Bindungsreagens für Zell-Oberflächenprotein und Effektorzelle
Die Erfindung betrifft ein Bindungsreagens, ein Verfahren zu seiner Herstellung und eine das Bindungsreagens enthaltende Vakzine.
Es ist bekannt, daß bei aktiver Immunisierung die verwendeten Zellen oftmals nur eine schwache oder gar keine Immunogenität zeigen. Dies findet sich insbesonde¬ re, wenn Tumorzellen verwendet werden.
Versuche wurden unternommen, die Immunogenität von Zellen zu steigern. Viel- fach führten solche Versuche, wie bei der Verwendung von durch Newcastle
Disease Virus (nachstehend mit NDV bezeichnet) erhaltenen Onkolysaten, nicht zu befriedigenden Ergebnissen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Immunogenität von Zellen gesteigert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch Bereitstellung eines Bindungsreagens erreicht, das sich dadurch auszeichnet, daß es eine erste Bindungskomponente für ein Zell- Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
Der Ausdruck "erste Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einer¬ seits an ein Zell-Oberflächenprotein und andererseits an eine zweite Bindungskom-
ponente binden kann. Die Bindung kann direkt oder indirekt sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Frag- ment. Als besonders günstig hat sich das Fv-Fragment eines Anti-Hämaglutinin- Neuraminidase-Antikörpers erwiesen.
Der Ausdruck "Zell-Oberflächenprotein" umfaßt jegliches Molekül, das auf einer Zelloberfläche vorliegen kann. Ein solches kann z.B. ein Peptid oder Protein sein, das von der Zelle selbst, von einem Virus in der Zelle oder von der Expression einer in die Zelle eingeführten DNA stammt. Vorzugsweise ist das "Zell-Oberflächen¬ protein" ein Virusprotein, wie das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül von NDV, das Hämaglutinin-Molekül von Influenza Virus oder das Hüllprotein von HTLV-I bzw. HIV, ein Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Onkogen-Produkt, wie v-Erb B2, ein Adhäsionsmolekül, ein Antikörper, wie ein gegen Hapten 2-phenyloxazol-5-on gerichteter Antikörper, oder Streptavidin (Avidin) bzw. ein Teil davon. Als beson¬ ders günstig hat es sich erwiesen, wenn das Zell-Oberflächenprotein ein Virus¬ protein von NDV ist, wobei insbesondere das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül von NDV zu erwähnen ist.
Der Ausdruck "zweite Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einerseits an eine erste Bindungskomponente und andererseits an ein kostimulato¬ risch wirkendes Molekül einer Effektorzelle binden kann. Die Bindung kann direkt oder indirekt sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Fragment. Als besonders günstig hat sich das Fv-
Fragment eines Anti-CD1 9-, Anti-CD20-, Anti-CD22- bzw. Anti-CD-28-Antikörpers erwiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die vorstehende Verbindung ein B7 Protein oder ein Teil davon (vgl. Nature 366 (1 993), 76; Science 262 (1 993), 909"). Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn ein solcher Teil nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt. Des weiteren ist es vorteilhaft, wenn die Verbindung ein Lymphokin, Interferon oder Interleukin ist.
Der Ausdruck "Effektorzelle" umfaßt jegliche an einer Immunreaktion beteiligte Zelle. Vorzugsweise handelt es sich um eine T-Zelle.
Der Ausdruck "kostimulatorisch wirkendes Molekül" umfaßt jegliches Molekül einer Effektorzelle, das durch Bindung oder in sonstiger Weise veranlaßt werden kann, die Effektorzelle zu stimulieren. Ein solches Molekül kann z.B. ein Rezeptor sein. Im Falle einer T-Zelle bieten sich insbesondere die Rezeptoren CD2-, CD3-, CD 1 9-, CD20-, CD22-, CD26-, CD28- und CTLA-4 sowie HSA (Heat Stable Antigen) als günstig für die Erfindung an. Der Rezeptor CD28 ist dabei besonders zu betonen.
In einem vorstehenden Bindungsreagens können die beiden Bindungskomponenten direkt oder indirekt miteinander verbunden sein. In letzerem Fall kann dies über einen Komplex, z.B. aus Streptavidin (Avidin) und Biotin bzw. S-Protein und S- Peptid der pankreatischen Ribonuklease A bewirkt werden. Hierzu weist eine der beiden Bindungskomponenten Streptavidin (Avidin) bzw. S-Protein oder einen Teil davon und die andere Bindungskomponente Biotin bzw. S-Peptid oder einen Teil davon auf. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, die Bestandteile der einzelnen Komplexe an die Bindungskomponenten zu koppeln und diese zur Ausbildung der Komplexe miteinander umzusetzen. Bindungsreagentien, in denen die Bindungs- komponenten indirekt miteinander verbunden sind, werden bevorzugt.
Weiterhin werden Bindungsreagentien bevorzugt, in denen eine oder beide Bin¬ dungskomponenten Gruppen enthalten, die sich zur Ausbildung intermolekularer Disulfidbrücken, d.h. von Disulfidbrücken zwischen Bindungskomponenten ver- schiedener Bindungsreagentien, eignen. Damit können z.B. Bindungsreagentien, die unterschiedliche, kostimulatorisch wirkende Moleküle binden, gekoppelt an ein einzelnes Zell-Oberflächenprotein gebunden werden. Dies erweist sich in vielen Fällen als besonders günstig, die Immunogenität von Zellen zu steigern.
Vorstehende Bindungsreagentien können nach üblichen Verfahren hergestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
(b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen
Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
(c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in üblicher Weise.
In den Verfahrensschritten (a) und (b) werden eine erste Bindungskomponente bzw. eine zweite Bindungskomponente durch übliche DNA-Rekombinationstechni¬ ken hergestellt. Dem Fachmann sind Systeme bekannt, die zur Expression der einzelnen Bindungskomponenten verwendet werden können. Er kennt Vektoren,
Expressions-Kontrollelemente und Zellen, die hierfür herangezogen werden können. Als günstig hat es sich erwiesen, beide Bindungskomponenten als Fv- Fragmente von Antikörpern bereitzustellen. Beispielhaft wird auf die Herstellung des Fv-Frag- ments eines Anti-Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers und des Fv-Fragments eines Anti-CD28-Antikörpers hingewiesen. Hierzu werden die Expressionsplasmide pOPE51 -σHN bzw. pOPE51 -σCD28 konstruiert ( vgl. nachstehendes Beispiel 1 ).
Die Expressionsplasmide pOPE51 -σHN und pOPE51 -σCD28 gehören zur vorliegen¬ den Erfindung.
Desweiteren sind dem Fachmann Verfahren bekannt, die erhaltenen Bindungskom¬ ponenten zu reinigen. Beispielhaft wird auf die Reinigung des Fv-σHN-Fragments und des Fv-σCD28-Fragments in nachstehendem Beispiel 2 verwiesen.
Im Verfahrensschritt (c) wird die Bindungskomponente von (a) mit jener von (b) gekoppelt. Dem Fachmann sind hierfür verwendbare Verfahren bekannt. Er kennt solche zur direkten wie auch indirekten Kopplung, z.B. über einen Streptavidin
(Avidin)/Biotin- oder S-Protein/S-Peptid-Komplex. Beispielhaft wird auf die Kopp¬ lung des Fv-σHN-Fragments mit dem Fv-σCD28-Fragment in nachstehendem Bei¬ spiel 3 verwiesen.
Ein weiteres Verfahren hat sich als günstig erwiesen, um ein vorstehendes Bin¬ dungsreagens, z.B. eines, dessen Bindungskomponenten Fv-Fragmente unter¬ schiedlicher Spezifitäten (Spezifität A; Spezifität B) sind, herzustellen. In diesem Verfahren werden die Fv-Fragmente durch Kombination ihrer jeweiligen, z.T. einzeln exprimierten VH- und VL- Domänen hergestellt. Hierzu werden in die Domä- nen Gruppen, die sich zur Ausbildung von Disulfidbrücken eignen, z.B. Cysteine, derart eingeführt, daß überwiegend VH- und VL-Domänen einer Spezifität mitein¬ ander kombinieren.
Im einzelnen werden zwei miteinander kompatible Expressionsplasmide verwendet, mit denen gleichzeitig in einem Wirt, z.B. E.coli, folgende Konstrukte exprimiert werden können:
(a) eine VH-Domäne eines Antikörpers der Spezifität A, verbunden über einen Peptid-Linker von z.B. 1 8 Aminosäuren mit der VL-Domäne eines Antikörpers der Spezifität B;
(b) eine freie VH-Domäne eines Antikörpers der Spezifität B; und
(c) eine freie VL-Domäne eines Antikörpers der Spezifität A.
Es werden Kombinationen aus VH- und VL-Domänen erhalten. Durch die Ausbildung von Disulfidbrücken sind dies überwiegend Kombinationen der Domäne VH und VL der Spezifität A und solche der Domäne VH und VL der Spezifität B (vgl. Fig. 3).
Erfindungsgemäß wird auch eine Vakzine mit inaktivierten Zellen bereitgestellt, die sich dadurch auszeichnet, daß ein oder mehrere Bindungsreagentien an ein Zell- Oberflächenprotein gebunden sind. Eine solche Vakzine weist vorzugsweise
Tumorzellen auf. Diese können aus durch Operation entfernten Tumoren oder aus einer etablierten Zellinie stammen.
Die (Tumor)Zellen können Virus-modifiziert sein. Auch können durch Virus erhalte¬ ne Lysate von (Tumor)Zellen vorliegen. Vorteilhafterweise wird NDV aus Virus verwendet. Als günstig hat es sich erwiesen, wenn das oder die Bindungsreagen¬ tien gegen ein Virusprotein von NDV, insbesondere dem Hämaglutinin-Neuramini- dase-Molekül, gerichtet sind. Beispielhaft wird auf die Herstellung der Tumorvakzi¬ ne von nachstehendem Beispiel 4 verwiesen.
Die (Tumor)Zellen können auch durch Expression einer in sie eingeführten, z.B. für Streptavidin (Avidin) oder einen Antikörper, wie einen gegen das Hapten 2-pheny- loxazol-5-on gerichteten Antikörper, codierenden DNA modifiziert sein. Als günstig hat sich erwiesen, wenn bei Streptavidin (Avidin) das oder die Bindungsreagentien biotinyliert sind, während bei dem Antikörper diese das Hapten 2-phenyloxazol-5- on enthalten.
Mit den erfindungsgemäßen, an (Tumor)Zellen anzubringenden Bindungsreagentien ist es möglich, Signale auf kostimulatorisch wirkende Moleküle, z.B. Rezeptoren, von Effektorzellen zu übertragen. Somit empfangen Effektorzellen nicht nur das durch ein Antigen von (Tumor)Zellen vermittelte Signal, sondern werden ferner kostimuliert. Die erfindungsgemäßen Bindungsreagentien eignen sich daher be¬ stens, die Immunogenität von Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu steigern. Sie stellen eine große Verbesserung für die aktive Immunisierung dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnung:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51 -σHN.
ApR: Ampicillinresistenz-kodierendes Gen; bp:Basenpaare, c-myc: Sequenz, die für ein Epitop codiert, das durch mAk 9E10 erkannt wird; Cys: Nukleotide, die für einen einzelnen Cysteinrest codieren; (His)5: Sequenz, die für fünf C-terminale
Histidinreste codiert; IG: "intergenic" Region des Phagens f1 , leader: Signalpep¬ tidsequenz der bakteriellen Pectatlyase (pelB leader); linker: Sequenz, die für (Gly4Ser)3 codiert, die VH und VL verbindet; ori: Startpunkt der DNA-Replikation für ColE1 ;P/O: lac Operon Promotor/Operator; VH und VL: variable Region der schwe- ren bzw. leichten Kette des Anti-HN-Antikörpers.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51 - σCD28.
ApR: Für das Ampicillinrestistenz-codierendes Gen; bp:Basenpaare; c-myc: Se¬ quenz, die für ein Epitop codiert, das durch mAk 9E10 erkannt wird; Cys: Nukleoti- de, die für einen einzelnen Cysteinrest codieren; (His)5: Sequenz, die für fünf C- terminale Histidinreste kodiert; IG: "intergenic" Region des Phagens f1 ; leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase (pelB leader); linker: Sequenz, die für (Gly4Ser)3 codiert, die VH und VL verbindet; ori: Standpunkt der DNA-Replica- tion für CoLEI ; P/O, lac Operon Promotor/Operator; V und VL: variable Region der schweren bzw. leichten Kette des Anti-σCD28-Antikörpers.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Bindungs- reagens.
anti HN: anti-HN-Antikörper; anti CD28: anti-CD28-Antikörper; S = S: Disulfid- brücke.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Konstruktion der Expressionsplasmide pOPE51 -σHN und pOPE51-σCD28
(A) Konstruktion von pOPE51-σHN
Als Ausgangsmaterial wurde der Vektor pOPE40 verwendet (vgl. Dübel et al., Gene 128 (1 993), 97). Dieser enthält eine DNA, die für das Fv-Fragment (VH + VL) eines Anti-Lysozym-Antikörpers codiert. Die DNA für VH ist mit jener für VL über einen Linker verbunden. Der DNA vorstehenden Fragments schließt sich in 3'- Richtung eine DNA an, die für ein Epitop des monoklonalen Antikörpers 9E10 auf dem myc Genprodukt codiert.
Zur Herstellung von pOPE51 -σHN wurde am 3'Ende vorstehender myc DNA von pOPE40 die DNA-Sequenz TGC ATA CAT CAC CAT CAT CAT eingefügt. Mit dieser für die Aminosäure-Sequenz Cys lle His His His His His codierenden DNA wurde das Codon für die Aminosäure Asn am 3'-Ende der myc DNA ersetzt. Ferner wurden im Linker zwischen VH und VL die Restriktionsstellen BssHIl und EcoRI entfernt. Darüber hinaus wurden in den Vektoranteil drei Restriktionsstellen, nämlich Ncol(nt. 76-81 ), Mini (nt. 579-584) und Notl (nt. 910-917), eingefügt. Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51 -σLys erhalten.
In diesem Expressionsplasmid wurde schließlich die DNA vorstehenden Fv-Frag- ments (VH:Pvull-Hindlll-Fragment; VL:EcoRV-BamHI-Fragment) durch jene für das Fv-Fragment (VH:Pvull-Hindlll-Fragment; VL:Eco-RV-BamHI-Fragment) eines Anti- Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers ersetzt. Die DNA letzteren Fragments wird nachstehend mit Fv-σHN-DNA bezeichnet. Die DNA für VH und VL dieses Fragments wurde aus der cDNA einer Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Tech- nik erhalten (vgl. lorio, R.M. et al., J.gen. Virol. 67 ( 1 986), 1 393).
Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51 -σHN (vg. Fig. 1 ) erhalten.
(B) Konstruktion von pOPE51-σCD28
Die Konstruktion von pOPE51 -σCD28 wurde ausgehend von pOPE51 -σLys, wie unter (A) für pOPE51 -σHN beschrieben, durchgeführt. Die DNA, welche für das Fv- Fragment (VH + VL) eines Anti-CD28-Antikörpers codiert, wurde aus der cDNA einer
Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Technik erhalten (vgl. van Lier, R. et al. in Leucocyte Typing IV, Oxford University Press ( 1 989), 353). Die DNA dieses Fragments wird nachstehend mit Fv-σCD28-DNA bezeichnet.
Das erhaltene Expressionsplasmid pOPE51 -σCD28 ist in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 2: Expression der Fv-σHN- und Fv-σCD28-DNA sowie Reinigung der Expressionsprodukte (Fv-σHN- und Fv-σCD28-Fragmente)
(A) Expression der Fv-σHN-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv- crHN-Fragment)
E.coli JM 109-Zellen wurden in üblicher weise mit dem Expressionsplasmid pOPE51 -σHN transformiert und in 2 I LB-Medium bei 30°C bis zu einer OD600 von
0,7 kultiviert. Isopropyl-ß-thiogalactosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzen¬ tration von 20μm zugegeben. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur 3 h inkubiert und anschließend durch Zentrifugation (4 500 g, 4°C, 1 5 min) gesammelt. Die Zellen wurden in 1 /50 des ursprünglichen Volumens in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei 0° suspendiert.
Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach 30- minütiger Inkubation auf Eis unter schwachem Schütteln wurden lösliche Zell¬ plasmaproteine durch Zentrifugation (30 000 g, 4°C, 30 min) entfernt. Die Zell¬ pellets wurden in 1 /40 des ursprünglichen Volumens in 30 mM Natriumphosphat, 0,3 M NaCI, 1 mM PMSF, pH 7,0 resuspendiert und durch Beschallung lysiert.
Anschließend wurde zentrifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C), wodurch lösliche Cytoplasmaproteine entfernt wurden. Die Pellets wurden in dem gleichen Volumen
in 3 M Harnstoff, 25mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 7,0 suspendiert und die lösli¬ chen Proteine durch Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Ein¬ schlußkörper wurden in 1 /40 des ursprünglichen Volumens in 6 M GuHCI, 0, 1 M Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert. Das Gemisch wurde erneut zen- trifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C) und der Überstand gegen 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, pH 7,0 dialysiert. Imidazol wurde bis zu einer Endkonzentration von 30 mM zugegeben. Die Proteinlösung wurde auf eine Chelating Sepharose Fast Flow-Säule gegeben, die mit NiCI2 beladen und mit 6 M Harnstoff, 25 M Tris-HCI und 50 mM Imidazol, pH 7,0 äquilibiriert worden war. Die Säule wurde mit dem fünffachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, 50 mM Imidazol, pH 7,0 gewaschen. Gebundene Fv-σHN-Fragmente wurden mit dem 1 ,5-fachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, 250 mM Imidazol, pH 7,0 eluiert. Anschließend wurde eine IMAC bei Raumtemperatur durchgeführt. Das eluierte Protein wurde bei 4°C gegen 0,4 M L-Arginin-HCI, 0, 1 M Tris-HCI, 5 mM EDTA, pH 7,0 dialysiert, anschließend unter Verwendung permeabler Collodion-
Beutel (Rückhaltevermögen: 1 2,4 kDa) konzentriert und dann auf eine Superdex 75 HL26/60-Säule aufgetragen, die mit 0,4 M L-Arginin-HCI, 0, 1 M Tris-HCI, 5 mM EDTA, pH 7,0 äquilibriert worden war. Eine Größenausschlußchromatographie wurde unter Bedingungen, wie von Kurucz et al., PNAS USA, 90 ( 1 993), 3830 beschrieben, durchgeführt. Zur Kalibrierung der Säule wurde ein Gelfiltrations- kalibrierungskit aus Ribonuklease A (1 3,7 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa), Ovalbumin (43 kDa) und Rinderserumalbumin (67 kDa) verwendet. Die eluierten Fraktionen mit dem Fv-σHN-Fragment wurden gesammelt und gegen PBS ( 1 5 mM Natriumphosphat, 0, 1 5 m NaCI, pH 7,0) dialysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden in üblicher Weise bestimmt.
(B) Expression der Fv-σCD28-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv-σCD28-Fragment)
Die Expression der Fv-σCD28-DNA und die Reinigung des Fv-σCD28-Fragments erfolgten, wie unter (A) für Fv-σHN-DNA (Fragment) beschrieben.
Beispiel 3: Kopplung des Fv-σHN-Fragments mit dem Fv-σCD28-Fragment
10 mg des Fv-σHN-Fragments (1 mg/ml) von Beispiel 2(A) wurden mit einem 100- fachen Überschuß der bifunktionellen Sulfhydryl-Verbindung Bismaleimidohexan (BMH; 1 mM) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Reste der Sulfhydryl-Verbindung durch Dialyse gegen PBS entfernt. Danach wurde das Fv-σCD28-Fragment von Beispiel 2 (B) in äquimolarer Menge zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch das erfindungs¬ gemäße Bindungsreagens Fv-σHN/Fv-σCD28 erhalten wurde.
Beispiel 4: Herstellung einer Tumorvakzine
Von frisch operiertem Tumorgewebe wurden Fett und Bindegewebe in üblicher Weise entfernt. Das Tumorgewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und mit 40 ml eines Enzym-Cocktails (Collagenase 0,32 mg/ml, DN-ase 0,535 mg/ml und Hyaluronidase 0,535 mg/ml in HBSS) 1 h bei 37°C unter Rühren inkubiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde über ein gebräuchliches Nylon-Netz abgegossen.
Bei "sehr harten" Tumoren wurden Gewebereste ein zweitesmal mit vorstehendem Enzym-Cocktail (40 ml) inkubiert und filtriert. Alle Suspensionen wurden vereinigt, mit HBSS auf 50 ml aufgefüllt und 1 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml vorstehender DN-ase-Lösung resuspendiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Die Suspension wurde auf 50 ml
HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1 300 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml HBSS resuspendiert und die Zellen wurden in einer Neubauer-Zellkammer mit Trypan-Blau gezählt.
Bei Vorliegen von mehr als 6x107 lebenden Tumorzellen und einem Anteil von
Nicht-Tumorzellen (Lymphozyten und Monozyten) von mehr als 50 % der Gesamt¬ zellen wurde ein weiterer Separationsschritt zur Entfernung der Lymphozyten und
Monozyten durchgeführt. Je 10Oyc l Dynabeads Anti-CD2 (Pan-T), Anti-CD 1 9 (Pan- B) und Anti-CD14 (Pan-Monocyten) wurden in Röhrchen gegeben und dreimal mit je 7 ml gekühltem HBSS/HSA gewaschen. Diesen Röhrchen wurden in 2 ml kaltem HBSS/HSA resuspendierte Zellen zugegeben und die Röhrchen wurden 30 min auf Eis inkubiert. Magnetbeads wurden mit einem Magnet entfernt und die Zellsuspen¬ sion wurde abgesaugt, in Röhrchen mit 50 ml HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 50 ml HBSS resuspendiert und anschließend 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert.
Das erhaltene Zellpellet wurde in HBSS resuspendiert, wobei 1 x 107 Zellen in 0,5 ml HBSS aufgenommen wurden. Von der erhaltenen Zellsuspension wurden ca. 0,5 ml in vorbereitete Einfrierröhrchen gegeben. Diesen wurden ca. 0,5 ml Zwei- fach-Einfriermedium auf Eis zugegeben, bevor die Einfrierröhrchen bei -70°C über Nacht gelagert und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden.
50//I vorstehender, nicht mit Einfriermedium versehener Zellsuspension wurden für Cytospin-Präparate auf Eis gestellt und mit PBS in einer Verdünnungsreihe jeweils 1 : 1 verdünnt. 6 Eppendorf-Hütchen mit je 50 /I PBS/BSA wurden jeweils 50//I vorstehender Verdünnungsreihe zugegeben und die Hütchen wurden in eine Cytospin-Apparatur eingeführt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1000 U/min wurden die Objektträger 1 min mit 100 % Methanol an der Luft fixiert. Anschlie¬ ßend erfolgte eine Färbung nach dem bekannten Verfahren von Pappenheim. Dann wurden lichtmikroskopisch die Zellen auf ihren Gehalt an Tumorzellen untersucht. Bei einem Gehalt von weniger als 50 % Tumorzellen wurde vorstehende Zell- Suspension nicht als Vakzine verwendet.
Bei einem Gehalt von mehr als 50 % Tumorzellen wurde vorstehende Zellsuspen¬ sion bei 37°C aufgetaut, in ein Röhrchen überführt und auf 14 ml mit PBS aufge¬ füllt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1300 U/min wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100//I PBS resuspendiert, in Einfrierröhrchen überführt und mit 30 ml NDS-Suspension (Konzentration 1000 HAU/ml) versetzt. Es folgte eine 30minütige Inkubation bei 37°C, wobei nach 1 5 min leicht aufge-
schüttelt wurde. Nach der Inkubation wurde sorgfältig gewaschen, ehe ein Aliquot von Tumorzellen (5x106 vitale Tumorzellen) mit ca. 5//g Protein des erfindungs¬ gemäßen Bindungsreagens von Beispiel 3 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Danach wurde die Zeil-Suspension mit 200 Gy bestrahlt. Die Zeil-Suspension wurde bis zur Injektion auf Eis gelagert, dann in eine Spritze aufgezogen und mit einer 0,9x40 ml Kanüle intradermal injiziert.