JPH10206426A - アレルギー検査容器、キット及び検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来よりも、精度が良く、操作が簡単で危険
性がなくアレルギーの検出ができる検査容器、検査方法
及び検査キットを提供する。 【解決手段】 内部が減圧にされた容器内に、アレルゲ
ン及び血液抗凝固剤（例、ヘパリンナトリウム）が血液
と接触可能な状態とされており、該アレルゲン（例、
Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）と血液細胞との反応によって
血液細胞から産生される生理活性物質（例、ヒスタミ
ン）量を測定するためのアレルギー検査容器であって、
上記生理活性物質の測定値に影響を与えないように、使
用前の該容器中のエンドトキシン量が制限されたことを
特徴とする上記測定容器。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アレルギー検査の
ための検査容器、アレルギー検査方法及びアレルギー検
査キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原が体内に侵入したときに、２つの異
なる型の免疫応答が起こることはよく知られている。第
一の型は、体液性免疫と呼ばれ、抗原に対して特異的な
液性抗体が産生され、この抗体がエフェクターになる場
合である。例えば、バクテリアの侵入の場合では、抗体
がバクテリアに結合し、白血球の食作用の亢進を促し、
バクテリア毒素を中和する。

【０００３】第二の型は、細胞性免疫応答として知ら
れ、抗原に特異的な感作リンパ球が産生され、それ自身
が免疫応答のエフェクターとなる場合である。例えば、
代表的な例として、ツベルクリン型遅延型過敏症、Jone
s-Mote反応、接触性過敏症、同種移植免疫、腫瘍免疫、
結核菌、癩菌、サルモネラ、リステリアなどの細胞内寄
生性細菌の感染症やウィルス感染症がある。細胞性免疫
の生体内発現の局所における特徴は、リンパ球、マクロ
ファージなどの単核細胞の浸潤であり、これらの細胞が
その反応の主体であると考えられている。これらの細胞
は、炎症局所に集積し、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−
α）、インターロイキン、インターフェロン、コロニー
刺激因子、走化性因子などの種々のサイトカインやプロ
スタグランジン、ロイコトリエン、一酸化窒素などの種
々のケミカルメディエーターを分泌することによって、
オートクリン及びパラクリンに作用しあうことによっ
て、細胞性免疫応答を発現している。

【０００４】また、ツベルクリン型遅延型過敏症や接触
性過敏症は、抗原特異的な細胞性免疫応答の代表とされ
ているが、最近、喘息やアトピー性皮膚炎などのＩｇＥ
抗体によるアレルギー疾患と位置づけられてきた疾患に
おいても、リンパ球やマクロファージから産生されるサ
イトカイン、例えば、ＴＮＦ−αやインターロイキン−
１（ＩＬ−１）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、
インターロイキン−８（ＩＬ−８）、γ−インターフェ
ロン（γ−ＩＮＦ）、Granulocyte MacrophageColony S
timulating Factor（ＧＭ−ＣＳＦ）などが、顆粒球の
局所集積や活性化に関係し、炎症の維持に働いていると
いう報告がなされ（第２４回日本臨床免疫学会総会・抄
録集）、抗原特異的な細胞性免疫応答にも関与している
と考えられている。

【０００５】代表的なアレルギー疾患である喘息、アト
ピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎は、気道や鼻粘膜中に
存在する肥満細胞や末梢血液中に存在する好塩基球の表
面に結合したＩｇＥに特異抗原が結合し、肥満細胞、好
塩基球の脱顆粒がおこりヒスタミンが遊離されることに
よりアレルギー反応が引き起こされることが明らかにな
っている。また、単球・マクロファージがＬＰＳ（リポ
多糖、エンドトキシン）によって、活性化されたときに
産生されるＩＬ−１によっても好塩基球からのヒスタミ
ン遊離が、引き起こされることも明らかになっている
（日本医学館出版、笠倉新平（編集）、サイトカイン
基礎から最新情報まで、１３〜２０頁（１９９２
年））。

【０００６】アレルギーの検査方法としては、採血した
血液と抗原を接触させ好塩基球から遊離されるヒスタミ
ン量を指標とする方法が知られている。しかしながら、
この方法には、サイトカインを誘導するレベルのＬＰＳ
が混入している採血管、または、容器を用いて採血した
場合、採血管、または、採血容器に混入しているＬＰＳ
と単球・マクロファージが反応し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−
１などのサイトカインが誘導され、そのサイトカインに
より好塩基球が刺激され、アレルギー検査を行う前にヒ
スタミンなどの生理活性物質の遊離が引き起こされ、反
応を精度良く把握することができない欠点がある。

【０００７】従来の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験法にて行
う、アレルギー検査方法の一例について、市販のキット
（販売元：岩井化学薬品）を例として以下に説明する。
まず、各種の濃度に希釈されたアレルギーの特異抗原
（以下、アレルギーの特異抗原をアレルゲンという）を
マイクロプレートのウェル内に分注する。次に、その抗
原の入ったウェル内に、被検者からヘパリン採血した血
液と酵素固定化抗ヒスタミンモノクローナル抗体を混合
した血液−抗体混合液を一定量分注し、３７℃、３０分
間反応させる。この反応で、血液中の好塩基球上のＩｇ
Ｅと抗原が結合すると好塩基球からヒスタミンが遊離さ
れる。遊離されたヒスタミン量をＥＬＩＳＡ法を用いて
定量する。

【０００８】しかしながら、このｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
法には、以下のような問題点があった。

【０００９】（１）被検者から血液を採血後、アレルゲ
ンと血液を接触させ、ヒスタミン遊離を誘導するまで
に、血液を長時間放置すると、採血容器内にサイトカイ
ンを誘導するレベルのＬＰＳが混入していると血液中の
単球・マクロファージからＩＬ−１が誘導され、そのＩ
Ｌ−１により好塩基球が刺激されてヒスタミンが遊離さ
れてしまい、アレルゲンによるヒスタミン遊離量を正確
に測定できなくなるという欠点があった。実際、市販の
採血管中のエンドトキシン（ＬＰＳ）量を調べた結果、
ＴＮＦ−αやＩＬ−βが誘導されるレベルのエンドトキ
シンが混入していることが明らかになっている。エンド
トキシンは、極微量で白血球から種々のサイトカインの
産生を誘導するため、例えば、製造工程での微量の埃の
混入、使用する洗浄水からの汚染などにより、血液採取
器に混入したものと考えられる。

【００１０】（２）ヒスタミン遊離誘導試験は、例え
ば、上記の市販のキットの場合のように、血液と酵素固
定化ヒスタミンモノクローナル抗体を混合し、アレルゲ
ンの分注されたヒスタミン遊離マイクロプレートに上記
混合液を分注し、ヒスタミン遊離の誘導を行う。この場
合、アレルゲンの希釈及びその分注、並びに血液の分注
などの手段は、用手法となり煩雑であった。また、血液
の分注に際して、検査従事者が血液に触れて、肝炎、エ
イズなどの種々の感染症に感染する危険性があった。ま
た、これらの操作中に、血液試料中に種々の雑菌や埃な
どが混入する恐れがあり、これらの汚染物または操作に
よる物理的刺激によって、血液中の細胞（単球・マクロ
ファージ）が不必要に刺激され、ＩＬ−１等のサイトカ
インの産生、好塩基球への刺激、ヒスタミンの遊離へと
つながり、測定結果に悪影響を及ぼす恐れがあった。

【００１１】（３）また、上記の市販のキットの場合
は、少量の血液をマイクロプレートに分注して検査を行
うので、血液サンプル量が少なく、検査終了後、同一サ
ンプルを再測定できないという欠点があった。

【００１２】これらの問題点のため、従来よりも、精度
が良く、操作が簡単で、危険性がないアレルギー検査方
法が望まれている。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
のアレルギーの検査方法の欠点を解消し、従来よりも、
精度が良く、操作が簡単で危険性がなくアレルギーの検
出ができる検査容器、検査方法及び検査キットを提供す
ることにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明の請求項１に記載
のアレルギー検査容器は、内部が減圧にされた容器内
に、アレルゲン及び血液抗凝固剤が血液と接触可能な状
態とされており、該アレルゲンと血液細胞との反応によ
って血液細胞から産生される生理活性物質量を測定する
ことによるアレルギー検査のための検査容器であって、
上記生理活性物質の測定値に影響を与えないように、使
用前の該容器中のエンドトキシン量が制限されたことを
特徴とする。

【００１５】本発明の請求項２に記載のアレルギー検査
容器は、上記使用前の該容器中のエンドトキシン量が、
検査しようとする液量に等しい量のエンドトキシンフリ
ー水を採取して抽出を行ったときの、該抽出液中の濃度
として０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされている請求項１記載
のアレルギー検査容器である。

【００１６】本発明のアレルギー検査方法は、請求項１
又は２記載の検査容器に血液を吸入し、前記アレルゲン
と血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生
理活性物質の量を測定することを特徴とする。

【００１７】本発明の請求項４に記載のアレルギー検査
キットは、請求項１又は２記載の検査容器と、前記アレ
ルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生さ
れる生理活性物質量を定量可能な試薬とからなることを
特徴とする。

【００１８】本発明の請求項５に記載のアレルギー検査
キットは、生理活性物質がヒスタミンである請求項４記
載のアレルギー検査キットである。

【００１９】以下、本発明のアレルギーの検査容器につ
いて説明する。

【００２０】本発明で用いられるアレルゲンとは、アレ
ルギーの特異抗原のことであり、例えば、喘息、花粉
症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、消化管アレ
ルギー、寄生虫アレルギーなどのアレルゲン検査に用い
られる抗原（Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（岩井化学薬品社
製）；ハウスダスト；ダニ抗原；ブタクサ花粉抽出物、
スギ花粉抽出物、イネ抽出物などの種々の花粉抗原；真
菌抗原；アスカリス抽出物などの寄生虫抗原；卵白アル
ブミン、小麦、大豆、エビ、カニ、肉類などの食物抗
原；ハチ毒など）が挙げられる。また、これらの材料を
種々の天然、合成高分子材料に公知の固定化方法によっ
て固定化した材料なども挙げられる。上記固定化方法と
しては、共有結合法、物理吸着法等のいずれの公知の方
法を用いても良い。

【００２１】上記アレルゲン中のエンドトキシン量は、
本発明の検査容器でアレルギー検査を行った場合、検査
値の精度に影響を与えないレベルが好ましく、また、ロ
ット間においてあまり差がない方が好ましく、アレルゲ
ンとしては、所謂、エンドトキシンフリーのものが特に
好ましい。

【００２２】本発明における、アレルゲンと血液細胞と
の反応によって、血液細胞から産生される生理活性物質
としては、特に、好塩基球やマスト細胞（肥満細胞）な
どが産生（遊離）するヒスタミン、血小板活性化因子
（ＰＡＦ）、好酸球遊走因子（ＥＣＦ：例えばＲＡＮＴ
ＥＳ、ＩＬ−８）などのケミカルメディエーターが好ま
しい。また、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インター
ロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、走化
性因子などの種々のサイトカイン；プロスタグランジ
ン；ロイコトリエン；一酸化窒素などの種々のケミカル
メディエーターなども挙げられる。

【００２３】本発明の検査容器においては、上記アレル
ゲンが、内部が減圧にされた容器内に、血液と接触可能
な状態とされている。上記血液と接触可能な状態として
は、例えば、上記アレルゲンが上記容器内に収容されて
いる場合が挙げられる。

【００２４】上記アレルゲンの形状としては、特に限定
されず、例えば、液状、粒子状などが挙げられる。ま
た、担体に固定化されていてもよい。上記液状の場合
は、通常、上記アレルゲンを、希釈液として、例えば、
リン酸緩衝液、ハンクス緩衝液などの緩衝液やＭＥＭ、
ＲＰＭＩ−１６４０等の通常の培地、生理食塩液（例え
ば、大塚製薬社製）、注射用水（例えば、大塚製薬社
製）などで希釈して用いる。

【００２５】アレルゲンの上記容器中の存在状態は、固
体状であってもよく、また、液体状であってもよい。ア
レルゲンが水溶性材料の場合、容器の内壁面に塗布、あ
るいは添加された後、粉末状にされてもよい。例えば、
注射用水を用いてアレルゲンを希釈した場合は、アレル
ゲンを容器に入れた後、乾固した方が好ましい。アレル
ゲンが水不溶性の材料の場合には、上記アレルゲンの表
面に気泡が残ると、転倒混和等により血液と接触させる
際に過度の溶血を引き起こし、測定系に影響する恐れが
あるため、水不溶性材料は、例えば、上記のような希釈
液に浸しておくのが好ましい。

【００２６】担体にアレルゲンが固定化されて用いられ
る場合、固定化する担体が水溶性材料の場合は、容器の
内壁面に塗布、あるいは添加した後、粉末状にしてもよ
い。担体が水不溶性材料の場合は、材料の表面に気泡が
残ると、過度の溶血を引き起こし、測定系に影響する恐
れがあるため、例えば、上記のような希釈液に浸してお
くのが好ましい。

【００２７】上記アレルゲンが血液と接触されたときの
全液（血液と、血液抗凝固剤溶液と、上記アレルゲンの
溶解もしくは懸濁用の液との総和）中のアレルゲンの最
適濃度は、それぞれのアレルゲンによって変わり得る。

【００２８】また、本発明の検査容器は、血液とアレル
ゲンを接触させ、生理活性物質を産生（遊離又は誘導）
する反応容器として用いられるので、血液が凝固しない
ように、上記容器中に血液抗凝固剤が収容されている必
要がある。

【００２９】上記血液抗凝固剤は、該容器の中に液体又
は固体のいずれの状態で存在されてもよい。

【００３０】上記血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合
物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙げられ、
ヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応を阻害し
ないので好ましい。

【００３１】上記ヘパリンナトリウムの該容器中の収容
量としては、該容器に血液が収容された時に、その血液
中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くなる
と細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがあるの
で、４〜５０ｕ／ｍｌになるように収容するのが好まし
い。

【００３２】また、本発明の検査容器の形状は、減圧に
し得るものであれば、特に限定されず、例えば、採血管
のようなチューブ状のもの、筒状のもので入口と出口の
両方が何らかの形で閉鎖されているもの、マイクロプレ
ート状のものが挙げられる。

【００３３】本発明の検査容器の材質としては、プラス
チックまたはガラスが挙げられるが、生理活性物質の産
生反応後、上記生理活性物質を測定するための遠心分離
操作に耐えられるだけの強度を有するものが好ましい。

【００３４】上記プラスチックとしては、熱可塑性樹
脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられる。熱可塑性樹
脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビ
ニル、ポリエチレンテレフタレート、スチレン−アクリ
ロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合
体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メチル
メタクリレート共重合体、エチレン−プロピレン共重合
体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリ
ル酸エステル共重合体等が挙げられる。熱硬化性樹脂と
しては、例えば、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹
脂、エポキシ−アクリレート樹脂等が挙げられる。

【００３５】本発明の検査容器には、その内部を減圧に
維持するために、通常、栓体を使用する。栓体の材質と
しては、例えばブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑
性エラストマー等が挙げられる。

【００３６】本発明の検査容器の減圧の程度は、常圧の
検体血液と上記検査容器が連通された時に、上記検査容
器の中に常圧の検体血液が吸入されうる程度の圧力であ
ればよく、その圧力は、吸入しようとする検体血液の量
によって決められる。すなわち、吸入しようとする検体
血液の量が多ければ多いほど減圧の程度を大きくする必
要がある。

【００３７】本発明の検査容器を用いてアレルギー検査
をする際に、採取する血液量は、容器の容積によって異
なるが、通常、４〜５ｍｌの容積のチューブ状の容器を
用いる場合であれば、０．５〜２ｍｌ程度でよい。ま
た、マイクロプレート状の容器を用いる場合であれば、
０．０５〜２ｍｌ程度でよい。

【００３８】また、本発明で用いられる容器のエンドト
キシン含量は、上記産生される生理活性物質量がエンド
トキシンに影響されないように、使用前に制限されてい
ることが必要である。上記使用前の該容器中のエンドト
キシン量は、測定しようとする液量に等しい量のエンド
トキシンフリー水を該容器内に採取し、３７℃で１時間
の条件で攪拌下で抽出を行ったとき、該抽出液中の濃度
として０．５ＥＵ（国際エンドトキシンユニット）／ｍ
ｌ以下とされているのが好ましい。〔なお、上記の抽出
を行う際のエンドトキシンフリー水の量は、上記のよう
に測定しようとする液量に全く等しい量である必要は必
ずしもなく、抽出が十分になされるなら測定しようとす
る液量未満であってもよいが、この場合であっても、抽
出液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ（国際エンド
トキシンユニット）／ｍｌ以下であれば本発明の作用効
果を奏する〕。

【００３９】後述の実験例から明らかなように、エンド
トキシン量が０．５ＥＵ／ｍｌを超えると血液から顕著
にサイトカインの誘導を引き起こし、誘導されたサイト
カインにより好塩基球の脱顆粒がおこりヒスタミンが産
生（遊離）される。従って、本発明によるアレルギー検
査を正確に行うためには、エンドトキシン含量がサイト
カインの産生を誘導するレベル以下に制限されているこ
とが必要である。

【００４０】なお、エンドトキシンは、通常２５０℃、
２時間の乾熱滅菌により失活させることが可能であり、
乾熱滅菌が不可能な場合は、エンドトキシンフリー水に
て洗浄することによって減ずることが可能である。

【００４１】上記エンドトキシン含量の測定方法として
は、種々の方法があるが、本発明でいうエンドトキシン
含量の測定方法は、合成発色基質法によるものである。
この測定には、例えば、生化学工業社製、商品名 エン
ドスペシーを利用できる。

【００４２】本発明の検査容器の製造方法の一例を挙げ
ると、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記
アレルゲン及び血液抗凝固剤を加え、容器を所定の減圧
状態にした後、上記容器に栓をすることによって製造す
る。

【００４３】上記の容器としては、例えば、一端が開口
し他端が閉塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、
栓体によって閉塞可能なものが好ましい。上記有底管体
としては、例えば、反応後、上記生理活性物質量を測定
するための遠心分離操作に好適な試験管状のものがより
好ましく、そのサイズとしては、外径が５〜３０ｍｍ、
高さ２０〜１５０ｍｍ程度が好ましい。

【００４４】また、本発明の検査容器は、エンドトキシ
ンや雑菌の混入を避けるため、できる限りクリーンな環
境で製造するのが好ましく、また、可能であれば製造後
に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。

【００４５】本発明の検査容器によって、アレルギーを
検査する方法について説明する。まず、まず血管又は採
血容器と上記検査容器とを連通させ、上記検査容器中に
検体血液を吸入させる。次いで、上記検査容器を適度に
振とうしながら、血液細胞と上記アレルゲンとを接触さ
せ、上記アレルゲンと血液細胞とを反応させて血液細胞
から生理活性物質を産生させる。反応後、静置もしくは
遠心分離により、血球と血漿に分離して、血漿中の生理
活性物質（例えばヒスタミンなど）量を各々の定量可能
な試薬により定量する。

【００４６】上記の採血容器と上記検査容器を連通させ
る方法としては、例えば、採血容器を注射針付きの注射
筒としておき、上記注射針を上記検査容器の栓体に突き
刺す方法が挙げられる。

【００４７】また、上記の血管と上記検査容器を連通さ
せる場合には、通常の真空採血法に用いられる注射針、
すなわち、針基の一方の側に血管刺通側の針を有し、他
方の側に上記検査容器の栓体を刺通し得る栓体刺通側の
針を有し、上記血管刺通側の針と栓体刺通側の針が連通
されている針を用いればよい。

【００４８】上記の血液細胞とアレルゲンとの反応温度
は、上記生理活性物質の産生が効率的に行われ、産生さ
れた生理活性物質が安定で、しかも、過度の溶血を引き
起こさない温度である１〜４２℃が好ましく、４〜４０
℃がより好ましい。また、反応時間は、上記生理活性物
質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさな
い反応時間である１０秒から３時間が好ましく、１〜１
２０分がより好ましい。

【００４９】本発明の検査容器を用いることにより産生
された生理活性物質量を測定する方法としては、例え
ば、測定しようとする生理活性物質に対するモノクロー
ナル抗体もしくはポリクローナル抗体；ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素；及び各々の
酵素の発色基質などを利用した酵素免疫測定方法が挙げ
られる。

【００５０】以下に、本発明の検査容器を用いて、アレ
ルギーを検査する１態様を詳しく説明する。先ず、血液
と上記アレルゲンとを上記検査容器の中で反応させ、ヒ
スタミンを産生させ、産生後の検査容器を２５００Ｇで
遠心分離して、血球成分と血漿成分を分離させる。次い
で、分離された血漿を、上記ヒスタミンに対するモノク
ローナル抗体を固定化したマイクロプレートのウェル
に、ピペッティングにより添加し、３７℃で２時間反応
させる。次いで、反応後の血漿液を吸引除去等の手段で
廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、Tween20 等の
ノニオン系の界面活性剤を含有する中性pHの洗浄用緩衝
液で上記ウェルを洗浄する。次いで、西洋わさびペルオ
キシダーゼを固定化した上記ヒスタミンに対するポリク
ローナル抗体をピペッティングにより上記ウェルに添加
し、３７℃で１時間反応させる。次いで、未反応の西洋
わさびペルオキシダーゼ固定化抗体を除くため、上記ウ
ェルを上記洗浄用緩衝液で洗浄した後、過酸化水素、テ
トラメチルベンジジンを含む基質溶液を添加し、５〜１
０分間反応させる。次いで、１Ｍ硫酸溶液を添加し、反
応を停止させて、酵素反応による基質の発色を４５０ｎ
ｍの吸光度から測定する。この測定値と既知濃度の上記
ヒスタミンを用いて作成した検量線から、上記ヒスタミ
ンの産生量を測定する。

【００５１】以下、本発明のアレルギー検査キットにつ
いて説明する。本発明のアレルギー検査キットに使用さ
れる試薬としては、上記アレルゲンと血液細胞との反応
によって血液細胞から産生される生理活性物質の量を定
量可能な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、
定量しようとする生理活性物質に対するモノクローナル
抗体もしくはポリクローナル抗体；ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼなどの酵素；及び各々の酵素
の発色基質などを利用する酵素免疫測定法用試薬が挙げ
られる。

【００５２】上記アレルギー検査キットの使用方法の１
例としては、前記の、本発明のアレルギー検査容器を用
いてアレルギーを検査する１態様を説明した方法と同様
である。

【００５３】本発明のアレルギー検査キットで測定され
る生理活性物質としては、ヒスタミンが特に適してい
る。

【００５４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明をさらに詳細に述べる。本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００５５】実施例１、比較例１ （１）アレルギー検査容器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌのエンドトキシ
ンフリーの採血管（１２．６φ×７５ｍｍ、積水化学工
業社製）２１本に、濃度２００ｕ／ｍｌのヘパリンナト
リウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名ノボ・
ヘパリン注１０００）の注射用生理食塩水（大塚製薬社
製）溶液を０．０５ｍｌ添加した。

【００５６】次いで、アレルゲンとして、Ｋ. Ｂｌｕｅ
ｇｒａｓｓ（岩井化学薬品社製）を岩井化学薬品社販売
のアレルギー検査キットの抗原希釈用液を用いて容量で
１００００倍に希釈したものを、２０μｌずつ上記ヘパ
リンナトリウム含有採血管２１本中の９本に添加した
（実施例１）。

【００５７】また、ヘパリンナトリウム含有採血管２１
本中の残りの１２本には、何も添加しなかった（比較例
１）。

【００５８】次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製
薬社製）でよく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓
体を、上記のようにして調製したアレルゲン添加したも
のとアレルゲンを添加しなかったものの合計２１本の採
血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せ
た後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減圧にし
てゆき、上記容器を５７０ｍｍＨｇに減圧したところ
で、該採血管の開口部を密栓した。以上のようにして、
アレルギー検査容器を製造した。

【００５９】（２）採血管（検査容器）のエンドトキシ
ン含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水（大
塚製薬社製）を採取し、その注射針を、上記（１）で製
造した、比較例１の検査容器１２本のうちの３本のブチ
ルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管にエンドトキシ
ンフリー水（大塚製薬社製）を１ｍｌ採取し、１時間、
３７℃で撹拌し、エンドトキシンを抽出し、この抽出液
中のエンドトキシン含量を生化学工業社製のエンドトキ
シン測定用キットであるエンドスペシーＥＳ６（商品
名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その結果、
試験した採血管３本ともに、抽出液中のエンドトキシン
含量は０．５ＥＵ／ｍｌ以下であった。

【００６０】（３）アレルギー検査 上記（１）で製造した実施例１の検査容器３本と比較例
１の検査容器３本のそれぞれの中に、Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒ
ａｓｓに感作性のあるボランティアから、真空採血によ
り検体血液１ｍｌを採取した。この採取操作をボランテ
ィア３人（それぞれのボランティア名をＡ、Ｂ、Ｃとす
る）について行った（従って、検体血液を採取した検査
容器は、実施例１の検査容器９本と比較例１の検査容器
９本の合計１８本となる）。

【００６１】次いで、予め３７℃に保温しておいた恒温
器の中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液を
採取した各々の検査容器をとりつけ、３０分、転倒混和
した。混和後、各々の検査容器を２５００ｒｐｍ、１０
分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。
採取した血漿中のヒスタミンをモノクローナル抗体を用
いた酵素免疫測定法を用いて測定した。この測定には、
岩井化学薬品社販売、アレルギー検査キット（ヒスタミ
ン遊離能測定キット）中のＥＬＩＳＡ ＫＩＴを用い
た。なお、このＫＩＴでのヒスタミンの定量範囲は、
０．１〜５５ｎｇ／ｍｌである。この測定結果を表１に
示した。

【００６２】

【表１】

【００６３】表１から分かるように、比較例１の検査容
器では、ヒスタミンは検出されなかった。実施例１の検
査容器では、ボランティアＡ、Ｂ、Ｃでそれぞれ、平均
値８．７ｎｇ／ｍｌ、１５．７ｎｇ／ｍｌ、１９．０ｎ
ｇ／ｍｌのヒスタミンが検出され、また、ヒスタミン検
出値のばらつき（変動係数、ＣＶ％）も、それぞれ４．
７％、３．７％、５．３％と小さく、良好に、アレルギ
ー検査をできることが分かった。

【００６４】比較例２ 実施例１で用いたアレルゲンに感作性のあるボランティ
ア３人（実施例１と同一人）から市販のヘパリンナトリ
ウム含有採血管（アレルゲンを含有しない）を用いて採
血し、岩井化学薬品社販売のアレルギー検査キット（ヒ
スタミン遊離能測定キット）を用いて、採血の２時間
後、この血液検体のヒスタミン遊離能を検査した。な
お、アレルゲンとしては、Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（岩
井化学薬品社製）を上記のアレルギー検査キットの抗原
希釈用液を用いて容量で１００００倍に希釈したものを
用い、その２０μｌを上記のアレルギー検査キット中の
ウェルに添加した。

【００６５】アレルギー検査方法は、上記のアレルギー
検査キットのプロトコールに従った。すなわち、血液検
体を、アレルゲン添加ウェル及びアレルゲン非添加ウェ
ルに添加して、３７℃、３０分反応させ、血液細胞から
産生されたヒスタミンを測定し、ヒスタミン遊離（産
生）量は、アレルゲン添加ウェルでの測定値からアレル
ゲン非添加ウェルでの測定値を減ずることにより求め
た。

【００６６】検査は、各ボランティア血液について、ｎ
＝３で行ない、結果を表２に示した。

【００６７】なお、上記の検査において血液の採取に用
いた市販のヘパリンナトリウム含有採血管中のエンドト
キシン含量を、実施例１の（２）に準じて測定した。す
なわち、上記の採血管と同じ製造ロットの採血管３本
に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）をそれぞ
れ０．９ｍｌずつ採取し、１時間、３７℃で撹拌し、エ
ンドトキシンを抽出し、この抽出液中のエンドトキシン
含量を生化学工業社製、エンドスペシーＥＳ６を用い
て、合成発色基質法で測定した。その結果、それぞれの
採血管抽出液中のエンドトキシン含量は、５０６ＥＵ／
ｍｌ、６０４ＥＵ／ｍｌ、７５１ＥＵ／ｍｌであった。

【００６８】

【表２】

【００６９】この結果、比較例２では、採血に用いた採
血管内にエンドトキシンが混入しているので、アレルゲ
ン非添加ウェルでもヒスタミンが産生された。また、ヒ
スタミンの遊離（産生）量のばらつき（変動係数、ＣＶ
％）も、７０．７％、１４５．５％、１０１．３％と実
施例１に比べて著しく大きくなった。

【００７０】以上より、採血には、エンドトキシンフリ
ーの採血管を用いなければ、血液細胞へのアレルゲン非
特異的な刺激が起こり、本来のアレルゲン刺激で産生さ
れるヒスタミン量を正確に、かつ、精度良く測定できな
いことが明らかである。

【００７１】実験例 エンドトキシンによる血液細胞からのインターロイキン
１β（ＩＬ−１β）の産生誘導における、エンドトキシ
ン濃度依存性を試験した。

【００７２】（１）試験用反応器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌの採血管（１
２．６φ×７５ｍｍ、積水化学工業社製）２０本を、エ
ンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）４ｍｌで１０回
よく洗浄し、濃度２００ｕ／ｍｌのヘパリンナトリウム
（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名ノボ・ヘパリ
ン注１０００）の注射用生理食塩水（大塚製薬社製）溶
液を０．０５ｍｌ添加した。

【００７３】Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＫＴ−Ｂ由来エンドトキ
シン（日本薬局方標準品Ｌｏｔ．８９２０）を注射用生
理食塩水（大塚製薬社製）に溶解、段階希釈して、上記
ヘパリン含有採血管１６本のそれぞれ２本ずつに、ヘパ
リンナトリウム溶解生理食塩水とエンドトキシン溶解生
理食塩水との合計の溶液中に、該エンドトキシン濃度が
０ＥＵ／ｍｌ、１ＥＵ／ｍｌ、２ＥＵ／ｍｌ、５ＥＵ／
ｍｌ、１０ＥＵ／ｍｌ、２０ＥＵ／ｍｌ、５０ＥＵ／ｍ
ｌ、１００ＥＵ／ｍｌとなるように０．０５ｍｌ添加し
た。

【００７４】次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製
薬社製）でよく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓
体を上記採血管の開口部に、開口部を密栓しないよう
に、軽く載せた後、減圧にできる容器内に置き、上記容
器を減圧にしてゆき、上記容器を５７０ｍｍＨｇに減圧
したところで、該採血管の開口部を密栓した。

【００７５】（２）採血管（反応器）のエンドトキシン
含量の測定 注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水（大
塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で得ら
れたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチルゴ
ム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキシン
フリー水（大塚製薬製）を０．９ｍｌ採取し、１時間、
３７℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、こ
の抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製、エ
ンドスペシーＥＳ６を用いて、合成発色基質法で測定し
た。その結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエ
ンドトキシン含量は０．５ＥＵ／ｍｌ以下であった。

【００７６】（３）ＩＬ−１β誘導能の測定方法 健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘパ
リン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、種々
の濃度のエンドトキシンを添加した減圧採血管１６本の
ブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内に、検体
血液０．９ｍｌを採取した。次いで、予め３７℃に保温
しておいた恒温器中の転倒混和用ロッカープラットフォ
ームに血液を採取した各々の採血管をとりつけ、４時
間、転倒混和した。混和後、各々の反応器を２５００ｒ
ｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を
採取した。採取した血漿中のＩＬ−１β量（ｐｇ／ｍ
ｌ）を、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を用いた酵素
免疫測定キットである、Genzyme 社製、商品名「PREDIC
TA Human IL-1β ELIZA KIT」にて測定した。尚、この
測定方法の検出限界濃度は１５ｐｇ／ｍｌであった。

【００７７】この測定結果を図１に示した。図１におけ
る横軸のＬＰＳ濃度の単位ＥＵ／ｍｌは、血液と接触し
たときの全溶液中のエンドトキシン濃度を示し、縦軸の
誘導量（ｐｇ／ｍｌ）は、血漿中のＩＬ−１βの濃度に
ついての各２本の採血管で得られた値の平均値を示す。
この結果から明らかなように、エンドトキシン濃度が
０．５ＥＵ／ｍｌを超えると、ＩＬ−１βの産生誘導が
起こることが明らかである。なお、エンドトキシン濃度
が０ＥＵ／ｍｌの場合の測定結果は、図１に示していな
いが、この場合のＩＬ−１β産生量は検出限界濃度以下
であった。

【００７８】

【発明の効果】本発明のアレルギー検査容器の構成は、
上記の通りであり、この検査容器では、従来のように、
採血した血液と抗原を混合し、マイクロプレートのウェ
ルに分注し、ヒスタミンを遊離させる煩雑な操作は必要
でないので操作が簡単であると共に、試験者は、肝炎、
エイズなどの種々の感染症に感染する危険性がほとんど
ない。また、この検査容器では、生理活性物質の測定値
に影響を与えないように、使用前の該容器中のエンドト
キシン量が制限されており、また、血液試料中に種々の
雑菌や埃などの混入の恐れがなく、採血した血液は、不
必要な刺激を受けず、よりｉｎ ｖｉｖｏに近い状態
で、アレルゲンと反応をさせることができるため、ｉｎ
ｖｉｖｏでのアレルゲンと血液細胞（例えば、好塩基
球）との反応に近い状態を実現でき、その反応性を反映
する生理活性物質（例えば、ヒスタミン）量を再現性良
く、定量できる利点がある。これらのため、この検査容
器を用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がな
く、精度良くアレルギー検査ができる。

【００７９】本発明のアレルギー検査容器において、使
用前の該容器中のエンドトキシン量が、検査しようとす
る液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を採取して
抽出を行ったときの、該抽出液中の濃度として０．５Ｅ
Ｕ／ｍｌ以下とされている場合には、この検査容器を用
いると、上記の効果の全てを奏すると共に、特に精度良
くアレルギー検査ができる。

【００８０】本発明のアレルギー検査方法の構成は、上
記の通りであり、この方法を用いると、従来のように、
採血した血液と抗原を混合し、マイクロプレートのウェ
ルに分注し、ヒスタミンを遊離させる煩雑な操作は必要
でないので操作が簡単であると共に、試験者は、肝炎、
エイズなどの種々の感染症に感染する危険性がほとんど
ない。また、この検査方法によると、採血した血液は、
不必要な刺激を受けず、よりｉｎ ｖｉｖｏに近い状態
で、アレルゲンと反応をさせることができるため、ｉｎ
ｖｉｖｏでのアレルゲンと血液細胞（例えば、好塩基
球）との反応に近い状態を実現でき、その反応性を反映
する生理活性物質（例えば、ヒスタミン）量を再現性良
く、定量できる利点がある。これらのため、この検査方
法を用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がな
く、精度良くアレルギー検査ができる。

【００８１】本発明のアレルギー検査キットの構成は、
上記の通り、請求項１又は２記載の検査容器と、アレル
ゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生され
る生理活性物質量を定量可能な試薬とからなるので、こ
の検査キットを用いると、従来よりも、操作が簡単で危
険性がなく、精度良くアレルギー検査ができる。

【００８２】上記のアレルギー検査キットにおいて、生
理活性物質がヒスタミンである場合には、この検査キッ
トを用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がな
く、より一層精度良くアレルギー検査ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例の測定結果を示すグラフであり、横軸は
ＬＰＳ濃度、縦軸はＩＬ−１βの誘導量を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内部が減圧にされた容器内に、アレルゲ
   ン及び血液抗凝固剤が血液と接触可能な状態とされてお
   り、該アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞
   から産生される生理活性物質量を測定することによるア
   レルギー検査のための検査容器であって、 上記生理活性物質の測定値に影響を与えないように、使
   用前の該容器中のエンドトキシン量が制限されたことを
   特徴とするアレルギー検査容器。
2. 【請求項２】 上記使用前の該容器中のエンドトキシン
   量が、検査しようとする液量に等しい量のエンドトキシ
   ンフリー水を採取して抽出を行ったときの、該抽出液中
   の濃度として０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされている請求項
   １記載のアレルギー検査容器。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の検査容器に血液を
   吸入し、前記アレルゲンと血液細胞との反応によって血
   液細胞から産生される生理活性物質の量を測定すること
   を特徴とするアレルギー検査方法。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載の検査容器と、前記
   アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産
   生される生理活性物質量を定量可能な試薬とからなるこ
   とを特徴とするアレルギー検査キット。
5. 【請求項５】 生理活性物質がヒスタミンである請求項
   ４記載のアレルギー検査キット。