JPH09510089A

JPH09510089A - 細胞表層蛋白質及びエフェクター細胞に対する結合試薬

Info

Publication number: JPH09510089A
Application number: JP7523228A
Authority: JP
Inventors: シュイルマッハー，フォルカー; カザイエ，カシャヤーシャ; ハース，クラウディア; モルデンハウアー，ゲルト; リトル，メルビン; デュベル，ステファン; ブライトリング，フランク; キプリアノフ，セルゲイ; ゴッター，ステファニー; ローデ，ハンス−ユルゲン
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 1997-10-14
Also published as: DE4407538C1; WO1995024490A1; US5911987A; EP0749487A1

Abstract

(57)【要約】本発明は細胞表層蛋白質に対する第一の結合成分とエフェクター細胞の共刺激的に作用する分子に対する第二の結合成分とを含むことを特徴とする結合試薬に関する。本発明はさらに、該結合試薬の製造方法並びに該結合試薬を含むワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞表層蛋白質及びエフェクター細胞に対する結合試薬本発明は結合試薬、その製造方法及び該結合試薬を含むワクチンに関する。活性免疫化の場合には、使用される細胞は弱い免疫原性を示すものか又は全く免疫原性を示さないものが多いことが知られている。これは特に腫瘍細胞が用いられるときにそうである。細胞の免疫原性を高めるための実験が行われた。ニューカッスル病ウイルス（以下本明細書ではＮＤＶと略記する）で得られたオンコライゼートを使用した場合のように、このような実験はしばしば満足な結果を得ることに失敗した。従って、細胞の免疫原性を高めることができる組成物を提供することが本発明の目的である。本発明によれば、この目的は細胞表層蛋白質に対する第一の結合成分とエフェクター細胞の共刺激的に作用する分子に対する第二の結合成分とを含むことを特徴とする結合試薬を提供することにより達成される。「第一の結合成分」という表現は、一方では細胞表層蛋白質に結合しそして他方では第二の結合成分に結合するすべての化合物を含む。この結合は直接的でも間接的でもよい。この化合物は抗体であるか又は結合ドメインを有するその部分であることが好ましい。このような部分としては、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）₂、Ｆｖ、又は（Ｆｖ）₂の各断片が好ましい。抗−ヘムアグルチニン −ニューラミニダーゼ抗体のＦｖ断片が特に好ましいことが証明された。「細胞表層蛋白質」という表現は細胞表面に存在するすべての分子を含む。それは、例えば、細胞そのもの、細胞中のウイルス、あるいは細胞に導入されたＤＮＡの発現に由来するペプチド又は蛋白質であってもよい。「細胞表層蛋白質」としては、ＮＤＶのヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニン分子又はＨＴＬＶ−１及びＨＩＶそれぞれのコート蛋白質などのウイルス蛋白質、成長因子受容体、ｖ−ＥｒｂＢ２などのオンコジーン産物、付着分子、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する抗体のような抗体、又はストレプトアビジン（アビジン）及びそれぞれそれらの部分が好ましい。細胞表層蛋白質がＮＤＶのウイルス蛋白質、ＮＤＶのヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子であることが特に好ましいことが分かった。「第二の結合成分」という表現は、一方では第一の結合成分に結合しそして他方ではエフェクター細胞の共刺激的に作用する分子に結合するすべての化合物を含む。この結合は直接的でも間接的でもよい。この化合物は抗体又は結合ドメインを有するその部分であることが好ましい。このような部分としては、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）₂、Ｆｖ、又は（Ｆｖ）₂の各断片が好ましい。抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、及び抗ＣＤ２８抗体それぞれのＦｖ断片が特に好ましいことが分かった。他の好ましい態様としては、上記の化合物がＢ７蛋白質又はその部分(Nature 366（1993），76、Science 262（1993）909)である場合である。かかる部分が膜結合ドメインを含まないときは特に好ましいことが明らかになった。さらに、この化合物がリンホカイン、インターフェロン、又はインターロイキンであることは特に有利である。「エフェクター細胞」という表現は免疫反応に関与するすべての細胞を含む。エフェクター細胞はＴ細胞であることが好ましい。「共刺激的に作用する分子」という表現は結合その他の仕方によりエフェクター細胞を刺激するように誘導することができるエフェクター細胞のすべての分子を含む。このような分子は、例えば受容体であってもよい。Ｔ細胞の場合は、特にＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、ＣＤ２２−、ＣＤ２６−、ＣＤ２８−及びＣＴＬＡ−４受容体並びにＨＳＡ（熱安定抗原）が本発明に好ましいものとして提示される。この関連で、受容体ＣＤ２８は特に強調すべきである。上記の結合試薬中では、二つの結合成分が相互に直接的に又は間接的に連結してしいる。後者の場合、これはコンプレックスを介して達成される。例えば、それぞれ、ストレプトアビジン（アビジン）とビオチン及びパンクレアティック・リボヌクレアーゼＡのＳ蛋白質とＳペプチドである。この目的で、二つの結合成分の一つはそれぞれストレプトアビジン（アビジン）及びＳ蛋白質又はそれらの部分を含み、そして他の結合成分はそれぞれビオチン及びＳペプチド又はそれらの部分を含む。当技術分野における熟練せる者は個々のコンプレックスの構成物を結合成分に連結し、そしてそれらを相互に反応せしめてコンプレックスを形成させるプロセスに熟知している。結合成分が相互に間接的に結合する結合試薬が好ましい。さらに、結合試薬は結合成分の一方又は両方が分子間ジスルフィド橋、即ち異種結合試薬の結合成分間のジスルフィド橋を作るのに適する基を含むことが好ましい。従って、例えば異種の共刺激的に作用する分子に結合する複数の結合試薬が１個の細胞表層蛋白質に結合しながら結合することができる。多くの場合、これは細胞の免疫原性を高めるために特に好ましいことが明らかとなる。上記の結合試薬は通常のプロセスにより製造することができる。次の工程を含むプロセスが好ましい。（ａ）第一の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離及びそれらの精製、（ｂ）第二の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離及びそれらの精製、（ｃ）常法による（ａ）の発現産物と（ｂ）の発現産物との連結。工程（ａ）及び（ｂ）では、第一の結合成分と第二の結合成分とはそれぞれ通常のＤＮＡ組換え技法により製造される。当技術分野における熟練者は個々の結合成分の発現に用いられ得るシステムを熟知している。熟練者はこの目的に使用することができるベクター、発現制御要素、及び細胞を知っている。両結合成分を抗体のＦｖ断片として提供することが好ましいことが分かった。実施例において、抗−ヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ抗体のＦｖ断片の製造並びに抗− ＣＤ２８抗体のＦｖ断片の製造に言及する。発現プラスミドｐＯＰＥ５１−αＨＮ及びｐＯＰＥ５１−αＣＤ２８がそれぞれこの目的で構築される（下記実施例１参照）。発現プラスミドｐＯＰＥ５１−αＨＮ及びｐＯＰＥ５１−αＣＤ２８は本発明に属する。さらに、当技術分野における熟練者は結果として得られる結合成分を精製するプロセスを熟知している。Ｆｖ−αＨＮ断片及びＦｖ−αＣＤ２８断片の精製について下記実施例２において実施例により言及する。工程（ｃ）では、（ａ）の結合成分が（ｂ）の結合成分と連結される。当技術分野における熟練者はこの目的に使用できるプロセスを熟知している。熟練者は、例えばストレプトアビジン（アビジン）／ビオチンコンプレックス又はＳ蛋白質／Ｓペプチドコンプレックスを介する直接的連結及び間接的連結に役立つプロセスを知っている。Ｆｖ−αＨＮ断片とＦｖ−αＣＤ２８断片の連結について下記実施例３において実施例により言及する。上記の結合試薬、例えばその結合成分が異なる特異性（特異性Ａ、特異性Ｂ）のＦｖ断片である結合試薬を製造するためには別のプロセスが好ましいことが分かった。このプロセスでは、Ｆｖ断片がそれらの特定の、部分的に個々に発現されたＶ_H及びＶ_Lドメインを結合することにより製造される。この目的のため、ジスルフィド橋を形成するのに適した基、例えばシステインが一つの特異性を持つＶ_H ドメイン及びＶ_Lドメインが優勢に相互に結合するようにこのドメインに導入される。特に、相互に不和合でない二つの発現プラスミドが使用される。それにより、下記の構築物が宿主、例えば大腸菌中で同時に発現させることができる、（ａ）例えば１８個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して特異性Ｂの抗体のＶ_Lドメインと結合した特異性Ａの抗体のＶ_Hドメイン、（ｂ）特異性Ｂの抗体の遊離のＶ_Hドメイン、及び（ｃ）特異性Ａの抗体の遊離のＶ_Lドメイン。Ｖ_HドメインとＶ_Lドメインの組合せが得られる。ジスルフィド橋を形成させることにより、これらは特異性ＡのＶ_HドメインとＶ_Lドメインの結合及び特異性ＢのＶ_HドメインとＶ_Lドメインの結合が優勢となる（図３を参照）。本発明によれば、不活性化細胞を持つワクチンも提供される。このワクチンは１又は２個以上の結合試薬が細胞表層蛋白質に結合していることに特徴がある。このようなワクチンは手術の際に摘出される腫瘍に由来する腫瘍細胞又は確立された細胞株を含むことが好ましい。この（腫瘍）細胞はウイルスで修飾することができる。ウイルスによって得られる（腫瘍）細胞の溶解物も提供できる。ウイルス由来のＮＤＶは有利に使用される。結合試薬（単数又は複数）がＮＤＶのウイルス蛋白質、特にヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子に対するものであることが好ましいことが分かった。腫瘍ワクチンの製造に関し下記の実施例４において実施例により言及する。（腫瘍）細胞も、それに導入されそして例えばストレプトアビジン（アビジン）又はハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する抗体などの抗体をコードするＤＮＡの発現により修飾することができる。結合試薬（単数又は複数）がストレプトアビジン（アビジン）の場合はビオチン化されることが、一方、抗体の場合にはそれらがハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンを含むことが好ましいことが分かった。（腫瘍）細胞に付着している本発明の結合試薬を用いて、共刺激的に作用する分子、例えばエフェクター細胞の受容体にシグナルを伝達することが可能である。即ち、エフェクター細胞は（腫瘍）細胞の抗原により伝達されたシグナルを受容するばかりでなく、共刺激を受けることにもなる。従って、本発明の結合試薬は細胞、特に腫瘍細胞の免疫原性を高めるのに極めて適している。本発明の結合試薬は活性免疫化における大きな進歩を示すものである。図面の簡単な説明図１は、発現プラスミドpOPE51-αHNの略図である。 Ap^R: アンピシリン耐性をコードする遺伝子、bp: 塩基対、c-myc:mAk 9E10により認識されるエピトープをコードする配列、Cys:個々のシステイン残基をコードするヌクレオチド、(His)₅:５つのＣ末端ヒスチジン残基をコードする配列、IG: ファージf1の「遺伝子間(intergenic) 」領域、リーダー: 細菌のペクチン酸塩リアーゼ（bakteriellen Pectatlyase）のシグナルペプチド配列（pelBリーダー）、リンカー: Ｖ_HとＶ_Lを連結する(Gly₄ Ser)₃をコードする配列、ori:ColE1のＤＮＡ複製の起点、P/O:lac オペロンプロモータ/ オペレータ、Ｖ_HとＶ_L: 抗HN抗体のH鎖とL鎖それぞれの可変部領域。図２は、発現プラスミドpOPE51-αCD28の略図である。 Ap^R: アンピシリン耐性をコードする遺伝子、bp: 塩基対、c-myc:mAk 9E10により認識されるエピトープをコードする配列、Cys:個々のシステイン残基をコードするヌクレオチド、(His)₅:５つのＣ末端ヒスチジン残基をコードする配列、IG: ファージf1の「遺伝子間(intergenic)」領域、リーダー: 細菌のペクチン酸塩リアーゼ（bakteriellen Pectatlyase）のシグナルペプチド配列（pelB リーダー）、リンカー: Ｖ_HとＶ_Lを連結する(Gly₄Ser)₃をコードする配列、ori:CoLE1 のＤＮＡ複製の起点、P/O:lacオペロンプロモータ/ オペレータ、ＶとＶ_L: 抗 αCD28抗体のH鎖とL鎖それぞれの可変部領域。図３は、本発明による結合試薬の概略図である。抗HN: 抗HN抗体、抗CD28: 抗−CD28抗体、Ｓ＝Ｓ：ジスルフィド橋次の実施例は、本発明を説明するものである。実施例１：発現プラスミドpOPE51-αHNおよびpOPE51-αCD28の構築（Ａ）pOPE51-αHNの構築ベクターpOPE40を出発材料として使用した（デュベルら、Gene 128(1993),９７参照）。これは、抗リゾチーム抗体のＦ_v断片（Ｖ_H＋Ｖ_L）をコードするＤＮＡを含んでいる。Ｖ_HのＤＮＡはＶ_LのＤＮＡとリンカーによって連結している。上記断片のＤＮＡに続いて、３’方向にｍｙｃ遺伝子産物上のモノクローナル抗体９Ｅ１０のエピトープをコードするＤＮＡがある。 pOPE51-αHNを生産するために、ＤＮＡ配列、ＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴを、上述のpOPE40のｍｙｃＤＮＡの３’末端に挿入した。アミノ酸配列Cys Ile His His His His HisをコードするこのＤＮＡにより、アミノ酸Asnのコドンを、ｍｙｃＤＮＡの３’末端において置換した。さらにB ssHIIとEcoRIの制限部位を、Ｖ_HとＶ_L の間のリンカーにおいて除去した。さらに、３つの制限部位、すなわちNcoI(nt ．76-81)、MlnI(nt.579-584)およびNotI(nt.910-917)をベクターの部分に挿入した。こうして発現ベクターpOPE51-αLysを得た。最後に、この発現ベクターにおいて、上記Ｆ_v断片（Ｖ_H:PvuII-HindIII断片、Ｖ_L :EcoRV-BamHI断片）のＤＮＡを、抗-赤血球凝集素ノイラミニダーゼ抗体のＦ_v 断片（Ｖ_H:PvuII-HindIII断片、Ｖ_L:EcoRV-BamHI断片）のＤＮＡと置換した。後者の断片のＤＮＡは、以後Ｆ_v−αＨＮＤＮＡと呼ぶ。本断片のＶ_H及びＶ_LのＤＮＡは、ハイブリドーマ細胞株のｃＤＮＡから、通常のＰＣＲ方法により得た（イオリオ，Ｒ．Ｍ．ら、J．gen．Virol．67(1986)，1393参照）。このように、発現プラスミドpOPE51-αHN（図１参照）を得た。（Ｂ）pOPE51-αCD28の構築 pOPE51-αCD28の構築は（Ａ）のpOPE51-αHNについて記載したpOPE51-αLysに基づいて行った。抗−ＣＤ２８抗体のＦ_v断片（Ｖ_H＋Ｖ_L）をコードするＤＮＡを、ハイブリドーマ細胞株のｃＤＮＡから、通常のＰＣＲ方法により得た（バンリー，Ｒ．ら、in Leucocyte Typing IV，Oxford University Press(1989)，353 参照）。以下この断片のＤＮＡをＦ_vαCD28ＤＮＡと呼ぶ。得られた発現プラスミドpOPE51-αCD28を図２に示す。実施例２：Ｆ_v−αHNＤＮＡおよびＦ_v−αCD28 ＤＮＡの発現と発現産物（Ｆ_v −αHN断片とＦ_v−αCD28断片）の精製（Ａ）Ｆ_v−αHNＤＮＡの発現と発現産物（Ｆ_v−αHN断片）の精製Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９細胞を通常の方法で発現プラスミドpOPE51-αHNにより形質転換し、ＬＢ培養液２Ｌにおいて３０℃で、ＯＤ₆₀₀が0.7になるまで培養した。イソプロピル-β-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度が20マイクロモーラー（μｍ）になるように加えた。この細胞を室温で３時間培養し、遠心分離（4, 500g、４℃、15分）により集菌した。この細胞を元の容量の1/50に濃縮し、0.1M 酢酸ナトリウム、pH5.5、10mM EDTA、1mMフェニルメチルスルフォニルフロライド（ＰＭＳＦ）に０℃で懸濁した。リゾチームを最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。氷上で３０分間培養し軽く振盪した後、可溶性細胞血漿蛋白を遠心分離して除いた（30000g、４℃、30分）。細胞ペレットを元の量の1/40に濃縮し、30mMリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、1mM PMSF、pH7.0に再懸濁し、超音波処理により溶菌した。次いで、可溶性細胞質蛋白を除去するために遠心分離(30000g、30分、４℃)を行った。ペレットを濃縮せずに、3Mの尿素、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH7.0に懸濁し、上述のように可溶性蛋白を遠心分離により除いた。封入体は、元の量の1/40に濃縮し、6M GuHCl、0.1M Tris-HCl、10ｍM EDTA、pH7.0に再懸濁した。この混合物を再度遠心分離をにかけ(30000g、30分、４℃)、上清を6Mの尿素、25mM Tris-HCl、p H7.0に対して透析した。イミダゾールを最終濃度30mMまで加えた。この蛋白溶液をNiCl₂と共に、6M尿素、25mM Tris-HCl、50mMイミダゾール、pH7.0で平衡化したキレーティングセファロースファーストフローカラム（Chelating Sepharose Fast Flow-Saeule）にのせた。このカラムを、カラム容積の５倍の6M尿素、25mM Tris-HCl、50mMイミダゾール、pH7.0で洗浄した。結合したＦ_v−αHN断片をカラム容積の１．５倍の6M尿素、25mM Tris-HCl、250mMイミダゾール、pH7.0で溶出した。次いで、IMACを室温にて行った。溶出した蛋白を４℃で0.4M L-塩酸アルギニン、0.1M Tris-HCl、5mM EDTA、pH7.0に対して透析し、透過性コロジオンバッグ(保持能力:12.4kDa)を用いて濃縮し、0.4M L-塩酸アルギニン、0.1M Tris -HCl、5mM EDTA、pH7.0で平衡化したSuperdex 75HL26/60カラムに供給した。ゲル濾過クロマトグラフィーを、クルッツら、PNAS USA、90(1993)、3830が記述する条件下で実施した。このカラムを検量するために、ゲル濾過検量キットを使用し、このキットはリボヌクレアーゼA(13.7kDa)、キモトリプシノーゲンA(25kDa) 、オボアルブミン(43kDa) およびウシ血清アルブミン(67kDa)を含む。Ｆ_v−αHN断片を持つ溶出画分を集め、PBS(15mMリン酸ナトリウム、0.15m NaCl、pH7.0)に対して透析した。蛋白濃度を通常の方法で測定した。（Ｂ）Ｆ_v−αCD28 ＤＮＡの発現と発現産物（Ｆ_v−αCD28断片）の精製Ｆ_v−αCD28 ＤＮＡの発現とＦ_v−αCD28断片の精製は、（Ａ）でＦ_v−αHN ＤＮＡ（断片）について記述したように行った。実施例３：Ｆｖ−αＨＮ断片とＦｖ−αＣＤ２８断片との結合実施例２（Ａ）のＦｖ−αＨＮ断片（１ｍｇ／ｍＬ）１０ｍｇを、１００倍過剰の二官能性スルフヒドリル化合物であるビスマレイミドヘキサン（ＢＭＮ、１ｍＭ）と３０分間、室温でインキュベートした。次いで、残余のスルフヒドリル化合物を、ＰＢＳに対して透析することにより除去した。そして、実施例２（Ｂ）のＦｖ−αＣＤ２８断片を等モル量添加した。本発明の方法によって結合試薬Ｆｖ−αＨＮ／Ｆｖ−αＣＤ２８を得るために、この混合物を３０分間室温でインキュベートした。実施例４：腫瘍ワクチンの産生手術されて間もない腫瘍組織の脂肪組織及び結合組織を常法により除去した。腫瘍組織は小片に切られ、４０ｍＬの酵素混合液（Enzym-Cocktail）（ＨＢＳＳ中に、コラゲナーゼ０．３２ｍｇ／ｍＬ、ＤＮアーゼ０．５３５ｍｇ／ｍＬ、及びヒアルロニダーゼ０．５３５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃、１時間攪拌下にてインキュベートした。得られた細胞懸濁液を、市販のナイロンネットでろ過した。「極めて強固な」腫瘍の場合、組織の残存物を再度上記の酵素混合液（４０ｍＬ）とインキュベートし、ろ過した。すべての懸濁液を一つにまとめ、ＨＢＳＳで５０ｍＬにフィルアップし、そして１２００ｒｐｍで１５分間遠心分離に付した。上清を除去し、沈殿を上記のＤＮアーゼ溶液１０ｍＬで再懸濁させ３７℃で１０分間インキュベートした。懸濁液をＨＢＳＳで５０ｍＬにフィルアップし、そして１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。沈殿を１０ｍＬのＨＢＳＳで再懸濁し、トリパンブルーを用いてノイバウアー型セルチャンバー中で細胞数を計った。６×１０⁷個以上の生存腫瘍細胞が存在し、かつ総細胞の５０％以上が非腫瘍細胞（リンパ球と単球）である場合、別の分離工程を実施してリンパ球と単球を除いた。１００μＬの、ダイナビーズ抗−ＣＤ２（Ｐａｎ−Ｔ）、抗−ＣＤ１９（Ｐａｎ−Ｂ）、及び抗−ＣＤ１４（Ｐａｎ−単球）を、それぞれ試験管に入れ、７ｍＬの冷却ＨＢＳＳ／ＨＳＡでそれぞれにつき３回洗浄した。２ｍＬの冷ＨＢＳＳ／ＨＳＡで再懸濁した細胞をこれらの試験管に添加し、その試験管を氷上で３０分間インキュベートした。磁石でマグネチックビーズを除き、細胞懸濁液を回収した。そして５０ｍＬのＨＢＳＳで試験管を満たし、１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。上清を除去し、沈殿を５０ｍＬのＨＢＳＳで再懸濁し、そして１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。０．５ｍＬのＨＢＳＳ中１×１０⁷個の細胞となるように、得られた細胞の沈殿をＨＢＳＳで再懸濁した。約０．５ｍＬの得られた細胞懸濁液を、用意しておいた凍結可能な試験管に入れた。凍結可能な試験管を−７０℃で一晩保存する前に、氷上で約０．５ｍＬの二倍凍結用培地をその試験管に入れ、次いで液体窒素中にて保存した。凍結用培地を加えていない、上記の細胞懸濁液５０μＬを、サイトスピンの調製のために氷上に置き、そしてそれぞれにＰＢＳで１：１の希釈列で希釈した。上記の５０μＬの希釈列それぞれを、５０μＬのＰＢＳ／ＢＳＡが入った６個のエッペンドルフカップに加えた。そして、カップはサイトスピンの装置に導かれた。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、スライドグラスを空気中で１００％メタノールを用いて１分間で固定した。次いで、パッペンハイムによる公知の方法により染色した。その後、光学顕微鏡下で、腫瘍細胞の含量についてその細胞を調べた。腫瘍細胞の含量が５０％に満たない場合、上記の細胞懸濁液はワクチンとしては使用されなかった。腫瘍細胞の含量が５０％を超えている場合、上記の細胞懸濁液を３７℃で溶かし、試験管に入れてＰＢＳで１４ｍＬにフィルアップした。１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、上清を除いた。沈殿を１００μＬのＰＢＳで再懸濁し、凍結可能な試験管に入れて、３０ｍＬのＮＤＳ懸濁液（濃度は１０００ＨＡＵ／ｍＬ）と混合した。次いで、１５分後に緩やかに振り動かしながら、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後注意深く洗浄し、腫瘍細胞の一部（５ ×１０⁶個の生存腫瘍細胞）を、本発明による実施例３の結合試薬のタンパク質約５μｇと、３７℃、３０分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を２００Ｇｙで照射した。細胞懸濁液は、注入を行なうまで氷上で保存した。そして、シリンジ中に引き上げ、０．９×４０ｍＬのカニューレを用いて皮内に注入した。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年８月７日【補正内容】請求の範囲１．ニューカッスル病ウイルスのヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子に対する又はハプテン−２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する抗体に対する第一の結合成分とエフェクター細胞の共刺激的に作用する分子に対する第二の結合成分とを含むことを特徴とする結合試薬。２．第一の結合成分が抗体又はその結合ドメインを含む部分であることを特徴とする、請求項１記載の結合試薬。３．抗体のその部分がＦａｂ’−、（Ｆａｂ’）₂−、Ｆｖ−又は（Ｆｖ）₂− 断片であることを特徴とする、請求項２記載の結合試薬。４．第二の結合成分が抗体又はその結合ドメインを含む部分であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の結合試薬。５．抗体のその部分がＦａｂ’−、（Ｆａｂ’）₂−、Ｆｖ−又は（Ｆｖ）₂− 断片であることを特徴とする、請求項４記載の結合試薬。６．第二の結合成分がＢ７蛋白質又はその部分であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の結合試薬。７．Ｂ７の部分が膜結合ドメインを含まないことを特徴とする、請求項６記載の結合試薬。８．エフェクター細胞がＴ−細胞であることを特徴とする、請求項１〜７いずれか１項に記載の結合試薬。９．共刺激作用を有する分子がＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０− 、ＣＤ２２−、ＣＤ２６−、ＣＤ２８−、又はＣＴＬＡ−４−受容体又はＨＳＡであることを特徴とする、請求項８記載の結合試薬。１０．結合成分がコンプレックスを介して相互に結合していることを特徴とする、請求項１〜９いずれか１項に記載の結合試薬。１１．該コンプレックスがストレプトアビジン（アビジン）とビオチンから構成されるものであることを特徴とする、請求項１０記載の結合試薬。１２．該コンプレックスがＳ−蛋白質とＳ−ペプチドから構成されるものであることを特徴とする、請求項１０記載の結合試薬。１３．次の工程を含んでなる、請求項１記載の結合試薬の製造方法、（ａ）第一の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離、及びその精製、（ｂ）第二の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離、及びその精製、及び（ｃ）（ａ）の発現産物と（ｂ）の発現産物との常法によるカップリング。１４．請求項１記載の結合試薬の第一の結合成分をコードするＤＮＡを発現単位中に含有することを特徴とする発現プラスミド。１５．図１記載のものであることを特徴とする、請求項１４記載の発現プラスミド。１６．請求項１記載の結合試薬の第二の結合成分をコードするＤＮＡを発現単位中に含有することを特徴とする発現プラスミド。１７．図２記載のものであることを特徴とする請求項１６記載の発現プラスミド。１８．請求項１記載の結合試薬の１又は２以上が細胞表層蛋白質に結合しているものである、不活性化細胞含有ワクチン。１９．該細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１８記載のワクチン。２０．腫瘍細胞が手術により摘出された腫瘍由来のものであることを特徴とする請求項１９記載のワクチン。２１．該腫瘍細胞が確立された細胞株由来のものであることを特徴とする請求項１９記載のワクチン。２２．該細胞表層蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１８〜２１いずれか１項に記載のワクチン。２３．該抗体がハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対するものであることを特徴とする請求項２２記載のワクチン。２４．該細胞がウイルスで修飾されていることを特徴とする請求項１８〜２１いずれか１項に記載のワクチン。２５．該ウイルスがニューカッスル病ウイルスであることを特徴とする請求項２４記載のワクチン。２６．細胞表層蛋白質がヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子であることを特徴とする請求項２５記載のワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/00 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ (72)発明者カザイエ，カシャヤーシャドイツ連邦共和国ザントハウゼンデー −69270 ヘルマンロンスベック 85 (72)発明者ハース，クラウディアドイツ連邦共和国シュヴァイゲルンデー−74193 ヴェストシュトラッセ 19 (72)発明者モルデンハウアー，ゲルトドイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69120 ブリュッケンシュトラッセ 41 (72)発明者リトル，メルビンドイツ連邦共和国ネッカーゲミュントデー−69151，フリッツ−フォン−ブリーエンシュトラッセ (72)発明者デュベル，ステファンドイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69120 クインケシュトラッセ 24 (72)発明者ブライトリング，フランクドイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69117 シュロスベルグ 49 (72)発明者キプリアノフ，セルゲイドイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69121 ハンドシュスーハイマーランドシュトラッセ 91 (72)発明者ゴッター，ステファニードイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69121 マックス−レゲー−シュトラッセ 15 (72)発明者ローデ，ハンス−ユルゲンドイツ連邦共和国ハイデルベルグデー −69123 インデルジードレルー 26 アー

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞表層蛋白質に対する第一の結合成分とエフェクター細胞の共刺激的に作用する分子に対する第二の結合成分とを含むことを特徴とする結合試薬。２．第一の結合成分が抗体又はその結合ドメインを含む部分であることを特徴とする、請求項１記載の結合試薬。３．抗体のその部分がＦａｂ’−、（Ｆａｂ’）₂−、Ｆｖ−又は（Ｆｖ）₂− 断片であることを特徴とする、請求項２記載の結合試薬。４．細胞表層蛋白質がウイルス蛋白質、成長因子受容体、オンコジーン産物、付着分子(Adhaesionsmolekuel)、ストレプトアビジン（アビジン）又は抗体であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の結合試薬。５．ウイルス蛋白質がニューカッスル病ウイルスのヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子であることを特徴とする、請求項４記載の結合試薬。６．抗体がハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対するものである、請求項４記載の結合試薬。７．第二の結合成分が抗体又はその結合ドメインを含む部分であることを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の結合試薬。８．抗体のその部分がＦａｂ’−、（Ｆａｂ’）₂−、Ｆｖ−又は（Ｆｖ）₂− 断片であることを特徴とする、請求項７記載の結合試薬。９．第二の結合成分がＢ７蛋白質又はその部分であることを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の結合試薬。１０．Ｂ７の部分が膜結合ドメインを含まないことを特徴とする、請求項９記載の結合試薬。１１．エフェクター細胞がＴ−細胞であることを特徴とする、請求項１〜１０いずれか１項に記載の結合試薬。１２．共刺激作用を有する分子がＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０ −、ＣＤ２２−、ＣＤ２６−、ＣＤ２８−、又はＣＴＬＡ−４−受容体又はＨＳＡであることを特徴とする、請求項１１記載の結合試薬。１３．結合成分がコンプレックスを介して相互に結合していることを特徴とする、請求項１〜１２いずれか１項に記載の結合試薬。１４．該コンプレックスがストレプトアビジン（アビジン）とビオチンから構成されるものであることを特徴とする、請求項１３記載の結合試薬。１５．該コンプレックスがＳ−蛋白質とＳ−ペプチドから構成されるものであることを特徴とする、請求項１３記載の結合試薬。１６．次の工程を含んでなる、請求項１記載の結合試薬の製造方法、（ａ）第一の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離そしてその精製、（ｂ）第二の結合成分をコードするＤＮＡの発現ベクター中への挿入、ＤＮＡの発現、発現産物の単離、そしてその精製、及び（ｃ）常法による、（ａ）の発現産物と（ｂ）の発現産物とのカップリング。１７．請求項１記載の結合試薬の第一の結合成分をコードするＤＮＡを発現単位中に含有することを特徴とする発現プラスミド。１８．図１記載のものであることを特徴とする、請求項１７記載の発現プラスミド。１９．請求項１記載の結合試薬の第二の結合成分をコードするＤＮＡを発現単位中に含有することを特徴とする発現プラスミド。２０．図２記載のものであることを特徴とする請求項１９記載の発現プラスミド。２１．請求項１記載の結合試薬の１又は２以上が細胞表層蛋白質に結合しているものである、不活性化細胞含有ワクチン。２２．該細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２１記載のワクチン。２３．腫瘍細胞が手術により摘出された腫瘍由来のものであることを特徴とする請求項２２記載のワクチン。２４．該腫瘍細胞が確立された細胞株由来のものであることを特徴とする請求項２２記載のワクチン。２５．該細胞表層蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項２１〜２４いずれか１項に記載のワクチン。２６．該抗体がハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対するものであることを特徴とする請求項２５記載のワクチン。２７．該細胞がウイルスで修飾されていることを特徴とする請求項２１〜２４いずれか１項に記載のワクチン。２８．該ウイルスがニューカッスル病ウイルスであることを特徴とする請求項２７記載のワクチン。２９．細胞表層蛋白質がヘムアグルチニン−ニューラミニダーゼ分子であることを特徴とする請求項２８記載のワクチン。