JPH10221346A - 血液凝固能の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 反応系におけるフィブリン塊の生成速度を抑
制して凝固時間（測定可能時間）を延長することによ
り，測定を終了した時点でも，生成されたフィブリン塊
が反応セルの壁面に固着しないようにして，測定後の反
応セルの再使用を可能にすると共に，一般的な自動分析
装置で測定できるようにすること。 【解決手段】 試薬を希釈液で希釈する希釈工程（Ｓ１
０２）と，希釈した試薬を用いて，所定量の検体および
試薬を反応セルに分注し，混合させることにより，希釈
した反応系を作成する反応系作成工程（Ｓ１０３）と，
反応系の濁度を光学的に測定する濁度測定工程（Ｓ１０
４）と，濁度に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲
であるか，血液凝固能が高いことによる異常範囲である
か，血液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判
定する判定工程（Ｓ１０５）と，測定済みの反応セルを
洗浄する洗浄工程（Ｓ１０６）と，を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，検体と試薬とを混
合させて反応系を作成し，反応系でフィブリン塊が生成
されることによって生じる濁度を光学的に測定して検体
の血液凝固能を測定する血液凝固能の測定方法に関し，
より詳細には，フィブリン塊の生成速度を抑制すること
により，血液凝固能の測定可能時間を延長して一般の自
動分析装置の使用を可能とすると共に，反応セルの再使
用を図れるようにした血液凝固能の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液検査項目の一つとして，血液凝固能
を測定して，検体（ここでは，検査対象者の血液成分）
の凝血障害の鑑別を行う項目が知られている。具体的に
は，この凝血障害の鑑別を行う項目の代表的なものとし
て，ＰＴ測定用試薬を用いて検体のプロトロンビン時間
（ＰＴ）を測定するＰＴ項目や，ＡＰＴＴ測定用試薬を
用いて検体の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ）を測定するＡＰＴＴ項目等がある。

【０００３】また，血液凝固能の測定方法としては，
検体と試薬とを混合させて反応系を作成し，該反応系で
フィブリン塊が生成されることによって生じる粘度変化
を測定する方法や，検体と試薬とを混合させて反応系
を作成し，該反応系でフィブリン塊が生成されることに
よって生じる濁度を光学的に測定する方法の２つの方法
がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら，上記従
来の血液凝固能の測定方法によれば，フィブリン塊の生
成によって生じる粘度変化または濁度を測定すること
で，血液凝固能を測定しているものの，反応系における
フィブリン塊の生成速度が速いため，測定を終了した時
点で，生成されたフィブリン塊が凝固して反応セルの壁
面に固着してしまうという問題点があった。

【０００５】換言すれば，血液凝固能の測定に使用する
反応セルは，使い捨てセルを用いる必要があるため，コ
ストがかかるという問題点や，使い捨てセルが使用可能
な自動分析装置でしか測定できないという問題点があっ
た。

【０００６】また，の粘度変化を測定する方法では，
例えば，カップ（反応セル）の中にスチールボールを入
れ，検体と試薬とを混合し，フィブリン塊の生成に伴っ
て粘度が上昇してくると一定速度で回っているカップ中
のスチールボールがカップと一緒に動き始めることを利
用して，このボールが動き始める時間を凝固時間として
測定しているが，このような測定が行える専用の測定装
置が必要であるという問題点があった。換言すれば，一
般の自動分析装置を用いて測定を行うことができないと
いう問題点があった。

【０００７】一方，濁度を測定する方法では，原理的
には，使い捨てセルが使用可能な自動分析装置であれ
ば，その装置を使用して血液凝固能の測定を行うことが
できるものの，現実的には，フィブリン塊の生成速度が
速く，凝固時間（換言すれば，測定可能時間）が短いた
め，測光ポイント（反応開始から濁度の測光を行うまで
の測光間隔）が２０秒程度に設定されている一般的な自
動分析装置では，測定時点で既に反応が終了しているこ
とになり，濁度の測定が行えないという問題点があっ
た。特に，ＰＴ項目の測定では，ＰＴの正常範囲の凝固
時間が１０秒前後と短いため，一般的な自動分析装置で
は，前述したように測光ポイントの関係で測定できなか
った。

【０００８】さらに，上記従来の濁度を測定する方法
によれば，フィブリン塊の生成速度が速く，凝固時間
（換言すれば，測定可能時間）が短いため，血液凝固能
の測定を行う場合に，検体の血液凝固能が正常範囲であ
るか（換言すれば，正常範囲の時間内で凝固が終了した
か），血液凝固能が低いことによる異常範囲であるか
（換言すれば，正常範囲の時間より長く凝固時間がかか
ったか）の２種類の鑑別しか行えなず，血液凝固能が高
いことによる異常範囲の場合（正常範囲より短い時間で
凝固してまう場合）には，一般的な自動分析装置の測光
ポイントでは過凝固の状態で測定されて正常範囲として
鑑別されてしまうという不具合があった。

【０００９】本発明は上記に鑑みてなされたものであっ
て，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を抑制して
凝固時間（測定可能時間）を延長することにより，測定
を終了した時点でも，生成されたフィブリン塊が反応セ
ルの壁面に固着しないようにして，測定後の反応セルの
再使用を可能にすると共に，一般的な自動分析装置で測
定できるようにすることを目的とする。

【００１０】本発明は上記に鑑みてなされたものであっ
て，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を抑制して
凝固時間（測定可能時間）を延長することにより，血液
凝固能が高いことによる異常範囲の場合（正常範囲より
短い時間で凝固してまう場合）でも，一般的な自動分析
装置で測定できるようにすることを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに，請求項１に係る血液凝固能の測定方法は，検体と
試薬とを混合させて反応系を作成し，前記反応系でフィ
ブリン塊が生成されることによって生じる濁度を光学的
に測定して前記検体の血液凝固能を測定する血液凝固能
の測定方法において，前記検体または／および試薬を希
釈液で希釈する希釈工程と，前記希釈工程で希釈した前
記検体または／および試薬を用いて，所定量の前記検体
および試薬を反応セルに分注し，混合させることによ
り，希釈した反応系を作成する反応系作成工程と，前記
希釈した反応系の濁度を光学的に測定する濁度測定工程
と，前記濁度測定工程で測定した濁度に基づいて，前記
検体の血液凝固能が正常範囲であるか，血液凝固能が高
いことによる異常範囲であるか，血液凝固能が低いこと
による異常範囲であるかを判定する判定工程と，前記濁
度測定工程で濁度を測定した後に，測定済みの前記反応
セルを洗浄する洗浄工程と，を含むものである。

【００１２】また，請求項２に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項１記載の血液凝固能の測定方法において，
前記希釈液が，前記希釈した反応系の塩濃度を前記フィ
ブリン塊の生成に適した塩濃度の範囲から外すために，
あらかじめＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ が添加されている
か，またはＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ を含まないもので
ある。

【００１３】また，請求項３に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項１または２記載の血液凝固能の測定方法に
おいて，前記希釈した反応系で，前記検体が２０倍希釈
程度で希釈された状態であり，前記試薬が１００倍希釈
程度で希釈された状態であるものである。

【００１４】また，請求項４に係る血液凝固能の測定方
法は，検体と試薬とを混合させて反応系を作成し，前記
反応系でフィブリン塊が生成されることによって生じる
濁度を光学的に測定して前記検体の血液凝固能を測定す
る血液凝固能の測定方法において，前記反応系の塩濃度
を前記フィブリン塊の生成に適した塩濃度の範囲から外
すために，前記試薬にＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ を添加
する塩添加工程と，所定量の前記検体および試薬を反応
セルに分注し，混合させることにより，反応系を作成す
る反応系作成工程と，前記反応系の濁度を光学的に測定
する濁度測定工程と，前記濁度測定工程で測定した濁度
に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範囲である
か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判定する
判定工程と，前記濁度測定工程で濁度を測定した後に，
測定済みの前記反応セルを洗浄する洗浄工程と，を含む
ものである。

【００１５】また，請求項５に係る血液凝固能の測定方
法は，請求項１〜４記載のいずれか一つの血液凝固能の
測定方法において，前記試薬が，ＰＴ測定用試薬または
ＡＰＴＴ測定用試薬であるものである。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下，本発明の血液凝固能の測定
方法について，〔実施の形態１〕，〔実施の形態２〕，
〔実施の形態３〕の順で，図面を参照して詳細に説明す
る。

【００１７】〔実施の形態１〕実施の形態１の血液凝固
能の測定方法（以下，希釈法と記載する）は，検体また
は／および試薬を希釈液で希釈して，これら検体，試薬
および希釈液を混合した反応系（すなわち，希釈した反
応系）においてフィブリン塊の生成反応を行わせること
により，該フィブリン塊の生成速度を抑制して凝固時間
（測定可能時間）を延長できるようにしたものである。

【００１８】ただし，既存の血液凝固能の測定方法の発
想では，最も血液凝固を効率的に行える条件で，確実に
フィブリン塊を生成して血液凝固能を測定することを目
的としているため，フィブリン塊の生成を抑制すること
は考えにくかった。また，従来，反応系を希釈した場合
に，検体の血液凝固（フィブリン塊の生成反応）が起こ
るか否か検証されておらず，またフィブリン塊が生成さ
れた場合でも血液凝固能の測定に利用できるが否か検証
されていなかった。

【００１９】したがって，以下に示すように， 希釈法（実施の形態１の血液凝固能の測定方法）の概
略フローチャート， 希釈法の検討項目 希釈法の同時再現性 希釈法と従来法との相関性 の順で，希釈法の説明と共に，希釈法によって従来法と
同様に血液凝固能を測定できることを証明する。

【００２０】希釈法の概略フローチャート 図１は，実施の形態１の血液凝固能の測定方法（希釈
法）の概略フローチャートを示す。ここでは，検体のプ
ロトロンビン時間（ＰＴ）から血液凝固能を測定する場
合を例として説明する。

【００２１】また，使用する検体，試薬，希釈液，測定
装置および測定条件は以下の通りである。 検体：血液凝固検査で用いる検体は，血漿であり，全血
から血球等（赤血球，白血球，血小板）を除去したもの
である。具体的には，抗凝固剤を入れた真空採血管で採
血し，採血した全血を遠心分離すると血漿（検体）が得
られる。 試薬：市販のＰＴ測定用試薬（商品名：トロンボプラス
チン・Ｃ，販売元：株式会社ミドリ十字）を用いる。 希釈液：ＨＥＰＥＳ緩衝液３０ｍＭに，ＮａＣｌ（１３
０ｍＭ），ＣａＣｌ₂（１２．５ｍＭ）を添加して塩濃
度を調整する。次に，この緩衝液をＰＨ７．３５に調整
し，希釈液とする。 希釈条件（希釈倍率）：希釈液３９６μｌを用いて試薬
４μｌを希釈（１００倍希釈）する。その後，試薬・希
釈液の混合液４００μｌを検体２０μｌを用いて希釈
（約２０倍希釈）し，希釈した反応系とする。 測定装置：一般的な自動分析装置を用いる。具体的に
は，日立製作所製の自動分析装置（７０５０形日立自動
分析装置）を使用する。 測光ポイント：自動分析装置７０５０の１ポイント２０
秒の測光間隔において，５−３２ポイントの範囲の少な
くとも二つのポイントを，濁度（吸光度）の測光ポイン
トして設定する。

【００２２】図１のフローチャートにおいて，先ず，検
体，試薬または希釈液が入ったカップをそれぞれ自動分
析装置に載置する（Ｓ１０１）。このとき，載置された
検体のカップは室温に保たれ，試薬および希釈液のカッ
プはそれぞれ冷却されている。

【００２３】次に，試薬４μｌと希釈液３９６μｌを混
合したものを所定の反応セルに分注する（Ｓ１０２：請
求項１の希釈工程）。これによって，試薬が希釈（１０
０倍希釈）されたことになる。

【００２４】次に，ステップＳ１０２で希釈した試薬が
入った反応セルに，検体４μｌを分注し，混合させるこ
とにより，希釈した反応系を作成する（Ｓ１０３：請求
項１の反応系作成工程）。なお，ここで検体を分注した
時点を０ポイントとして測光ポイントのカウントが開始
される。

【００２５】ステップＳ１０３で検体を分注してから，
あらかじめ設定した測光ポイント（例えば，１０ポイン
ト）に到達すると，前記希釈した反応系の吸光度（濁
度）を光学的に測定する（Ｓ１０４：請求項１の濁度測
定工程）。

【００２６】ステップＳ１０４で測定した吸光度（濁
度）に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲である
か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判定する
（Ｓ１０５：請求項１の判定工程）。具体的には，自動
分析装置のプリンタまたは表示部に，測定した吸光度を
表示し，オペレータ（分析者）が目視で吸光度を確認し
て，あらかじめ検証された正常値の吸光度の範囲に入っ
ているか，または上下の何れに外れているかに基づい
て，正常値の吸光度の範囲の場合に検体の血液凝固能が
正常範囲であると判定し，正常値の範囲を超えている場
合に検体の血液凝固能が高いことによる異常であると判
定し，正常値の範囲より低い場合に検体の血液凝固能が
低いことによる異常であると判定する。なお，この判定
工程は，あらかじめ判定プログラムを作成して，自動分
析装置に組み込むことにより，自動化することができる
のは勿論である。

【００２７】その後，ステップＳ１０３で吸光度（濁
度）を測定した後に，測定済みの反応セルを洗浄する
（Ｓ１０６：請求項１の洗浄工程）。なお，希釈法で
は，希釈した反応系を用いることにより，フィブリン塊
の生成速度を抑制して凝固時間（測定可能時間）が延長
されているため，測定を終了した時点でも，生成された
フィブリン塊が反応セルの壁面に固着しない。したがっ
て，一般的な自動分析装置に備わっている洗浄工程で，
使用済みの反応セルを容易に洗浄することができ，測定
後の反応セルの再使用が可能となる。

【００２８】前述したように実施の形態１の血液凝固能
の測定方法（希釈法）によれば，反応系におけるフィブ
リン塊の生成速度を抑制して凝固時間（測定可能時間）
を延長することにより，測定を終了した時点でも，生成
されたフィブリン塊が反応セルの壁面に固着しないよう
にして，測定後の反応セルの再使用が可能となる。

【００２９】また，凝固時間（測定可能時間）を延長す
ることにより，測光ポイントを大きくすることができる
ため，一般的な自動分析装置で測定することができる。

【００３０】さらに，血液凝固能が高いことによる異常
範囲の場合（正常範囲より短い時間で凝固してまう場
合）でも，一般的な自動分析装置で測定することができ
る。

【００３１】希釈法の検討項目 次に，前述した希釈法で説明したように，反応系を希釈
した場合に，反応系におけるフィブリン塊の生成速度を
抑制して凝固時間（測定可能時間）の延長が行えるこ
と，および検体の血液凝固能の測定が行えること，につ
いて具体的に説明する。

【００３２】希釈法を実施する場合に，反応系を希釈す
ることによって，フィブリン塊の生成速度が自動分析装
置で測定するのに適した生成速度に抑制され，かつ，測
定した吸光度（濁度）から血液凝固能の判定を確実に行
えることが重要（必須条件）である。

【００３３】このため，希釈法を実施するための検討項
目として，以下の項目を設定し，上記必須条件を満たす
ようにこれらの項目を検討した。なお，これらの検討項
目は互いに影響し合うため，多種多様な条件で実験を行
った結果に基づいて，最終的にそれぞれの項目の実験が
最適に行える条件で希釈法を実施した。

【００３４】また，測定装置としては，一般的な自動分
析装置を用いることを前提とし，一般的な自動分析装置
の１ポイント２０秒の測光間隔において，５−３２ポイ
ントの範囲で測光を行った。

【００３５】−１ 検量線データ（希釈法のΔＯＤと
従来法の凝固時間との関係） 先ず，図２の検量線データを参照して，希釈法のΔＯＤ
と従来法の凝固時間との関係について説明する。なお，
ΔＯＤは一定時間の吸光度差を示し，ここでは，自動分
析装置における５ポイント目の吸光度と３２ポイント目
の吸光度との差（３２ポイント目の吸光度−５ポイント
目の吸光度）を示す。

【００３６】従来の粘度変化を測定する方法で測定した
際の凝固時間が，１１．３秒，１５．５秒，２１．７
秒，２５．４秒，３０．２秒の５つの種類の検体を準備
する。これら５つの検体を，希釈法（図１の概略フロー
チャートで示した方法）を用いて５ポイント目の吸光度
と３２ポイント目の吸光度との差（ΔＯＤ）を求め，以
下の結果を得た。 凝固時間（１１．３秒） → ΔＯＤ（１３８５） 凝固時間（１５．５秒） → ΔＯＤ （７２４） 凝固時間（２１．７秒） → ΔＯＤ （３９７） 凝固時間（２５．４秒） → ΔＯＤ （２５９） 凝固時間（３０．２秒） → ΔＯＤ （１３２）

【００３７】次に，希釈法におけるΔＯＤと従来法の凝
固時間とを用いて図２に示すように検量線データを作成
した。これにより，希釈法で測定したΔＯＤを従来法の
凝固時間に換算することができ，希釈法による血液凝固
能の判定（鑑別）を行う際の基準を得ることができる。
なお，この検量線データが実際に使用可能であること
は，後述する希釈法の同時再現性と希釈法と従来法
との相関性によって明らかになる。

【００３８】−２ 希釈液中の塩濃度の検討 次に，希釈液中の塩濃度の影響について説明する。本発
明者は，希釈法の実験を行う過程で，希釈液の塩濃度を
調整しない場合（すなわち，塩が無添加の場合）に検体
中の塩濃度の違いによって，従来法で凝固時間が同じ検
体でも，希釈法で測定したΔＯＤの値にずれが生じるこ
とを発見した。これは反応系の塩濃度が検体の塩濃度の
みに依存するため，その影響が大きく現れるものと推定
される。換言すれば，反応系の塩濃度によってフィブリ
ン塊の生成が影響を受けることを発見し，最適な希釈液
の塩濃度について検討した。

【００３９】図３は，希釈液中のＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂
濃度の影響を示す説明図である。ここでは，試薬（トロ
ンボプラスチン・Ｃ）を４μｌ，希釈液（ＨＥＰＥＳ緩
衝液，ＰＨ７．３５）を３９６μｌ，検体（正常血漿と
高度異常血漿の２種類）を２０μｌとして，図示の如
く，塩濃度（ＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂ ）を変えて希釈法を
実施し，ΔＯＤ（吸光度差：３２−５ポイント）を測定
して塩濃度の影響を調べた。なお，図３において，ΔＯ
Ｄ１は検体が正常血漿の場合の吸光度差，ΔＯＤ２は検
体が高度異常血漿の場合の吸光度差を示す。

【００４０】先ず，ＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂ を添加しない
場合，ΔＯＤ１は１３５２，ΔＯＤ２は１３０であっ
た。この値を塩濃度の影響の判定値として用いる。判定
値としては，できるだけΔＯＤが大きいほど再現性や，
異常と正常の分離能が大きくなるので好ましい。

【００４１】次に，ＮａＣｌを１３０ｍＭとして，Ｃａ
Ｃｌ₂ を３〜５０ｍＭの範囲で変えたところ，ＣａＣｌ
₂ が１２．５ｍＭで最も判定値に近い値を示した。

【００４２】次に，ＣａＣｌ₂ を１２．５ｍＭとして，
ＮａＣｌを３０〜５００ｍＭの範囲で変えたところ，Ｎ
ａＣｌが３０ｍＭで最も判定値に近い値を示した。

【００４３】さらに，ＮａＣｌ：１３０ｍＭ，ＣａＣｌ
₂ ：１２．５ｍＭのΔＯＤ１，２と，ＮａＣｌ：３０ｍ
Ｍ，ＣａＣｌ₂ ：１２．５ｍＭのΔＯＤ１，２との比較
から，ＮａＣｌ：１３０ｍＭ，ＣａＣｌ₂ ：１２．５ｍ
Ｍが最も判定値に近い値であることが分かった。

【００４４】上記の結果より，試薬（トロンボプラスチ
ン・Ｃ）を４μｌ，希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液，ＰＨ
７．３５）を３９６μｌ，検体（正常血漿と高度異常血
漿の２種類）を２０μｌとして用いる場合の希釈法にお
いて，希釈液の塩濃度をＮａＣｌ：１３０ｍＭ，ＣａＣ
ｌ₂ ：１２．５ｍＭに調整することが望ましいことが明
らかになった。

【００４５】−３ 希釈倍率の検討 次に，希釈倍率について説明する。希釈倍率の影響とし
ては，反応系中における試薬の希釈倍率および検体の希
釈倍率の影響の両方が考えられる。したがって，図４に
示すように，試薬：希釈液：検体のそれぞれの比率を変
えて希釈した反応系を生成し，希釈法で１分後（３ポイ
ント目）の吸光度ＯＤ₀₁と１０分後（３０ポイント目）
の吸光度ＯＤ₁₀を求め，反応速度比（ＯＤ₁₀／ＯＤ₀₁）
を求めた。この反応速度比がＯＤ₁₀／ＯＤ₀₁≦１の場
合，１分後に既に凝固が殆ど終了しており，１０分後ま
でフィブリン塊の生成状態に変化がないことを示してい
る。また，ＯＤ₁₀／ＯＤ₀₁≒１０の場合には，反応速度
が緩やかで，かつ，反応タイムコースが直線（１０分間
の反応の進行状態がほぼ時間に比例している）であるこ
とを示している。

【００４６】さらに，反応セルを洗浄して再使用する目
的から，フィブリン塊の生成が進み過ぎて，フィブリン
塊が反応セルに固着（凝固）することは望ましくないの
で，従来の粘度変化を測定する方法を用いて凝固の程度
を観測し，十分な時間（例えば，検体が正常血漿の場合
には１１秒以上）経過してもスチールボールが動かない
場合に，『凝固しない』と判定し，スチールボールが動
くが１回転せずに元に戻る場合に，『わずかに凝固す
る』と判定し，スチールボールが１回転以上動く場合
に，『凝固する』と判定し，凝固（すなわち，フィブリ
ン塊の固着発生）の程度の目安とした。

【００４７】図４に示すように，反応速度比が大きく，
凝固の程度が『凝固しない』であるものを探すと，試薬
４μｌ：希釈液３９６μｌ：検体２０μｌで測定した結
果が該当することが分かる。これより，希釈した反応系
で，検体が２０倍希釈程度で希釈された状態であり，試
薬が１００倍希釈程度で希釈された状態であることが望
ましいことが明らかである。

【００４８】図５は，このようにして求めた希釈倍率
（試薬４μｌ：希釈液３９６μｌ：検体２０μｌ）を用
いて，希釈法で１−３２ポイントの各ポイントのＯＤ
（吸光度）を測定し，ＯＤ（反応状態）と時間（ポイン
ト）との反応タイムコースを作成したものである。図５
の反応タイムコースから明らかなように，反応開始時か
ら４ポイント目までは，反応速度が安定していない（す
なわち，反応タイムコースが折れ線となっており，また
傾斜が大きい）ものの，５ポイント目以降は，ほぼ直線
となって反応が安定している。この直線が緩やかである
ほど，フィブリン塊の生成が抑制されていることを示
し，さらに直線度が高い程，フィブリン塊の生成が安定
的に時間に比例して進んでいることを示している。

【００４９】−４ 希釈液種類の検討 次に，希釈液の種類について検討結果を示す。希釈液と
して，イミダゾール緩衝液，グリシン緩衝液，ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液を用いて，それぞれの緩衝液３９６μｌにＮａ
Ｃｌ（１３０ｍＭ），ＣａＣｌ₂ （１２．５ｍＭ）を添
加して塩濃度を調整し，ＰＨ７．３５に調整した。

【００５０】さらにこれらの希釈液を用いて，試薬（ト
ロンボプラスチン・Ｃ）を４μｌ，希釈液を３９６μ
ｌ，検体（正常血漿と高度異常血漿の２種類）を２０μ
ｌとして，希釈法で３２−５ポイントのΔＯＤ１（検体
が正常血漿の場合の吸光度差），ΔＯＤ２（検体が高度
異常血漿の場合の吸光度差）を求めた。

【００５１】図６は，上記希釈液の種類に対応した検討
結果を示す。図示の如く，イミダゾール緩衝液，グリシ
ン緩衝液，ＨＥＰＥＳ緩衝液の何れを希釈液として用い
ても大差なく，希釈法に使用可能であることが明らかに
なった。

【００５２】−５ 希釈法の検討結果 以上の各検討項目の結果より，希釈法を実施する場合の
反応系の希釈条件として，以下のことが明らかになっ
た。

【００５３】第１に，試薬（トロンボプラスチン・Ｃ）
を４μｌ，希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液，ＰＨ７．３５）
を３９６μｌ，検体（正常血漿と高度異常血漿の２種
類）を２０μｌとして用いる場合の希釈法において，希
釈液の塩濃度をＮａＣｌ：１３０ｍＭ，ＣａＣｌ₂ ：１
２．５ｍＭに調整することが望ましい。

【００５４】第２に，希釈した反応系で，検体が２０倍
希釈程度で希釈された状態であり，試薬が１００倍希釈
程度で希釈された状態であることが望ましい。

【００５５】第３に，希釈液は，イミダゾール緩衝液，
グリシン緩衝液，ＨＥＰＥＳ緩衝液の何れを用いても良
い。

【００５６】希釈法の同時再現性 次に，上記希釈法の検討結果に基づいて，実施の形態１
の血液凝固能の測定方法（希釈法）を実施した場合の同
時再現性について説明する。

【００５７】図７は，希釈法の同時再現性を示すための
説明図である。検体として正常血漿を用いて，同一の測
定条件で１０回の測定を行った。また，検体として高度
異常血漿を用いて，同一の測定条件で１０回の測定を行
った。なお，ここでは，希釈法で測定したＯＤ値を図２
の検量線データを用いて従来法（従来の粘度変化を測定
する方法）の凝固時間（秒）に変換した値を測定結果と
して示す。

【００５８】図７に示すように，それぞれ平均値Ｘが１
１．１（秒）と２３．９（秒）であり，再現性が２．４
％と２．３％であった。この結果より，本発明の希釈法
の再現性が十分に高く，血液凝固能の測定に使用可能で
あることが明らかである。

【００５９】希釈法と従来法との相関性 次に，希釈法と従来法（従来の粘度変化を測定する方
法）との相関性について説明する。図８は，複数の検体
（３０検体）を，それぞれ希釈法と従来法の両方で測定
し，相関図を作成したものである。図示の如く，非常に
相関度（Ｒ＝０．８２５）の高い対応を示しており，従
来法で正常範囲と判定される範囲の検体は，希釈法でも
正常範囲と判定される領域に分布しており，希釈法が従
来法と同様に血液凝固能の測定に使用可能であることが
明らかである。

【００６０】〔実施の形態２〕実施の形態２の血液凝固
能の測定方法（以下，希釈法と記載する）は，基本的に
実施の形態１の血液凝固能の測定方法と同様であり，試
薬としてＡＰＴＴ測定用試薬を用いてＡＰＴＴ項目を測
定するようにしたものである。

【００６１】ただし，ＡＰＴＴ項目の測定では，試薬と
してＡＰＴＴ測定用試薬を用いて，検体の活性化部分ト
ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定するため，一
連のフィブリン塊の生成反応サイクルにおいて，実施の
形態１で示したＰＴ測定用試薬と，ＡＰＴＴ測定用試薬
の作用部位が異なる。

【００６２】したがって，ここでは，ＡＰＴＴ測定用試
薬の作用部位に違いによる希釈法の変更部分のみを詳細
に説明する。

【００６３】ＡＰＴＴ測定用試薬は，第１試薬（商品
名：アクチン）と第２試薬（ＣａＣｌ ₂ ）との２つの試
薬からなる。これは，検体と第１試薬とを反応させて，
約３〜５分間放置し，活性化を行った後，第２試薬をト
リガーとしてフィブリン塊の生成を行うためである。

【００６４】また，ＡＰＴＴ項目の測定では，フィブリ
ン塊の生成速度がＰＴ項目の測定と比較して遅いため，
自動分析装置での測光ポイントを１９−３２に設定す
る。また，測光ポイントのカウントは，検体と第２試薬
とを混合した時点から開始する。

【００６５】また，希釈液の塩濃度は，基本的に実施の
形態１と同様であるが，前述したようにＣａＣｌ₂ が第
２試薬として添加されるため，希釈液の塩濃度はＮａＣ
ｌのみで調整するものとする。

【００６６】なお，上記の相違点は，血液凝固能の測定
を行う当業者にとっては，周知のことであり，実施の形
態１の希釈法で示した概略フローチャート（図１参照）
を変更して容易にＡＰＴＴの測定を行うことができる。

【００６７】さらに試薬の変更に伴って試薬の希釈倍率
を変更した。詳細は後述するが，ＡＰＴＴ測定用試薬の
場合，実験によって希釈倍率１０倍が最適であった。

【００６８】次に，ＡＰＴＴ測定用試薬を用いた場合の
希釈法の実施例について具体的に説明する。測定は以下
の条件で行った。検体：正常血漿 試薬：第１試薬（商品名：アクチン），第２試薬（Ｃａ
Ｃｌ₂ ） 希釈液：希釈液として第１〜第３の３種類を用意する。
第１の希釈液は，イミダゾール緩衝液（５０ｍＭ）にＮ
ａＣｌ（１００ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。第
２の希釈液は，ＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ）にＮａＣ
ｌ（１３０ｍＭ）を添加して塩濃度を調整する。第３の
希釈液は，ＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ）はＮａＣｌの
添加なし。すなわち，塩濃度の調整なし。なお，これら
の希釈液はＰＨ７．３５に調整する。 測定装置：一般的な自動分析装置を用いる。具体的に
は，日立製作所製の自動分析装置（７０５０形日立自動
分析装置）を使用する。 測光ポイント：自動分析装置７０５０の１ポイント２０
秒の測光間隔において，１９−３２ポイントの範囲の少
なくとも二つのポイントを，濁度（吸光度）の測光ポイ
ントして設定する。

【００６９】上記のように複数の希釈液（第１の希釈液
〜第３の希釈液）をそれぞれ単独に用いて，第１試薬お
よび第２試薬を，１０倍希釈，５０倍希釈，１００倍希
釈で希釈し，それぞれの場合について，以下のように希
釈法でΔＯＤ（３２ポイント目の吸光度と１９ポイント
目の吸光度の差）を求めた。

【００７０】先ず，第１試薬（アクチン）を上記の希釈
倍率で希釈してＲ１とし，次に，第２試薬（１．２５ｍ
ＭのＣａＣｌ₂ ）を同様に希釈してＲ２とする。

【００７１】次に，検体をＳとして，Ｓ／Ｒ１／Ｒ２＝
２０μｌ／２５０μｌ／２５０μｌの比率で，検体Ｓに
Ｒ１を添加後，５分間活性化した後，Ｒ２を添加し，Ｒ
２添加後１９−３２ポイントで測光（吸光度の測定）を
行った。図９にその測定結果を示す。

【００７２】図９から明らかなように，各希釈液におい
て，それぞれ１０倍希釈以外ではΔＯＤが良好に測定で
きなかった。したがって，ＡＰＴＴ測定用試薬を用いた
場合には，試薬（第１試薬および第２試薬）を１０倍希
釈することが望ましい。

【００７３】次に，上記希釈法の検討結果に基づいて，
実施の形態２の血液凝固能の測定方法（希釈法）を実施
した場合の同時再現性について説明する。

【００７４】図１０（ａ），（ｂ）は，希釈法の同時再
現性を示すための説明図である。同図（ａ）が第１の希
釈液を用いて１０倍希釈で，検体として正常血漿を用い
て，同一の測定条件で１０回の測定を行った場合，およ
び検体として高度異常血漿を用いて，同一の測定条件で
１０回の測定を行った場合を示す。同図（ｂ）が第２の
希釈液を用いて１０倍希釈で，検体として正常血漿を用
いて，同一の測定条件で１０回の測定を行った場合，お
よび検体として高度異常血漿を用いて，同一の測定条件
で１０回の測定を行った場合を示す。なお，ここでは，
希釈法で測定したＯＤ値をあらかじめ作成した検量線デ
ータを用いて従来法（従来の粘度変化を測定する方法）
の凝固時間（秒）に変換した値を測定結果として示す。

【００７５】図１０（ａ）に示すように，それぞれ平均
値Ｘが３８．１（秒）と４４．６（秒）であり，再現性
が０．９６％と０．８７％であった。この結果より，本
発明の希釈法の再現性が十分に高く，血液凝固能の測定
に使用可能であることが明らかである。

【００７６】また，図１０（ｂ）に示すように，それぞ
れ平均値Ｘが３６．０（秒）と４６．４（秒）であり，
再現性が１．７４％と１．５２％であった。この結果よ
り，本発明の希釈法の再現性が十分に高く，血液凝固能
の測定に使用可能であることが明らかである。

【００７７】図１１（ａ），（ｂ）は，希釈法と従来法
（従来の粘度変化を測定する方法）との相関性を示す説
明図である。同図（ａ）は，第１の希釈液・１０倍希釈
の場合の相関図を示し，同図（ｂ）は，第２の希釈液・
１０倍希釈の場合の相関図を示す。なお，複数の検体
（３０検体）を，それぞれ希釈法と従来法の両方で測定
し，相関図を作成したものである。

【００７８】同図（ａ），（ｂ）に示すように，非常に
相関度（Ｒ＝０．８４５，Ｒ＝０．８６２）の高い対応
を示しており，従来法で正常範囲と判定される範囲の検
体は，希釈法でも正常範囲と判定される領域に分布して
おり，希釈法が従来法と同様に血液凝固能の測定に使用
可能であることが明らかである。

【００７９】〔実施の形態３〕実施の形態３の血液凝固
能の測定方法（以下，塩濃度調整法と記載する）は，反
応系の塩濃度をフィブリン塊の生成に適した塩濃度の範
囲から外すことにより，該フィブリン塊の生成速度を抑
制して凝固時間（測定可能時間）を延長できるようにし
たものである。

【００８０】図１２は，実施の形態３の血液凝固能の測
定方法の概略フローチャートを示す。ここでは，検体の
プロトロンビン時間（ＰＴ）から血液凝固能を測定する
場合を例として説明する。

【００８１】図１２のフローチャートにおいて，先ず，
検体または試薬が入ったカップをそれぞれ自動分析装置
に載置する（Ｓ１２０１）。

【００８２】次に，所定の反応セルに試薬を分注し，続
いてＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂ を添加して塩濃度を調整する
（Ｓ１２０２：請求項４の塩添加工程）。

【００８３】次に，ステップＳ１２０２で塩濃度を調整
した試薬の入った反応セルに，検体を分注し，混合させ
ることにより，反応系を作成する（Ｓ１２０３：請求項
４の反応系作成工程）。なお，ここで検体を分注した時
点を０ポイントとして測光ポイントのカウントが開始さ
れる。

【００８４】ステップＳ１２０３で検体を分注してか
ら，あらかじめ設定した測光ポイント（例えば，１０ポ
イント）に到達すると，前記希釈した反応系の吸光度
（濁度）を光学的に測定する（Ｓ１２０４：請求項４の
濁度測定工程）。

【００８５】ステップＳ１２０４で測定した吸光度（濁
度）に基づいて，検体の血液凝固能が正常範囲である
か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判定する
（Ｓ１２０５：請求項４の判定工程）。

【００８６】その後，ステップＳ１２０３で吸光度（濁
度）を測定した後に，測定済みの反応セルを洗浄する
（Ｓ１２０６：請求項４の洗浄工程）。なお，塩濃度調
整法では，塩濃度を調整した反応系を用いることによ
り，フィブリン塊の生成速度を抑制して凝固時間（測定
可能時間）が延長されているため，測定を終了した時点
でも，生成されたフィブリン塊が反応セルの壁面に固着
しない。したがって，一般的な自動分析装置に備わって
いる洗浄工程で，反応セルを容易に洗浄することがで
き，測定後の反応セルの再使用が可能である。

【００８７】前述したように実施の形態３の血液凝固能
の測定方法（塩濃度調整法）によれば，反応系における
フィブリン塊の生成速度を抑制して凝固時間（測定可能
時間）を延長することにより，測定を終了した時点で
も，生成されたフィブリン塊が反応セルの壁面に固着し
ないようにして，測定後の反応セルの再使用が可能とな
る。

【００８８】また，凝固時間（測定可能時間）を延長す
ることにより，測光ポイントを大きくすることができる
ため，一般的な自動分析装置で測定することができる。

【００８９】さらに，血液凝固能が高いことによる異常
範囲の場合（正常範囲より短い時間で凝固してまう場
合）でも，一般的な自動分析装置で測定することができ
る。

【００９０】

【発明の効果】以上説明したように，本発明の血液凝固
能の測定方法（請求項１）は，検体と試薬とを混合させ
て反応系を作成し，反応系でフィブリン塊が生成される
ことによって生じる濁度を光学的に測定して検体の血液
凝固能を測定する血液凝固能の測定方法において，検体
または／および試薬を希釈液で希釈する希釈工程と，希
釈工程で希釈した検体または／および試薬を用いて，所
定量の検体および試薬を反応セルに分注し，混合させる
ことにより，希釈した反応系を作成する反応系作成工程
と，希釈した反応系の濁度を光学的に測定する濁度測定
工程と，濁度測定工程で測定した濁度に基づいて，検体
の血液凝固能が正常範囲であるか，血液凝固能が高いこ
とによる異常範囲であるか，血液凝固能が低いことによ
る異常範囲であるかを判定する判定工程と，濁度測定工
程で濁度を測定した後に，測定済みの反応セルを洗浄す
る洗浄工程と，を含むため，反応系におけるフィブリン
塊の生成速度を抑制して凝固時間（測定可能時間）を延
長することにより，測定を終了した時点でも，生成され
たフィブリン塊が反応セルの壁面に固着しないようにし
て，測定後の反応セルの再使用を可能にでいる。また般
的な自動分析装置で測定することができる。さらに血液
凝固能が高いことによる異常範囲の場合（正常範囲より
短い時間で凝固してまう場合）でも，一般的な自動分析
装置で測定できる。

【００９１】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項２）は，請求項１記載の血液凝固能の測定方法にお
いて，希釈液が，希釈した反応系の塩濃度をフィブリン
塊の生成に適した塩濃度の範囲から外すために，あらか
じめＮａＣｌおよびＣａＣｌ ₂ が添加されているか，ま
たはＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ を含まないものであるた
め，フィブリン塊の生成速度の抑制を良好に行える。

【００９２】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項３）は，請求項１または２記載の血液凝固能の測定
方法において，希釈した反応系で，検体が２０倍希釈程
度で希釈された状態であり，試薬が１００倍希釈程度で
希釈された状態であるため，フィブリン塊の生成速度の
抑制を良好に行える。

【００９３】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項４）は，検体と試薬とを混合させて反応系を作成
し，反応系でフィブリン塊が生成されることによって生
じる濁度を光学的に測定して検体の血液凝固能を測定す
る血液凝固能の測定方法において，反応系の塩濃度をフ
ィブリン塊の生成に適した塩濃度の範囲から外すため
に，試薬にＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ を添加する塩添加
工程と，所定量の検体および試薬を反応セルに分注し，
混合させることにより，反応系を作成する反応系作成工
程と，反応系の濁度を光学的に測定する濁度測定工程
と，濁度測定工程で測定した濁度に基づいて，検体の血
液凝固能が正常範囲であるか，血液凝固能が高いことに
よる異常範囲であるか，血液凝固能が低いことによる異
常範囲であるかを判定する判定工程と，濁度測定工程で
濁度を測定した後に，測定済みの反応セルを洗浄する洗
浄工程と，を含むため，反応系におけるフィブリン塊の
生成速度を抑制して凝固時間（測定可能時間）を延長す
ることにより，測定を終了した時点でも，生成されたフ
ィブリン塊が反応セルの壁面に固着しないようにして，
測定後の反応セルの再使用を可能にでいる。また般的な
自動分析装置で測定することができる。さらに血液凝固
能が高いことによる異常範囲の場合（正常範囲より短い
時間で凝固してまう場合）でも，一般的な自動分析装置
で測定できる。

【００９４】また，本発明の血液凝固能の測定方法（請
求項５）は，請求項１〜４記載のいずれか一つの血液凝
固能の測定方法において，試薬が，ＰＴ測定用試薬また
はＡＰＴＴ測定用試薬であるため，検体のプロトロンビ
ン時間（ＰＴ）または検体の活性化部分トロンボプラス
チン時間（ＡＰＴＴ）から血液凝固能を測定することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施の形態１の血液凝固能の測定方法（希釈
法）の概略フローチャートである。

【図２】検量線データ（希釈法のΔＯＤと従来法の凝固
時間との関係）を示す説明図である。

【図３】希釈液中のＮａＣｌ，ＣａＣｌ₂ 濃度の影響を
示す説明図である。

【図４】希釈倍率の影響を示す説明図である。

【図５】反応タイムコースを示す説明図である。

【図６】希釈液種類の検討結果を示す説明図である。

【図７】実施の形態１の血液凝固能の測定方法（希釈
法）の同時再現性を示すための説明図である。

【図８】実施の形態１の血液凝固能の測定方法（希釈
法）と従来法（従来の粘度変化を測定する方法）との関
係を示す相関図である。

【図９】実施の形態２の血液凝固能の測定方法（希釈
法）における望ましい希釈倍率を示す説明図である。

【図１０】実施の形態２の血液凝固能の測定方法（希釈
法）の同時再現性を示すための説明図である。

【図１１】実施の形態２の血液凝固能の測定方法（希釈
法）と従来法（従来の粘度変化を測定する方法）との関
係を示す相関図である。

【図１２】実施の形態４の血液凝固能の測定方法（塩濃
度調整法）の概略フローチャートである。

【符号の説明】

ΔＯＤ 一定時間の吸光度差

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体と試薬とを混合させて反応系を作成
   し，前記反応系でフィブリン塊が生成されることによっ
   て生じる濁度を光学的に測定して前記検体の血液凝固能
   を測定する血液凝固能の測定方法において，前記検体ま
   たは／および試薬を希釈液で希釈する希釈工程と，前記
   希釈工程で希釈した前記検体または／および試薬を用い
   て，所定量の前記検体および試薬を反応セルに分注し，
   混合させることにより，希釈した反応系を作成する反応
   系作成工程と，前記希釈した反応系の濁度を光学的に測
   定する濁度測定工程と，前記濁度測定工程で測定した濁
   度に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範囲である
   か，血液凝固能が高いことによる異常範囲であるか，血
   液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判定する
   判定工程と，前記濁度測定工程で濁度を測定した後に，
   測定済みの前記反応セルを洗浄する洗浄工程と，を含む
   ことを特徴とする血液凝固能の測定方法。
2. 【請求項２】 前記希釈液は，前記希釈した反応系の塩
   濃度を前記フィブリン塊の生成に適した塩濃度の範囲か
   ら外すために，あらかじめＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ が
   添加されているか，またはＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂ を
   含まないことを特徴とする請求項１記載の血液凝固能の
   測定方法。
3. 【請求項３】 前記希釈した反応系で，前記検体が２０
   倍希釈程度で希釈された状態であり，前記試薬が１００
   倍希釈程度で希釈された状態であることを特徴とする請
   求項１または２記載の血液凝固能の測定方法。
4. 【請求項４】 検体と試薬とを混合させて反応系を作成
   し，前記反応系でフィブリン塊が生成されることによっ
   て生じる濁度を光学的に測定して前記検体の血液凝固能
   を測定する血液凝固能の測定方法において，前記反応系
   の塩濃度を前記フィブリン塊の生成に適した塩濃度の範
   囲から外すために，前記試薬にＮａＣｌおよびＣａＣｌ
   ₂ を添加する塩添加工程と，所定量の前記検体および試
   薬を反応セルに分注し，混合させることにより，反応系
   を作成する反応系作成工程と，前記反応系の濁度を光学
   的に測定する濁度測定工程と，前記濁度測定工程で測定
   した濁度に基づいて，前記検体の血液凝固能が正常範囲
   であるか，血液凝固能が高いことによる異常範囲である
   か，血液凝固能が低いことによる異常範囲であるかを判
   定する判定工程と，前記濁度測定工程で濁度を測定した
   後に，測定済みの前記反応セルを洗浄する洗浄工程と，
   を含むことを特徴とする血液凝固能の測定方法。
5. 【請求項５】 前記試薬は，ＰＴ測定用試薬またはＡＰ
   ＴＴ測定用試薬であることを特徴とする請求項１〜４記
   載のいずれか一つの血液凝固能の測定方法。