EP0749487A1 - Bindungsreagens für zell-oberflächenprotein und effektorzelle - Google Patents

Bindungsreagens für zell-oberflächenprotein und effektorzelle

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EP0749487A1
EP0749487A1 EP95911308A EP95911308A EP0749487A1 EP 0749487 A1 EP0749487 A1 EP 0749487A1 EP 95911308 A EP95911308 A EP 95911308A EP 95911308 A EP95911308 A EP 95911308A EP 0749487 A1 EP0749487 A1 EP 0749487A1
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EP
European Patent Office
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binding
binding reagent
reagent according
expression
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95911308A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Volker Schirrmacher
Khashayarsha Khazaie
Claudia Haas
Gerd Moldenhauer
Melvyn Little
Stefan Dübel
Frank Breitling
Sergey Kipriyanov
Stefanie Gotter
Hans-Jürgen RODE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Little Melvyn Prof Dr
RODE, HANS-JUERGEN, DR.
SCHIRRMACHER, VOLKER, PROF. DR.
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
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    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies

Definitions

  • the invention is therefore based on the object of providing a means by which the immunogenicity of cells can be increased.
  • the above compound is a B7 protein or a part thereof (cf. Nature 366 (1 993), 76; Science 262 (1 993), 909 "). It has proven to be particularly advantageous if such Part does not include the membrane-bound domain, and it is also advantageous if the compound is a lymphokine, interferon or interleukin.
  • effector cell encompasses any cell involved in an immune response. It is preferably a T cell.
  • costimulatory molecule includes any molecule of an effector cell that can be caused by binding or otherwise to stimulate the effector cell. Such a molecule can e.g. be a receptor.
  • a receptor e.g. be a receptor.
  • the receptors CD2-, CD3-, CD19-, CD20-, CD22-, CD26-, CD28- and CTLA-4 as well as HSA (Heat Stable Antigen) are particularly advantageous for the invention .
  • the receptor CD28 should be particularly emphasized.
  • binding reagents are preferred in which one or both binding components contain groups which form the formation of intermolecular disulfide bridges, i.e. of disulfide bridges between binding components of different binding reagents.
  • binding reagents that bind different, costimulatory molecules, coupled to a single cell surface protein. In many cases, this proves to be particularly beneficial for increasing the immunogenicity of cells.
  • Expression vector expression of the DNA, isolation of the expression product and its purification
  • a vaccine with inactivated cells is also provided, which is characterized in that one or more binding reagents are bound to a cell surface protein.
  • a vaccine preferably has Tumor cells. These can originate from tumors removed by surgery or from an established cell line.
  • binding reagents according to the invention which are to be attached to (tumor) cells, it is possible to transmit signals to molecules having a costimulatory effect, e.g. Receptors to transmit from effector cells. Effector cells thus not only receive the signal mediated by an antigen of (tumor) cells, but are also costimulated.
  • the binding reagents according to the invention are therefore particularly suitable for increasing the immunogenicity of cells, in particular tumor cells. They are a great improvement for active immunization.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the expression plasmid pOPE51- ⁇ CD28.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a binding reagent according to the invention.
  • anti HN anti-HN antibody
  • anti CD28 anti-CD28 antibody
  • S S: disulfide bridge.
  • the vector pOPE40 was used as the starting material (cf. Dübel et al., Gene 128 (1 993), 97). This contains a DNA which codes for the F v fragment (V H + V L ) of an anti-lysozyme antibody. The DNA for V H is linked to that for V L via a linker. The DNA above fragment is followed in the 3 'direction by a DNA which codes for an epitope of the monoclonal antibody 9E10 on the myc gene product.
  • Hybridoma cell line obtained using conventional PCR technology (cf. van Lier, R. et al. In Leucocyte Typing IV, Oxford University Press (1 989), 353).
  • the DNA of this fragment is referred to below as F v - ⁇ CD28-DNA.
  • the expression plasmid pOPE51 - ⁇ CD28 obtained is shown in FIG. 2.
  • E.coli JM 109 cells were transformed in the usual way with the expression plasmid pOPE51 - ⁇ HN and in 2 I LB medium at 30 ° C. up to an OD 600 of
  • Isopropyl- ⁇ -thiogalactoside IPTG was added up to a final concentration of 20 ⁇ m.
  • the cells were incubated at room temperature for 3 h and then collected by centrifugation (4 500 g, 4 ° C., 1 5 min).
  • the cells were suspended in 1/50 of the original volume in 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, 10 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) at 0 °.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -thiogalactoside
  • Lysozyme was added to a final concentration of 1 mg / ml. After incubation on ice for 30 minutes with gentle shaking, soluble cell plasma proteins were removed by centrifugation (30,000 g, 4 ° C., 30 min). The cell pellets were resuspended in 1/40 of the original volume in 30 mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl, 1 mM PMSF, pH 7.0 and lysed by sonication.
  • Imidazole was added to a final concentration of 30 mM.
  • the protein solution was placed on a chelating Sepharose Fast Flow column loaded with NiCl 2 and equilibrated with 6 M urea, 25 M Tris-HCl and 50 mM imidazole, pH 7.0.
  • the column was washed with five times the column volume of 6 M urea, 25 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole, pH 7.0.
  • Bound F v - ⁇ HN fragments were eluted with 1.5 times the column volume of 6 M urea, 25 mM Tris-HCl, 250 mM imidazole, pH 7.0.
  • An IMAC was then carried out at room temperature.
  • the eluted protein was dialyzed at 4 ° C against 0.4 M L-arginine-HCl, 0.1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.0, then using permeable Collodione-
  • Fat and connective tissue were removed from freshly operated tumor tissue in the usual way.
  • the tumor tissue was cut into small pieces and incubated with 40 ml of an enzyme cocktail (collagenase 0.32 mg / ml, DN-ase 0.535 mg / ml and hyaluronidase 0.535 mg / ml in HBSS) for 1 h at 37 ° C. with stirring.
  • the cell suspension obtained was poured off over a customary nylon mesh.
  • tissue residues were incubated a second time with the above enzyme cocktail (40 ml) and filtered. All suspensions were combined, made up to 50 ml with HBSS and centrifuged for 15 minutes at 1200 rpm. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 10 ml of the above DN-ase solution and incubated at 37 ° C. for 10 min. The suspension was made up to 50 ml
  • the cell pellet obtained was resuspended in HBSS, 1 ⁇ 10 7 cells being taken up in 0.5 ml HBSS. Approx. 0.5 ml of the cell suspension obtained was placed in prepared freezing tubes. About 0.5 ml of double freezing medium on ice was added to these before the freezing tubes were stored at -70 ° C. overnight and then kept in liquid nitrogen.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Bindungsreagens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine erste Bindungskomponente für ein Zell-Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Bindungsreagens sowie eine das Bindungsreagens enthaltende Vakzine.

Description

Bindungsreagens für Zell-Oberflächenprotein und Effektorzelle
Die Erfindung betrifft ein Bindungsreagens, ein Verfahren zu seiner Herstellung und eine das Bindungsreagens enthaltende Vakzine.
Es ist bekannt, daß bei aktiver Immunisierung die verwendeten Zellen oftmals nur eine schwache oder gar keine Immunogenität zeigen. Dies findet sich insbesonde¬ re, wenn Tumorzellen verwendet werden.
Versuche wurden unternommen, die Immunogenität von Zellen zu steigern. Viel- fach führten solche Versuche, wie bei der Verwendung von durch Newcastle
Disease Virus (nachstehend mit NDV bezeichnet) erhaltenen Onkolysaten, nicht zu befriedigenden Ergebnissen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die Immunogenität von Zellen gesteigert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch Bereitstellung eines Bindungsreagens erreicht, das sich dadurch auszeichnet, daß es eine erste Bindungskomponente für ein Zell- Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
Der Ausdruck "erste Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einer¬ seits an ein Zell-Oberflächenprotein und andererseits an eine zweite Bindungskom- ponente binden kann. Die Bindung kann direkt oder indirekt sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Frag- ment. Als besonders günstig hat sich das Fv-Fragment eines Anti-Hämaglutinin- Neuraminidase-Antikörpers erwiesen.
Der Ausdruck "Zell-Oberflächenprotein" umfaßt jegliches Molekül, das auf einer Zelloberfläche vorliegen kann. Ein solches kann z.B. ein Peptid oder Protein sein, das von der Zelle selbst, von einem Virus in der Zelle oder von der Expression einer in die Zelle eingeführten DNA stammt. Vorzugsweise ist das "Zell-Oberflächen¬ protein" ein Virusprotein, wie das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül von NDV, das Hämaglutinin-Molekül von Influenza Virus oder das Hüllprotein von HTLV-I bzw. HIV, ein Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Onkogen-Produkt, wie v-Erb B2, ein Adhäsionsmolekül, ein Antikörper, wie ein gegen Hapten 2-phenyloxazol-5-on gerichteter Antikörper, oder Streptavidin (Avidin) bzw. ein Teil davon. Als beson¬ ders günstig hat es sich erwiesen, wenn das Zell-Oberflächenprotein ein Virus¬ protein von NDV ist, wobei insbesondere das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül von NDV zu erwähnen ist.
Der Ausdruck "zweite Bindungskomponente" umfaßt jegliche Verbindung, die einerseits an eine erste Bindungskomponente und andererseits an ein kostimulato¬ risch wirkendes Molekül einer Effektorzelle binden kann. Die Bindung kann direkt oder indirekt sein. Vorzugsweise ist die Verbindung ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne aufweisender Teil davon. Günstigerweise ist ein solcher Teil ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Fragment. Als besonders günstig hat sich das Fv-
Fragment eines Anti-CD1 9-, Anti-CD20-, Anti-CD22- bzw. Anti-CD-28-Antikörpers erwiesen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die vorstehende Verbindung ein B7 Protein oder ein Teil davon (vgl. Nature 366 (1 993), 76; Science 262 (1 993), 909"). Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn ein solcher Teil nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt. Des weiteren ist es vorteilhaft, wenn die Verbindung ein Lymphokin, Interferon oder Interleukin ist. Der Ausdruck "Effektorzelle" umfaßt jegliche an einer Immunreaktion beteiligte Zelle. Vorzugsweise handelt es sich um eine T-Zelle.
Der Ausdruck "kostimulatorisch wirkendes Molekül" umfaßt jegliches Molekül einer Effektorzelle, das durch Bindung oder in sonstiger Weise veranlaßt werden kann, die Effektorzelle zu stimulieren. Ein solches Molekül kann z.B. ein Rezeptor sein. Im Falle einer T-Zelle bieten sich insbesondere die Rezeptoren CD2-, CD3-, CD 1 9-, CD20-, CD22-, CD26-, CD28- und CTLA-4 sowie HSA (Heat Stable Antigen) als günstig für die Erfindung an. Der Rezeptor CD28 ist dabei besonders zu betonen.
In einem vorstehenden Bindungsreagens können die beiden Bindungskomponenten direkt oder indirekt miteinander verbunden sein. In letzerem Fall kann dies über einen Komplex, z.B. aus Streptavidin (Avidin) und Biotin bzw. S-Protein und S- Peptid der pankreatischen Ribonuklease A bewirkt werden. Hierzu weist eine der beiden Bindungskomponenten Streptavidin (Avidin) bzw. S-Protein oder einen Teil davon und die andere Bindungskomponente Biotin bzw. S-Peptid oder einen Teil davon auf. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, die Bestandteile der einzelnen Komplexe an die Bindungskomponenten zu koppeln und diese zur Ausbildung der Komplexe miteinander umzusetzen. Bindungsreagentien, in denen die Bindungs- komponenten indirekt miteinander verbunden sind, werden bevorzugt.
Weiterhin werden Bindungsreagentien bevorzugt, in denen eine oder beide Bin¬ dungskomponenten Gruppen enthalten, die sich zur Ausbildung intermolekularer Disulfidbrücken, d.h. von Disulfidbrücken zwischen Bindungskomponenten ver- schiedener Bindungsreagentien, eignen. Damit können z.B. Bindungsreagentien, die unterschiedliche, kostimulatorisch wirkende Moleküle binden, gekoppelt an ein einzelnes Zell-Oberflächenprotein gebunden werden. Dies erweist sich in vielen Fällen als besonders günstig, die Immunogenität von Zellen zu steigern.
Vorstehende Bindungsreagentien können nach üblichen Verfahren hergestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt: (a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
(b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen
Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expressionsprodukts und seine Reinigung,
(c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in üblicher Weise.
In den Verfahrensschritten (a) und (b) werden eine erste Bindungskomponente bzw. eine zweite Bindungskomponente durch übliche DNA-Rekombinationstechni¬ ken hergestellt. Dem Fachmann sind Systeme bekannt, die zur Expression der einzelnen Bindungskomponenten verwendet werden können. Er kennt Vektoren,
Expressions-Kontrollelemente und Zellen, die hierfür herangezogen werden können. Als günstig hat es sich erwiesen, beide Bindungskomponenten als Fv- Fragmente von Antikörpern bereitzustellen. Beispielhaft wird auf die Herstellung des Fv-Frag- ments eines Anti-Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers und des Fv-Fragments eines Anti-CD28-Antikörpers hingewiesen. Hierzu werden die Expressionsplasmide pOPE51 -σHN bzw. pOPE51 -σCD28 konstruiert ( vgl. nachstehendes Beispiel 1 ).
Die Expressionsplasmide pOPE51 -σHN und pOPE51 -σCD28 gehören zur vorliegen¬ den Erfindung.
Desweiteren sind dem Fachmann Verfahren bekannt, die erhaltenen Bindungskom¬ ponenten zu reinigen. Beispielhaft wird auf die Reinigung des Fv-σHN-Fragments und des Fv-σCD28-Fragments in nachstehendem Beispiel 2 verwiesen.
Im Verfahrensschritt (c) wird die Bindungskomponente von (a) mit jener von (b) gekoppelt. Dem Fachmann sind hierfür verwendbare Verfahren bekannt. Er kennt solche zur direkten wie auch indirekten Kopplung, z.B. über einen Streptavidin (Avidin)/Biotin- oder S-Protein/S-Peptid-Komplex. Beispielhaft wird auf die Kopp¬ lung des Fv-σHN-Fragments mit dem Fv-σCD28-Fragment in nachstehendem Bei¬ spiel 3 verwiesen.
Ein weiteres Verfahren hat sich als günstig erwiesen, um ein vorstehendes Bin¬ dungsreagens, z.B. eines, dessen Bindungskomponenten Fv-Fragmente unter¬ schiedlicher Spezifitäten (Spezifität A; Spezifität B) sind, herzustellen. In diesem Verfahren werden die Fv-Fragmente durch Kombination ihrer jeweiligen, z.T. einzeln exprimierten VH- und VL- Domänen hergestellt. Hierzu werden in die Domä- nen Gruppen, die sich zur Ausbildung von Disulfidbrücken eignen, z.B. Cysteine, derart eingeführt, daß überwiegend VH- und VL-Domänen einer Spezifität mitein¬ ander kombinieren.
Im einzelnen werden zwei miteinander kompatible Expressionsplasmide verwendet, mit denen gleichzeitig in einem Wirt, z.B. E.coli, folgende Konstrukte exprimiert werden können:
(a) eine VH-Domäne eines Antikörpers der Spezifität A, verbunden über einen Peptid-Linker von z.B. 1 8 Aminosäuren mit der VL-Domäne eines Antikörpers der Spezifität B;
(b) eine freie VH-Domäne eines Antikörpers der Spezifität B; und
(c) eine freie VL-Domäne eines Antikörpers der Spezifität A.
Es werden Kombinationen aus VH- und VL-Domänen erhalten. Durch die Ausbildung von Disulfidbrücken sind dies überwiegend Kombinationen der Domäne VH und VL der Spezifität A und solche der Domäne VH und VL der Spezifität B (vgl. Fig. 3).
Erfindungsgemäß wird auch eine Vakzine mit inaktivierten Zellen bereitgestellt, die sich dadurch auszeichnet, daß ein oder mehrere Bindungsreagentien an ein Zell- Oberflächenprotein gebunden sind. Eine solche Vakzine weist vorzugsweise Tumorzellen auf. Diese können aus durch Operation entfernten Tumoren oder aus einer etablierten Zellinie stammen.
Die (Tumor)Zellen können Virus-modifiziert sein. Auch können durch Virus erhalte¬ ne Lysate von (Tumor)Zellen vorliegen. Vorteilhafterweise wird NDV aus Virus verwendet. Als günstig hat es sich erwiesen, wenn das oder die Bindungsreagen¬ tien gegen ein Virusprotein von NDV, insbesondere dem Hämaglutinin-Neuramini- dase-Molekül, gerichtet sind. Beispielhaft wird auf die Herstellung der Tumorvakzi¬ ne von nachstehendem Beispiel 4 verwiesen.
Die (Tumor)Zellen können auch durch Expression einer in sie eingeführten, z.B. für Streptavidin (Avidin) oder einen Antikörper, wie einen gegen das Hapten 2-pheny- loxazol-5-on gerichteten Antikörper, codierenden DNA modifiziert sein. Als günstig hat sich erwiesen, wenn bei Streptavidin (Avidin) das oder die Bindungsreagentien biotinyliert sind, während bei dem Antikörper diese das Hapten 2-phenyloxazol-5- on enthalten.
Mit den erfindungsgemäßen, an (Tumor)Zellen anzubringenden Bindungsreagentien ist es möglich, Signale auf kostimulatorisch wirkende Moleküle, z.B. Rezeptoren, von Effektorzellen zu übertragen. Somit empfangen Effektorzellen nicht nur das durch ein Antigen von (Tumor)Zellen vermittelte Signal, sondern werden ferner kostimuliert. Die erfindungsgemäßen Bindungsreagentien eignen sich daher be¬ stens, die Immunogenität von Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu steigern. Sie stellen eine große Verbesserung für die aktive Immunisierung dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnung:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51 -σHN.
ApR: Ampicillinresistenz-kodierendes Gen; bp:Basenpaare, c-myc: Sequenz, die für ein Epitop codiert, das durch mAk 9E10 erkannt wird; Cys: Nukleotide, die für einen einzelnen Cysteinrest codieren; (His)5: Sequenz, die für fünf C-terminale Histidinreste codiert; IG: "intergenic" Region des Phagens f1 , leader: Signalpep¬ tidsequenz der bakteriellen Pectatlyase (pelB leader); linker: Sequenz, die für (Gly4Ser)3 codiert, die VH und VL verbindet; ori: Startpunkt der DNA-Replikation für ColE1 ;P/O: lac Operon Promotor/Operator; VH und VL: variable Region der schwe- ren bzw. leichten Kette des Anti-HN-Antikörpers.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsplasmids pOPE51 - σCD28.
ApR: Für das Ampicillinrestistenz-codierendes Gen; bp:Basenpaare; c-myc: Se¬ quenz, die für ein Epitop codiert, das durch mAk 9E10 erkannt wird; Cys: Nukleoti- de, die für einen einzelnen Cysteinrest codieren; (His)5: Sequenz, die für fünf C- terminale Histidinreste kodiert; IG: "intergenic" Region des Phagens f1 ; leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase (pelB leader); linker: Sequenz, die für (Gly4Ser)3 codiert, die VH und VL verbindet; ori: Standpunkt der DNA-Replica- tion für CoLEI ; P/O, lac Operon Promotor/Operator; V und VL: variable Region der schweren bzw. leichten Kette des Anti-σCD28-Antikörpers.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Bindungs- reagens.
anti HN: anti-HN-Antikörper; anti CD28: anti-CD28-Antikörper; S = S: Disulfid- brücke.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 : Konstruktion der Expressionsplasmide pOPE51 -σHN und pOPE51-σCD28
(A) Konstruktion von pOPE51-σHN
Als Ausgangsmaterial wurde der Vektor pOPE40 verwendet (vgl. Dübel et al., Gene 128 (1 993), 97). Dieser enthält eine DNA, die für das Fv-Fragment (VH + VL) eines Anti-Lysozym-Antikörpers codiert. Die DNA für VH ist mit jener für VL über einen Linker verbunden. Der DNA vorstehenden Fragments schließt sich in 3'- Richtung eine DNA an, die für ein Epitop des monoklonalen Antikörpers 9E10 auf dem myc Genprodukt codiert.
Zur Herstellung von pOPE51 -σHN wurde am 3'Ende vorstehender myc DNA von pOPE40 die DNA-Sequenz TGC ATA CAT CAC CAT CAT CAT eingefügt. Mit dieser für die Aminosäure-Sequenz Cys lle His His His His His codierenden DNA wurde das Codon für die Aminosäure Asn am 3'-Ende der myc DNA ersetzt. Ferner wurden im Linker zwischen VH und VL die Restriktionsstellen BssHIl und EcoRI entfernt. Darüber hinaus wurden in den Vektoranteil drei Restriktionsstellen, nämlich Ncol(nt. 76-81 ), Mini (nt. 579-584) und Notl (nt. 910-917), eingefügt. Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51 -σLys erhalten.
In diesem Expressionsplasmid wurde schließlich die DNA vorstehenden Fv-Frag- ments (VH:Pvull-Hindlll-Fragment; VL:EcoRV-BamHI-Fragment) durch jene für das Fv-Fragment (VH:Pvull-Hindlll-Fragment; VL:Eco-RV-BamHI-Fragment) eines Anti- Hämaglutinin-Neuraminidase-Antikörpers ersetzt. Die DNA letzteren Fragments wird nachstehend mit Fv-σHN-DNA bezeichnet. Die DNA für VH und VL dieses Fragments wurde aus der cDNA einer Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Tech- nik erhalten (vgl. lorio, R.M. et al., J.gen. Virol. 67 ( 1 986), 1 393).
Es wurde das Expressionsplasmid pOPE51 -σHN (vg. Fig. 1 ) erhalten. (B) Konstruktion von pOPE51-σCD28
Die Konstruktion von pOPE51 -σCD28 wurde ausgehend von pOPE51 -σLys, wie unter (A) für pOPE51 -σHN beschrieben, durchgeführt. Die DNA, welche für das Fv- Fragment (VH + VL) eines Anti-CD28-Antikörpers codiert, wurde aus der cDNA einer
Hybridomzellinie mittels üblicher PCR-Technik erhalten (vgl. van Lier, R. et al. in Leucocyte Typing IV, Oxford University Press ( 1 989), 353). Die DNA dieses Fragments wird nachstehend mit Fv-σCD28-DNA bezeichnet.
Das erhaltene Expressionsplasmid pOPE51 -σCD28 ist in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 2: Expression der Fv-σHN- und Fv-σCD28-DNA sowie Reinigung der Expressionsprodukte (Fv-σHN- und Fv-σCD28-Fragmente)
(A) Expression der Fv-σHN-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv- crHN-Fragment)
E.coli JM 109-Zellen wurden in üblicher weise mit dem Expressionsplasmid pOPE51 -σHN transformiert und in 2 I LB-Medium bei 30°C bis zu einer OD600 von
0,7 kultiviert. Isopropyl-ß-thiogalactosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzen¬ tration von 20μm zugegeben. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur 3 h inkubiert und anschließend durch Zentrifugation (4 500 g, 4°C, 1 5 min) gesammelt. Die Zellen wurden in 1 /50 des ursprünglichen Volumens in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei 0° suspendiert.
Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach 30- minütiger Inkubation auf Eis unter schwachem Schütteln wurden lösliche Zell¬ plasmaproteine durch Zentrifugation (30 000 g, 4°C, 30 min) entfernt. Die Zell¬ pellets wurden in 1 /40 des ursprünglichen Volumens in 30 mM Natriumphosphat, 0,3 M NaCI, 1 mM PMSF, pH 7,0 resuspendiert und durch Beschallung lysiert.
Anschließend wurde zentrifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C), wodurch lösliche Cytoplasmaproteine entfernt wurden. Die Pellets wurden in dem gleichen Volumen in 3 M Harnstoff, 25mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 7,0 suspendiert und die lösli¬ chen Proteine durch Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Ein¬ schlußkörper wurden in 1 /40 des ursprünglichen Volumens in 6 M GuHCI, 0, 1 M Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert. Das Gemisch wurde erneut zen- trifugiert (30 000 g, 30 min, 4°C) und der Überstand gegen 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, pH 7,0 dialysiert. Imidazol wurde bis zu einer Endkonzentration von 30 mM zugegeben. Die Proteinlösung wurde auf eine Chelating Sepharose Fast Flow-Säule gegeben, die mit NiCI2 beladen und mit 6 M Harnstoff, 25 M Tris-HCI und 50 mM Imidazol, pH 7,0 äquilibiriert worden war. Die Säule wurde mit dem fünffachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, 50 mM Imidazol, pH 7,0 gewaschen. Gebundene Fv-σHN-Fragmente wurden mit dem 1 ,5-fachen Säulenvolumen an 6 M Harnstoff, 25 mM Tris-HCI, 250 mM Imidazol, pH 7,0 eluiert. Anschließend wurde eine IMAC bei Raumtemperatur durchgeführt. Das eluierte Protein wurde bei 4°C gegen 0,4 M L-Arginin-HCI, 0, 1 M Tris-HCI, 5 mM EDTA, pH 7,0 dialysiert, anschließend unter Verwendung permeabler Collodion-
Beutel (Rückhaltevermögen: 1 2,4 kDa) konzentriert und dann auf eine Superdex 75 HL26/60-Säule aufgetragen, die mit 0,4 M L-Arginin-HCI, 0, 1 M Tris-HCI, 5 mM EDTA, pH 7,0 äquilibriert worden war. Eine Größenausschlußchromatographie wurde unter Bedingungen, wie von Kurucz et al., PNAS USA, 90 ( 1 993), 3830 beschrieben, durchgeführt. Zur Kalibrierung der Säule wurde ein Gelfiltrations- kalibrierungskit aus Ribonuklease A (1 3,7 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa), Ovalbumin (43 kDa) und Rinderserumalbumin (67 kDa) verwendet. Die eluierten Fraktionen mit dem Fv-σHN-Fragment wurden gesammelt und gegen PBS ( 1 5 mM Natriumphosphat, 0, 1 5 m NaCI, pH 7,0) dialysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden in üblicher Weise bestimmt.
(B) Expression der Fv-σCD28-DNA und Reinigung des Expressionsprodukts (Fv-σCD28-Fragment)
Die Expression der Fv-σCD28-DNA und die Reinigung des Fv-σCD28-Fragments erfolgten, wie unter (A) für Fv-σHN-DNA (Fragment) beschrieben. Beispiel 3: Kopplung des Fv-σHN-Fragments mit dem Fv-σCD28-Fragment
10 mg des Fv-σHN-Fragments (1 mg/ml) von Beispiel 2(A) wurden mit einem 100- fachen Überschuß der bifunktionellen Sulfhydryl-Verbindung Bismaleimidohexan (BMH; 1 mM) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Reste der Sulfhydryl-Verbindung durch Dialyse gegen PBS entfernt. Danach wurde das Fv-σCD28-Fragment von Beispiel 2 (B) in äquimolarer Menge zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch das erfindungs¬ gemäße Bindungsreagens Fv-σHN/Fv-σCD28 erhalten wurde.
Beispiel 4: Herstellung einer Tumorvakzine
Von frisch operiertem Tumorgewebe wurden Fett und Bindegewebe in üblicher Weise entfernt. Das Tumorgewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und mit 40 ml eines Enzym-Cocktails (Collagenase 0,32 mg/ml, DN-ase 0,535 mg/ml und Hyaluronidase 0,535 mg/ml in HBSS) 1 h bei 37°C unter Rühren inkubiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde über ein gebräuchliches Nylon-Netz abgegossen.
Bei "sehr harten" Tumoren wurden Gewebereste ein zweitesmal mit vorstehendem Enzym-Cocktail (40 ml) inkubiert und filtriert. Alle Suspensionen wurden vereinigt, mit HBSS auf 50 ml aufgefüllt und 1 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml vorstehender DN-ase-Lösung resuspendiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Die Suspension wurde auf 50 ml
HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1 300 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml HBSS resuspendiert und die Zellen wurden in einer Neubauer-Zellkammer mit Trypan-Blau gezählt.
Bei Vorliegen von mehr als 6x107 lebenden Tumorzellen und einem Anteil von
Nicht-Tumorzellen (Lymphozyten und Monozyten) von mehr als 50 % der Gesamt¬ zellen wurde ein weiterer Separationsschritt zur Entfernung der Lymphozyten und Monozyten durchgeführt. Je 10Oyc l Dynabeads Anti-CD2 (Pan-T), Anti-CD 1 9 (Pan- B) und Anti-CD14 (Pan-Monocyten) wurden in Röhrchen gegeben und dreimal mit je 7 ml gekühltem HBSS/HSA gewaschen. Diesen Röhrchen wurden in 2 ml kaltem HBSS/HSA resuspendierte Zellen zugegeben und die Röhrchen wurden 30 min auf Eis inkubiert. Magnetbeads wurden mit einem Magnet entfernt und die Zellsuspen¬ sion wurde abgesaugt, in Röhrchen mit 50 ml HBSS aufgefüllt und 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 50 ml HBSS resuspendiert und anschließend 10 min bei 1300 U/min zentrifugiert.
Das erhaltene Zellpellet wurde in HBSS resuspendiert, wobei 1 x 107 Zellen in 0,5 ml HBSS aufgenommen wurden. Von der erhaltenen Zellsuspension wurden ca. 0,5 ml in vorbereitete Einfrierröhrchen gegeben. Diesen wurden ca. 0,5 ml Zwei- fach-Einfriermedium auf Eis zugegeben, bevor die Einfrierröhrchen bei -70°C über Nacht gelagert und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden.
50//I vorstehender, nicht mit Einfriermedium versehener Zellsuspension wurden für Cytospin-Präparate auf Eis gestellt und mit PBS in einer Verdünnungsreihe jeweils 1 : 1 verdünnt. 6 Eppendorf-Hütchen mit je 50 /I PBS/BSA wurden jeweils 50//I vorstehender Verdünnungsreihe zugegeben und die Hütchen wurden in eine Cytospin-Apparatur eingeführt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1000 U/min wurden die Objektträger 1 min mit 100 % Methanol an der Luft fixiert. Anschlie¬ ßend erfolgte eine Färbung nach dem bekannten Verfahren von Pappenheim. Dann wurden lichtmikroskopisch die Zellen auf ihren Gehalt an Tumorzellen untersucht. Bei einem Gehalt von weniger als 50 % Tumorzellen wurde vorstehende Zell- Suspension nicht als Vakzine verwendet.
Bei einem Gehalt von mehr als 50 % Tumorzellen wurde vorstehende Zellsuspen¬ sion bei 37°C aufgetaut, in ein Röhrchen überführt und auf 14 ml mit PBS aufge¬ füllt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1300 U/min wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100//I PBS resuspendiert, in Einfrierröhrchen überführt und mit 30 ml NDS-Suspension (Konzentration 1000 HAU/ml) versetzt. Es folgte eine 30minütige Inkubation bei 37°C, wobei nach 1 5 min leicht aufge- schüttelt wurde. Nach der Inkubation wurde sorgfältig gewaschen, ehe ein Aliquot von Tumorzellen (5x106 vitale Tumorzellen) mit ca. 5//g Protein des erfindungs¬ gemäßen Bindungsreagens von Beispiel 3 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Danach wurde die Zeil-Suspension mit 200 Gy bestrahlt. Die Zeil-Suspension wurde bis zur Injektion auf Eis gelagert, dann in eine Spritze aufgezogen und mit einer 0,9x40 ml Kanüle intradermal injiziert.

Claims

Patentansprüche
1 . Bindungsreagens, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erste Bindungskom¬ ponente für ein Zell-Oberflächenprotein und eine zweite Bindungskomponen¬ te für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
2. Bindungsreagens nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die erste Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne auf¬ weisender Teil davon ist.
3. Bindungsreagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-f* agment ist.
4. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich¬ net, daß das Zell-Oberflächenprotein ein Virusprotein, ein Wachstumsfaktor- Rezeptor, ein Onkogen-Produkt, ein Adhäsionsmolekül, Streptavidin (Avi¬ din) oder ein Antikörper ist.
5. Bindungsreagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Virusprotein das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül des Newcastle Disea- se Virus ist.
6. Bindungsreagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti¬ körper gegen Hapten 2-phenyloxazol-5-on gerichtet ist.
7. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich¬ net, daß die zweite Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bin- dungsdomäne aufweisender Teil davon ist.
8. Bindungsreagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Fragment ist.
9. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich¬ net, daß die zweite Bindungskomponente ein B7 Protein oder ein Teil davon ist.
10. Bindungsreagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil von B7 nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt.
1 1 . Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Effektorzelle eine T-Zelle ist.
1 2. Bindungsreagens nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das kostimulatorisch wirkende Molekül ein CD2-, CD3-, CD1 9-, CD20-, CD22-, CD26-, CD28-, oder CTLA-4-Rezeptor oder HSA ist.
13. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Bindungskomponenten über einen Komplex miteinander verbunden sind.
14. Bindungsreagens nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex aus Streptavidin (Avidin) und Biotin besteht.
1 5. Bindungsreagens nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex aus S-Protein und S-Peptid besteht.
1 6. Verfahren zur Herstellung eines Bindungsreagens nach Anspruch 1 , um¬ fassend die folgenden Schritte:
(a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres¬ sionsprodukts und seine Reinigung, (b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres¬ sionsprodukts und seine Reinigung, und
(c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in übli¬ cher Weise
17. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine erste Bin¬ dungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
1 8. Expressionsplasmid nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 1 ist.
1 9. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine zweite
Bindungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
20. Expressionsplasmid nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 2 ist.
21 . Vakzine mit inaktivierten Zellen, wobei an ein Zell-Oberflächenprotein ein oder mehrere Bindungsreagentien nach Anspruch 1 gebunden sind.
22. Vakzine nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Tumor¬ zellen sind.
23. Vakzine nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus durch Operation entfernten Tumoren stammen.
24. Vakzine nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus einer etablierten Zellinie stammen.
25. Vakzine nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Oberflächenprotein ein Antikörper ist.
26. Vakzine nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen das Hapten 2-phenyloxazol-5-on gerichtet ist.
27. Vakzine nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Virus-modifiziert sind.
28. Vakzine nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein
Newcastle Disease Virus ist.
29. Vakzine nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Ober¬ flächenprotein das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül ist.
GEÄNDERTE ANSPRÜCHE
[beim Internationalen Büro am 7. August 1995 (07.08.95) eingegangen, ursprünglicher
Anspruch 1 geändert; ursprüngliche Ansprüche 2 und 3 unverändert; ursprüngliche
Ansprüche 4-6 gestrichen; ursprüngliche Ansprüche 7-29 in neue Ansprüche 4-26 umnumeriert (3 Seiten)]
1 . Bindungsreagens, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erste Bindungskom¬ ponente für das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül des Newcastle Disea¬ se Virus oder für einen Antikörper, der gegen das Hapten-2-phenyloxazol-5- on gerichtet ist, und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulato¬ risch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist.
2. Bindungsreagens nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die erste Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bindungsdomäne auf¬ weisender Teil davon ist.
3. Bindungsreagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Fragment ist.
4. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich¬ net, daß die zweite Bindungskomponente ein Antikörper oder ein eine Bin¬ dungsdomäne aufweisender Teil davon ist.
5. Bindungsreagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Antikörpers ein Fab'-, (Fab')2-, Fv- oder (Fv)2-Fragment ist.
6. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich¬ net, daß die zweite Bindungskomponente ein B7 Protein oder ein Teil davon ist.
7. Bindungsreagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil von B7 nicht die Membran-gebundene Domäne umfaßt.
8. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Effektorzelle eine T-Zelle ist.
9. Bindungsreagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das kosti- mulatorisch wirkende Molekül ein CD2-, CD3-, CD1 9-, CD20-, CD22-,
CD26-, CD28-, oder CTLA-4-Rezeptor oder HSA ist.
10. Bindungsreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Bindungskomponenten über einen Komplex miteinander ver¬ bunden sind.
1 1 . Bindungsreagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex aus Streptavidin (Avidin) und Biotin besteht.
1 2. Bindungsreagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex aus S-Protein und S-Peptid besteht.
1 3. Verfahren zur Herstellung eines Bindungsreagens nach Anspruch 1 , um¬ fassend die folgenden Schritte:
(a) Insertion einer eine erste Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres¬ sionsprodukts und seine Reinigung,
(b) Insertion einer eine zweite Bindungskomponente codierenden DNA in einen Expressionsvektor, Expression der DNA, Isolierung des Expres¬ sionsprodukts und seine Reinigung, und
(c) Kopplung des Expressionsprodukts von (a) mit jenem von (b) in übli¬ cher Weise
14. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine erste Bin¬ dungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
1 5. Expressionsplasmid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 1 ist. 16. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine eine zweite Bindungskomponente des Bindungsreagens nach Anspruch 1 codierende DNA in einer Expressionseinheit enthält.
17. Expressionsplasmid nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß es jenes von Fig. 2 ist.
18. Vakzine mit inaktivierten Zellen, wobei an ein Zell-Oberflächenprotein ein oder mehrere Bindungsreagentien nach Anspruch 1 gebunden sind.
1 9. Vakzine nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Tumor¬ zellen sind.
20. Vakzine nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus durch Operation entfernten Tumoren stammen.
21 . Vakzine nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen aus einer etablierten Zellinie stammen.
22. Vakzine nach einem der Ansprüche 1 8 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Oberflächenprotein ein Antikörper ist.
23. Vakzine nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen Hapten 2-phenyloxazol-5-on gerichtet ist.
24. Vakzine nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Virus-modifiziert sind.
25. Vakzine nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Newcastle Disease Virus ist.
26. Vakzine nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Ober¬ flächenprotein das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül ist. IN ARTIKEL 19 GENANNTE ERKLÄRUNG
Als Stand der Technik werden die folgenden Druckschriften genannt:
D1 : Critical Reviews in Immunology, Bd. 12, Nr. 3,4, 1992, Seiten 101 -124
D2: Onkologie, Bd. 1 6, Nr. 5, 1 993, Seiten 290-296
D3: Cancer Research, Bd. 53, Nr. 18, 1 993, Seiten 4310-4314
D4: Blood, Bd. 82, Nr. 6, 1993, Seiten 1 803-1812
D5: International Journal of Cancer, Bd. 50, Nr. 5, 1 992, Seiten 800-804
D6: European Journal of immunology, Bd. 23, Nr. 10, 1993, Seiten 2592-2596
D7: EP-A-0 610 046
Gegenüber dem im Recherchenbericht genannten Stand der Technik sind die
Gegenstände der vorliegenden Anmeldung neu und erfinderisch.
In keiner der Entgegenhaltungen D1 -D8 ist ein Bindungsreagenz, das eine erste Bindungskomponente für das Hämaglutinin-Neuraminidase-Molekül des Newcastle Disease Virus oder für einen Antikörper, der gegen das Hapten 2-phenyloxazol-5- on gerichtet ist, und eine zweite Bindungskomponente für ein kostimulatorisch wirkendes Molekül einer Effektorzelle aufweist, gezeigt bzw. nahegelegt.
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