JPH10177140A - 三次元走査共焦点顕微鏡 - Google Patents

三次元走査共焦点顕微鏡

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JPH10177140A
JPH10177140A JP9186466A JP18646697A JPH10177140A JP H10177140 A JPH10177140 A JP H10177140A JP 9186466 A JP9186466 A JP 9186466A JP 18646697 A JP18646697 A JP 18646697A JP H10177140 A JPH10177140 A JP H10177140A
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axis
scanning element
scanning
intensity
confocal microscope
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JP9186466A
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Rox R Anderson
ロックス アンダーソン アール
Robert H Webb
エイチ．ウェブ ロバート
Miland Rajadhyacksha
ラヤデハクシャ ミリンド
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General Hospital Corp
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】試料の映像を発生させる共焦点顕微鏡１０
は、第一軸に沿って光線を走査する第一走査エレメン
ト、および前記第一軸に垂直な第二軸に沿って前記光線
を走査する第二走査エレメントを有する。第三走査エレ
メントは、予め決められた強度で、第一軸と第二軸とに
よって決められた映像形成平面に垂直な第三軸に沿って
前記光線を走査する。第二走査エレメントと第三走査エ
レメントとは、同じ周波数で走査するように同期されて
いる。第二の予め決められた強度と第三の予め決められ
た強度とは、それらの最大強度に対する割合である。セ
レクターは前記割合の和が 100パーセントになるように
第二および第三の予め決められた強度を決定する。 【効果】生態組織の不侵食、リアルタイム、映像周波数
の映像を作ることができる。生体中で、皮膚の約０〜３
mmの範囲の深さの組織について映像形成させることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【背景】本発明は共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】共焦点顕微鏡は、高解像度・高倍率像を形
成するために試料平面で光の焦点を合わせ、光を走査す
ることを伴う。従来の共焦点顕微鏡は、試料中の薄い面
の高解像度像である、連続した薄い「光学切片」を発生
することによって、試料の像を映している（例えば、米
国特許 4,827,125 および 4,198,571 を参照。これら
の内容を参照としてここに組み入れる）。共焦点顕微鏡
は、通常、インヴィトロで使用される。
【０００３】共焦点走査顕微鏡には、従来、２つの型が
ある。タンデム型走査共焦点顕微鏡（tandem scanning
confocal microscope ）（"TSCM"）は水銀ランプのよう
な光源に照射された回転ピンホールディスクを採用して
いる。操作の間に、前記ディスクは試料を通過して焦点
を掃引する。ディスクは、さらに、後方散乱された光を
空間的に濾過する。この機器は、例えば、皮の切片の像
を映すのに使用される。類似の機器である共焦点レーザ
ー走査顕微鏡（confocal laser scanning microscope）
("CLSM") は、生検細胞試料などの試料の像を映すのに
レーザー光線を使用する。この機器においては、レーザ
ー光線は試料の単一平面内の回折限界点近くに焦点を絞
られる。次いで、試料面を横切ってこの焦点を走査させ
るか、あるいは、マイクロメーターステージを使用して
試料を移動させる。一般的に、CLSMはTSCMよりも大きな
検出力、優れた波長選択性、およびよりよい照射力を有
する。
【０００４】
【要約】本発明は、像平面回転組立体を含む共焦点顕微
鏡を特徴とする。該像平面回転組立体は、３本の直交す
る軸に沿って光線を走査するために３基の走査エレメン
トを含む。前記走査エレメントのうちの２基は同期され
ており、選択された単一の周波数で走査する。２基の同
期された走査エレメントによって走査される光線の所望
の強度を設定するのに、セレクターが使用される。所望
の強度とは、それぞれの最大強度に対するパーセンテー
ジ強度であり、両パーセンテージの和は 100 パーセン
トである。
【０００５】好ましい態様は、前記セレクターが、２基
の同期された走査エレメントの強度を選択的に変化させ
る周波数源を有するコントローラーであることを含む。
前記２基の同期された走査エレメントは共用の周波数源
によって駆動される。
【０００６】本発明の共焦点顕微鏡は、アームの旋回軸
点に走査エレメントを収容する旋回式連結アーム、映像
形成レンズ、および第２走査エレメントと該映像形成レ
ンズとの間に配置される焦点レンズを含む。焦点レンズ
は、前記映像形成レンズの入射口をアームの走査エレメ
ントに光学共役させて、前記入射口で視野(field) の空
間的変位を最小にするように配置されている。照準装置
は、光線が走査エレメントから出るときに光線の照準を
合わせ、光線が映像形成レンズの入射口に実質的に集中
しているように走査エレメントを位置させるように設計
されている。
【０００７】約 1550 〜1800 nm の波長で光を発する光
源が前記光線を作る。
【０００８】本発明の別の態様によると、顕微鏡の対物
レンズを生体組織に結びつける結合器は、組織に接着載
置するための組織接触面を定めるテンプレートを含む。
該接触面は組織映像形成口を定める。筐体は対物レンズ
収容室を定め、対物レンズを筐体に強固に結びつける第
一取付具、およびテンプレートを筐体に強固に結び付け
る第二取付具を有する。
【０００９】本発明の別の態様によると、試料の映像を
発生する方法は、試料に光線の焦点を絞る対物レンズを
含む共焦点顕微鏡で試料を照射すること、および屈折率
が約1.39〜1.41の屈折率調整流体を対物レンズと試料と
の間に介させることを含む。本発明は多くの長所を有す
る。操作者は、組織を侵すことなく(non-invasive-ly)
、水平面、垂直面あるいは様々な角度の面にそって配
向する生体組織の光学切片を見ることができる。映像
は、組織表面のかなり下からも得ることができる。顕微
鏡の連結アームによって、都合のよい位置決めおよび組
織との接触が可能になる。連結アームは、従来のシステ
ムにおけるよりもより光学面を必要としないように作ら
れており、それによって光の減衰を最小にする。アーム
に含まれる映像形成レンズは、組織と直接接触させて置
かれており、それによってレンズと組織との間の相対的
な動きを最小にし、映像を形成する面の深さを安定化さ
せる。
【００１０】本発明の他の特徴および利点は、続く詳細
な記載および請求の範囲から明らかであろう。
【００１１】
【詳細な記載】図１および図１Ａを参照すると、本発明
による共焦点顕微鏡10は光学通路15（ｚ軸）に沿って映
像形成野14を作るレーザー12を有する。映像形成野14
は、連結アーム20を介して映像形成される、例えば人間
の皮膚などの組織22に送られる。例えば、約37,762 r.
p.m. （この周波数は、標準的な定格映像周波数である
15.7 kHz に対応する）で駆動され、約25の反射小面に
区画された回転多角形鏡などの高速走査装置44の反射面
に、レーザー12からの映像形成野14は部分伝達光線分割
光学素子34を通って伝播される。
【００１２】高速走査機44が回転すると、映像形成野14
は光学通路15（ｚ軸）に垂直な軸（ｘ軸）に沿って振動
状に走査される。次いで、映像形成野14は移送レンズ54
を通って連結アーム20中へと向けられる。高速走査装置
44によって角度的に変位した２つの代表的な映像形成野
14', 14'' が図面に示されている。
【００１３】連結アーム20は、例えば 60Hz の周波数で
発振する検流鏡のような低速走査装置56を収容する。低
速走査装置56の振動はｘおよびｚ軸に垂直な第３の軸
（ｙ軸）に沿った映像形成野を走査する。次に、走査さ
れた映像形成野は焦点レンズ66を通って顕微鏡の対物レ
ンズ72に移る。焦点の深さはレンズ72、あるいは走査プ
ラットフォーム18に取り付けられた焦点レンズ16（例え
ば、100 cm〜2 m の焦点距離を有している）によって調
節することができる。走査プラットフォーム18は、光学
通路15（ｚ軸）に沿って焦点の深さを走査するために、
振動状に光線通路に沿って動かされる。図１Ａにおいて
は、２つの代表的な映像形成野14', 14''組織内の一定
の深さの別々の位置で、焦点を絞られていることが示さ
れている。映像形成は組織22から送られた光（即ち、反
射または放出された光）を用いて行われるのが好まし
い。映像形成野14のわずかな一部14''' は照射の後に組
織から反射される。送出された光はピンホール81を通っ
て光検出器80へ入る。ｘ軸に沿って走査された反射野の
部分は標準的な映像周波数である 15.7 kHz に同期した
電気信号を発する。そして、ｙ軸および／またはｚ軸に
沿って走査された反射野の部分は約60 Hz のより低い周
波数に同期された電気信号を発生する。この 60 Hz は
従来の米国の映像装置のフレーム切替周波数に対応する
周波数である。図２〜２Ｂを参照すると、顕微鏡の走査
光学系は、連続した水平(xy)切片100（図３）、連続し
た垂直(xz)切片110 （図３Ａ）、および連続した傾斜(x
w)切片120 （図３Ｂ）を映像形成させるように走査され
る。
【００１４】１基以上の走査光学機器44, 56, 16 の走
査規模（即ち、走査角または縦方向の変位の大きさ）を
変えることによって、様々な切片の像を得ることができ
る。深さが決定する水平切片100 においては、ｚ軸が深
くなる方向に移動しながら、ｘおよびｙ軸を走査する。
垂直切片110 を映像形成するためには、ｙ軸を少しずつ
移動しながら、ｘおよびｚ軸を走査する。
【００１５】傾斜切片120 は３つの軸全てを走査するこ
と、およびｙ軸とｚ軸との相対的な走査強度を調整する
ことによって映像形成される。図４を参照すると、前記
調整は、単純な電位差回路のような平衡制御を用いるこ
とによってなすことができる。これによって、共通の波
形駆動機58によって走査プラットフォーム18および低速
走査機56に送られる波形の相対的な強度を変えることが
可能になる。走査プラットフォーム18および低速走査機
56の走査周波数は、約１〜100 Hzの周波数範囲で駆動機
58によって同期されている。
【００１６】回路105 によって、ｘｙ平面、ｘｚ平面ま
たはｘ軸を含む他のいかなる面もの走査が可能になる。
低速走査駆動電圧Ｖは、単一の検流計Ｒによって演算増
幅器202a, 204a を通じて、それぞれ増幅器 202, 204
（ｚおよびｘ軸走査）を駆動するように配分されてい
る。例えば、ノブが終始時計回りである場合は、分割部
分ｆはゼロに等しく、電圧の全てが駆動増幅器202 にか
かっているように見え、その結果、ｘｚ走査が行われる
（それゆえ、駆動増幅器204 にかかる電圧はゼロであ
る）。ノブが完全に半時計回りであるときは、ｆは１に
等しく、全電圧が駆動増幅器204 にかかっているように
見え、その結果ｘｙ走査が行われる。その中間において
は、例えば、ｆを0.3 とすると、駆動増幅器204 はその
最大出力の0.3 倍（30％）、駆動増幅器202 はその最大
出力の0.7 倍（70％）であり、ｚ軸に対して23度（tan
23 = .3/.7）の平面201 を走査することになる（図４を
参照）。
【００１７】図５を参照すると、低速走査機56は、高速
走査機44の目標平面に対応する共役映像形成平面に配置
されているアーム20の旋回点56a に位置している。この
位置は反射「肘」結合部68の表面での映像形成野14の動
きを最小にする。操作の間、低速走査機56は２つの型の
角運動に付される。高速で振動性（例えば、60 Hz の周
波数）の運動は、映像形成のためにｙ軸に沿って映像形
成野を走査する。一方、低速で非振動性の運動はアーム
20が動いている間に（矢印65）対物レンズ72の入射口7
2' に映像形成野を合わせる。低速走査機56は、例えば
エンコーダなどの帰還センサー56b を使用することによ
って入射口72' に向けられる。帰還センサーはアーム20
の動きを感知し、低速走査機56は旋回点56a の周りを回
転角の半分動かされる。検流動作のような電気的に誘導
される動きも使用することができるが、この低速の動き
は機械的な連動装置によって達成することができる。
【００１８】アームが可動で対象の動きに追随すること
ができるので、対象の呼吸や心臓の鼓動に対応するもの
など、組織内の時間に依存する小さな変動は、アームが
その対象に固定されている場合は、修正可能である。
【００１９】生体組織のさらなる安定化は、例えば、皮
膚を共焦点顕微鏡の連結アームに強固に固定するための
接着剤または吸引を使用することによって、さらに堅固
に顕微鏡と皮膚とを結合させるよって達成される。図６
を参照すると、顕微鏡と皮膚との結合器300 は真鍮の環
302 およびテンプレート304 を有する。テンプレート30
4 の穴306 を映像形成される皮膚位置に合わせた状態
で、テンプレート304 を対象の皮膚に接着する。顕微鏡
対物レンズ筐体308 は、対物レンズ72を収容する室310
を構成する。筐体308 は観察窓312 およびボルトを入れ
る穴316 を定める取付アーム314 を有している。
【００２０】使用に際しては、テンプレート314 は対象
の皮膚に接着され、室310 内に配置された対物レンズ72
を含む筐体308 は環302 の中に置かれる。それから、筐
体308 と環302 とはネジを用いて取り付けられる。
【００２１】図７を参照すると、取付板320 は、対物レ
ンズ72のネジ山を切った部分72a とかみ合うネジ山を切
った穴324 を定める枠322 を含む。アーム326 は取付け
ネジ330 用の細孔328 を定める。筐体308 はアーム326
とネジ330 との間に置かれ、アーム314 の取付穴316 に
はめ込まれる。アーム334 の細孔328 および細孔332よ
って筐体308 の位置の調整が可能になる。取付板320 は
正面板336 を介して３次元載物台（図示されていない）
に取り付けられる。
【００２２】図８を参照すると、レーザー12の光波長
は、ある特定の試料の画像品質を最適にするように選ば
れる。組織22の映像形成は組織内の隣接構造間の屈折率
の相違に依存し、汚れやリン光染料によって吸収されな
いことには関係がない。この事実によって、組織の中に
最もよく浸透するように入射光の波長を選択することが
可能になる。光の散乱が少なく、組織内の水による吸収
が大きいので、赤外領域の波長が望ましい。したがっ
て、主な水の吸収帯、例えば、1064 nm と 1650 nmとの
間の赤外領域の波長が好ましい。一般的に、映像形成に
望ましい波長は 700〜2000 nm であり、それより短い可
視領域の波長は強く吸収されるか、ほとんどの組織によ
って光学的に散乱される。また、特定帯域および赤外の
より長波長領域（即ち、1940 nm および約３ミクロンよ
りも大きな波長）は殆どの組織に存在する水によってよ
り強く吸収される。
【００２３】スペクトルの近赤外領域に近い 600 nm の
光の表皮吸収体であるメラニンは、光を強度に後方散乱
するので、自然発生対比剤として本発明の共焦点顕微鏡
と共に使用することができる。
【００２４】対物レンズ72と組織22との間の屈折率を約
1.40に合わせると、画像の品質が高くなる。調整流体と
して蔗糖の40％水溶液を使用すると、望ましい屈折率が
得られる。
【００２５】本発明の共焦点顕微鏡を使用すると、生体
組織の不浸食、リアルタイム、映像周波数の映像を作る
ことができる。生体中で、皮膚の約０〜３ mm の範囲の
深さの組織について映像形成させることができる。顕微
鏡用の標本を得るのに、組織生検や組織に侵入する他の
技術は必要とされない。
【００２６】他の態様は以下の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による共焦点顕微鏡の概略図で
ある。
【図１Ａ】図１Ａは、図１の共焦点顕微鏡の組織をとら
えた映像形成レンズの拡大図である。
【図２】図２は、ｚ軸に沿って間隔をあけて採ったｘｙ
切片を示す横断面図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ｙ軸に沿って間隔をあけて採った
ｘｚ切片を示す横断面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｗ軸に垂直に、間隔をあけて採っ
たｘｗ切片を示す横断面図である。ここで、ｗはｙｚ平
面においてｙ軸に対してある角度を有する軸である。
【図３】図３は、ｙ軸およびｚ軸に沿って相対的な走査
強度を調整する回路の設計図である。
【図４】図４は、傾いた平面の走査図である。
【図５】図５は、２つの位置にある、共焦点顕微鏡の連
結式アームの概略図である。
【図６】図６は、本発明による、映像形成レンズ結合器
の概略図である。
【図７】図７は、図６の映像形成レンズ結合器と共に使
用する取付板の概略図である。
【図８】図８は、水の吸収スペクトルをプロットした図
である。
【手続補正書】
【提出日】平成９年１２月１１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による共焦点顕微鏡の概略図で
あり、図１Ａは、図１の共焦点顕微鏡の組織をとらえた
映像形成レンズの拡大図である。
【図２】図２は、ｚ軸に沿って間隔をあけて採ったｘｙ
切片を示す横断面図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ｙ軸に沿って間隔をあけて採った
ｘｚ切片を示す横断面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｗ軸に垂直に、間隔をあけて採っ
たｘｗ切片を示す横断面図である。ここで、ｗはｙｚ平
面においてｙ軸に対してある角度を有する軸である。
【図３】図３は、ｙ軸およびｚ軸に沿って相対的な走査
強度を調整する回路の設計図である。
【図４】図４は、傾いた平面の走査図である。
【図５】図５は、２つの位置にある、共焦点顕微鏡の連
結式アームの概略図である。
【図６】図６は、本発明による、映像形成レンズ結合器
の概略図である。
【図７】図７は、図６の映像形成レンズ結合器と共に使
用する取付板の概略図である。
【図８】図８は、水の吸収スペクトルをプロットした図
である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エイチ．ウェブ アメリカ合衆国，マサチューセッツ州 01773， リンカーン，オールド コンコ ルド ロード ９ (72)発明者 ミリンド ラヤデハクシャ アメリカ合衆国，マサチューセッツ州 02114， チャールズタウン，エイス ス トリート ＃5304 42

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 画像平面回転体を有する共焦点顕微鏡で
    あって、該画像平面回転体が：第一の予め決められた強
    度で、第一軸に沿って光線を走査する第一走査エレメン
    ト；前記第一軸に垂直な第二軸に沿って、第二の予め決
    められた強度で前記光線を走査する第二走査エレメント
    であり、かつ、前記第二の予め決められた強度は最大第
    二強度のあるパーセンテージ強度であって、それによっ
    て、前記第一軸と第二軸とによって限定された平面に二
    次元映像形成野を発生させる第二走査エレメント；前記
    平面に垂直な第三軸に沿って、第三の予め決められた強
    度で前記光線を走査する第三走査エレメントであり、か
    つ、前記第三の予め決められた強度は最大第三強度のあ
    るパーセンテージ強度であって、前記第二走査エレメン
    トはある選択された周波数で前記第二軸に沿って走査
    し、前記第三走査エレメントは第二走査エレメントと同
    期されており、前記選択された周波数で第三軸に沿って
    走査する第三走査エレメント；および前記第二の予め決
    められた強度と第三の予め決められた強度とを決定する
    セレクターであり、かつ、前記最大第二強度のパーセン
    テージと最大第三強度のパーセンテージとの和が100 パ
    ーセントになるように、第二の予め決められた強度と第
    三の予め決められた強度とは関係付けられているセレク
    ター、 を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
  2. 【請求項２】 前記第三軸が顕微鏡の光学通路を有し、
    前記第三走査エレメントが該光学通路に沿って調節可能
    な縦方向の変位で移動するように設計された振動装置に
    取り付けられている請求項１の共焦点顕微鏡。
  3. 【請求項３】 前記セレクターが、前記第二および第三
    の予め決められた強度を選択的に変化させる周波数源を
    有する制御装置を有する請求項１の共焦点顕微鏡。
  4. 【請求項４】 前記第二走査エレメントおよび第三走査
    エレメントが共通の周波数源によって駆動される請求項
    １の共焦点顕微鏡。
  5. 【請求項５】 前記第二走査エレメントおよび第三走査
    エレメントが約１〜100 Hzの周波数で駆動される請求項
    １の共焦点顕微鏡。
  6. 【請求項６】 前記第二走査エレメントを収容する旋回
    式連結アームをさらに有する請求項１の共焦点顕微鏡。
  7. 【請求項７】 前記アームに収容された映像形成レンズ
    をさらに有し、前記映像形成レンズは前記第二走査エレ
    メントからの二次元映像形成野を受け取り、該二次元映
    像形成野を試料中の焦平面に絞るように設計されている
    請求項６の共焦点顕微鏡。
  8. 【請求項８】 前記第三軸が顕微鏡の光学通路を有し、
    前記連結アームが第二走査エレメントと映像形成レンズ
    との間の光学通路に沿って配置された焦点レンズをさら
    に有し、該焦点レンズが映像形成レンズの入射口を第二
    走査エレメントに対して光学共役させて該入射口におい
    て映像形成野の空間的変位を最小にする、請求項７の共
    焦点顕微鏡。
  9. 【請求項９】 第二走査エレメントが連結アームの旋回
    点に配置されている請求項６の共焦点顕微鏡。
  10. 【請求項10】 前記光線が走査エレメントを出るときに
    光線の照準を合わせる照準装置をさらに有する請求項９
    の共焦点顕微鏡。
  11. 【請求項11】 前記アームに収容された映像形成レンズ
    をさらに有し、前記映像形成レンズは前記第二走査エレ
    メントからの二次元映像形成野を受け取り、該二次元映
    像形成野を試料中の焦平面に絞るように設計されてお
    り、前記照準装置が、光線が映像形成レンズの入射口に
    実質的に集中した状態にあるように前記第二走査エレメ
    ントを配置する設計である請求項10の共焦点顕微鏡。
  12. 【請求項12】 前記アームが、第二走査エレメントから
    二次元映像形成野を受け取るように設計された反射肘型
    継手をさらに有する請求項６の共焦点顕微鏡。
  13. 【請求項13】 前記光線を作る光源をさらに有し、該光
    源が約1550〜1800 nmの波長で光を放出する請求項１の
    共焦点顕微鏡。
  14. 【請求項14】 軸に沿って光線を走査する走査エレメン
    トを有する共焦点顕微鏡と共に使用される連結アームで
    あって、該連結アームが：その旋回点に取り付けられた
    走査エレメントを収容する筐体；および前記光線が走査
    エレメントを出るときに光線の照準を合わせる照準装置
    を有することを特徴とすること。
  15. 【請求項15】 前記アームに収容された映像形成レンズ
    をさらに有し、前記映像形成レンズは前記走査エレメン
    トからの光線を受け取り、該光線を試料中の焦平面に絞
    るように設計されており、前記照準装置が、光線が映像
    形成レンズの入射口に実質的に集中した状態にあるよう
    に前記走査エレメントを配置する設計である請求項14の
    連結アーム。
  16. 【請求項16】 波長が約1550〜1800 nm の範囲にある光
    線を作る光源を含む光学伝送システム、 第一軸に沿って前記光線を走査する第一走査エレメン
    ト、および前記第一軸に垂直な第二軸に沿って前記光線
    を走査する第二走査エレメントを有し、前記第一軸と第
    二軸とによって決定される平面に沿って二次元映像を発
    生させる、生体組織の映像を発生させる共焦点顕微鏡。
  17. 【請求項17】 約０〜３mmの深さで組織の映像を形成す
    るように設計された請求項16の共焦点顕微鏡。
  18. 【請求項18】 組織に接着載置し、組織映像形成口を定
    める組織接着面を限定するテンプレート、および対物レ
    ンズ収容室を定める筐体であって、該筐体に対物レンズ
    を強固に結合させる第一取付具と、筐体に前記テンプレ
    ートを強固に結合させる第二取付具とを含む筐体を有す
    る、生体組織に顕微鏡の対物レンズを結合させる結合
    器。
  19. 【請求項19】 a)試料に光線を絞る対物レンズを含む共
    焦点顕微鏡で該試料を照射し、 b)前記対物レンズと前記試料との間に屈折率が約1.39〜
    1.41である屈折率調整流体を使用することを有する、試
    料の映像を形成する方法。
  20. 【請求項20】 a)第一軸に沿って第一の予め決められた
    強度で光線を走査する第一走査エレメント、 前記第一軸に垂直な第二軸に沿って第二の予め決められ
    た強度で前記光線を走査する第二走査エレメントであっ
    て、該第二の予め決められた強度は最大第二強度のある
    パーセンテージ強度であって、それによって第一軸と第
    二軸とによって定められる平面に二次元の映像形成野を
    発生する第二走査エレメント、 前記平面に垂直な第三軸に沿って第三の予め決められた
    強度で光線を走査する第三走査エレメントであって、該
    第三の予め決められた強度は最大第三強度のあるパーセ
    ンテージ強度であって、前記第二走査エレメントは前記
    第二軸に沿って選択された周波数で走査を行い、前記第
    三走査エレメントは前記第二走査エレメントに同期して
    前記選択された周波数で第三軸に沿って走査を行う第三
    走査エレメント、並びに前記第二の予め決められた強度
    および第三の予め決められた強度を決定するセレクター
    であって、前記第二の予め決められた強度と第三の予め
    決められた強度とは、前期最大第二強度の前記パーセン
    テージと最大第三強度の前記パーセンテージとの和が 1
    00パーセントに等しいという関係があるセレクター、を
    有する共焦点顕微鏡で試料を照射し、 b)前記試料中に前記光学野を走査し、 c)光検出器で試料から送出された光を受けて試料の映像
    を形成する、試料の映像を発生する方法。
  21. 【請求項21】 自然発生対比剤としてメラニンを含有す
    る試料に前記光学野を走査することをさらに有する請求
    項20の方法。
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