
なお、この際、目的によっては培地にエタノール、メタ
ノール、アセトンのような有機溶媒を添加することによ
り、低分子量のムタンも回収することができる。更に、
得られた沈殿物を水酸化ナトリウム等のアルカリにムタ
ンを溶解することで菌体を除いた後、塩酸、硫酸等の酸
で中和することにより、水への分散性が高まり、よりバ
ラツキの少ないムタンを析出させることができる。析出
したムタンは、凍結乾燥等の適当な方法で乾燥粉末とし
て保存することができる。

【００３１】本発明の製造方法で得られるムタンは、均
一な品質を有するもので、力価バラツキ（Ｃ．Ｖ値）が
３％以下となり得るものである。

【００３２】

【発明の効果】本発明のムタンの製造方法によれば、雑
菌のコンタミネーションやロット間のバラツキがなく、
工業製品としての規格もしくはムタナーゼ等を使用した
工業製品の品質管理等に耐え得る均質な品質を有するム
タンを比較的短時間で効率良く製造することができ、得
られたムタンは、例えばムタナーゼ力価測定用基質又は
試薬、練歯磨、液状歯磨、洗口剤等の歯垢形成抑制や歯
垢除去等を目的とした口腔用組成物などに応用可能であ
る。

【００３３】

【実施例】以下、実験例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限される
ものではない。

【００３４】〔実験例１〕デキストラナーゼ添加条件の
検討（培養法） ムタンを培養法により、下記培養条件及び方法で製造し
た。 ムタンの製造方法：５００ｍｌの培養瓶を用いて１０％
ショ糖を含むブレイン・ハート・インヒュージョン培地
（ＢＨＩ培地、ＢＢＬ社製）を３００ｍｌの脱イオン水
中に溶解し、１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理
を行った。次いで、予めＢＨＩ培地で一晩前培養を行っ
たストレプトコッカス・ソブリナス６７１５菌液を３ｍ
ｌ植菌した。同時にデキストラナーゼを表１の条件に従
い添加し、３７℃で静置培養を行った。以後２４時間ご
とに所定の条件でデキストラナーゼを添加すると共に、
適当な濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いて培地ｐＨを
７．０に調整した。培養６日目に得られた沈殿物（グル
カンと菌体の混合物）を遠心分離により回収した。

【００３５】次に、得られた沈殿物を１Ｎの水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、室温で１時間放置した。放置後、
遠心分離により除菌操作を行い、得られた上清は２Ｎの
塩酸を用いて中和後、低温室に一晩放置しムタンを析出
させた。翌日、析出したムタンを遠心分離で集め、脱イ
オン水で十分洗浄した後、凍結乾燥を行い、ムタン標品
を得た。

【００３６】得られたムタンの評価を以下の方法で行っ
た。 ムタナーゼ力価：上記方法で調製したムタンを４％（Ｗ
／Ｗ）となるように蒸留水に懸濁し、本懸濁液０．６ｍ
ｌに酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）に溶解したム
タナーゼ０．２ｍｌを加え、４０℃で１０分間反応させ
た。上清に遊離した還元糖をソモギーネルソン法を用い
て測定し、力価とした。 デキストラナーゼとの反応性：本懸濁液０．６ｍｌにリ
ン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に溶解した５００
Ｕ／ｍｌのデキストラナーゼ０．２ｍｌを加え、４０℃
で１０分間反応させ、上清に遊離した還元糖をソモギー
ネルソン法を用いて測定した。

【００３７】表１の結果より、デキストラナーゼと反応
しない（Ｏ．Ｄ０．１以下）グルカンをムタンと定義す
るならば、培養法でのムタン製造においては、デキスト
ラナーゼを１０Ｕ／ｍｌ／日以上添加することが望まし
く、更にムタンの純度（デキストラナーゼと反応しない
こと）やバラツキの点から判断すると、１００Ｕ／ｍｌ
／日以上添加することが好ましいことがわかった。

【００３８】

【表１】 ＊１）◎：３ロットのムタンを力価を指標に評価したと
きのバラツキ（Ｃ．Ｖ値）が３％以下 ○：３ロットのムタンを力価を指標に評価したときのバ
ラツキ（Ｃ．Ｖ値）が５％以下 ×：３ロットのムタンを力価を指標に評価したときのバ
ラツキ（Ｃ．Ｖ値）が５％超 ＊２）デキストラナーゼと反応させた結果遊離した還元
糖量 ◎：Ｏ．Ｄ６６０ｎｍが０．０５以下 ○：Ｏ．Ｄ６６０ｎｍが０．０５超０．１以下 ×：Ｏ．Ｄ６６０ｎｍが０．１超 ＊３）デキストラナーゼを添加しないで得られたムタン
を１ヶ月デキストラナーゼ処理した後の値。なお、それ
以上のデキストラナーゼ処理を繰り返してもＯ．Ｄ値が
０．０７以下にはならなかった。

【００３９】〔実験例２〕デキストラナーゼ添加条件の
検討（酵素法） ムタンを酵素法により下記反応条件及び方法で製造し
た。 ムタンの製造方法： （１）菌体外グルコシルトランスフェラーゼの調製 ストレプトコッカス・ソブリナス６７１５株を１リット
ルのＢＨＩ培地を用いて一晩培養し、この培養液を遠心
分離により上清と沈渣に分けた。上清に５０％飽和にな
るように硫安（３１３ｇ／Ｌ）を加え、４℃で一晩スタ
ーラーで撹拌した。これを遠心し得られた沈渣を培養上
清の１／４０容量の５ｍＭナトリウム・リン酸緩衝液
（以下、リン酸緩衝液という）に懸濁させた。この懸濁
液を同緩衝液に対して４℃で一晩透析したものを菌体外
グルコシルトランスフェラーゼ標品とした。 （２）酵素反応 ５００ｍｌの培養瓶に上記菌体外グルコシルトランスフ
ェラーゼ標品と１０％ショ糖を含むリン酸緩衝液３００
ｍｌを加え、同時にデキストラナーゼを表２の条件に従
い添加し、３７℃で反応を行った。反応２日目に得られ
た沈殿物を遠心分離により回収した。

【００４０】次に、得られた沈殿物を１Ｎの水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、室温で１時間放置した。放置後、
遠心分離により不溶物を除去し、得られた上清は２Ｎの
塩酸を用いて中和後、低温室に一晩放置しムタンを析出
させた。翌日析出したムタンを遠心分離で集め、脱イオ
ン水で十分洗浄した後、凍結乾燥を行いムタン標品とし
た。

【００４１】得られたムタンの評価を実験例１と同様の
方法で行った。結果を表２に示す。表２の結果より、デ
キストラナーゼと反応しない（Ｏ．Ｄ０．１以下）グル
カンをムタンと定義するならば、酵素法によるムタン製
造においては、デキストラナーゼを１Ｕ／ｍｌ／日以上
添加することが好ましく、更にムタンの純度（デキスト
ラナーゼと反応しないこと）やバラツキの点から判断す
ると５０Ｕ／ｍｌ／日以上添加することが好ましいこと
がわかった。

【００４２】

【表２】 ＊１）、＊２）、＊３）は表１と同様

【００４３】〔実施例１〕下記方法及び条件でムタンを
製造した。 培地組成： ＴＴＹ培地 トリプチケース（ＢＢＬ） １５ｇ／Ｌ トリプトース（Ｄｉｆｃｏ） ４ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） ４ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２ Ｎａ₂ＣＯ₃ ２ ＮａＣｌ ２ ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ グルコース １０ ムタンの製造方法：５リットルの培養瓶を用いて１％シ
ョ糖を含む上記ＴＴＹ培地成分を３リットルの脱イオン
水中に溶解し、１２１℃で２０分間のオートクレーブ処
理を行った。次いで、予めブレイン・ハート・インヒュ
ージョン培地（ＢＢＬ社製）で一晩前培養を行ったスト
レプトコッカス・ソブリナス６７１５菌液を３ｍｌ植菌
した。同時にデキストラナーゼを１００Ｕ／ｍｌとなる
よう添加し、３７℃で静置培養を行った。

【００４４】２４時間培養後、今度は４０％ショ糖を含
むＴＴＹ培地１リットルとデキストラナーゼ１００Ｕ／
ｍｌを培養液に添加すると共に、適当な濃度の水酸化ナ
トリウム溶液を用いて培地ｐＨを７．０に調整した。

【００４５】以後２４時間ごとにデキストラナーゼの添
加とｐＨの調整を行い、培養６日目に、得られた沈殿物
（グルカンと菌体の混合物）を遠心分離により回収し
た。

【００４６】次に、得られた沈殿物を１Ｎの水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、室温で１時間放置した。放置後遠
心分離により除菌操作を行い、得られた上清は２Ｎの塩
酸を用いて中和後、低温室に一晩放置しムタンを析出さ
せた。翌日析出したムタンを遠心分離で集め、脱イオン
水で十分洗浄した後、凍結乾燥を行った。

【００４７】この操作により、約８ｇの白色粉末（ムタ
ン）を得ることができた。得られたムタンを下記方法で
評価した。結果を表３に示す。 ムタナーゼ力価の測定法：上記方法で調製したムタン４
ｇを４５ｍｌの１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に溶解し、
室温に１０分間放置した。次いで１Ｎの硫酸水溶液を用
いて中和し、ムタンを析出させた。最後に４％（Ｗ／
Ｗ）となるよう蒸留水でメスアップしホモミキサーで十
分懸濁したものを基質用液（以下、コロイダルムタンと
いう）とした。

【００４８】力価の測定は、上記コロイダルムタン０．
６ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、４０℃で１０分間反
応を行い、上清中に遊離した還元糖をソモギーネルソン
法を用いて測定した。 デキストラナーゼとの反応性：上記コロイダルムタン
０．６ｍｌにリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に
溶解した５００Ｕ／ｍｌのデキストラナーゼ０．２ｍｌ
を加え、４０℃で１０分間反応させ、上清に遊離した還
元糖をソモギーネルソン法を用いて測定した。

【００４９】

【表３】

【００５０】表３の結果から、５リットルスケールでも
高品質のムタンが調製できることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 口腔連鎖球菌から培養法又は酵素法でム
   タンを製造する際、ムタン生合成工程中にデキストラナ
   ーゼを添加することを特徴とするムタンの製造方法。