JPH09506639A - 哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送ならびにウィルス複製を阻害する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベース(nucleobase)輸送を阻害する方法、並びに、ウィルス複製の阻害、およびヌクレオシド・アナローグのリン酸化を増強する方法を開示し、ここで、各方法は、有効成分としてカルボスチリル誘導体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベース 輸送ならびにウィルス複製を阻害する方法 関連出願に対するクロス・リファレンス 本願は、１９９４年８月１日に出願された米国特許出願第０８／２８３，７０ ７号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベース(nucleobase) 輸送を阻害する方法、ならびに、ウィルス複製の阻害、およびヌクレオシド・ア ナローグのリン酸化を増強する方法に関し、ここで、各方法は、有効成分として カルボスチリル誘導体を使用する。 発明の背景 Ｉ．カルボスチリル類 下記の一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級ア ルコキシ基を有しても良いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および ４位の炭素−炭素結合は単結合または二重結合である］ で示されるカルボスチリル誘導体、およびその塩は、当分野で周知である（米国 特許第４，４１５，５７２号、これは、その全体が引用により組込まれる）。 これらのカルボスチリル類は、モデル系において、心拍数や心筋の酸素消費に ほとんど影響を与えることなく、心筋の収縮性を増強する経口的な変力剤(inotr opic agent)であることが見い出され（フェルドマン(Feldman)ら、N．Engl．J．Med .、329:149-155(1993)）、うっ血性心不全の患者の治療に有効である（米国 特許第４，４１５，５７２号；およびホリ(Hori)ら、Jpn．Circ．J.、50:659-66 6 (1986)）。幾つかの研究は、上述のカルボスチリル類が、うっ血性心不全患者 において、血行動態指数および運動能力を改善することを実証した（イノウエ(I noue)ら、Heart Vessels、2:166-171(1986)；ササヤマ(Sasayama)ら、Heart Ves sels 、2:23-28(1986)；およびフェルドマンら、Am．Heart J.、116:771-777(198 8)）。さらに、日本および米国の両国におけるマルチセンター・ランダム化プラ シーボ統制試験(placebo-controlled trials)は、これらのカルボスチリル類が 、うっ血性心不 全の患者の生活の質と死のリスクの低下の両方を改善する、ことを実証した（OP C-8212 マルチセンター・リサーチ・グループ、Cardiovasc．Drugs Ther.、4:41 9-425(1990)；フェルドマンら、Am．J．Cardiol.、68:1203-1210(1991)；および フェルドマンら、N．Engl．J．Med.、329:149-155(1993)）。 これらのカルボスチリル類の変力特性に関連する作用のメカニズムは、カリウ ム電流(potassium current)の低下（イイジマ(Iijima)ら、J．Pharmacol．Exp．Ther .、240:657-662(1987)）、ホスホジエステラーゼの穏やかな阻害、および内 方へのカルシウム電流(inward calcium current)の増加を含む（ヤタニ(Yatani) ら、J．Cardiovasc．Pharmacol.、13:812-819(1989)；およびタイラ(Taira)ら、Arzneimittelforschung 、34:347-355(1984)）。しかしながら、死亡率を減少さ せるのに最も有効であったカルボスチリル類の用量（１日当り、６０ｍｇ）は、 血行動態効果を全くまたは殆ど示さず、該薬剤が、その正の変力効果よりも他の メカニズムにより、死亡率を減少させるかもしれない、ことを示唆している（フ ェルドマンら、N．Engl．J．Med.、329:149-155(1993)；およびパッカー(Packer )、N．Engl．J．Med.、329:201-202(1993)）。 上述のカルボスチリル類はまた、リポポリサッカライドで刺激された末梢血単 核細胞（ＰＢＭＣ）による、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含む種々のサイトカイ ンの産生を、用量に依存して(dose-dependent)阻害することが公知である（マル ヤマ(Maruyama)ら、Biochem．Biophys．Res．Commu.、195:1264-1271(1993)；お よびマツモリ(Matsumori)ら、Circul.、89:955-958(1994)）。 さらに、それらは、ＣＦＵ−Ｃの減少に関連する、可逆的好中球減少を誘導す ることができる（フェルドマンら、Am．Heart J.、116:771-777(1988)；OPC-821 2 マルチセンター・リサーチ・グループ、Cardiovasc．Drugs，Ther.、4:419-42 5(1990)；フェルドマンら、Am．J．Cardiol.、68:1203-1210(1991)；およびフェ ルドマンら、N．Engl．J．Med.、329:149-155(1993)）。 加えて、上述のカルボスチリル類は、アポトーシス（プログラムされた細胞死 ）の調節において、並びに癌の治療、腫瘍転移の阻害およびＲＮＡウィルス複製 の阻害において有効であることが見い出された（１９９３年４月３０日に出願さ れた米国特許出願第０７／９８９，０２８号、該出願はヨーロッパ特許公開第０ ５５２３７３号に対応する。その各々が全体として引用によりこの中に組込まれ る；ナカイ(Nakai)ら、Jpn．J．Cancer Re s .、Abstract、および Proc．Jpn．Cancer Assoc.、581ページ(1993)；およびマ ルヤマら、Biochem．Biophys．Res．Comm.、195:1264-1271(1993)）。 これらのカルボスチリル類、特に物質(species)、３，４−ジヒドロ−６−［ ４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キ ノリン（以下、「ベスナリノン(vesnarinone)」と称する）が、哺乳動物細胞内 のヌクレオシドおよびヌクレオベースの輸送を阻害することは、これらの化合物 が、ヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送を阻害する公知の化合物の構造と全 く異なっているので、本発明の驚くべき発見であった。 II．エプスタイン−バーウィルス エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）、ヒトリンパ栄養性ヘルペス群ＤＮＡ ウィルスは、ヒトＢリンパ球に感染し、種々のリンパ球増多性疾患に関連する（ ミラー(Miller)ら、Virol.、第２版、1921-1958ページ(1990)）。ＥＢＶの再活 性化(reactivation)が、Ｂ細胞介在性自己免疫の発生に関連するかもしれないこ とを示す幾つかの報告がある（フォックス(Fox)、J．Virol．Methods、21:19-27 (1988)；フォックスら、Springer Semin．Immunopathol.、13:217-231(1991)； ログテンバーグ(Logten berg)ら、Immunol．Rev.、128:23-47(1992)）。 ＥＢＶは、インビボおよびインビトロで、Ｂリンパ球中に、潜伏感染として維 持される。その潜伏形態において、ＥＢＶゲノムは、環状エピソームの(episoma l)形態で存在し、遺伝子発現は比較的制限される（サンプル(Sample)ら、J．Vir ol .、64:1667-1974 (1990)）。インビトロでは、潜伏遺伝子の発現は、不死化(i mmortalization)および、少なくとも部分的にｂｃｌ−２遺伝子発現の上向き調 節(up-regulation)に関係するアポトーシスに対する宿主細胞の耐性と関連する （ヘンダーソン(Henderson)ら、Cell、65:1107-1115(1991)；およびグレゴリー( Gregory)ら、Nature、349:612-614(1991)）。潜伏期におけるＥＢＶゲノムの複 製は、宿主細胞のポリメラーゼにより制御され、宿主細胞周期の厳密にＳ期(S-p hase)の間に起こる（アダムス(Adams)、J．Virol.、61:1743-1746(1987)）。 ホルボールエステル類、ｎ−ブチラート、ハロゲン化ピリミジン類、カルシウ ムイオノフォア類、および抗イムノグロブリン(Ig)抗体を含む種々の試薬は、潜 伏感染されたＢリンパ球において、溶解性または増殖性のＥＢＶ複製期への転換 (switch)を開始できる（トヴェイ(Tovey)ら、Nature、276:270-272(1978)；ガー バー(Gerber)、Proc ．Natl．Acad．USA、69:83-85(1972)；ファギオニ(Faggioni)ら、Science、232 :1554-1556(1986)；タカダ(Takada)、Int．J．Cancer、33:27-32(1984)；お よびタカギ(Takagi)ら、Virol.、185:309-315(1991)）。多数の感染性ＥＢＶビ リオンが産生される、増殖期におけるＥＢＶゲノムの複製は、宿主細胞のＤＮＡ 複製から独立しているが、細胞内デオキシヌクレオベース・プールの変化により 影響され得る（ダッタ(Datta)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77: 5163-5166 (1980)）。臨床病理的に、ＥＢＶサイクルの増殖期に入ることは、インビボでの ＥＢＶ感染の再活性化に重要な役割を果たすことを意味する。 上述のカルボスチリル類、特にベスナリノンが、ＥＢＶモデル系におけるデー タおよびＣＭＶモデルにおけるデータから証明されるように、ＤＮＡウィルス複 製の阻害に有用であり、抗ＤＮＡウィルス化合物と共に使用されると、相乗効果 を奏することは、本発明の驚くべき発見であった。 III．ヌクレオシド・アナローグのリン酸化の増強 驚くべきことに、上述のカルボスチリル類、特にベスナリノンが、ＡＺＴでは なくチミジンの輸送を阻害し、ヌクレオシド・アナローグ特にＡＺＴのリン酸化 を増強 するのに有用であり、またＨＩＶモデル系におけるデータにより証明されるよう に、抗ＲＮＡウィルス化合物と共に使用されると、ＲＮＡウィルス複製の阻害に おいて相乗効果を示すことが、本発明において見い出された。 発明の概要 本発明の目的は、哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベースの輸送 (transport)を阻害する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、ＤＮＡウィルス複製を阻害する方法を提供することであ る。 本発明のさらなる目的は、ＥＢＶ感染の治療方法を提供することである。 本発明のまたさらなる目的は、ＣＭＶ感染の治療方法を提供することである。 本発明の追加的な目的は、ヌクレオシド・アナローグのリン酸化を増強する方 法を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、ＲＮＡウィルス複製を阻害する方法を提供するこ とである。 本発明のまたさらなる目的は、ＨＩＶ感染の治療方法を提供することである。 本発明のこれらおよび他の目的は、この後に示す本発明の詳細な説明で明らか になるが、下記の一般式（１） ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、およびその塩 、の使用により達成された。 図面の簡単な説明 図１Ａ−１Ｂは、０〜２５０μＭ ベスナリノンの存在下（図１Ａ）；並びに 、ＲＰＭＩ １６４０培地の存在下、あらゆる薬剤の非存在下、ＨＥＰＥＳ緩衝 液の存在下、および１００μＭ デフェロキサミン(deferoxamine)または１５ｎ Ｍ アフィジコリン(aphidicolin)の存在下（図１Ｂ）に、１０μｇ／ｍｌ Ｐ ＨＡで４８時間刺激されたヒトＴ細胞による［³Ｈ］チミジン取込みを示す。図 １Ｃは、ヒトＴ細胞が、ＲＰＭＩ １６４０培地の存在下、あらゆる薬剤の非存 在下（○）、ＨＥＰＥＳ 緩衝液（□）、２５０μＭ ベスナリノン（■）、１００μＭ デフェロキサミ ン（△）または１５ｎＭ アフィジコリン（▲）の存在下に、０〜１２０時間、 １０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（●）で刺激された後の、細胞数を示す。 図２Ａ−２Ｆは、ＲＰＭＩ １６４０培地（図２Ａ）；１０μｇ／ｍｌ ＰＨ Ａ（図２Ｂ）；ＨＥＰＥＳ緩衝液の存在下での、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（図２ Ｃ）；２５０μＭ ベスナリノン存在下での、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（図２Ｄ ）；１５ｎＭ アフィジコリンの存在下での、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（図２Ｄ ）；または、１００μＭ デフェロキサミン存在下での、１０μｇ／ｍｌ ＰＨ Ａ（図２Ｆ）により、ヒトＴ細胞が０〜１２０時間刺激された後に測定された、 蛍光強度により測定したときの、細胞ＤＮＡ含量を示す。 図３は、２５０μＭ ベスナリノン、１００μＭ デフェロキサミンまたは１ ５ｎＭ アフィジコリンの存在下、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡで４８時間刺激され たヒトＴ細胞による［³Ｈ］チミジン、［³Ｈ］ウリジンおよび［³Ｈ］アミノ酸 の取込みを示す。 図４は、２５０μＭ ベスナリノン、１００μＭ デフェロキサミン、１５ｎ Ｍ アフィジコリンまたは１． ０μＭ ジピリダモール(dipyridamole)の存在下、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡで４ ８時間刺激されたヒトＴ細胞における、［³Ｈ］ヌクレオシドまたは［³Ｈ］ヌク レオベース輸送に対する効果を示す。 図５Ａ−５Ｄは、Ｒａｊｉ細胞（図５Ａ）またはＣＨＯ細胞（図５Ｃ）におけ る、［³Ｈ］アデノシン（○）または［³Ｈ］アデニン（●）の輸送に対する、０ 〜７５０μＭ ベスナリノンの用量依存性効果；およびＲａｊｉ細胞（図５Ｂ） またはＣＨＯ細胞（図５Ｄ）における、［³Ｈ］アデノシン（○）または［³Ｈ］ アデニン（●）の輸送に対する、０〜１００μＭ ジピリダモールの用量依存性 効果を示す。 図６Ａ−６Ｂは、０〜２５０μＭ ベスナリノン（図６Ａ）；または１〜１０ μＭ ジピリダモール（図６Ｂ）の存在下、ＣＨＯ細胞を５０ｎＭ ５−Ｆｕｄ と共にインキュベーションした１２０時間後に、カウントした細胞数を示す。 図７は、０〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲のベスナリノンの存在下、５０μｇ ／ｍｌの抗ＩｇＧ抗体で刺激され、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で測定され るＺＥＢＲＡを発現する、ＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ細胞(DMSO-released Akata cells)の実際のパーセンテージ、 およびin situ ハイブリダイゼーションで測定されるＥＢＶ ＤＮＡ陽性の細胞 数、を示す。 図８Ａ−８Ｄは、ベスナリノンの非存在下（−）または３０μｇ／ｍｌの濃度 のベスナリノンの存在下（＋）での、５０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ抗体で刺激され たＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ細胞からの、ライゼートのウェスタン・ブロ ットを示す。ＢＺＬＦ１の産物（ＺＥＢＲＡ）（図８Ａ）；ＢＲＬＦ１の産物（ Ｒ）（図８Ｂ）；ＢＨＲＦ１の産物（ＥＡ−Ｒ）（図８Ｃ）；ＢＭＲＦ１の産物 （ＥＡ−Ｄ）（図８Ｄ）が、抗ＩｇＧで刺激した３時間後および２０時間後に収 集された細胞からのライゼートをウェスタン・ブロットすることによりアッセイ された。 図９Ａ−９Ｆは、０〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲のベスナリノンの存在下、 ５０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧで２０時間刺激されたＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔ ａ細胞の、フローサイトメトリー分析を示す。コントロールは、抗ＩｇＧ刺激な しのサンプルの結果を示す。Ｇ１ポピュレーションのＤＮＡ含量に対応する２Ｃ ピークは、チャンネル数７５〜１００付近に現れる。 図１０Ａ−１０Ｄは、１０⁶個の対数的に増殖するＤＭＳＯ−抑止されたＡｋ ａｔａ細胞(DMSO-arrested Akata cells)から６０％（ｖ／ｖ）エタノールで抽出し、該Ａｋａｔａ細胞は、ベスナ リノンも抗ＩｇＧ刺激もなく（○）、若しくはＩｇＧ刺激を加えて（□）ＤＭＳ Ｏ−解除されてから１３時間後および２１時間後にアッセイされ、並びに該Ａｋ ａｔａ細胞は、１００μｇ／ｍｌベスナリノンとともに抗ＩｇＧ刺激なしに（◇ ）若しくは抗ＩｇＧ刺激とともに（×）、ＤＭＳＯ−解除されてから１３時間後 および２１時間後にアッセイされたものであり、酵素的方法により定量したｄＮ ＴＰのｐｍｏｌｅを示す。 図１１は、対数的に増殖するＡｋａｔａ細胞の頻度を示し、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノンを含む培地で７日間培養し（前処理）、２０μｇ／ｍｌ ベスナリ ノン存在下（＋）または非存在下（−）に５０μｇ／ｍｌ 抗ＩｇＧで刺激した ２４時間後にin situ ハイブリダイゼーションにより測定した、ＥＢＶの増殖的 複製を実証している。さらに、その後で、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノンを含む （後処理＋）、若しくは含まない（後処理−）新鮮な培地に再懸濁され、続いて ５０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧで刺激した細胞を示す。結果を、ベスナリノン非処理 細胞中の値に対するパーセンテージとして示す。 図１２Ａ−１２Ｃは、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノン の非存在下（−）または存在下（＋）に７日間培養した、４つの異なるバーキッ トリンパ腫細胞系、即ち、Ａｋａｔａ、Ｐ３ＨＲ１、Ｊｉｊｏｙｅ、およびＲａ ｊｉからのライゼートのウィスタン・ブロットを示す。２つのＥＢＶの潜伏遺伝 子産物、ＥＢＮＡ２（図１２Ａ）およびＬＭＰ１（図１２Ｂ）、並びに１つの宿 主遺伝子産物、ｂｃｌ−２（図１２Ｃ）について評価した。 図１３Ａ−１３Ｂは、１００μｇ／ｍｌ ベスナリノン存在下（＋）または非 存在下（−）に、５０μｇ／ｍｌ 抗ＩｇＧ抗体の非存在下（−）または存在下 （＋）で１３時間刺激した、ＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ細胞からの抽出物 のチミジンキナーゼ・アッセイを示す。全チミジンキナーゼ活性を、ｄＴＴＰの 非存在下で測定した（図１３Ａ）。ｄＴＴＰ耐性チミジンキナーゼ活性を測定す るために、１００μＭ ｄＴＴＰをキナーゼ反応混合物に加えた（図１３Ｂ）。 図１４Ａおよび１４Ｂは、ＣＨＯ細胞（図１４Ａ）並びにヒト一次(primary) Ｔリンパ球（図１４Ｂ）中における、ベスナリノンによる用量依存性様式の、Ａ ＺＴではなく［³Ｈ］チミジンの取込み阻害を示す。 図１５Ａは、染色体の破片(debris)を取り除いた後の、ＰＨＡ活性化およびリ ンパ球の細胞抽出物中のリン酸化 ［³Ｈ］チミジンの蓄積を、ベスナリノンが遅延させることを示し；また図１５ Ｂは、ＰＨＡ活性化ヒトＴリンパ球中のＡＺＴのリン酸化を、ベスナリノンが増 強することを示す。 図１６Ａは、細胞中でトリホスフェート・レベルまで、チミジンが効果的にリ ン酸化されることを示す。図１６Ｂは、ＡＺＴが、ＡＺＴ−ＭＰまでリン酸化さ れるが、この段階を超えてジホスフェート形態までは少ししかリン酸化されない ことを示す。 図１７は、７５μＭの濃度（３０μｇ／ｍｌ）のベスナリノンが、細胞内ＡＺ Ｔ−ＭＰ、ＡＺＴ−ＤＰ、およびＡＺＴ−ＭＰをそれぞれ、１００％、４５％お よび２５％増加させたことを示す。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ベスナリノン（図１８Ａ）とジピリダモール（図１ ８Ｂ）が共に、チミジン取込みを用量依存性様式で阻害し；ジピリダモールが、 ベスナリノンよりもヌクレオシド輸送のより強力な阻害剤であり；チミジン取込 みに関するＩＣ₅₀が、ジピリダモールで１０ｎＭ未満、ベスナリノンで約２５μ Ｍであった、ことを示す。 図１９Ａは、ベスナリノンが、Ｕ９３７細胞中のリン酸化ＡＺＴ濃度を、用量 依存性様式で増加させることを 示す。図１９Ｂは、０〜２５０μＭ ベスナリノンと同程度にチミジン輸送を阻 害する０〜１００ｎＭ ジピリダモールが、リン酸化ＡＺＴの細胞内濃度に影響 しない、ことを示す。 図２０Ａは、種々の濃度のベスナリノンおよび／またはＡＺＴの存在下あるい は非存在下に、ＡＺＴ感受性ＨＩＶ株１８ａに感染したＰＢＭＣによる、ＨＩＶ −１ｐ２４抗原の産生を示す。図２０Ｂは、種々の濃度のベスナリノンおよび／ またはＡＺＴの存在下あるいは非存在下に、ＡＺＴ耐性ＨＩＶ株１８ｃに感染し たＰＢＭＣによる、ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の産生を示す。 発明の詳細な説明 一般式（１）において、フェニル環に低級アルコキシ基および置換基を有して も良いベンゾイル基には、フェニル環を置換する１〜３個の直鎖状または分岐状 Ｃ_1-6アルコキシ基を有するベンゾイル基、例えば、ベンゾイル、２−メトキシ ベンゾイル、３−メトキシベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、２−エトキシ ベンゾイル、３−エトキシベンゾイル、４−エトキシベンゾイル、４−イソブト キシベンゾイル、４−ヘキシロキシベンゾイル(4-hexloxybenzoyl)、３，４−ジ メトキシベンゾイル、３，４−ジエトキシベンゾイル、３，４，５−トリメトキ シ ベンゾイル、２，５−ジメトキシベンゾイル等が含まれる。 本発明による有効成分化合物（１）の中で、３，４−ジヒドロ−６−［４−（ ３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリン 、即ち、ベスナリノンが、最も好ましい。 前記カルボスチリル類は、慣用されている酸と容易に塩を形成する。そのよう な酸として、無機酸、例えば、硫酸、硝酸、塩酸および臭化水素酸；および有機 酸、例えば、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、エタンスルホン酸(ethanesulfoni c acid)、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸および安息香 酸が言及され得る。これらの塩はまた、一般式（１）の遊離化合物がまさにそう であり得るように、本発明において、有効成分として使用されることもできる。 一般式（１）の化合物およびそれらの塩は、一般に、それ自身、慣用されてい る薬学的製剤に製剤化されることができる。そのような製剤は、慣用されている 充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、および希釈剤 または賦形剤を用いて調製される。これらの薬学的製剤は、治療の目的に従って 選択される種々の投与形態を有しても良く、それらの代表的例は、錠剤、 丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（溶液、 懸濁液など）、および眼科用液剤である。 錠剤の製造のために、この分野でこれまでに周知の広範囲の担体が使用され得 る。従って、その使用は、例えば、ビヒクルまたは賦形剤、例えば、ラクトース 、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム 、カオリン、結晶セルロースおよびケイ酸；結合剤、例えば、水、エタノール、 プロパノール、単シロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カ ルボキシメチルセルロース、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウムお よびポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリ ウム、粉末カンテン、粉末ラミナラン(laminaran)、炭酸水素ナトリウム、炭酸 カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナト リウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプンおよびラクトース；崩壊阻害剤 、例えば、スクロース、ステアリン、カカオ脂および水素添加油；吸収促進剤、 例えば、第４級アンモニウム塩基およびラウリル硫酸ナトリウム；湿潤剤または 保湿剤、例えば、グリセロールおよびデンプン；吸着剤、例えば、デンプン、ラ クトース、カオリン、 ベントナイトおよびコロイドシリカ；および滑沢剤、例えば、精製タルク、ステ アリン酸塩、粉末ホウ酸およびポリエチレングリコール、から成り得る。必要な 場合には、錠剤はさらに、慣用されているコーティングを備えることができ、例 えば、糖衣錠、ゼラチンをコートした錠剤、腸溶錠、フィルムコーティング錠、 または二重コート若しくは多層錠を与える。 丸剤の製造のために、当分野で周知の広範囲の担体が使用され得る。その例は 、ビヒクルまたは賦形剤、例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオ 脂、硬化植物油、カオリンおよびタルク；結合剤、例えば、粉末アラビアゴム、 粉末トラガントゴム、ゼラチンおよびエタノール；および崩壊剤、例えば、ラミ ナランおよびカンテンである。 坐剤の製造のために、当分野で周知の広範囲の担体が使用され得る。例として 、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール類、高級アルコールエス テル類、ゼラチンおよび半合成グリセリド類が言及され得る。 注射剤の調製において、液剤または懸濁剤が好ましくは滅菌され、好ましくは 血液と等張であり、そのような投与形態を調製するために、当分野で慣用的に使 用されている全ての希釈剤が使用され得る。従って、例えば、 水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化(ethoxylated)イソ ステアリルアルコール、ポリオキシ化(polyoxylated)イソステアリルアルコール およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが言及され得る。この場合 、薬学的製剤は、塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセロールを、等張液を 与えるのに十分な量で、含んで良い。慣用されている溶解補助剤、緩衝液、無痛 化剤または局所麻酔薬、などを加えることができる。 さらに、必要な場合、薬学的製剤は、着色料、保存剤、香料、矯味剤、甘味剤 など、並びに他の薬剤を含んで良い。 本発明で使用するための、これらの薬学的製剤中の有効成分化合物の割合は、 重要ではなく、広い範囲から好適に選択されて良い。しかしながら、一般に、そ の割合は、約１．０〜約７０重量％、好ましくは約１．０〜約３０重量％の範囲 内で、推奨的に選択される。 本発明の薬学的製剤の投与経路も、重要ではないが、投与形態、患者の年齢、 性別および他の要因、並びに治療されるべき疾患の重篤度に従って選択される。 従って、例えば、それらが、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤またはカ プセル剤の形態で与えられるとき、製剤 は経口的に投与される。注射可能な溶液は、単独でまたは、グルコース、アミノ 酸などを含む非経口的注入のために慣用されている液体と混合して、経静脈的に 投与される。必要な場合には、これらの液剤はまた、筋肉内、皮内、皮下または 腹腔内経路により同様に投与されても良い。坐剤は、直腸に投与され、眼科用液 剤は、眼のための滴剤ローションである。 前記薬学的製剤の投与量は、投与の方法、患者の年齢、性別および他の背景要 因、疾病の重篤度などに依存するが、一般に、有効成分すなわち化合物（１）と して、１日当り体重キログラム当り、約０．５〜３０ｍｇ投与することが推奨さ れる。各投与量単位に含まれる有効成分の量は、約１０〜１０００ｍｇである。剤形例１ ３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベ ンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリ ン １５０ ｇ アヴィセル(Avicel) （商標、旭化成工業株式会社） ４０ ｇ コーンスターチ ３０ ｇ ステアリン酸マグネシウム ２ ｇ ヒドロキシプロピルメチルセルロース １０ ｇ ポリエチレングリコール６０００ ３ ｇ ひまし油 ４０ ｇ メタノール ４０ ｇ 上記の有効成分、アヴィセル、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウ ムを、混合し、共にすりつぶし、得られた混合物をドラギィ(dragee)Ｒ１０ ｍ ｍパンチで圧縮成形する。このようにして得た錠剤を、ヒドロキシプロピルメチ ルセルロース、ポリエチレングリコール６０００、ひまし油およびメタノールか らなるフィルムコーティング組成物でコートして、フィルムコーティング錠とす る。剤形例２ ３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメトキシベ ンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリ ン １５０ ｇ クエン酸 １ ｇ ラクトース ３３．５ ｇ ジカルシウムホスフェート(Dicalcium phosphate) ７０ ｇ プルロニックＦ−６８(Pluronic F-68) ３０ ｇ ラウリル硫酸ナトリウム １５ ｇ ポリビニルピロリドン １５ ｇ ポリエチレングリコール （カルボワックス１５００(Carbowax 1500)） ４．５ ｇ ポリエチレングリコール （カルボワックス６０００(Carbowax 6000)） ４５ ｇ コーンスターチ ３０ ｇ 乾燥ラウリル硫酸ナトリウム ３ ｇ 乾燥ステアリン酸マグネシウム ３ ｇ エタノール 十分な量 上述の有効成分、クエン酸、ラクトース、ジカルシウムホスフェート、プルロ ニックＦ−６８およびラウリル硫酸ナトリウムを混合する。 Ｎｏ．６０ふるいを用いてサイズ選別をした後、混合物を、ポリビニルピロリ ドン、カルボワックス１５００およびカルボワックス６０００を含むアルコール 溶液を用いて、湿式法(wet process)により顆粒化した。必要な場合、アルコー ルを加えて、粉末をペースト状の塊にする。次に、コーンスターチを加えて、均 一な顆粒が形成されるまで混合を続ける。続いて、混合物を、Ｎｏ．１０ふるい に通し、トレイに置いて、オーブン中で１００℃に１２〜１４時間維持して乾燥 する。乾燥した顆粒を、Ｎｏ．１６ふるいで篩過し、次に乾燥ラウリル硫酸ナト リウムおよび乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、混 合した後、錠剤機を用いて、混合物を所望のサイズと形状に圧縮する。 上記のコアを、水分吸収を防ぐために、ニス剤で処理し、タルクを振りかけ、 その後、アンダーコート層を作る。内服用に十分であるように、ニス剤コーティ ングを多数回繰り返す。さらにアンダーコート層とスムーズコーティングを適用 することにより、錠剤を完全に丸く滑らかにする。着色コーティングは、所望の 着色が得られるまで行う。乾燥した後、コーティングされた錠剤をつやだしして 、均一に光沢した錠剤を得る。 その複製が本発明で阻害され得るＤＮＡウィルスは：単純ヘルペスウィルス１ 型および２型、ヒトヘルペスウィルス６型、帯状疱疹ウィルス、ヒトサイトメガ ロウィルスおよびＥＢＶを含む。ＥＢＶは、その複製が本発明で阻害され得る、 好ましいＤＮＡウィルスである。 従って、上述のカルボスチリル類は、慢性ＥＢＶ感染に関わる疾患、例えば、 慢性疲労症候群(chronic fatigue syndrome)および慢性伝染性単核症；ＥＢＶ関 連リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、 上咽頭癌およびホジキン病；またはＥＢＶ誘導リンパ球増多(lymphoproliferati ve)；またはＥＢＶ関連自己免疫疾患、例えば、シェーグレン症候群の 治療に有用である。 さらに、ＤＮＡウィルス複製を阻害する方法、特にＥＢＶ感染を治療する方法 において、本発明のカルボスチリル類は、他の公知の抗ＤＮＡウィルス化合物、 特に、他の公知の市販されている抗ＥＢＶ化合物、例えば、アシクロビア(Acycl ovir)（９−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］グアニン）（バローズ・ウ ェルカム(Burroughs Wellcome)）；およびガンシクロビア・ナトリウム(Gancicl ovir sodium)９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニン（ ＤＨＰＧ）（シンテックス(Syntex)）と組み合わせて、使用されることができる 。この様にして、公知の抗ＤＮＡウィルス化合物に慣用的に使用される投与量は 、減らすことができる。特定の投与量の抗ＤＮＡウィルス化合物。 その複製が本発明で阻害され得るＲＮＡウィルスは：ヒト免疫不全ウィルス（ ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病ウィルス、およびヒト免疫不全ウィルスII型を含む 。ＨＩＶは、その複製が本発明で阻害され得る、好ましいＲＮＡウィルスである 。 従って、上記のカルボスチリル類は、ＨＩＶ感染に関連する疾患、例えば、カ ポジ肉腫、血液病学的結果(hemologic consequences)、および自己免疫の治療に 有用で ある。 さらに、ウィルス複製を阻害する方法、特にＨＩＶ感染を治療する方法におい て、本発明のカルボスチリル類は、他の公知の抗ＲＮＡウィルス化合物、特に、 他の公知の市販されている抗ＨＩＶ化合物、例えば、ＡＺＴ（３’−アジド−３ ’−デオキシチミジン）（バローズ・ウェルカム）、ｄｄＣ（２’３’−ジデオ キシシチジン）（ホフマン・ラロシェ(Hoffmann LaRoche)）、ｄｄＩ（２’３’ −ジデオキシイノシン）（ビー．エム．スクィブ(B．M．-Squibb)）、ｄ４Ｔ（ ２’３’−ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジン）（ビー．エム．スクィ ブ）、３ＴＣ（５’３’−ジデオキシチアシチジン）（グラクソ(Glaxo)）と組 み合わせて、使用されることができる。この様にして、公知の抗ＲＮＡウィルス 化合物に慣用的に使用される投与量は、減らすことができる。 本発明のカルボスチリル類と併用投与されるとき、そのリン酸化が増強される 特定のヌクレオシド・アナローグは、限定されない。そのようなヌクレオシド・ アナローグの例には、先に挙げた抗ＤＮＡウィルス化合物および抗ＲＮＡウィル ス化合物、特にＡＺＴが含まれる。 下記の実施例は、説明のみを目的として記載するもので、本発明の範囲の制限 を決して意図しない。 実施例１ Ａ．ベスナリノンは薬剤添加後直ちにヌクレオシド取込みをブロックする ベスナリノンは、テストされた細胞タイプに依存して、穏やかな細胞増殖抑制 性の作用を有することが報告された（ナカイら、Jpn．J．Cancer Res.、Abstrac t、Proc．Jpn．Cancer Assoc.、581ページ(1993)）。従って、ベスナリノンの作 用のメカニズムを調べるために、細胞中へのヌクレオシドまたはヌクレオベース の輸送を、アロノウ(Aronow)ら、J．Biol．Chem.、260:16274-16278(1985)に記 載されるように測定した。 より詳細には、ヒト一次(primary)Ｔ細胞を、健康なドナーの白血球搬出法(le ukopheresis)によって末梢血から分離した。単核細胞の懸濁液を、フィコール・ ハイパック比重差遠心により調製し、Ｔ細胞を、クマガイ(Kumagai)ら、J．Cell ．Physiol.、137:329(1988)に記載されるようにＥロゼット精製(enrichment)に より得た。得られたＴ細胞を、コントロールとして、あらゆる薬剤の非存在下（ 「ＰＨＡ」として示す）およびＨＥＰＥＳ緩衝液の存在下（「ビヒクル」として 示す）、あるいは、上述のように調製された０〜２５０μＭ ベスナリノンの存 在下に、１０μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン（Ｐ ＨＡ）で４８時間刺激した。 １０ｍｇのベスナリノンを、０．５ｍｌの２．０ＮＨＣｌに溶解した。溶液を 、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５５）を補足した９．０ｍｌのＲＰＭ Ｉ １６４０培地に加え、２．０Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨ７．０に中和した 。１．０ｍｇ／ｍｌのベスナリノンを含む、得られた中和されたベスナリノン溶 液を、０．４５μｍミリポア(Millipore)フィルターを用いて直ちに Ｍのベスナリノン）。 次に、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ハイクロ ーン、ローガン、ユタ州）、２．０ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ(GIBCO)）、 １００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（ギ ブコ）を補足され、および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク州）に再懸濁し、 ３７℃にて２０分間インキュベートした。 続いて、１．０μＣｉの［³Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ＩＣＮ ）を、２．０×１０⁶個の細胞（１００μｌ）に加え、細胞を６時間パルス標識 した。次に、混合物を、マイクロフュージ管(microfuge tube)中の、 シリコンオイル／パラフィンオイル（９４：６）上に、直ちに重層し(layered) 、１４，０００ｒｐｍで１分間スピンして、細胞を、水相中の遊離［³Ｈ］基質 から分離した。 水相と油相を捨て、細胞ペレット中の放射能を、液体シンチレーションカウン ティングを用いて測定した。結果を、図１Ａに示す。 図１Ａに示されるように、ベスナリノンは、ＤＮＡ中への［³Ｈ］チミジン取 込みを、用量依存性様式で阻害する。 次に、１５μＭ アフィジコリンおよび１００μＭデフェロキサミンを得て、 テラダ(Terada)ら、J．Immunol.、147:698-704(1991)に記載のように利用した。 結果を、図１Ｂに示す。 図１Ｂに示すように、ＤＮＡポリメラーゼα／δを阻害するアフィジコリン、 またはリボヌクレオベース・レダクターゼを阻害するデフェロキサミンの添加も 、［³Ｈ］チミジン取込みを阻害した。 次に、上述の薬剤の細胞増殖に対する効果を、１２０時間かけて評価した。よ り詳細には、２５０μＭ ベスナリノン、１５ｎＭ アフィジコリンまたは１０ ０μＭ デフェロキサミン、および１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡを 使用して、上記の実験を繰り返した。結果を、図１Ｃに示す。 図１Ｃに示されるように、高い用量のベスナリノン（２５０μＭ）は、コント ロールの培養物と比較すると、細胞増殖を阻害したが、にもかかわらず細胞数の 増加が観察された。対照的に、図１Ｃに示されるように、アフィジコリンまたは デフェロキサミンの存在下では、細胞数の増加は全く観察されなかった。再度、 ３つの全ての薬剤が、図１Ｂに示される用量で、同じ程度まで、［³Ｈ］チミジ ン取込みを阻害した。 次に、細胞ＤＮＡ含量を、０〜１２０時間の処置時間をかけて、評価した。よ り詳細には、上述と同じ方法で処理した１０⁶個のＴ細胞を、７０％（ｖ／ｖ） エタノールで４℃にて一晩固定し、遠心し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で 洗浄した。固定した細胞を、０．５ｍｌのＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌリボヌク レアーゼ（シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州）で、３７℃にて１０分 間インキュベートした。細胞懸濁液を、０．５ｍｌのＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌプ ロピジウムイオジド(propidium iodide)（カルビオケム(Calbiochem)、ラ・ジョ ラ、カリフォルニア州）溶液と混合し、６０分後、４８８ｎｍ励起で赤い蛍光（ ＞６００ｎｍ）を集める、フロ ーサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ Ｐｒｏｆｉｌｅ、コウルター(Coulter)、ハイ アリー、フロリダ州）で分析した。結果を、図２Ａ−２Ｆに示す。 図２Ａ−２Ｆに示されるように、細胞数の増加と一致して、細胞ＤＮＡ含量の モニターにより、ベスナリノンの存在下では４８時間以内に、特定の割合の細胞 が、細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期の両方に入るが、アフィジコリンまたはデ フェロキサミンの存在下では、そうならないことが判明した。［³Ｈ］チミジン 取込みは、実験を通して（１２０時間まで）、全ての時点で、同じ程度までベス ナリノンにより阻害され、後半の時点では、［³Ｈ］チミジン取込みの回復はな かった。従って、これらの結果は、ベスナリノンが、ＤＮＡ合成それ自身の阻害 以外のメカニズムにより、［³Ｈ］チミジン取込みを阻害するかもしれない、こ とを示唆する。 ［³Ｈ］チミジンおよび［³Ｈ］ウリジン取込みに対する、ベスナリノンの相互 作用をさらに評価するために、増殖細胞をベスナリノンに短時間曝す(exposure) 効果を調べた。 より詳細には、１０⁶個のＴ細胞を、２５０μＭ ベスナリノンまたは１５ｎ Ｍ アフィジコリンまたは１００μＭ デフェロキサミンの存在下、１０μｇ／ ｍｌ Ｐ ＨＡで４８時間刺激し、［³Ｈ］チミジンまたは［³Ｈ］ウリジン（３５．１Ｃｉ ／ｍｍｏｌｅ、ＩＣＮ）を３０分間のみ加え、上述のように細胞ペレットを得て 、評価した。結果を、図３に示す。 図３に示されるように、ベスナリノンおよびアフィジコリンは、これらの条件 下でも、［³Ｈ］チミジン取込みを阻害することができた。対照的に、図３に示 されるように、デフェロキサミンは部分的にのみ、［³Ｈ］チミジン取込みを阻 害し、これは、増殖細胞中のｄＮＴＰプールの増加が、ｄＮＴＰのさらなる供給 がなくても、ある一定の時間ＤＮＡ合成を維持するのに十分だからであろう。 さらに、図３に示されるように、ベスナリノンは、［³Ｈ］ウリジン取込みも 迅速に阻害した。これもまた、細胞のアクリジンオレンジ染色に続きフローサイ トメトリーで測定した、細胞ＲＮＡ含量に対する非常に小さい効果とは対照的で あった。アフィジコリンまたはデフェロキサミンは、［³Ｈ］ウリジン取込みを 阻害しなかった。 次に、ＰＨＡ刺激されたＴ細胞を、５．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］アミノ酸混 合物（１．０ｍＣｉ／ｍｌ、アマーシャム(Amersham)、アーリントンハイツ、イ リノイ州）で３０分間標識し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、続いて１． ０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むＰＢＳ中で溶解し、その後、７．０％（ｗ／ｖ）の トリクロロ酢酸と１．０％（ｗ／ｖ）のピロリン酸の混合物を添加した。沈殿物 を、ＧＦ／Ａフィルターにロードし、７．０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸と１ ．０％（ｗ／ｖ）のピロリン酸の混合物で大量に洗浄した。放射能を、シンチレ ーション・カウンティングにより測定した。この結果も、図３に示す。 図３に示されるように、ベスナリノンは、 ［³Ｈ］アミノ酸取込みを阻害し なかった。 従って、ベスナリノンによる、［³Ｈ］チミジンおよび［³Ｈ］ウリジン両方の 取込みの深く迅速な阻害は、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成に対する直接的効果によっ ては、説明されにくい。この不一致は、ベスナリノンが、細胞へのヌクレオシド 取込みを妨害するかもしれないことを示唆する。 Ｂ．ベスナリノンはヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送を阻害する ヌクレオシドは、細胞の原形質膜を透過し、ヌクレオベース合成のサルベージ 経路のソースとして利用される（コリー(Cory)、Biochemistry with Clinical C orrelation 中、13章、529-571 ページ(1992)；およびロッドウエル(Rodwell)、B iochemistry 中、36章、363-377ページ (1993)）。ヌクレオシドの哺乳動物細胞への輸送は、種々の特異性を有する単一 または複数の担体によって媒介されているように見える、促進拡散メカニズムに よって起こる（アロノウら、J．Biol．Chem.、261: 14467-14473(1986)）。この 担体モデルは、輸送に関するヌクレオシド間の競合的阻害を示す速度論的証拠と 、ヌクレオシド輸送能力に遺伝的に欠陥のある突然変異細胞での結果に基づいて いる（アロノウら、J．Biol．Chem.、261: 14467-14473(1986)；コーエン(Cohen )ら、J．Biol．Chem.、254:112-116(1979)；およびウルマン(Ullman)ら、Mol．C ell ．Biol.、3:1187-1196(1983)）。 哺乳動物細胞におけるヌクレオシド輸送の研究は、４−ニトロベンジル−６− チオイノシン（ＮＢＭＰＲ）、ジピリダモールおよびジラゼップ(dilazep)を含 む、哺乳動物細胞中のヌクレオシド輸送体の特異的な高親和性阻害剤の存在によ り、大きく高められた（アロノウら、J．Biol．Chem.、260:6226-6233(1985)； ショルティセック(Scholtissek)ら、Biochem．Biophys．Acta、158:435-447(196 8)；プラゲマン(Plagemann)ら、J．Membr．Biol.、81:255-262(1984)；ベルリン (Berlin)ら、Int．Rev．Cytol.、42:287-336(1975)；およびフジタ(Fujita)ら、Br ．J．Pharmacol.、68:343-349(1980)）。サルベ ージ(salvage)ヌクレオベース合成のための他の生理学的ソースである、ヌクレ オベースのエントリー(entry)については、あまり明確にされていない。 ヌクレオシドおよびヌクレオベースは、幾つかの動物細胞で、互いに他のトラ ンスロケーションを相互に妨げ合い、ヌクレオベース輸送におけるヌクレオシド 輸送体の役割を示唆する（アロノウら、J．Biol．Chem.、261:2014-2019(1986) ）。他方、独立したヌクレオベース輸送の存在が、突然変異細胞系を使用する研 究を通じて示唆されている（アロノウら、J．Biol．Chem.、261: 2014-2019(198 6)）。従って、ベスナリノンがヌクレオシド輸送を阻害するという可能性が、放 射性標識されたヌクレオシドおよびヌクレオベースのＴ細胞への迅速な輸送を見 ることにより、評価された。 より詳細には、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡで４８時間刺激された１０⁶個のＴ細 胞を、２５０μＭ ベスナリノン、１００μＭ デフェロキサミン、１５ｎＭ アフィジコリンまたは１．０μＭ ジピリダモールで処理し、［³Ｈ］チミジン 、［³Ｈ］アデノシン（２３Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、アマーシャム(Amersham)）、［³ Ｈ］アデニン（２６Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、アマーシャム）、または［³Ｈ］ウラシ ル（５３Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、アマーシャム）で１分間パル ス標識し、上述のように細胞ペレットを得て、評価した。結果を、図４に示す。 図４に示されるように、ベスナリノンは、 ［³Ｈ］チミジン、［³Ｈ］アデノ シン、［³Ｈ］アデニンの、およびより少なくではあるが［³Ｈ］ウラシルについ ても、輸送を阻害した。対照的に、デフェロキサミンまたはアフィジコリンは、 ＤＮＡへの［³Ｈ］チミジン取込みを阻害したこれら薬剤の同じ濃度を使用した にも拘わらず、これらのヌクレオシドまたはヌクレオベースの輸送には全く影響 しなかった。さらに、ヌクレオシド輸送体の特異的な高親和性阻害剤であるジピ リダモール（ショルティセックら、Biochem．Biophys．Acta、158: 435-447（19 68）；およびプラゲマンら、J．Membr．Biol.、81:255-262(1984)）は、ヌクレ オシド輸送を抑制したが、ヌクレオベース輸送は抑制しなかった。 次に、ヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送に関する、ベスナリノンへの用 量依存性応答を、幾つかの異なる細胞系、即ち、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションから得たヒトリンパ芽球様細胞系であるＲａｊｉ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−８６）、およびジー・エル・ジョンソン博士（デンバー、コロラ ド州）から提供されたチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系、ＣＨＯ を用いて調べた。 より詳細には、２．０×１０⁶個のＲａｊｉまたはＣＨＯ細胞を、０〜７５０ μＭ ベスナリノンまたは０〜１００μＭ ジピリダモールで処理し、［³Ｈ］ アデニンまたは［³Ｈ］アデノシンで１分間パルス標識して、上述のように細胞 ペレットを得、評価した。結果を、図５Ａ−５Ｄに示す。 図５Ａに示されるように、ベスナリノンの存在下で、Ｒａｊｉ細胞は、プリン ・ヌクレオベースである［³Ｈ］アデニンの輸送能力を用量依存性様式で増大さ せたが、図５Ｃに示されるように、ベスナリノンの存在下で、ＣＨＯ細胞は、こ のヌクレオベースのより低い輸送能力を有していた。対照的に、図５Ａおよび５ Ｃに示されるように、ベスナリノンの存在下では、両方の細胞とも、プリン・ヌ クレオシドであるアデノシンを、用量依存性様式で輸送する、類似した能力を示 した。特にヌクレオベース輸送に関する多様性は、これまでに報告されていたの で、そのような多様性は、驚くにあたらない（アロノウら、Mol．Cell Biol.、6 :2957-2962(1986)）。 インビトロでは、ヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送に対する阻害効果が 、ベスナリノンのインビボでの治療的範囲内（２〜８０μＭ）で観察される（図 ５Ａお よび５Ｃの棒線(bar)として示される）ことに注目すべきである。 対照的に、図５Ｂおよび５Ｄに示されるように、ジピリダモールは、その治療 的範囲内（１０〜１００ｎＭ）でアデニン輸送に対していかなる影響も及ぼさず に、アデニン輸送を選択的様式で阻害した（同様に、図５Ｂおよび５Ｄに棒線と して示される）。ショルティセックら、Biochem．Biophys．Acta、158: 435-447 (1968)；およびプラゲマンら、J．Membr．Biol.、81:255-262(1984)に記載され るように、高濃度（１０〜１００μＭ）のジピリダモールのみが、アデニン輸送 を阻害した。 チミジンおよびウリジンを含む、他のヌクレオシドの輸送は、アデノシンと同 じ様にベスナリノンに影響されたが、ウラシル（ピリミジン・ヌクレオベース） の輸送は、アデニンのように阻害されるが、より少なくであった。 これらのデータは、ベスナリノンが、ヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送 を阻害するが、ジピリダモールのものとは異なるメカニズムを介してである、こ とを示している。さらに、図５Ａおよび５Ｃは、ベスナリノンによるヌクレオシ ド輸送の阻害の程度は、図１Ａに明示されるヌクレオシド取込みのものと同様で あった。これ らの結果は、ベスナリノンによる［³Ｈ］ヌクレオシド取込み阻害のほとんどが 、ベスナリノンによるヌクレオシド輸送の阻害によることを示している。 ヌクレオシド輸送阻害剤、例えば、ジピリダモールまたはＮＢＭＰＲは、５− フルオロウリジン（５ＦＵｄ）または高い用量のチミジンの細胞障害性効果から 、この細胞障害性ヌクレオシドのアナローグまたはチミジンの輸送を阻害するこ とにより、細胞増殖を救う(rescue)ことが知られている（アロノウら、Mol．Cel l Biol.、6:2957-2962(1986)）。従って、ベスナリノンを、ＣＨＯ細胞を用いて 、同じ効果を有するかどうか決定するためにテストした。 より詳細には、１×１０⁴個のＣＨＯ細胞／ｍｌを、０〜２５０μＭ ベスナ リノンまたは１．０〜１０μＭジピリダモールの存在下に、５０ｎＭ ５−ＦＵ ｄとインキュベートし、インキュベーションから１２０時間後に細胞数をカウン トした。結果を、図６Ａ−６Ｂに示す。 図６Ｂに示されるように、ジピリダモールは、５−ＦＵｄの細胞静止効果を、 有意に逆転した。図６Ａにも示されるように、ベスナリノンは、用量依存性様式 で細胞を救う(rescue)類似の能力を実証した。より高い（≧１００ｎＭ）または 、より低い（≦１０ｎＭ）用量の５− ＦＵｄが使用されたときは、類似の効果を実証するのは困難であったが、これは 、ベスナリノン自身の抗増殖効果によるらしい。これらのデータは、ベスナリノ ンが、ヌクレオシド輸送の阻害剤として作用する付加的な支持を提供する。 この実施例では、ベスナリノンが、ヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送を 阻害するが、ヌクレオシド輸送の他の高親和性阻害剤、例えば、ジピリダモール は、ヌクレオベース輸送阻害の顕著に低下した能力を有する、ことが実証された 。ベスナリノンに関しては、さらにより高い濃度のベスナリノンが要求されるが 、インビトロでのヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送に対する阻害効果が、 インビボでのベスナリノンの治療的範囲（２〜８０μＭ）内に観察され、インビ トロでのこれらの効果がベスナリノンの幾つかの臨床的効果と関連するかもしれ ないことを示唆することは、注目に値する。 特にヌクレオベース合成がサルベージ経路に、より大きく依存する場合には、 ベスナリノンによる、ヌクレオシドおよびヌクレオベースの細胞への取込みの阻 害は、細胞増殖を阻害する結果となり得る。多形核白血球、特定の脳細胞、腸粘 膜細胞または赤血球のような細胞タイプは、ヌクレオベースに関する新規な合成 能力を、殆ど 或いは全く有さないが、他の細胞、例えば、肝細胞は、活性な新規な合成システ ムを有する。従って、これらのインビトロでの観察は、幾人かの患者に観察され るベスナリノンの主要な副作用である、顆粒球減少症の原因を説明するかもしれ ない（OPC-8212 マルチセンター・リサーチ・グループ、Cardiovasc．Drugs、Th er .、4:419-425(1990)；フェルドマンら、Am．J．Cardiol.、68:1203-1210(1991 )；フェルドマンら、N．Engl．J．Med.、329:149-155(1993)；およびパッカー(P acker)、N．Engl.J．Med.、329:201-202(1993)。 ベスナリノンによるヌクレオシドおよびヌクレオベース輸送の減少はまた、Ｈ ＩＶ−１複製に対する阻害効果に役割も果たし得る（メヤーハンス(Meyerhans) ら、J．Virol.、68:535-540(1994)；オブライエン(O'Brien)ら、J．Virol.、68: 1258-1263(1994)；およびガオ(Gao)ら、Proc. Natl．Acad．Sci．USA、90:8925- 8928(1993)）。最近、ヌクレオベース・プール中の減少または不均衡の引き金を 引くこと(triggering)が、細胞内のＨＩＶ−１逆転写の速度を減少させること、 或いは中断した(aborted)ウィルス複製を誘導することが報告された（ウルマン ら、Mol．Cell．Biol.、3:1187-1196(1983)；アロノウら、J．Biol．Chem.、260 :6226-6233(1985)；およびシ ョルティセックら、Biochem．Biophys．Acta、158:435-447(1968)）。 最後に、アデノシン輸送の阻害は、ベスナリノン作用のもう１つの新規な局面 との関連を提供し得る。ジピリダモールは、細胞へのアデノシン輸送の阻害を介 して、アデノシン濃度の局所的な増加を引き起こすことが提案されている（プラ ゲマンら、Biochem．Biophys．Acta、947:405-443(1988)）。アデノシンは、細 胞表面膜上の特異的なアデノシン・レセプターに対する結合を介して、ｃＡＭＰ の増加を引き起こすこと（フォックス(Fox)ら、Ann．Rev．Biochem.、47:655-68 6(1978)）、冠状動脈の拡張（フォックスら、Ann．Rev．Biochem.、47:655-686( 1978)）、脳血流量の増加（ハイスタッド(Heistad)ら、Am．J．Physiol.、240:7 75-780(1981)）、ＴＮＦ−α産生の減少（パーメリィ(Parmely)ら、J．Immunol. 、151:389-396(1993)）、および血小板凝集の減少（ダウィッキ(Dawicki)ら、Bi ochem ．Pharmacol.、34:3965-3972(1985)）を引き起こすこと、が知られている 。ベスナリノンは、同様に、アデノシン輸送を阻害することにより、アデノシン の血中濃度を増加するかもしれず、この結果、心臓病（フェルドマンら、N．Eng l ．J．Med.、329:149-155(1993)；およびパッカー(Packer)、N．Engl．J．Me d .、329:201-202(1993)）またはＴＮＦ−α産生の減少（マルヤマ(Maruyama)ら 、Biochem．Biophys．Res．Comm.、195:1264-1271(1993)；およびマツモリ(Mats umori)ら、Circul.、89:955-958(1994)）における、ベスナリノンの治療的利益 の幾つかを説明する。 実施例２ Ａ．ＺＥＢＲＡの発現およびＥＢＶの増殖複製に対するベスナリノンの効果 ケンゾー・タカダ(Kenzo Takada)博士から提供された、ヒトバーキットリンパ 腫細胞系であるＡｋａｔａ（タカダ、Int．J．Cancer、33:27-32(1984)；および タカダら、Virus Genes、5:147-156(1991)）を、１５％（ｖ／ｖ）の加熱不活化 ＦＣＳ、および２０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０ 培地で、３７℃にて培養した。 Ａｋａｔａ細胞の細胞性進行(cell progression)を、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭ ＳＯ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）の存在下に、細胞を９６時間培養す ることにより、抑止した(arrested)（サワイ(Sawai)ら、Exp.Cell．Res.、187:4 -10(1990)；およびタカセ(Takase)ら、Cell Growth Differ.、3:515-521(1992) ）。続いて、ＤＭＳＯ−抑止されたＡｋａｔａ細胞を、ＰＢＳで２回洗 浄し、下記のように調製される、ベスナリノンを０〜１００μｇ／ｍｌの種々の 濃度範囲で含むＲＰＭＩ １６４０培地に、１０⁶／ｍｌの密度で移した。 １０ｍｇのベスナリノンを、０．５ｍｌの２．０Ｎ ＨＣｌに溶解し、次に、 ５．０ｍｌのＨ₂Ｏと４．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した。２．０ Ｎ ＮａＯＨ（約０．５ｍｌ）で中和した後、ベスナリノン溶液（１．０ｍｇ／ ｍｌ）を、直ちに０．４５μｍミリポアフィルターで濾過し、培養培地に所望の 濃度に希釈した。 移動（ＤＭＳＯからの解除(release)）から１時間後に、抗ヒトＩｇＧ抗体の ヤギＦ（ａｂ’）₂フラグメント（オルガノン・テクニカ(Organon Teknika)、ダ ーハム、ノースカロライナ州）を、５０μｇ／ｍｌの濃度で加えて、増殖性ＥＢ Ｖ複製を誘導した（タカギら、Virology、185:309-315(1991)）。 抗ＩｇＧで処理した３時間後および２０時間後に、ＢａｍＨＩ Ｚ複製アクチ ベーター（ＺＥＢＲＡ）のフローサイトメトリー検出、およびＥＢＶ ＤＮＡの in situ 検出を、それぞれするために、細胞を集めた。 ＺＥＢＲＡのフローサイトメトリー検出のために、７０％（ｖ／ｖ）エタノー ルで４℃にて６０分間固定した後、１０⁶個の細胞を遠心して、ＰＢＳで洗浄し た。０． ５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０、２．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび１．５％ （ｗ／ｖ） ヒトγ−グロブリン（シグマ）を含む、２５０μｌ ＰＢＳ中で、 ５分間室温にてインキュベーションした後、１０μｌのマウス・モノクローナル 抗ＥＢ１／ＺＥＢＲＡのハイブリドーマ上清（Ｚ−１２５、エヴリン・マネット (Evelyn Manet)博士より提供)（ミカエリアン(Mikaelian)ら、J．Virol、67:734 -742(1993)）を加えて、混合物を４℃にて１２０分間インキュベートした。細胞 を、次に、ＰＢＳで洗浄し、さらに５．０μｌのアフィニティ精製したヒツジ抗 マウスＩｇＧのＦＩＴＣ複合体化Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント（Ｆ／Ｐモル比＝ ３．２、シグマ）で、４℃にて６０分間、処理した。細胞を、再びＰＢＳで洗浄 し、４８８ｎｍ励起で対数目盛で蛍光（５２０〜５４０ｎｍ）をモニターしなが ら、フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ、コウルター）で分析 した。ＺＥＢＲＡに関する陽性を、非線形最小二乗法により計算した（タカセ(T akase)ら、J．Immunol．Methods、118:129-138(1989)）。 細胞内のＥＢＶ ＤＮＡ検出のために、エンゾ・ダイアグノスティクス(ENZO Diagnostics)（ショセット、ニューヨーク州）からのキットを使用して、in sit uハイブ リダイゼーション法を実施した（タカギら、Virol.、185:309-315(1991)）。ハ イブリダイゼーション法は、製造元の指示に基本的に従って行った。 より詳細には、ガラス・スライド上でコートされた細胞を、アセトン中で室温 にて１０分間、固定した。標的およびプローブＤＮＡ（ＥＢＶ ＢａｍＨＩ Ｚ フラグメントのビオチン化プローブ）を、９４℃にて４分間、変性させ、２０分 間３７℃にてハイブリダイズさせた。特異的にハイブリダイズしたＤＮＡの検出 のために、このスライドを、アビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ 複合体で処理し、３−アミノ−９−エチルカルバゾールと過酸化水素で発色した (developed)。ＥＢＶ ＤＮＡに対する陽性を、赤色粒(red-colored grains)の 存在により決定し、少なくとも１０００個の細胞を、光学顕微鏡下で調べた。増 殖性ＥＢＶ複製が進行している細胞は、強力な染色により明白に区別される（タ カギら、Virol.、185:309-315(1991)）。in situハイブリダイゼーションでのＥ ＢＶ ＤＮＡの陽性とサザン・ブロッティング（ＢａｍＨＩ消化およびＮＪｈｅ ｔ ＤＮＡプローブ化）（ラアブートラウブ(Raab-Traub)ら、Cell、47:883-889 (1986)）で明示されるＥＢＶ ＤＮＡの複数の線状形態(multiple linear forms )の両方とも、抗Ｉｇ Ｇ処理したＡｋａｔａ細胞では、アシクロビアの前処理により劇的に減少するこ とは、注目すべきである。結果を、図７に示す。 図７に示されるように、ＥＢＶ ＤＮＡにより測定されるＥＢＶ産生細胞のポ ピュレーションは、ベスナリノンの存在下、徐々に用量依存性様式で減少した。 他方、ＺＥＢＲＡに関する陽性の度合いは、１０μｇ／ｍｌに等しいか或いはそ れ未満の濃度のベスナリノンによっては減少しなかった。曲線中のシフトは、３ ０μｇ／ｍｌ以上の濃度で観察された。従って、増殖サイクルの初期遺伝子(ear ly gene)の発現、即ち、ＺＥＢＲＡと、ＥＢＶゲノムの増殖性複製の、ベスナリ ノンに対する感受性(susceptibility)を判別することができた。 Ｂ．初期抗原の発現に対するベスナリノンの効果 ＤＭＳＯで阻止されたＡｋａｔａ細胞を、洗浄し、３０μｇ／ｍｌ ベスナリ ノンを含む培養培地に移した。解除(release)と移動から１時間後、上述の抗Ｉ ｇＧ抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。抗ＩｇＧでの処理から３時間後およ び２０時間後に、ウェスタン・イムノブロットによるＥＢＶ初期抗原ＺＥＢＲＡ （ＢＺＬＦ１産物）の検出のために、細胞を集めた。 より詳細には、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、２．０％（ｖ／ｖ）ノニデット(Nonidet)Ｐ −４０、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１．０ｍＭ フェニル−メタンスルホニル フルオリド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン(aprotinin)、１０μ Ｍ ロイペプチン(leupeptin)、および１００μＭ オルトバナジン酸ナトリウ ムを含む緩衝液中で、４℃にて溶解した。遠心した後、ラエムリ(Laemmli)、Nat ure 、227:680-685(1970)に記載のように、ライゼートを、電気泳動のために調製 した。４×１０⁵個の細胞に相当する量のライゼートを、各イムノブロット分析 のために使用した。 タンパク質をニトロセルロースフィルターに電気泳動的に移動し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０、２．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、および０．１％（ｗ／ｖ）アジ 化ナトリウムでフィルターをブロックした後、フィルターを好適な一次抗体と共 にインキュベートした。ＺＥＢＲＡ（ＥＢ１、ＢＺＬＦ１遺伝子産物）検出のた めに、使用される抗体はマウスモノクローナル抗ＥＢ１（Ｚ−１２５）であった ；Ｒ（ＢＲＬＦ１産物）検出のために、使用される抗体はマウスモノクローナル 抗Ｒ（Ｒ５Ａ９、エヴリン・マネット博士より提供）であった；ＥＡ−Ｒ（ＢＨ ＲＦ１産物）検出のために、モノクローナル抗ＥＡ−Ｒ（５Ｂ１１、エリオット ・キエフ(Elliot Kieff)博士から提供）であった（ピアーソン(Pearson)ら、Vir ol .、160:151-161(1987)；およびヘンダーソン(Henderson)ら、Proc．Natl．Aca d ．Sci．USA、90:8479-8483(1993)）；およびＥＡ−Ｄ（ＢＭＲＦ１産物）検出 のために、マウスモノクローナル抗ＥＡ−Ｄとともに抗体が使用された（ＮＥＡ −９２４０）デュポン、ボストン、マサチューセッツ州（ピアーソンら、J．Vir ol .、47:193-201(1983)；およびキエール(Kiehl)ら、Virol.、184:330-340(1991 )）。 特異的な反応バンドを、アルカリ性ホスファターゼ（プロメガ(Promega)、マ ディソン、ウィスコンシン州）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（アマーシャ ム）またはＥＣＬ化学発光（アマーシャム）と複合体化した抗マウス二次抗体を 用いて、検出した。即ち、ＺＥＢＲＡとＲの検出のために、アルカリ性ホスファ ターゼを使用した。ＥＡ−ＲとＥＡ−Ｄの検出のために、西洋ワサビペルオキシ ダーゼとＥＣＬ化学発光法を使用した（アマーシャム）。発色は、発色性(color ogenic)基質であるブロモクロロインドリルホスフェート（bromochloroindoly l phosphate)およびアルカリ性ホスファターゼのためにニトロブルーテトラゾリ ウムを使用して、慣用されている方法によった。ＺＥＢＲＡの発現は、刺激から ３時間後にプラトー・レベルに達し、ＥＢＶの増殖性複製は、このシステムでは 、刺激から１２時間後に止まった。結果を、図８Ａ−８Ｄに示す。 図８Ａに示されるように、図７に示されるデータと比較して、ＺＥＢＲＡの発 現は、ベスナリノンの存在下では、抗ＩｇＧの刺激から３時間後、ある限られた 範囲まで抑制された。図８Ｂに示されるように、他の直接の初期遺伝子(immedia te early gene)産物であるＲは、刺激から３時間後および２０時間後には、ベス ナリノンの存在下または非存在下で、実質的に同じレベルで発現された。図８Ｃ に示されるように、ｂｃｌ−２ホモロガスな初期遺伝子産物であるＥＡ−Ｒも、 刺激から３時間後および２０時間後には、同じ程度に発現された。対照的に、図 ８Ｄに示されるように、他の３つの初期遺伝子よりも遅い時点で発現される、Ｅ ＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ補因子であるＥＡ−Ｄの発現は、ベスナリノンの存在 下では、刺激から２０時間後に、劇的に抑制された。 Ｃ．ベスナリノン存在下での抗ＩｇＧ処理したＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ 細胞の細胞ＤＮＡ含量 ＥＢＶ複製の増殖期の間、ＤＮＡの２Ｃピークの広がりが注目された。この現 象は、恐らく溶解プロセスの一部としての、染色体ＤＮＡの変性または崩壊(dis ruption)に寄与する。幾つかの場合、２Ｃピークの変化の程度は、ＥＢＶ産生速 度と相関していた。このようにして、ベスナリノン存在下での、抗ＩｇＧ処理し たＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ細胞における２Ｃピークを評価した。 より詳細には、上述のような０〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のベスナリノ ン存在下に、５０μｇ／ｍｌの抗１ｇＧで２０時間刺激した、ＤＭＳＯ−解除さ れたＡｋａｔａ細胞を、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで４℃にて一晩固定し、１ ０⁶個の細胞を遠心し、ＰＢＳで洗浄した。次に、固定した細胞を、０．５ｍｌ のＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼ（シグマ）と共に、３７℃に て２０分間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を、０．５ｍｌのプロピジ ウムイオジド（カルビオジエム(Calbiodiem)、ラ・ジョラ、カリフォルニア州） 溶液（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ）と混合し、６０分後に、４８８ｎｍ励起で直線 目盛で、蛍光（＞６００ｎｍ）をモニターしながら、フローサイトメトリー（Ｅ ＰＩＣＳ Ｐｒｏｆｉｌｅ、コウルター、ハイアリー、フロリダ 州）で分析した（タカセ(Takase)ら、Cell Growth Differ.、3:515-521(1992)） 。ＤＮＡヒストグラムのＧ１ピークの標準偏差を非線形最小二乗法により計算し た（タカセら、J．Immunol．Methods、118:129-138(1989)）。結果を、図９Ａ− ９Ｆに示す。 図９Ａ−９Ｆに示されるように、抗ＩｇＧ処理のないコントロール・サンプル で観察される鋭い２Ｃピークと比較して、明らかに広がった２Ｃピークは、ベス ナリノンの存在下または非存在下で、抗１ｇＧで処理したサンプルで観察された 。これらの観察は、抗ＩｇＧ処理したＡｋａｔａ細胞で観察される溶解プロセス のこの特徴が、ＥＢＶ ＤＮＡ複製の減少にも拘わらず、ベスナリノンによって は妨げられない、ことを示す。 Ｄ．ベスナリノン処理した細胞のｄＮＴＰプール Ａｋａｔａ細胞中の４種のｄＮＴＰｓのプロフィールを、対数関数的に増殖し た細胞、ＤＭＳＯ−抑止された細胞、ベスナリノン非存在下でＤＭＳＯから解除 された１３時間後および２１時間後の細胞、並びに１００μｇ／ｍｌ ベスナリ ノン存在下でＤＭＳＯから解除された１３時間後および２１時間後の細胞の中で 、種々の条件下で測定した。 より詳細には、１０⁷個の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、３ ００μｌの冷した６０％（ｖ／ｖ）エタノール中に激しく懸濁した（チルステッ ド(Tyrsted)、Exp．Cell Res、91:429-440(1975)）。氷上で１０分間インキュベ ーションした後、ｄＮＴＰｓを含む上清を取り除き、凍結し、ロータリーエバポ レーターで蒸発させた。残渣を、１００μｌのＨ₂Ｏに溶解し、この溶液の１０ μｌアリコートを、ｄＮＴＰプール測定のために使用した。 各ｄＮＴＰ量の定量のために、ＤＮＡポリメラーゼＩと仔ウシ胸腺ＤＮＡを基 質として用いる酵素法を行った（ウィリアムズ(Williams)ら、J．Biochem．Biop hys ．Methods、1:153-162(1979)）。 より詳細には、１０μｌのサンプルまたはｄＮＴＰ標準溶液を、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．６２５ｍＭ ＤＴＴ、０．１２５ｍｇ ／ｍｌ 仔ウシ胸腺ＤＮＡ（シグマ）、０．６２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、６．２５μＭ ３種のｄＮＴＰｓ、および５．０μＣｉ／ｍｌ の、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、並びにｄＧＴＰ測定のために［³Ｈ］ｄＡＴＰ（ＩＣ Ｎ、コスタメサ、カリフォルニア州）を含む、或いはｄＡＴＰ測定のために［³ Ｈ］ｄＴＴＰ（ＩＣＮ）を含む、反応緩衝液４０μｌと混合した。反応溶液を、 次に、１．０単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ （ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）と混合し、４０分間３７ ℃にてインキュベートした。反応の終了後、混合物を、ワットマンＤＥ−８１ペ ーパーフィルターにのせ、０．３５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．５）で３回洗浄 した後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した。サンプル 中のｄＮＴＰの量を、１セットの標準ｄＮＴＰサンプルにより推定した検量線に 従って、計算した。１００μｇ／ｍｌまでの濃度のベスナリノンは、このインビ トロでのＤＮＡポリメラーゼ・アッセイでは、ｄＮＴＰ含量の測定には全く影響 しない。結果を、図１０Ａ−１０Ｄに示す。 図１０Ａ−１０Ｄに示されるように、全てのｄＮＴＰｓの細胞含量は、ＤＭＳ Ｏ処理の後、一様に減少した。細胞含量は、ベスナリノンの非存在下では、相対 的により高いレベルで、かなり良く維持されるか又は増加した事実にも拘わらず 、抗ＩｇＧ刺激のないベスナリノン存在下では、解除から１３時間後には、ｄＡ ＴＰとｄＧＴＰの両方とも漸進的な減少を示した。ｄＴＴＰの細胞含量は、全条 件を通して、４種のｄＮＴＰｓ中で、最も少ない貯蔵プールであることが実証さ れた。ＤＭＳＯ−抑止された細胞中の減少したレベルのｄＴＴＰは、解除から２ １時間後までに、殆ど増殖細胞中のものまでに回復 した。他方、ベスナリノン存在下でＤＭＳＯから解除された細胞では、ｄＴＴＰ のレベルは、全く低いままであった。ｄＣＴＰのレベルは、解除後の細胞では、 ベスナリノンの存在下または非存在下で、低いままであった。 並行して、解除後の未処理Ａｋａｔａ細胞のｄＮＴＰｓ含量の測定のために、 抗ＩｇＧ処理したＡｋａｔａ細胞中のｄＮＴＰプールも、同様にして測定した。 結果を、図１０Ａ−１０Ｄに示す。 図１０Ａ−１０Ｄに示されるように、抗ＩｇＧ処理から１２時間後（解除から １３時間後に等しい）のｄＴＴＰレベルは、顕著に増大した。このレベルのｄＴ ＴＰは、処理から２０時間後、高いまま維持され、ベスナリノンの存在下で部分 的に抑制された。３種の他のｄＮＴＰｓについては、ｄＴＴＰに観察されるよう な含量の増加は、実証されなかった。抗ＩｇＧ刺激された細胞中の、ｄＮＴＰに 対するベスナリノンの効果は、ｄＴＴＰを除いて、非刺激細胞でのそれよりも小 さかった。 Ｅ．増殖細胞中のＥＢＶの増殖複製に対するベスナリノンの効果 Ａｋａｔａ細胞を、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノンを有する、或いは有しない 、培養培地で７日間にわたり、発育相(growth phase)に維持した（前処理）。細 胞を、 スピンダウンし、その後、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノンを有する、或いは有し ない、新鮮な培養培地に移した（後処理）。１時間後、抗ＩｇＧを、５０μｇ／ ｍｌの最終濃度で培地に加え、上述のように２４時間後のＥＢＶ ＤＮＡのin s ituハイブリダイゼーションのために、細胞を集めた。結果を、図１１に示す。 図１１に示されるように、抗ＩｇＧ抗体の添加前により長い時間かけて（前処 理＋後処理）、または添加直前に（後処理のみ）、細胞をベスナリノンで処理す ると、未処理細胞と比較して、ＥＢＶ ＤＮＡに関する陽性のレベルが減少した 。抗ＩｇＧと同時にのみベスナリノンで処理した細胞は、ＥＢＶ産生のより深い 減少を示した。さらに、前処理のみにも拘わらず、ＥＢＶ ＤＮＡの陽性の程度 は、より高かった。従って、溶解サイクルに同時に入る細胞は、ベスナリノンに 、より感受性(susceptible)であるかもしれない。 Ｆ．ＥＢＶ感染の潜伏期に関連する分子の発現に対するベスナリノンの効果 ＥＢＶを含む４種の異なるヒトＢ細胞系、即ち、ＥＢＶの異なる２つのサブグ ループ、Ａ型およびＢ型を含む細胞を用いて、ＥＢＶ感染の潜伏期に関連する分 子の発現に対するベスナリノンの効果を調べた（アドルディン ガー(Adldinger)ら、Virol.、141:221-234(1985)；ジムバー(Zimber)ら、Virol. 、196:900-904(1993)；およびグレゴリーら、Nature、349:612-614(1991)）。そ れら細胞系には、Ａｋａｔａ（Ａ型、Ｉ群）、Ｒａｊｉ（Ａ型、III群）、Ｐ３ ＨＲ１（Ｂ型、Ｉ群）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−６２）、およびＪｉｊｏｙｅ （Ｂ型、III群）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−８７）が含まれる。調べた分子は 、潜伏核タンパク質(latent nuclear protein)、ＥＢＮＡ２、潜伏膜タンパク質 (latent membrane protein)、ＬＭＰ１、および抗アポトーシス宿主成分ｂｃｌ −２であった。一般に、Ｉ群の細胞系は、ごく僅かな量のＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１ 、およびｂｃｌ−２を示し、明らかに多量のこれらの分子を有するIII群の系と は対照的であった。２つの表現型の間のこれらの相違は、アポトーシスを誘導す る感受性(sensitivity)、並びにＥＢＶ感染の増殖期を誘導する能力と関連して いた（ヘンダーソン(Henderson)ら、Cell、65:1107-1115(1991)；およびグレゴ リーら、Nature、349:612-614(1991)）。 より詳細には、２０μｇ／ｍｌ ベスナリノンを有する、或いは有しない培地 で７日間培養された細胞を、上述のようにウェスタン・ブロッティングのために 集めた。ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、およびｂｃｌ−２の検出のため に、マウスモノクローナル抗ＥＢＮＡ２（ＰＥ２、アキュレイト(Accurate)、ウ ェストベリー、ニューヨーク州）（ヤング(Young)ら、N．Engl．J．Med.、321:1 080-1085(1989)）、マウスモノクローナル抗ＬＭＰ１（Ｓ１２、デビッド・エイ ・ソーレイローソン(David A．Thorley-Lawson)博士から提供）（マン(Mann)ら 、J．Virol.、55:710-720(1985)）、およびモノクローナル抗ｂｃｌ−２（ｂｃ ｌ−２／１２４、アキュレイト）（ペッゼラ(Pezzella)ら、Am．J．Pathol.、13 7 :225-232(1990)）を、それぞれ使用した。ＥＣＬ化学ルミネセンス法を、これ らのタンパク質の検出のために使用した。これらの条件下では、ベスナリノン存 在下での細胞増殖は、細胞数を評価したとき、コントロール培養物の８０〜９０ ％に減少した。結果を、図１２Ａ−１２Ｃに示す。 図１２Ａ−１２Ｃに示されるように、ベスナリノンは、Ｉ群系ではこれらの分 子を誘導しなかったし、さらにベスナリノンは、III群系でこれらの分子の発現 レベルを変化させもしなかった。従って、種々の遺伝子産物を発現するＥＢＶ含 有細胞、またはアポトーシスに対する感受性(susceptibility)は、ベスナリノン に対する感受性とは別々であるかもしれない。 Ｇ．抗ＩｇＧ処理したＡｋａｔａ細胞におけるチミジン キナーゼ活性に対するベスナリノンの効果 チミジンキナーゼは、ｄＴＴＰの代謝的合成に重要な役割を果たし（ササヤマ (Sasayama)ら、Heart Vessels、2:23-28(1986)；およびフェルドマンら、Am．He art J.、116:771-777(1988)）、およびＥＢＶ初期遺伝子、ＢＸＬＦ１は、チミ ジンキナーゼをコードし、該キナーゼは、基質としての広範囲のヌクレオシドま たはヌクレオベースのアナローグによって、並びにｄＴＴＰに対し相対的により 強い耐性によって、細胞の同等物(counterpart)からは区別されることが知られ ていた。 即ち、チミジンキナーゼ活性を、トゥレン−テシア(Turenne-Tessier)ら、J．Virol .、57:1105-1112(1986)の方法に幾つかの修正を加えた方法に従って、１０ ０μｇ／ｍｌの濃度のベスナリノンの存在下に培養し１２時間後に集めた、５０ μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧで処理したＡｋａｔａ細胞で、測定した。 より詳細には、１０⁷個の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、直ちにドライアイス／エ タノールで凍結した。凍結細胞のペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０ ）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．０ｍＭ ＡＴＰ、１．０ ｍＭ ＤＴＴ、５．０％（ｖ／ｖ）グリセロール、８０μｇ／ｍｌ アプロチニ ン、４０μＭ ロ イペプチンおよび１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む、１００μｌのキナーゼ抽出緩衝 液に懸濁し、短時間の音波処理後３０分間氷上でインキュベートした。核を、１ ５分間高速遠心して取り除き、上清（キナーゼ抽出物）を等分して、−７０℃に て保存した。キナーゼ抽出物のタンパク質濃度（約４．０ｍｇ／ｍｌ）を、ＢＳ Ａを標準タンパク質とし、標準的なブラッドフォード(Bradford)試薬（バイオ− ラド(Bio-rad)・プロテインアッセイキット、バイオ−ラド・ラボラトリーズ、 ハーキュルズ、カリフォルニア州）を用いて、測定した。 ５．０μｌのキナーゼ抽出物を、１５０ｍＭ ホスフェート（ｐＨ７．５）、 ２０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、４０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＤＴ Ｔ、１０ｍＭ ＮａＦおよび２０μＭ ［³Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏ ｌｅ、ＩＣＮ）を含む、３５μｌのキナーゼ反応緩衝液と共に、３７℃にて５な いし１５分間、インキュベートした。氷上に置き、４．０μｌの０．５Ｍ ＥＤ ＴＡ（ｐＨ８．０）を加えることにより、反応を終わらせた。ｄＴＴＰ耐性チミ ジンキナーゼ活性の測定のために、１００μＭ ｄＴＴＰ（ファーマシア(Pharm acia)）をさらに含むキナーゼ反応緩衝液を使用した。 反応の間に形成されるリン酸化［³Ｈ］チミジン誘導体 の量を、ワットマンＤＥ−８１ペーパーフィルター上に反応混合物をのせ、これ をその後、乾燥して液体シンチレーションでカウントする前に、１．０ｍＭ ギ 酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中で４回およびエタノール中で１回洗浄して測定 した。このインビトロ・アッセイシステムの中に、ベスナリノンを１００μｇ／ ｍｌまでの濃度で添加すると、チミジンキナーゼ活性のいかなる阻害も示さなか った。結果を、図１３Ａに示す。 図１３Ａに示されるように、増殖細胞中の全チミジンキナーゼの高い活性は、 ＤＭＳＯ−抑止された細胞では大きく低下し、解除から１３時間後に、僅かな程 度回復した。チミジンキナーゼ活性のさらなる増加は、抗ＩｇＧ処理細胞で観察 され、この増加は、ベスナリノン存在下で、部分的に阻害された。 次に、チミジンキナーゼ・アッセイを、１００μＭ ｄＴＴＰ存在下に、同じ 方法で行ったが、該ｄＴＴＰは、細胞起源のチミジンキナーゼを優先的に抑制す る。結果を、図１３Ｂに示す。 図１３Ｂに示されるように、抗ＩｇＧ処理細胞では、高いレベルのｄＴＴＰ耐 性チミジンキナーゼがあった。これらの観察から、抗ＩｇＧ処理細胞で観察され るチミジンキナーゼ活性の増加は、ＥＢＶのチミジンキナーゼ 遺伝子（ＢＸＬＦ１）の発現によるものらしい、ことが示される。さらに、ｄＴ ＴＰ耐性チミジンキナーゼの増加もまた、ベスナリノン処理により部分的に抑制 された。 この実施例で示されるように、ベスナリノンは、細胞システム中でＥＢＶ感染 の増殖期を阻害し、これは明らかに多くの利点を提供する。即ち、Ａｋａｔａ細 胞の抗ＩｇＧ抗体処理の後では、増殖性ウィルスサイクルが速やかに誘導される 。さらに、細胞周期の進行(progression)抑止とそれに続く解除の導入、抗Ｉｇ Ｇ抗体処理によって、細胞がＳ期に入る前に、１２時間以内に、ＥＢＶのより有 効で同時的な複製が誘導される。この迅速で同時的な、増殖期への移行により、 事象(events)をより明確な様式で明らかにすることが可能となる。また、それら の事象は、宿主細胞増殖に関連するものとは独立して、分析されることができる 。 このシステムにおいて、ベスナリノンは、ＥＢＶゲノムの増殖性複製を、用量 依存性様式で顕著に阻害した。対照的に、ＺＥＢＲＡ、ＲおよびＥＡ−Ｒを含む 、潜伏段階からの脱出(exit)に関連する初期遺伝子の発現においては、変化は、 殆ど或いは全く観察されなかった。さらに、抗ＩｇＧ抗体で処理した細胞で、フ ローサイトメトリーにより検出された、ＤＮＡの広がった２Ｃピーク は、ベスナリノンの存在下で持続した。ＤＮＡのこの立体配置(configulation) は、溶解サイクルに入る証拠である。これらのデータは、刺激による溶解期への 移行(entry)を特徴づけるもので、in situハイブリダイゼーションで検出される ＥＢＶゲノムの増殖性複製に対するベスナリノンの効果とは独立しているように 見えた。ＥＡ−Ｄ発現のみが、抗ＩｇＧ刺激から２０時間後、ベスナリノンによ って顕著に減少した。ＥＡ−Ｄは、ＥＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの補因子であり 、他の３つの初期遺伝子よりも、遅い時点で一般に発現される。初期遺伝子発現 への効果のこの分離(dissociation)に関する１つの可能な説明は、ＥＡ−ＤがＥ ＢＶ複製単位に関連し得（キエール(Kiehl)ら、Virol.、184:330-340(1991)；お よびダイバタ(Daibata)ら、Virol.、196:900-904(1993)）、およびその発現がＥ ＢＶ ＤＮＡ複製自身の状況(status)により部分的に制御され得ることである。 ＤＭＳＯ−解除されたＡｋａｔａ細胞では、ｄＴＴＰは、最も少ないデオキシ ヌクレオベース・プールを示し、ベスナリノン処理の主要な標的の１つであった 。さらに、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰのレベルもまた、ベスナリノン処理により、 同じ程度まで影響を受けた。デオキシヌクレオベース・プールの減少または変化 を、ＤＮＡウィル ス複製の減少（ダッタ(Datta)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77:5163-5166( 1980)）、およびレトロウィルスの逆転写の突然変異の速度の増加（ヴァルタニ アン(Vartanian)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、91:3092-3096(1994)）と関 連づける幾つかの一連の証拠があった。 アシクロビアのような抗ウィルス剤は、活性なアシクロビア・トリホスフェー トに改変した後に、ＥＢＶ ＤＮＡ複製において、ｄＧＴＰに対する競合物質と して作用する（ダッタら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77:5163-5166(1980)） 。ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＧＴＰプールサイズの、ベスナリノンによる変 化は、このシステムで観察されるＥＢＶ複製の抑制を合理的に説明するかもしれ ない。４つのｄＮＴＰｓの中で、ｄＴＴＰは、特に抗ＩｇＧ処理で誘導される唯 一のｄＮＴＰであり、細胞中のｄＴＴＰレベルのこの増加は、初期遺伝子産物と して認識されるＥＢＶチミジンキナーゼの発現に起因するように見えた。１００ μｇ／ｍｌ ベスナリノン処理による抗ＩｇＧ処理された細胞における、ｄＴＴ Ｐレベルの増加の実質的抑制は、同じ培養条件下で観察されるチミジンキナーゼ 活性の誘導の抑制に比肩し得るものであった。この初期遺伝子（ＢＸＬＦ１）の 発現は、ＺＥＢＲＡの場合と同様に、この濃度でのこの薬剤処理に より影響され得る。 これらの研究により、ＥＢＶの再活性化が観察され、ＥＢＶの増殖性複製が重 要な役割を演ずる疾患において、ベスナリノンは治療的効果を有することがわか ったことが示される。 実施例３ Ａ．ＣＭＶ複製の阻害に対するベスナリノンの効果 ベスナリノンを、インビトロでＣＭＶプラーク減少アッセイにおいて、抗ＣＭ Ｖ活性について評価した。 より詳細には、１２ウェルの組織培養プレート中のＭＲＣ₅細胞（バイオウィ ッテカー(Biowhittaker)、ウォーカーズヴィル、メリーランド州）のサブコンフ ルエント(subconfluent)な単層を、２．０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足した イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）中、１：５００希釈のストック・ウィルス（ ＣＭＶ株 ＡＤ１６９；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−５３８）懸濁液に、２時間３７ ℃にて曝し(exposed)、ウィルス吸収をさせた。続いて、非吸収ウィルスを含む 液を除去し、細胞層を、血清を含まないイーグルＭＥＭですすいだ(rinsed)。次 に、２．０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および０．２５％（ｗ／ｖ）アガロースを 含むイーグルＭＥＭを含む１．０ｍｌのオーバーレイ培地中、下記の表１に示さ れる濃 度のトリプリケートのウィルス感染細胞培養物に、ベスナリノンを加えた。続い て、ＣＰＥ（プラーク）の個別の病巣(foci)が形成される７日目まで、９５％空 気／５％ＣＯ₂を含む湿った雰囲気中で、３７℃にて該プレートをインキュベー トした。ベスナリノン添加により生ずるプラーク減少について、ベスナリノン処 理培養物の平均プラーク数を、非処理ウィルス感染コントロール培養物の平均プ ラーク数と比較することにより、評価した。結果を、下記の表１に示す。 上記表１に示されるように、ベスナリノンは、ＣＭＶプラーク産生を用量依存 性様式で阻害した。治療範囲内である、３０μｇ／ｍｌの濃度で、ベスナリノン は、ＣＭＶプラーク形成に対して、非常に高いレベルの有効性（９１．５％）を 発揮した。 Ｂ．ＭＲＣ₅細胞の細胞障害性に対するベスナリノンの効 果 ＭＲＣ₅細胞に対するベスナリノンの細胞障害性を、上記のセクションＡ．に 記載されるベスナリノン処理細胞の顕微鏡的評価により、決定した。少量の沈殿 物が、３１μｇ／ｍｌで観察された。いかなる細胞障害性も、観察されなかった 。 ベスナリノンのＭＲＣ₅細胞の細胞障害性はまた、ムーマン(Moomann)、J．Imm unol ．Methods、65:55(1983)に記載されるように分光光度計により測定するとき には、ＳＤＳで溶解された生存(viable)細胞のミトコンドリア酵素による、３− （４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルテトラゾリ ウムブロミド（ＭＴＴ）のＭＴＴ−ホルマザンへの還元によっても測定された。 より詳細には、２．０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したイーグルＭＥＭ中 、５．０μｇ／ｍｌのＭＴＴを、各ウェルに加え、３７℃にて６時間インキュベ ートした。続いて、細胞を、０．０２Ｎ ＨＣｌ中３０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを加 えて、溶解した。培養物を、３７℃にて一晩インキュベートした。次に、分光光 度計を用い、５７０ｎｍにて光学密度を測定した。細胞障害性のコントロールは 、培地のみに曝される、偽感染(mock-infected)細胞 であり、２．０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭに希釈された、 下記の表２に示される濃度のベスナリノンでオーバーレイされた。ベスナリノン 処理された各ウェルの吸光度（５７０ｎｍでのＯ．Ｄ．）を、細胞コントロール ・ウェルの平均ＯＤと比較した。コントロールのパーセントとして表される、細 胞の生存度(viability)を、下記の表２に示す。 上記の表２に示されるように、細胞生存度を測定するためにＭＴＴを使用する と、細胞障害性は、殆ど或いは全く観察されなかった。 Ｃ．ＣＭＶ複製の阻害に対するベスナリノンおよびＤＨＰＧの効果 ベスナリノンおよびＤＨＰＧを、インビトロで抗ＣＭＶ活性について評価した 。 より詳細には、下記の表３に示す濃度のベスナリノン を、単独で或いは、下記の表３に示す濃度のＤＨＰＧと組合せて、上述のＣＭＶ プラーク減少アッセイで評価した。各化合物およびそれらの組合せの、阻害パー セントを、下記の表３に示す。 上記の表３に示されるように、ベスナリノンは、３１μｇ／ｍｌの濃度では、 ＣＭＶプラーク産生を９６．１６％減少させた。ベスナリノンの他の濃度は、か ろうじて活性な程度（１９．２７〜１０．６９％減少）にすぎなかった。５．０ μＭ、２．５μＭおよび１．２５μＭのＤＨＰＧは、４５．１４、２０．７５お よび７．８８％のＣＭＶプラーク減少を示した。化合物の組合せは、種々の程度 の％ＣＭＶプラーク減少を示した。 プラーク産生を５０％減少させる最小化合物濃度（Ｍ ＩＣ₅₀）を、片対数曲線の当てはめ(semilog curve fitting)のための回帰分析 プログラムを用いて、単一化合物アッセイから計算した。ベスナリノンに関する ＭＩＣ₅₀は、２４μｇ／ｍｌであり、ＤＨＰＧに関するそれは、＞５．０μＭで あった。 続いて、上記のデータを、プリチャード(Prichard)ら、Antiviral Res.、14:1 81-206(1990)に記載される技法を用いて分析したが、この技法は、観察された組 合せ効果と、２つの化合物の相互作用が単に相加的(additive)であった場合に期 待される効果との間の差の測定を包含する。化合物の個々の効果を用いて、相加 的効果を計算し、これらを観察された組合せ効果から差し引いた。異なる部位に 影響する阻害剤に好適である、相加性に関する下記式を使用した。 Ｚ＝Ｘ＋Ｙ（１−Ｘ） 式中、Ｚは、トータルの阻害（活性）であり；Ｘは、化合物Ｘの特定の濃度で観 察される活性であり、およびＹ（１−Ｘ）は、活性の一部分のみが阻害されたま まであるときの、化合物Ｙの活性である（プリチャードら、上記）。 相加的効果が、観察された組合せ効果から差し引かれた後に、正の値または相 加的効果を超える活性は、相乗 性(synergy)を示唆した。負の値または相加的効果を下回る活性は、拮抗作用(an tagonism)を示唆した。結果を、下記の表４に示す。 上記の表４に示されるように、９５％の信頼レベルで、有意な相乗作用があっ た。相乗作用のピークは、２．５μＭのＤＨＰＧと７．７５μｇ／ｍｌのベスナ リノンの組合せで見られた。一般に、ＤＨＰＧの全ての用量と組合せたとき、１ ５．５μｇ／ｍｌおよび７．７５μｇ／ｍｌのベスナリノンを含む相乗性のバン ドがあった。 従って、ベスナリノンは、抗ＣＭＶ活性を有し、およびそのようにしてＤＨＰ Ｇの抗ウィルス活性を強化した。プリチャードら、上記、の化合物組合せを評価 する技法に基づき、ベスナリノンとＤＨＰＧとの主要な相互作用 は、相乗的であると考えられる。 Ｄ．ＭＲＣ₅細胞の細胞障害性に対するベスナリノンおよびＤＨＰＧの効果 細胞障害性は、化合物処理された偽感染細胞コントロールの顕微鏡的観察によ り、また上述のように、生存細胞のミトコンドリア酵素によるＭＴＴ−ホルマザ ンへのＭＴＴの還元を評価することによっても、測定された。少量の沈殿物が、 ３１μｇ／ｍｌのベスナリノンで観察され、および３１μｇ／ｍｌのベスナリノ ンを用いた全ての薬剤組合せ（ＤＨＰＧ）用量で観察された。結果を、下記の表 ５に示す。 上記の表５に示されるように、細胞の生存度を測定す るためにＭＴＴを用いたときは、殆ど或いは全く細胞障害性は観察されなかった し、顕微鏡的にもそのようなものは観察されなかった。 実施例４ Ａ．チミジンおよびＡＺＴの取込みに対するベスナリノンの効果 ＡＺＴは、生理学的なヌクレオシドよりも、より親油性である。従って、ＡＺ Ｔは、ヌクレオシド輸送体をバイパスし受動的拡散により細胞に入る、ことが予 想される。ジピリダモールは、ヌクレオシド輸送の特異的な阻害剤であり、生理 学的ヌクレオシドの輸送を阻害するが、ＡＺＴは阻害しない、ことが知られてい る。従って、ヌクレオシド輸送阻害剤であるベスナリノンの、［³Ｈ］ＡＺＴ取 込みに対する効果を、アロノウら、J．Biol．Chem.、260:16274-16278(1985)に 記載される、迅速な取込み方法を用いて、調べた。 より詳細には、２．０×１０⁶個のＣＨＯ細胞またはＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞 を、１０．０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清および２．０ｍＭ Ｌ−グル タミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ シンを補足した、１００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁し、０〜２５０ μＭ ベスナリ ノンの存在下で２０分間、３７℃にてプレ・インキュベートした。 ヒトＰＢＭＣを、ＨＩＶ−１およびＨＢＶ血清反応陰性である健康なドナーの 、白血球搬出(leukopheresis)により得た。フィコール・ハイパック比重差遠心 により、それから単核細胞の懸濁液を調製し、そして、テラダら、J．Immunol. 、147:698-704(1991)に記載されるように、Ｅロゼット精製(enrichment)により 、それからＴ細胞を得た。 ベスナリノンを、０．５ｍｌの２．０Ｎ ＨＣｌに溶解した１０ｍｇのベスナ リノンを含むストック溶液として調製し、続いてこれを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７．５５）を補足した９．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地に加え 、２．０Ｎ ＮａＯＨを加えることによりｐＨ７．０に中和した。得られた中和 ベスナリノン溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を、０．４５μｍのミリポアフィルター を用いて直ちに濾過し、図１４Ａおよび１４Ｂに示される量にて細胞培養物に加 えた。 続いて、１．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）ま たは１．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ＡＺＴ（１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加え、混合 物を、マイクロヒュージ管中のシリコンオイル／パラフィンオイル （９６：６）に直ちに重層した(layered)。１分後、１４，０００ｒｐｍ（１０ ，０００×ｇ）で２分間遠心することにより、細胞を、水相中の遊離ヌクレオシ ドまたはヌクレオベースから分離した。水相と油相を捨て、細胞ペレットの放射 能を、液体シンチレーションカウンティングで測定した。［³Ｈ］基質の取込み を、コントロール、即ち、ストック・ベスナリノンのみを調製するのに使用した 溶液で処理した細胞のパーセンテージとして評価した。結果を、図１４Ａおよび １４Ｂに示す。図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、ベスナリノンは、先に 報告したように（クマクラ(Kumakura)ら、Life Sciences、57:PL57-82(1995)） 、ＣＨＯ細胞（図１４Ａ）、および一次ヒトＴ細胞（図１４Ｂ）において、［³ Ｈ］チミジン取込みを用量依存性様式で阻害した。対照的に、［³Ｈ］ＡＺＴの 取込みは、ベスナリノンによっては影響されなかった。同様の結果が、ヒト単芽 球細胞系、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３）、およびＲａｊｉ細 胞を使用して得られた。従って、ジピリダモールと同様に、ベスナリノンは、チ ミジン取込みの特異的な阻害剤であるが、ＡＺＴ取込みに対しては、そうではな い。 Ｂ．ベスナリノン存在下でのＡＺＴのリン酸化 細胞へのチミジンおよびＡＺＴ移入(entry)の、ベスナ リノンによる区別的阻害は、ＡＺＴの細胞内リン酸化に対する、チミジンのあら ゆる拮抗作用的影響を抑制することが期待されるであろう。これは、ベスナリノ ンとＡＺＴとを組合せて、細胞中で後者の活性を増強する、組合せ治療の治療的 可能性を提供するであろう。ＨＩＶ−１のようなレトロウィルスのウィルス複製 を阻害するＡＺＴの活性は、細胞中における増加された濃度のリン酸化ＡＺＴを 達成することに基づく(ワインシュタイン(Weinstein)ら、Ann．NY Acad．Sci.、616 :367-384(1991))。従って、ベスナリノンによるチミジン取込みの阻害が、Ａ ＺＴの細胞内リン酸化に対して少しでも影響するかどうか決定するために、［³ Ｈ］ＡＺＴのリン酸化形態の細胞内蓄積に対するベスナリノンの効果を評価した 。 より詳細には、１．０×１０⁷個のＰＨＡ活性化ヒトＴリンパ球を、０、７５ または２５０μＭ ベスナリノンの存在下、１０．０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウ シ胎児血清および２．０ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンお よび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した、１．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。１０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ ／ｍｍｏｌｅ）または１０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ＡＺＴ（１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ ｅ）を加え、混合物を３７ ℃にて、０、３０、６０および１２０分間、インキュベートした。次に、細胞を 、集め、ＰＢＳで洗浄し、４００μｌの６５％（ｖ／ｖ）エタノール中で、２０ 分間０℃にて溶解した。上清を、１４，０００ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で５ 分間遠心することにより分離し、ＤＥＡＥフィルターペーパー（ワットマンＤＥ −８１）に載せた。該フィルターペーパーを、１．０ｍＭ ギ酸アンモニウムで １０分間ずつ４回洗浄し、放射能を、液体シンチレーションを用いて測定した。 結果を、図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ｂに示されるように、ベスナリノ ンは、ＰＨＡ活性化ヒトＴリンパ球におけるリン酸化ＡＺＴの蓄積を増大させた 。対照的に、図１５Ａに示されるように、ベスナリノンは、染色体破片を除去し た後の細胞内抽出物中のリン酸化［³Ｈ］チミジンの蓄積を遅らせた。ＰＨＡ活 性化ヒトＴリンパ球の代わりに、Ｕ９３７細胞を使用したとき、同様の結果が得 られた。 Ｃ．ＡＺＴのリン酸化形態 ＡＺＴ−ＴＰ（ＡＺＴ−トリホスフェート）は、ウイルス逆転写酵素に誤まっ て利用される(mis-utilized)有効な形態である（ワインシュタインら、上記）。 従って、Ｕ９３７細胞中のＡＺＴ−ＭＰ、ＡＺＴ−ＤＰ、およびＡＺＴ−ＴＰの 細胞内濃度に対する、ベスナリノンの効 果を次に調べた。 より詳細には、１０．０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清および２．０ｍ Ｍ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン並びに１００μｇ／ｍｌのス トレプトマイシンを補足した１．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中の１．０× １０⁷個／ｍｌのＵ９３７細胞を、５．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン（６． ７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）または５．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ＡＺＴ（１４Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）とともに、３７℃にて２時間インキュベートした。次に、細胞を集め、 ＰＢＳで洗浄し、そして４００μｌの６５％（ｖ／ｖ）エタノールの中で、２０ 分間０℃にて溶解した。上清を、１４，０００ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で５ 分間遠心することにより分離し、陰イオン交換カラム（サックス(SAX)、フェノ メネックス(Phenomenex)）を用いるＨＰＬＣにかけた。１．０ｍｌ／分の流速で 、カラム中のＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ４．１）の濃度は、５５分間に、１５ｍＭから１ ．０Ｍに直線的に増加した。１．０ｍｌの分画を集め、液体シンチレーションに より放射能を測定した。ＡＺＴとＡＺＴ−ＭＰに対する保持時間を、冷したＡＺ ＴとＡＺＴ−ＭＰ（シグマ）を同じ条件で用いて、確認した。結果を、図１６Ａ および１６Ｂに示す。図１６Ａに示されるように、チ ミジンは、細胞中のトリホスフェート・レベルまで効果的にリン酸化されていた 。対照的に、図１６Ｂに示されるように、ＡＺＴはＡＺＴ−ＭＰにリン酸化され たが、この段階を超えてジホスフェート形態までのリン酸化は不十分であった。 これにより、ＡＺＴは、チミジンキナーゼに対する良好な基質であるが、細胞中 のチミジル酸キナーゼに対してはそうでない、ことが示される。 Ｄ．ＡＺＴのリン酸化形態の濃度 次に、ＡＺＴ−ＭＰ、ＡＺＴ−ＤＰおよびＡＺＴ−ＴＰの細胞内濃度に対する 、ベスナリノンの効果を調べた。 より詳細には、１０．０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清および２．０ｍ Ｍ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン並びに１００μｇ／ｍｌのス トレプトマイシンを補足した１．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中の１．０× １０⁷個／ｍｌのＵ９３７細胞を、０、１２．５、２５または７５μＭ ベスナ リノンの存在下に、５．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ＡＺＴ（１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）とともに、３７℃にて２時間インキュベートした。［³Ｈ］ＡＺＴ−ＭＰ、［³ Ｈ］ＡＺＴ−ＤＰおよび［³Ｈ］ＡＺＴ−ＴＰの細胞内濃度を、上述のようにＨ ＰＬＣを用いて測定した。結果は、サンプルの［³Ｈ］ＡＺＴ−ＮＰ（ｃｐｍ） ／コントロールの［³Ｈ］ＡＺＴ−Ｎ Ｐ（ｃｐｍ）の比率により表され、これを図１７に示す。図１７に示されるよう に、ベスナリノンは、７５μＭ（３０μｇ／ｍｌ）の濃度で、ＡＺＴ−ＭＰ、Ａ ＺＴ−ＤＰおよびＡＺＴ−ＴＰの細胞内濃度を、それぞれ１００％、４５％およ び２５％増加させた。これらの結果は、２つの化合物が共に加えられるとき、Ａ ＺＴの細胞内有効形態をベスナリノンが増大させる、ことを示す。 Ｅ．チミジンのリン酸化 ベスナリノン対ジピリダモール ジピリダモールは、ヌクレオシド輸送の強力な阻害剤であり、また、レトロウ ィルス感染でＡＺＴの生物学的活性を強化することが期待されている（ワインシ ュタインら、上記）。従って、ベスナリノンとジピリダモールの、チミジンリン 酸化を増強する比較能力を調べた。 より詳細には、０〜２５０μＭ ベスナリノンまたは０〜１０００ｎＭ ジピ リダモール存在下に、１分以内での、Ｕ９３７細胞内の［³Ｈ］チミジン取込み を、上述のように測定した。ジピリダモールを、エタノールに溶解した５０ｍＭ のストック溶液として調製した。結果を、図１８Ａおよび１８Ｂに示す。図１８ Ａおよび１８Ｂに示されるように、ベスナリノン（図１８Ａ）とジピリダモール （図１８Ｂ）の両方とも、チミジン取込みを用量 依存性様式で阻害した。図１８Ａおよび１８Ｂはまた、ジピリダモールがベスナ リノンよりもヌクレオシド輸送のより強力な阻害剤であり；チミジン取込みに対 するＩＣ₅₀は、ジピリダモールで＜１０ｎＭであり、ベスナリノンで約２５μＭ であった、ことを明示する。 Ｆ．ＡＺＴのリン酸化 ベスナリノン対ジピリダモール 上述のように、０〜２５０μＭ ベスナリノンも０〜１０００ｎＭ ジピリダ モールも、チミジン取込みに対する効果を有さず、このことは、それらの両方が 、生理学的チミジン取込みの選択的阻害剤であることを示している。従って、細 胞内リン酸化ＡＺＴに対するこれらの化合物の効果を、次に調べた。 より詳細には、１０．０％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清および２．０ｍ Ｍ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン並びに１００μｇ／ｍｌのス トレプトマイシンを補足した１．０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中の１．０× １０⁷個／ｍｌのＵ９３７細胞を、０〜２５０−μＭ ベスナリノンまたは０〜 １００ｎＭ ジピリダモールの存在下に、５．０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］ＡＺＴ （１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに、３７℃にて２時間インキュベートした。次に 、細胞を集め、ＰＢＳで 洗浄し、そして４００μＩの６５％（ｖ／ｖ）エタノールの中で、２０分間０℃ にて溶解した。上清を、１４，０００ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で５分間遠心 することにより分離し、ＤＥＡＥフィルターペーパー（ワットマンＤＥ−８１） にのせた。フィルターペーパーを、１．０ｍＭ ギ酸アンモニウムで１０分間ず つ４回洗浄し、液体シンチレーションにより放射能を測定した。結果を、図１９ Ａおよび１９Ｂに示す。図１９Ａに示されるように、ベスナリノンは、Ｕ９３７ 細胞中リン酸化ＡＺＴ濃度を用量依存性様式で増加させた。しかしながら、図１ ９Ｂに示されるように、驚くべきことに、０〜１００ｎＭ ジピリダモールは、 チミジン輸送を０〜２５０μＭ ベスナリノンと同じ程度まで阻害するが、リン 酸化ＡＺＴの細胞内濃度には影響しなかった。これは、以前に報告されたＡＺＴ に関する知見と一致する（ワインシュタインら、上記）。この異なる効果の下に 横たわるメカニズム（一種または複数）は、現在不明のままであるが、ヌクレオ シド／ヌクレオベース輸送の阻害剤としてのこれら２つの化合物の間の相違に注 目することは重要である（クマクラら、上記）。ベスナリノンは、ヌクレオシド およびヌクレオベース輸送の両方を、同様に阻害するが、ジピリダモールは、ヌ クレオベース輸送に影響する ことなく、臨床的に到達可能な用量（＜１０μＭ）で、ヌクレオシド輸送を選択 的に阻害する（クマクラら、上記）。事実、高濃度のジピリダモールは、ベスナ リノンと同様にＡＺＴのリン酸化を増加する。これらの結果は、ヌクレオシド／ ヌクレオベース輸送の異なる阻害を生じるメカニズムが、ＡＺＴの異なるリン酸 化と相関するかもしれないことを示唆している。或いは、ジピリダモールまたは ベスナリノンは、別の活性を有しており、ヌクレオシド輸送の阻害とは独立に、 細胞内のＡＺＴのリン酸化を減少または増加するのかもしれない。 Ｇ．強化された抗ＨＩＶ−１効果 先に議論したベスナリノンの異なる効果をもたらすメカニズムは今日まで確定 されていないままであるが、それらのデータは、ベスナリノンがジピリダモール よりも、ＡＺＴ−ＴＰの細胞内濃度を増加することにより、ＡＺＴの抗ウィルス 活性を強化するのに、より効果的であるかもしれないことを示唆している。従っ て、ベスナリノンによるＡＺＴの抗ＨＩＶ−１効果の増強を、臨床サンプルから 単離したＨＩＶ−１の２つの独立株、１つはＡＺＴ感受性（１８ａ）、もう１つ はＡＺＴ耐性（１８ｃ）の、反応を評価することにより調べた。 より詳細には、ＰＢＭＣを、３．０μｇ／ｍｌのＰＨ Ａおよび１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２とともに、４８時間インキュベートした。次に 、ＨＩＶ−１の臨床的単離株である１８ａ（ＡＺＴ感受性）または１８ｃ（ＡＺ Ｔ耐性）を、１０〜１００ ＴＣＩＤ₅₀ウィルス／ｍｌ加えた。感染から２時間 後、細胞を、遠心によりウィルスから分離し、培養培地で２回洗浄し、そしてベ スナリノンおよび／またはＡＺＴの図２０Ａおよび２０Ｂに示す濃度での存在下 または非存在下に、９６ウェル培養プレートでインキュベートした。感染から５ 日後、上清を集め、ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原をｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（ネン (NEN)デュポン）を用いて測定した。 組合せ(combination)指数（ＣＩ）を、ジョンソン(Johnson)ら、J．Infect．D is .、159:837-844(1989)に記載されるように、チョウ(Chou)とタラ(Tala)の複数 薬剤効果分析を用いて、計算した。ＣＩ値の＜１、＝１、および＞１は、それぞ れ、相乗作用、相加作用、および拮抗作用を示す。結果を、図２０Ａ（株１８ａ ：ＡＺＴ感受性）および図２０Ｂ（１８ｃ：ＡＺＴ耐性）に示す。図２０Ａに示 されるように、ＡＺＴは単独で、１８ａ感染細胞中のｐ２４産生を阻害した（Ｉ Ｃ₅₀＝０．６７ｎＭ）。対照的に、図２０Ｂに示されるように、ＡＺＴは単独で は、１８ｃ感染細胞中のｐ２４産生を阻害しなかった （ＩＣ₅₀＞６４０ｎＭ）。ベスナリノンは単独でも、ｐ２４産生に対する阻害効 果を有したが、高濃度（＞５０〜１００μｇ／ｍｌ）でのみであった。図２０Ａ および図２０Ｂに明示されるように、ベスナリノンは、１８ａおよび１８ｃ感染 細胞に対するＡＺＴによるｐ２４の減少を、血清中で達成されうる濃度で増強し た。これおよび他の実験での組合せ指数は、１８ａに対しては０．００５と０． １３の間であり、１８ｃに対しては０．０６と０．５９の間であった。これらの 結果は、ベスナリノンが、これらの細胞中でＡＺＴの抗ＨＩＶ−１活性を増強す る、ことを示す。 要約すると、実施例４が実証していることは、（１）ベスナリノンは、チミジ ンの輸送を阻害するが、ＡＺＴについてはしない；（２）ベスナリノンは、細胞 中でのＡＺＴのリン酸化を増強する；および（３）ベスナリノンは、インビトロ でＡＺＴの抗ＨＩＶ−１活性を増強する、ことである。これらの結果は、ベスナ リノンとＡＺＴとの組合せが、ＨＩＶに感染した患者に有用である、ことを示す 。 本発明は特定の実施態様を参照して詳細に述べてきたが、種々の変更および修 飾が本発明の精神および範囲から離れることなしに為され得ることは、当業者に 明らか であろう。

【手続補正書】 【提出日】１９９６年７月１６日 【補正内容】請求の範囲 ： １． 薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とする哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌク レオベース(nucleobase)輸送阻害剤 。 ２． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容されるその塩である請求項１に記載の哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよび ヌクレオベース輸送阻害剤 。 ３． 薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするＤＮＡウィルス複製阻害剤。 ４． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容されるその塩である請求項３に記載のＤＮＡウィルス複製阻害剤。 ５． 前記ＤＮＡウィルスが単純ヘルペスウィルス１型、単純ヘルペスウィル ス２型、ヒトヘルペスウィルス６型、帯状疱疹ウィルス、ヒトサイトメガロウィ ルスおよびエプスタイン−バーウィルスからなる群から選ばれる請求項３に記載 のＤＮＡウィルス複製阻害剤。 ６． 前記ＤＮＡウィルスがエプスタイン−バーウィルスである請求項５に記 載のＤＮＡウィルス複製阻害剤。 ７． 前記ＤＮＡウィルスがサイトメガロウィルスである請求項５に記載のＤ ＮＡウィルス複製阻害剤 。 ８． 薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするエプスタイン−バーウィルス感染治療剤。 ９． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容されるその塩である請求項８に記載のエプスタイン−バーウィルス感染治療 剤 。 １０． 前記カルボスチリルが９−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］グ アニンおよび９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニンか らなる群から選ばれる抗ＤＮＡウィルス化合物と共同投与(co-administer)され る請求項８に記載のエプスタイン−バーウィルス感染治療剤。 １１． 薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするサイトメガロウィルス感染治療剤。 １２． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容 されるその塩である請求項１１に記載のサイトメガロウィルス感染治療剤。 １３． 前記カルボスチリルが９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ メチル）グアニンと共同投与(co-administer)される請求項１１に記載のサイト メガロウィルス感染治療剤 。 １４． 薬学的有効量の抗ＲＮＡウィルス化合物および薬学的有効量の下記一 般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするＲＮＡウィルス複製阻害剤。 １５． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペ ラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に許容されるその塩である請求 項１４に記載のＰＮＡウィルス複製阻害剤。 １６． 前記抗ＲＮＡウィルス化合物が３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、２’３’−ジデオキシシチジン、２’３’−ジデオキシイノシン、２’３’ −ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジンおよび５’３’−ジデオキシチア シチジンからなる群から選ばれる請求項１４に記載のＲＮＡウィルス複製阻害剤 。 １７． 前記ＲＮＡウィルスがＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病ウィルス、およびヒ ト免疫不全ウィルスII型からなる群から選ばれる請求項１４に記載のＲＮＡウィ ルス複製阻害剤 。 １８． 前記ＲＮＡウィルスがＨＩＶである請求項１７に記載のＲＮＡウィル ス複製阻害剤 。 １９． 薬学的有効量の抗ＲＮＡウィルス化合物および薬学的有効量の下記一 般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするＨＩＶウィルス感染治療剤。 ２０． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容されるその塩である請求項１９に記載のＨＩＶウィルス感染治療剤。 ２１． 前記抗ＲＮＡウィルス化合物が３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、２’３’−ジデオキシシチジン、２’３’−ジデオキシイノシン、２’３’ −ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジンおよび５’３’−ジデオキシチア シチジンからなる群から選ばれる請求項１９に記載のＨＩＶウィルス感染治療剤 。 ２２． ヌクレオシド・アナローグと共同投与(co-administer)される、薬学 的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を有効成分とするヌクレオシド・アナローグのリン酸化増強 剤 。 ２３． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容されるその塩である請求項２２に記載のヌクレオシド・アナローグのリン 酸化増強剤 。 ２４． 前記ヌクレオシド・アナローグが９−［（２−ヒドロキシエトキシ） メチル］グアニン、９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グア ニン、３’−アジド−３’−デオキシチミジン、２’３’−ジデオキシシチジン 、２’３’−ジデオキシイノシン、２ ’３’−ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジンおよび５’３’−ジデオキ シチアシチジンからなる群から選ばれる請求項２２に記載のヌクレオシド・アナ ローグのリン酸化増強剤 。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 哺乳動物細胞内のヌクレオシドおよびヌクレオベース(nucleobase)輸送 を阻害する方法であって、該哺乳動物細胞を薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩に曝す(exposing)ことを包含する方法。 ２． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容されるその塩である請求項１に記載の方法。 ３． ＤＮＡウィルス複製を阻害する方法であって、該ＤＮＡウィルスに感染 した細胞を薬学的有効量の下記 一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩に曝す(exposing)ことを包含する方法。 ４． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容されるその塩である請求項３に記載の方法。 ５． 前記ＤＮＡウィルスが単純ヘルペスウィルス１型、単純ヘルペスウィル ス２型、ヒトヘルペスウィルス６型、帯状疱疹ウィルス、ヒトサイトメガロウィ ルスおよびエプスタイン−バーウィルスからなる群から選ばれる請求項３に記載 の方法。 ６． 前記ＤＮＡウィルスがエプスタイン−バーウィルスである請求項５に記 載の方法。 ７． 前記ＤＮＡウィルスがサイトメガロウィルスである請求項５に記載の方 法。 ８． エプスタイン−バーウィルス感染を治療する方法であって、そのような 治療を必要としている被験者に薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を投与することを包含する方法。 ９． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメト キシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的に 許容さ れるその塩である請求項８に記載の方法。 １０． 前記カルボスチリルが９−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］グ アニンおよび９−（１，３−ヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニンから なる群から選ばれる抗ＤＮＡウィルス化合物と共同投与(co-administer)される 請求項８に記載の方法。 １１． サイトメガロウィルス感染を治療する方法であって、そのような治療 を必要としている被験者に薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を投与することを包含する方法。 １２． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６ −［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピぺラジニル］−２（１Ｈ） −キノリンまたは薬学的に許容されるその塩である請求項１１に記載の方法。 １３． 前記カルボスチリルが９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ メチル）グアニンと共同投与(co-administer)される請求項１１に記載の方法。 １４． ＲＮＡウィルス複製を阻害する方法であって、該ＲＮＡウィルスに感 染した細胞を薬学的有効量の抗ＲＮＡウィルス化合物および薬学的有効量の下記 一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩に曝す(exposing)ことを包含する方法。 １５． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピぺラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容されるその塩である請求項１４に記載の方法。 １６． 前記抗ＲＮＡウィルス化合物が３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、２’３’−ジデオキシシチジン、２’３’−ジデオキシイノシン、２’３’ −ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジンおよび５’３’−ジデオキシチア シチジンからなる群から選ばれる請求項１４に記載の方法。 １７． 前記ＲＮＡウィルスがＨＩＶ、成人Ｔ細胞白血病ウィルス、およびヒ ト免疫不全ウィルスII型からなる群から選ばれる請求項１４に記載の方法。 １８． 前記ＲＮＡウィルスがＨＩＶである請求項１７に記載の方法。 １９． ＨＩＶウィルス感染を治療する方法であって、そのような治療を必要 としている被験者に薬学的有効量の抗ＲＮＡウィルス化合物および薬学的有効量 の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を投与することを包含する方法。 ２０． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容されるその塩である請求項１９に記載の方法。 ２１． 前記抗ＲＮＡウィルス化合物が３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、２’３’−ジデオキシシチジン、２’３’−ジデオキシイノシン、２’３’ −ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジンおよび５’３’−ジデオキシチア シチジンからなる群から選ばれる請求項１９に記載の方法。 ２２． ヌクレオシド・アナローグのリン酸化を増強する方法であって、該ヌ クレオシド・アナローグおよび薬学的有効量の下記一般式（１）： ［式中、Ｒは、任意にフェニル環に置換基として低級アルコキシ基を有しても良 いベンゾイル基であり、カルボスチリル骨格の３および４位の炭素−炭素結合は 単結合または二重結合である］で示されるカルボスチリル誘導体、または薬学的 に許容されるその塩を細胞に共同投与(co-administer)することを包含する方法 。 ２３． 前記カルボスチリルが３，４−ジヒドロ−６−［４−（３，４−ジメ トキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−２（１Ｈ）−キノリンまたは薬学的 に許容されるその塩である請求項２２に記載の方法。 ２４． 前記ヌクレオシド・アナローグが９−［（２−ヒドロキシエトキシ） メチル］グアニン、９−（１，３−ヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニ ン、３ ’−アジド−３’−デオキシチミジン、２’３’−ジデオキシシチジン、２’３ ’−ジデオキシイノシン、２’３’−ジデヒドロ−２’３’−ジデオキシチミジ ンおよび５’３’−ジデオキシチアシチジンからなる群から選ばれる請求項２２ に記載の方法。