JPH10170514A - ヒスタミンの蛍光強度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速かつ簡便な操作でしかも再現性に優れた
被検液から遊離されるヒスタミンの蛍光強度測定法を得
るものである。 【解決手段】 アレルゲン成分を有し、ウエル内にガラ
ス微細繊維を付着せしめたマイクロプレートにヒスタミ
ン遊離能を有する被検液を分注する工程と、マイクロプ
レートを一定の条件下に維持しながらアレルゲン成分の
刺激により被検液中からヒスタミンを遊離せしめる工程
と、遊離ヒスタミンをガラス微細繊維に特異的結合せし
めた後マイクロプレートを洗浄する工程と、蛍光発色試
薬をウエルに分注してガラス微細繊維よりヒスタミンを
溶出させた後、蛍光発色団と結合させる工程と、遊離ヒ
スタミン量に基づく蛍光強度を測定する工程とを有し、
これらの工程を一定間隔で順次連続して行うものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒスタミン遊離能
を有する被検液、例えば全血、白血球画分、洗浄血球ま
たは好塩基球を含有する体液からアレルゲン成分の刺激
により遊離したヒスタミンの自動測定に関し、更に詳し
く言えば被検液の分注工程−ヒスタミン遊離反応工程−
洗浄工程−蛍光発色試薬分注工程−発色安定化試薬分注
工程−蛍光測定工程を一連の連続した反応工程としたヒ
スタミンの蛍光強度測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギー疾患患者の治療は、起因する
アレルゲンが何であるかを知ることが極めて重要なこと
である。このための検査法としては、例えばｉｎ ｖｉ
ｖｏの検査の場合は皮内試験、吸入誘発試験、食物負荷
試験などが知られている。また、患者に苦痛を与えない
ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断法は、血清中のレアギン、すな
わち特異ＩｇＥ抗体を免疫的に測定する方法が一般的に
行われている。これらの検査で判定される疾患は、例え
ば薬物やワクチンによるアナフィラキシー、気管支喘
息、花粉症、食物アレルギー等のごとく外来性のアレル
ゲンに起因するものが挙げられる。

【０００３】アレルゲン成分の刺激により被検液からの
ヒスタミン遊離反応は、体液性の抗体が関与している即
時型アレルギー反応の引き金であり、特異ＩｇＥ抗体量
測定よりも生体内の反応をより強く反映しているという
ことが既に報告されている（安枝浩：ヒスタミン遊離試
験．臨床免疫２０，２３７−２４７，１９８８）。従っ
て、反応操作に種々の制約を受けない、あるいは、危険
性を伴わない安全なｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒスタミン遊
離反応に基づく起因アレルゲンの検索が、特異ＩｇＥ測
定によるアレルゲン検索と比較して同等もしくはそれ以
上の意味を持つことが期待される。

【０００４】遊離ヒスタミン測定法に関しては、例えば
特公平３−１９９４８号公報、特表平４−５０６２５２
号公報等が知られている。これらの公報に開示されたヒ
スタミン遊離測定法は、ウエルに刺激用のアレルゲンを
固定したガラスファイバーを有するマイクロプレートを
使用する。すなわち、マイクロプレートのウエルに添加
された被検液から遊離されるヒスタミンは、ガラスファ
イバーに特異的に吸着されるため、Ｂ／Ｆ分離が極めて
容易に行え、そして、ガラスファイバーに吸着せしめた
ヒスタミンをアルカリにて溶出し、次いで蛍光発色団で
あるｏ−フタルアルデヒドと結合させて蛍光を発色さ
せ、その蛍光強度を測定すればヒスタミン量を測定する
ことができるため、簡便な測定法とされていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな測定法では、一連の測定工程においてマイクロプレ
ートを蛍光測定に持ち込むまでに手作業による極めて煩
雑な工程を必要とし、中でも、マイクロプレートへの被
検液・試薬の分注、マイクロプレートの洗浄等の段階で
多大の時間を必要としていた。更に、全血の被検液を用
いる場合には、蛍光測定での妨害を防ぐために、特にマ
イクロプレートの洗浄工程を長く取る必要があった。

【０００６】しかし、この種のアレルギー疾患の多くは
周知のように季節性のものであり、それのシーズンには
一時に多数の検体が集中し、しかも、測定は血液からの
ヒスタミン遊離を見るため、血球は活性を保った条件下
で行わなければならない。このため、測定は一般的には
採血後４８時間以内に行う必要があることから、前記の
ごとく手作業による煩雑な工程を含む測定法では多検体
の測定には到底対処できず、それ故、被検液の測定を効
率的に行うことのできる方法が強く要望されていた。

【０００７】本発明者らは、このような要望を満足せし
めるために鋭意研究の結果、迅速性、操作性、再現性に
優れた、被検液から遊離されるヒスタミンの測定法を開
発し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は
被検液の分注工程−ヒスタミン遊離反応工程−洗浄工程
−蛍光発色試薬分注工程−発色安定化試薬分注工程−蛍
光強度測定工程を、一定の間隔で連続した工程とするこ
とにより、極めて効率的かつ簡便に連続測定することが
できるようにしたヒスタミンの蛍光強度測定方法を提供
するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、被検液から遊
離されたヒスタミン量に由来する蛍光強度を測定するも
のにおいて、アレルゲン成分を有し、ウエル内にガラス
微細繊維を付着せしめたマイクロプレートのウエルにヒ
スタミン遊離能を有する被検液を分注する工程と、マイ
クロプレートを一定の条件下に維持しながらアレルゲン
成分の刺激により被検液中からヒスタミンを遊離せしめ
る工程と、遊離ヒスタミンをガラス繊維に特異的結合せ
しめた後マイクロプレートを洗浄する工程と、蛍光発色
試薬をウエルに分注してガラス微細繊維よりヒスタミン
を溶出させた後、蛍光発色団と結合させる工程と、発色
安定化試薬を加え蛍光結合物を安定化させた後遊離ヒス
タミンの蛍光強度を測定する工程を有し、これらの工程
を一定間隔で順次連続して行うことを特徴とするヒスタ
ミンの蛍光強度測定法であって、極めて簡便かつ効率的
にアレルギー疾患に起因するアレルゲンを連続検索する
ことができる。

【０００９】更に、本発明は、被検液から遊離されたヒ
スタミンを有するマイクロプレートに蛍光発色試薬を分
注し、蛍光発色団とヒスタミンの結合物を生成させた
後、蛍光反応生成物の安定化をはかるため安定化試薬を
分注することが好ましい。被検液は、全血、白血球画
分、洗浄血球または好塩基球を含有する体液である。ヒ
スタミン蛍光発色試薬は、ｏ−フタノールアルデヒドで
あり、蛍光発色試薬の分注一定時間後に反応液に発色安
定化試薬を加え、酸性条件となすｐＨ補正工程を有す
る。ｐＨ補正は過塩素酸によりｐＨ１．３〜２．４の範
囲に補正される。測定工程は、ウエル内の反応液を蛍光
強度測定部へ導入する少なくとも２個以上の吸引パイプ
を有し、それぞれの吸引部を予め設定されたウエル内に
導入し、反応液または検査液を蛍光光度計に移送して同
時に複数測定すれば、より効率的な測定が可能となる。

【００１０】更にまた、本発明は、被検液分注工程Ａ
と、緩衝液分注と蛍光発色試薬分注工程Ｂと、洗浄液分
注と安定化試薬分注の工程Ｃと、ヒスタミン遊離反応と
洗浄液での反応の工程Ｄと、洗浄工程Ｅと、ヒスタミン
と蛍光発色試薬の反応工程Ｆと、蛍光強度測定工程とが
組み合わされ、被検液からの遊離ヒスタミンを測定する
に際し、マイクロプレートが上記の工程Ｂ→Ａ→Ｄ→Ｅ
→Ｃ→Ｄ→Ｅ→Ｂ→Ｆ→Ｃを一定間隔で移動した後、反
応液または検査液を蛍光強度測定工程に移送して測定す
れば、重複できる工程を共通使用できるため、システム
の配列がコンパクト化し得ることになる。

【００１１】本発明において、使用した用語「被検液」
とは、ヒスタミン遊離能を有する血球を含むもので、例
えば全血、白血球画分、洗浄血球または好塩基球を含有
することを意味する。また、各分注ステージまたは工程
において、使用した用語「分注機」とは、被検液、及び
試薬を攪拌または静置しながら一定の液量を採取し、マ
イクロプレートに分注するものでればよく、特に限定さ
れない分注機であることを意味する。

【００１２】更に、本発明において、使用した用語「恒
温ステージ」とは、遊離反応に必要な時間マイクロプレ
ートを一定温度に維持する装置であればよく、特に限定
されないが、好ましい例としては、３０℃〜４５℃の範
囲で自由に温度設定が可能で、かつ、マイクロプレート
を振とうすることができ、また自動的に出し入れするこ
とのできる恒温室が挙げられる。恒温室に一時にセット
できる被検液数は、当該恒温室の大きさ、すなわち収納
し得るプレート数により規定されることを意味するもの
である。

【００１３】更にまた、本発明において、使用した用語
「洗浄機」とは、９６穴マイクロプレートに、被検液・
洗浄液等を同時に吸排出できる性能を有していればよ
く、特に限定されない。また、蛍光強度を測定するステ
ージにおいて使用した用語「蛍光強度測定ステージ」と
は反射型もしくはフローセル型のものであればよく、特
に限定されないが、好適な例としては、１０ｐｇ／ｍｌ
濃度のクマリン溶液の蛍光強度が検出可能である蛍光光
度計が挙げられる。

【００１４】

【発明の実施の態様】以下に図面を参照しながら本発明
の実施例について説明するが、本発明は何らこれらによ
って限定されるものではない。本発明におけるヒスタミ
ンの蛍光強度測定法における好適な測定システムは以下
の主要部から構成される。 （１）アレルゲン成分を有し、ウエルにガラス微細繊維
を固定したマイクロプレートをセットしておくプレート
保持部。 （２）被検液の分注ステージにおいて被検液を上記のマ
イクロプレートに分注する分注機。 （３）マイクロプレートへ緩衝液、蛍光発色試薬、洗浄
液、安定化試薬を分注する分注機。

【００１５】（４）各試薬類を収納するボトルユニッ
ト。 （５）マイクロプレートを収納して一定温度の反応条件
を維持せしめながら被検液からヒスタミンの遊離反応を
行い、また洗浄液による洗浄反応を行うための恒温室。 （６）マイクロプレートの洗浄を充分に行うための洗浄
機。 （７）遊離ヒスタミンの蛍光強度を測定するための測定
部を含む蛍光測定分析器。

【００１６】（８）マイクロプレートをそれぞれの処理
工程に順次移動させてマイクロプレートをそれぞれのス
テージの所定位置に予め決められたシーケンスに従って
セットされるプレート移動部。 （９）指令に基づき当該システムの全体の作動を制御
し、データの記憶・演算を行って結果をプリンター等に
出力する記憶・制御部。 （１０）上記（９）への作動指令を行う制御部。

【００１７】図１に示した実施例による測定法のフロー
チャートは、被検液の分注工程−ヒスタミン遊離反応工
程−洗浄工程−蛍光試薬分注工程−安定化試薬分注工程
−蛍光測定工程が一連の連続した反応工程にて行われる
システムである。即ち、プレート保持部１０は緩衝液分
注ステージ１１に接続され、該ステージ１１は被検液分
注ステージ１２を介して反応条件維持の恒温ステージ１
３に接続され、該ステージ１３は洗浄ステージ１４に接
続され、更に洗浄液分注ステージ１５を介して上記の恒
温ステージ１３に接続してある。

【００１８】恒温ステージ１３は洗浄ステージ１６を介
して蛍光発色試薬分注ステージ１７に接続され、更にヒ
スタミンと蛍光発色試薬反応ステージ１８、安定化試薬
分注ステージ１９を介して蛍光強度測定ステージ２０に
接続してある。該蛍光強度測定ステージ２０はプレート
排出部２７と反応液または検査液排出部２８に接続して
ある。

【００１９】上記の一連の工程途中に配置した恒温ステ
ージ１３が検査液の往路と復路に共通して使用されるよ
うに配置してある。従って、この方法によれば、恒温ス
テージ１３以外のステージは全て独立して処理が行える
ため、マイクロプレートの数が何枚になっても連続測定
が行える利点がある。

【００２０】さて、図１に示した実施例による測定法を
工程順に従って具体的に説明すると、プレート保持部１
０には公知の９６穴マイクロプレートＴ（図２参照）が
一度に数十枚積み重ねてセットされる。マイクロプレー
トＴのウエルＵの内底面にはガラスファイバー微細繊維
〔ＷｈａｔｍａｎｎＧＦ／Ｆ（商品名）より調製〕が固
定してある。固定方法としては、例えば特表平４−５０
６２５２号公報に開示されているように、ガラスファイ
バーシートを細片に切り、遠心型ボールミルで粉砕し、
粉砕ガラスマイクロファイバーを得る。この粉砕ガラス
マイクロファイバーを室温にて、蒸留水中に懸濁する。

【００２１】この懸濁液を充分に攪拌した後、粉砕ファ
イバーを室温で一定時間沈降させ、その後、上層部を注
意深くデカンテーションすることによって粒度の整った
粉砕ファイバーを含有する懸濁液を得る。一方、市販の
ビニルアセテート／エチレンコポリマー分散液を室温で
攪拌し、蒸留水で希釈して結合剤分散液を得、この結合
剤分散液を粉砕ガラスファイバー懸濁液に加え、結合剤
／粉砕ガラスファイバー分散液とし、これをポンプで上
記マイクロプレートＴのウエルＵに一定量移し、一夜乾
燥させる。そして、ガラスファイバー微細繊維に例えば
ネコ、日本スギ、ダニ、牛乳、卵白など種々の試験アレ
ルゲンが固定する。固定化法についても特表平４−５０
６２５２号公報の記載にしたがって行えばよい。

【００２２】そこで、例えば薬物やワクチンによるアナ
フィラキシー、気管支喘息、花粉症、食物アレルギー等
の起因アレルゲンを調べるための種々のアレルゲン成分
を有するマイクロプレートＴをプレート保持部１０にセ
ットする。このプレート保持部１０は、制御部により予
め設定されたシーケンスにしたがって各ステージの分注
位置にプレート移動部により順次移送され正しくセット
される。

【００２３】さて、プレート移動部でプレート保持部１
０が緩衝液分注ステージ１１に送られ、該緩衝液分注ス
テージ１１において分注機（ＥＤＡ ３００Ａ，バイオ
テック社製）により各ウエル当たり２５μｌの緩衝液が
９６穴同時に分注される。分注時間は２０秒程度であ
り、緩衝液としては、ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
が使用される。緩衝液の分注により、マイクロプレート
ＴのウエルＵに固着されている各アレルゲンが溶離され
てくる。

【００２４】各ウエルＵに緩衝液が分注されたマイクロ
プレートＴは、プレート移動部で次段の被検液分注ステ
ージ１２に送られる。該被検液分注ステージ１２では各
ウエルＵに対して被検液が分注機（ピペットステーショ
ンＳＧＲ３００、三光純薬社製）により２５μｌを１２
穴づつ９６穴全体に分注される。分注時間は大体３０秒
程度である。

【００２５】各ウエルＵへの被検液の分注が終了したな
らばマイクロプレートＴを順次、反応条件維持の恒温ス
テージ１３のラックに移送する。この移送はマイクロプ
レートＴを１分間隔で移送する。恒温ステージ１３は３
７℃に保持されていて、この一定温度の反応条件下でマ
イクロプレートＴは３０分〜９０分間放置される。恒温
ステージ１３での反応条件下で、アレルゲン成分の刺激
により被検液中の細胞からヒスタミンが遊離され、該遊
離ヒスタミンはガラス繊維に特異的に結合される。

【００２６】反応条件維持の恒温ステージ１３に送られ
て９０分間経過後のマイクロプレートＴは次段の洗浄ス
テージ１４に送られる。洗浄ステージ１４では洗浄機
（９６ＰＷ ＳＬＴ社製）が使用される。洗浄剤として
は、例えばＳＤＳを含有してもよい蒸留水が使用され、
洗浄回数は６回行われる。反応液・洗浄液の吸排出は９
６穴が同時に行われ、次位のマイクロプレートの洗浄開
始までの時間は１分間である。

【００２７】洗浄を終了したマイクロプレートＴは次段
の洗浄液分注ステージ１５へ送られる。この洗浄液分注
ステージ１５では分注機として（ＥＤＲ ３００Ａ、バ
イオテック社製）を使用して洗浄液２００μｌが９６穴
マイクロプレートＴに対して同時に分注される。分注時
間は３０秒である。

【００２８】各ウエルＵに洗浄液が分注されたマイクロ
プレートＴは、上記の反応条件維持の恒温ステージ１３
に再び戻される。反応条件維持の恒温ステージ１３にお
いてマイクロプレートＴを３７℃、３０分〜６０分間放
置する。この一定温度の反応条件下で、残存する発色系
に影響を与える血液由来物質が除去される。

【００２９】遊離ヒスタミンが結合したマイクロプレー
トＴは次段の洗浄ステージ１６に送られる。洗浄ステー
ジ１６による洗浄の目的は、マイクロプレート中の洗浄
液を取り除くためである。洗浄剤として、蒸留水による
洗浄が本実施例では６回行われる。反応液・洗浄液の吸
排出はマイクロプレートＴの９６穴が同時に行われ、次
位のマイクロプレートの洗浄開始までの時間は１分間で
ある。

【００３０】洗浄ステージ１６によりウエルＵが充分に
洗浄されたマイクロプレートＴは次段の蛍光発色試薬の
分注ステージ１７に送られる。この分注ステージ１７で
は、分注機（ＥＤＲ ３００Ａ、バイオテック社製）が
使用され、各ウエルＵに蛍光発色試薬７５μｌが分注さ
れ、ガラス微細繊維に結合されていたヒスタミンが溶出
せしめられた後、ヒスタミンと蛍光発色試薬とで蛍光発
色団が形成される。蛍光発色試薬としては、例えばＯＰ
Ｔ液（ｏ−フタルアルデヒド／５０ｍＭ ＮａＯＨ）が
使用され、ヒスタミンと蛍光発色試薬反応ステージ１８
で遊離ヒスタミンとＯＰＴ液との間の充分な反応が行わ
れる。

【００３１】ヒスタミンと蛍光発色試薬反応ステージ１
８で１０分間経過したマイクロプレートＴは次段の安定
化試薬分注ステージ１９へ送られる。各ウエルＵに安定
化試薬を７５μｌ注入して酸性条件をｐＨ１．３〜２．
４に調整する。安定化試薬としては、例えば過塩素酸
（ＨＣｌＯ₄ ）が用いられる。ｐＨ補正の目的は、遊離
ヒスタミンとＯＰＴ液との間で生成された蛍光反応生成
物の安定性を確保するためである。

【００３２】ｐＨ補正したマイクロプレートＴを蛍光強
度測定ステージ２０に送る。蛍光強度測定ステージ２０
は、測定手段として、例えば図２に示すように２本の吸
引パイプ２１、２２を備え、該パイプ２１、２２にはそ
れぞれ蛍光光度計２３、２４及びポンプＰ１、Ｐ２を組
み込んだ構造のものが使用される。それぞれの吸引パイ
プ２０、２１の吸引部は９６穴ウエルに予め決められた
シーケンスに従って順次挿入され、ウエルＵ内の反応液
または検査液２５が同時吸引される。

【００３３】吸引手段であるポンプＰ１，Ｐ２として
は、例えばペリスタポンプ（Ｍｏｄｅｌ ＡＣ−２１２
０型、アトー社製）が使用され、各ウエルＵから検査液
を吸引パイプ２１、２２内に吸引するとき、各反応液ま
たは検査液が混合汚染させられるのを防止するため、例
えば吸引パイプ２１、２２内にエアー層２６−反応液ま
たは検査液２５−エアー層２６の形態となるようにして
吸引し、反応液または検査液２５をエアー層２６、２６
でサンドイッチ状態にして夫々の蛍光光度計２３、２４
へ移送し、測定する。測定後のマイクロプレートは、プ
レート排出部２７から回収し、反応液または検査液は排
出部２８から回収し、一測定サイクルが終了する。測定
値はコンピュターへ入力され、何れのアレルゲンに起因
するかの判定が行われる。

【００３４】本発明の図３に示した変形実施例における
測定法のフローチャートは、被検液の分注工程−ヒスタ
ミン遊離反応工程−洗浄工程−蛍光試薬分注工程−安定
化試薬分注工程−蛍光測定工程を一連の連続した反応工
程で行うことは、図１に示した実施例の場合と同様であ
るが、図３の実施例では、緩衝液分注ステージと洗浄液
分注ステージが他の処理ステージと共通使用される。

【００３５】即ち、被検液分注工程Ａは一方において緩
衝液分注と蛍光発色試薬分注の工程Ｂと接続され、他方
においてヒスタミン遊離反応、洗浄液による反応工程Ｄ
に接続され、該工程Ｄは一方において洗浄工程Ｅに、他
方において洗浄液分注と安定化試薬分注の工程Ｃにそれ
ぞれ接続してある。洗浄工程Ｅは緩衝液分注と蛍光発色
試薬分注の工程Ｂに接続され、更に該工程Ｂは遊離ヒス
タミンと蛍光発色試薬との反応工程Ｆに接続され、該工
程Ｆは洗浄液分注と安定化試薬分注の工程Ｃに接続して
ある。洗浄工程Ｅは洗浄液分注と安定化試薬分注の工程
Ｃに接続され、該工程Ｃは蛍光強度測定ステージ２０に
接続され、該ステージ２０は一方においてプレート排出
部２７に、他方において反応液または検査液排出部２８
にそれぞれ接続してある。

【００３６】従って、この実施例によれば、緩衝液分注
ステージと洗浄液分注ステージが共通使用され、各工程
またはステージをライン状に配列することなく、システ
ム全体をコンパク化できる利点がある。なお、図３の実
施例における各ステージにおいて、図１の実施例と同じ
ステージのものについては、同じ番号を付すとともにそ
の作用は図１の実施例と同様であるため、詳しい説明は
省略する。

【００３７】図３の実施例において、被検液分注工程Ａ
と、緩衝液分注と蛍光発色試薬分注の工程Ｂと、洗浄液
分注と安定化試薬分注の工程Ｃと、ヒスタミン遊離反
応、洗浄液による反応工程Ｄと、洗浄工程Ｅと、遊離ヒ
スタミンと蛍光発色試薬との反応工程Ｆとが前記で説明
したごとく接続されていることによって、マイクロプレ
ートＴは工程Ｂ→Ａ→Ｄ→Ｅ→Ｃ→Ｄ→Ｅ→Ｂ→Ｆ→Ｃ
を経て、蛍光強度測定ステージ２０に予め決められたシ
ーケンスに従って移送される。

【００３８】すなわち、マイクロプレートＴを複数個セ
ットしたプレート保持部１０を緩衝液分注ステージ１１
に送る。この分注ステージ１１に移送されたマイクロプ
レートＴの各ウエルＵには、緩衝液が分注機により９６
穴同時に分注される。分注が終了したマイクロプレート
Ｔは被検液分注ステージ１２に送られ、被検液が分注機
により１２穴づつ９６穴全体に分注される。分注を終了
したマイクロプレートＴは反応条件維持の恒温ステージ
１３のラックに移送される。マイクロプレートＴの移送
は１分間隔である。

【００３９】恒温ステージ１３に送られて９０分経過し
た最初のマイクロプレートＴが洗浄ステージ１４に送ら
れ、蒸留水による洗浄が行われる。反応液・洗浄液の吸
排出は９６穴同時に行われ、次位の洗浄開始までの時間
は１分間である。洗浄が終了したマイクロプレートＴは
洗浄液分注ステージ１５に送られ、分注機により洗浄液
が分注され、再び反応条件維持の恒温ステージ１３に戻
される。

【００４０】反応条件維持の恒温ステージ１３に６０分
間放置した後、マイクロプレートＴは洗浄ステージ１４
に再び送られ、洗浄水により洗浄した後、蛍光発色試薬
分注ステージ１７に送られ、各ウエルに蛍光発色試薬が
分注され、遊離ヒスタミンと蛍光発色試薬との反応ステ
ージ１８を経て安定化試薬分注ステージ１９に送られ、
分注機より安定化試薬が分注される。

【００４１】安定化試薬が分注されたマイクロプレート
Ｔは蛍光強度測定ステージ２０に送られ、ヒスタミンの
蛍光強度が図１に示した実施例と同様にして測定れ、測
定後、マイクロプレートＴはプレート排出部２７から回
収され、反応液または検査液は排出部２８から回収さ
れ、一測定サイクルが終了される。

【００４２】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、ヒスタミ
ン遊離能を有する被検液からアレルゲン成分の刺激によ
り遊離したヒスタミンの自動測定、すなわち被検液の分
注工程−ヒスタミン遊離反応工程−洗浄工程−蛍光発色
試薬分注工程−安定化試薬分注工程−蛍光測定工程を一
連の連続した反応工程としてヒスタミンの蛍光強度を測
定するので、多検体を極めて効率的かつ簡便に測定する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒスタミンの好適な測定法の実施例を示すもの
であり、被検液の分注工程−ヒスタミン遊離反応工程−
洗浄工程−蛍光試薬分注工程−蛍光強度測定工程が一連
の連続した反応工程で行うフローチャートである。

【図２】蛍光強度測定ステージの概略的説明図である。

【図３】ヒスタミン測定法の他の実施例を示すものであ
り、緩衝液分注と蛍光発色試薬分注工程−被検液分注と
安定化試薬分注工程−ヒスタミン遊離工程−洗浄工程−
遊離ヒスタミンと蛍光発色試薬との反応工程−蛍光測定
工程を一連の連続した反応工程で行うフローチャートで
ある。

【符号の説明】

Ａ 被検液分注工程 Ｂ 緩衝液分注と蛍光発色試薬分注の工程 Ｃ 洗浄液分注と安定化試薬分注の工程 Ｄ ヒスタミン遊離工程 Ｅ 洗浄工程 Ｆ ヒスタミンと蛍光発色試薬との反応工程 Ｔ マイクロプレート Ｕ ウエル ２０ 蛍光強度測定ステージ ２１、２２ 吸引パイプ ２３、２４ 蛍光光度計

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検液から遊離されたヒスタミンの蛍光
   強度を測定するものにおいて、 アレルゲン成分を有し、ウエル内にガラス微細繊維を付
   着せしめたマイクロプレートのウエルにヒスタミン遊離
   能を有する被検液を分注する工程と、 マイクロプレートを一定の条件下に維持しながらアレル
   ゲン成分の刺激により被検液中からヒスタミンを遊離せ
   しめる工程と、 遊離ヒスタミンをガラス繊維に特異的結合せしめた後マ
   イクロプレートを洗浄する工程と、 蛍光発色試薬をウエルに分注してガラス微細繊維よりヒ
   スタミンを溶出させた後、蛍光発色団と結合させる工程
   と、 発色安定化試薬を加えた後ヒスタミンの蛍光強度を測定
   する工程、 を有し、これらの工程を一定間隔で順次連続して行うこ
   とを特徴とするヒスタミンの蛍光強度測定方法。
2. 【請求項２】 被検液が、全血であることを特徴とする
   請求項１に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
3. 【請求項３】 被検液が、白血球画分、洗浄血球または
   好塩基球を含有する体液であることを特徴とする請求項
   １に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
4. 【請求項４】 ヒスタミン蛍光発色試薬が、ｏ−フタル
   アルデヒドであることを特徴とする請求項１に記載のヒ
   スタミンの蛍光強度測定方法。
5. 【請求項５】 ヒスタミン蛍光発色試薬の分注後に反応
   液を酸性条件となすｐＨ補正工程を有することを特徴と
   する請求項１に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
6. 【請求項６】 反応液のｐＨ補正は過塩素酸によりｐＨ
   １．３〜２．４の範囲に補正されることを特徴とする請
   求項１または５項に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方
   法。
7. 【請求項７】 蛍光強度測定工程はウエル内の反応液ま
   たは検査液を蛍光強度測定部へ導入する少なくとも２個
   以上の吸引パイプを有し、それぞれの吸引部を予め設定
   されたウエルに導入し、反応液または検査液を蛍光光度
   計に移送して同時に複数測定を行うことを特徴とする請
   求項１に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
8. 【請求項８】 被検液分注工程Ａと、緩衝液分注と蛍光
   発色試薬分注の工程Ｂと、洗浄液分注と安定化試薬分注
   の工程Ｃと、ヒスタミン遊離工程Ｄと、洗浄工程Ｅと、
   遊離ヒスタミンと蛍光発色試薬との反応工程Ｆおよび蛍
   光強度測定工程とにより、被検液からの遊離ヒスタミン
   を測定するに際し、マイクロプレートを工程Ｂ→Ａ→Ｄ
   →Ｅ→Ｃ→Ｄ→Ｅ→Ｂ→Ｆ→Ｃを一定間隔で移動せしめ
   た後、反応液または検査液を蛍光強度測定工程に移送し
   てヒスタミンの蛍光強度を測定することを特徴とするヒ
   スタミンの蛍光強度測定方法。
9. 【請求項９】 被検液が、全血であることを特徴とする
   請求項８に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
10. 【請求項１０】 被検液が白血球画分、洗浄血球または
    好塩基球を含有する体液であることを特徴とする請求項
    ８に記載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。
11. 【請求項１１】 ヒスタミン蛍光発色試薬が、ｏ−フタ
    ルアルデヒドであることを特徴とする請求項８に記載の
    ヒスタミンの蛍光強度測定方法。
12. 【請求項１２】 蛍光強度測定工程はウエル内の反応液
    を蛍光強度測定部へ導入する少なくとも２個以上の吸引
    パイプを有し、それぞれの吸引部を予め設定されたウエ
    ルに導入し、反応液または検査液を蛍光光度計に移送し
    て複数測定を同時に行うことを特徴とする請求項８に記
    載のヒスタミンの蛍光強度測定方法。