JPH09506090A - プロリル・エンドペプチダーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、立体異性体類の全部を含めた式１

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 プロリル・エンドペプチダーゼ阻害剤 プロリンに結合されたペブチド結合は、特異性の広いペプチダーゼ類に対して 比較的抵抗力があると思われ［メントレイン（Mentlein）、1988年］、プロリン を含有するペプチド結合を加水分解するペプチダーゼ類が、プロリン含有ペプチ ド類の代謝に重要でありうることを示唆している［アタック（Atack）ら、Eur． J．of Pharm．205巻157-163頁(1991年)］。プロリル・ペプチダーゼは生物学的 に活性のあるプロリン含有ペプチド類の代謝において、このような役割を果たし ていると思われる。この酵素は、プロリンを含有する生物学的に活性のある多く のペブチド類、例えばオキシトシン、チロトロピン放出ホルモン、黄体形成ホル モン放出ホルモン、アンギオテンシンII、ブラジキニン、サブスタンスＰ、ニュ ーロテンシン、及びパソプレッシンを加水分解する。 プロリル・エントペプチダーゼはカルボキシ末端側プロリン切断酵素として、 活性ペプチド類を分解する働きをもつ。特定的には、プロリル・エンドペプチダ ーゼはプロリン残基のカルボキン側てペプチド結合を加水分解することによって 作用する。プロリル・エンドペプチダーゼは作用機作的には、セリンプロテアー ゼとして作用すると考えられ、α-キモトリプシン、トリプシン、及 びズブチリシシのような他のセリンプロテアーゼと同様な機作によって、ペプチ ド結合を切断する。 この酵素は一般にプロリン誘導体類を含有するペプチド結合に作用するが、酵 素形態は異なる組織源において変わるようであり、その場合、酵素は基質特異性 の差を示す。プロリル・エンドペプチダーゼは幾つかの植物（人参、マッシュル ーム）、微生物（フラボバクテリウム・メニゴセプチクム、Flavobacterium men igosepticum）及び動物組織から精製されている。動物では、この酵素は体全体 に遍在的に見られるが、プロリル・エンドペプチダーゼは一般に中枢神経系（CN S）内で最高濃度で見出ざれる［ウィルク（Wilk）、1983年］。動物の供給源の 基質に対して試験するための一般的な酵素の供給源は、牛、ラット、及びハツカ ネズミの脳であった。 プロリル・エンドペプチダーゼの低分子量阻害剤が研究された。これらの阻害 剤は一般にプロリンの化学誘導体、又は末端プロリンを含有する小ペプチド類で ある。ベンジロキシカルボニル-プロリル-プロリナールは、この酵素の特異的な 遷移状態阻害剤であることが示された［ウィルク・エス（Wilk，S.）及びオーロ エスキ・エム（Orloeski，M.）、J．Neurochem．41巻69頁（1983年）；フリード マン（Friedman）ら、Neurochem．42巻237頁（1984年）］。L-プロリン又はL-プ ロリル-ピロリジンのN-末端置換物［アダックら、Eur．J．of Pharm．205 巻157-163頁(1991年)、JP 03 56,460、EP 384.341)、並びにプロリナールを含有 するN-ベンジロキシカルボニル(Z)ジペプチドをカルボキシ末端で変更したもの が、プロリル・エンドペプチダーゼ阻害剤として合成されている［ニシカタ（Ni shikata）ら、Chem．Pharm．Bull．34巻(７号)2931-2936頁(1986年)；ベーカー ・エイ（Baker，A.）ら、Bioorganic & Medicinal Chem．Letts．１巻(11号)585 -590頁(1991年)］。核構造のチオプロリン、チアゾリジン、及びオキソピロリジ ン置換体類は、プロリル・エンドペプチダーゼを阻害することが報告されている ［ツル（Tsuru）ら、J．Biochem．94巻1179頁(1988年)；ツルら、J．Biochem．1 04巻580-586頁（1988年）；サイトー(Saito)ら、J．Enz．Inhib．5巻51-75頁(19 91年)；ウチダ・アイ（Uchida，I.）ら、PCT国際出願WO 90 12,005、JP 03 56,4 61、JP 03 56,462］。同様に、種々のフッ素化ケトン誘導体類［ヘニング(Henni ng)，EP 4,912,127］を含めた、カルボキシ末端プロリンの種々の変更が行なわ れた。フッ素化ケトン誘導体類の一般的な合成怯が記載されている［アンゲラス トロ・エム・アール（Angelastro，M.R.）ら、Tetrahedron Letters 33巻(23号) 3265-3268頁(1992年)］。アシル−プロリンやアシル−ペプチド−プロリン（Z-G ly-Pro-CH₂Cl）のクロロメチルケトン誘導体類などのその他の化合物類は、酵素 の活性位置をアルキル化することによって酵素を阻害 することが実証されている［ヨシモト・ティー（Yoshimoto．T.）ら、Biochemis ty 16巻2942頁(1977年)］。 発明のまとめ 本発明は立体異性体類の全部を含めた、式１のペプチド誘導体類について特許 請求している。 式中、Ａはペンジル又はｔ−ブチル基である。 X₁は-S-、又は-CH₂-、 X₂は-S-、又は-CH₂-、 Bは-CF₃-又は-CF₂CF₃である。 式１の好ましい誘導体類が、上記マーカッシュ形式群内に含まれ、従って、更 に群を選んで選ばれた置換基を含んだ下位概念の群を形成することができること が理解される。式Ｉの好ましい群は、本明細書に示される実証された実旌例の態 様を更に含むようにも選択できる。 式１化合物類は酵素プロリルエンドペプチダーゼの重要な阻害剤である。新規 な阻害剤はカルボキシ末端のペンタフルオロエチル置換基を含有するジプロリル ペプチドの誘導体類である。そのジプロリルペプチドの誘導体類中で、X₁又はX₂ として硫黄が選ばれるとき、プロリン部分がチオプロリン誘導体で置換できる。 本発明のペプチド類似林類は、潜在的にプロリルエンドペプチダーゼ の有意の阻害活性をもち、従って健忘症と記憶不足を処置し、並びに記憶機能を 強化するための科学的に興味深い、治療的に有意義の補助薬となっている。さら に、チアゾリジン官能基の存在は、これらの化合物に強化された効力とより長い 作用期間を提供しうる。 本発明の更に一つの目的は、記憶回復や強化への治療的介入のモデルとしての 、プロリルエントペプチダーゼの蛋白質分解活性を阻害することである。蛋白質 分解活性の阻害は、望ましくない高水準の酵素を制御するのに役立ち得る。プロ リルエンドペプチダーゼの阻害剤は幾つかのグループによって、ラット及びハツ カネズミのモデルで抗健忘症効果をもつことが報告された［ヨシモト（Yoshimot o）ら、J．Pharmacobio-Dyn．10巻730頁(1983年)；及びサイトーら、J．Enz．In hib．3巻163頁(1990年)；ウチダ・アイ（Uchida，I.）ら、PCT国際出願WO 90 12 ,005］。理論に縛られることを望んでいないが、さ記憶の強化とプロリルエンド ペブチダーゼ阻害との相互関係は、酵素がバソプレッシンを分解する能力がある ためであると考えられる。更に、プロリルエンドペプチダーゼの阻害剤は、ハツ カネズミでスコポラミン誘発性の記憶不足を逆転させることが示された［アタッ クら、Eur．J．of Pharm．205巻157-163頁(1991年)］。 本発明のジペプチド類の合成による製造は、反応経路Ｉに示され、以下のペー ジに記載されている。 プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の合成 反応経路ＩのＡ−Ｇは、式１化合物類の合成を示す。 カルボキシ末端ペンタフルオロエチルケトン類（化合物IVaとIVb）又はメトキ シメチルアミノアミド類（化合物IIaとIVb）をもった式１化合物類の合成用の必 須中間体類は、アンゲラストロ・エム［Tetrahedron Letters33巻(23号)3265-32 68頁(1992年)；及びナーム・エス(Nahm，S)及びワインレブ・エス・エム(Weinre b，S.M.)、 Tetrahedron Letters 22巻3815頁(1981年)］により記載された方法で本質的に調 製できる。 反応経路Ｉ、段階Ａは式IIａとIIbのメトキシメチルアミノアミド類の一般的 な調製を示す。式IIa及びIIb化合物類は、ｔ−ブトキシカルボニル保護されたプ ロリン（2-ピロリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル）とチオプロリン （チアゾリジン-3,4-ジカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル）誘導体類から 、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩との反応によって調製できる。この反 応は、本質的に、ナーム・エス及びワインレブ・エス・エム、Tetrohedron Lett ers 22巻3815頁(1981年)に記載されているとおりに実施できる。本質的に、N,O- ジメチルヒトロキシルアミン塩酸塩のカップリングは、水溶性カルボジイミドの ような適当なカップリング試薬を使用して行なわれ、生成物はこの技術で知られ た標準的な単離手段によって精製できる。 段階Ｂは、IIaのチオプロリンのｔ−ブトキシカルボニル保護基が酢酸エチル 中での塩酸処理のような適当な酸処理によって除去されると、対応するN-メトキ シ-N-メチル-4-チアゾリジンカルボキサミド一塩酸塩（化合物III）がつくられ ることを示す。最終生成物は、当業者に知られた慣用的な単離技術を用いて適当 に精製できる。 段階Ｃでは、IIの化合物類はIVa及びIVbのペンタフルオロエチルケトン類に転 化できる。ヨウ化ペンタフルオロエチルとメチルリチウム・臭化リチウム錯体と から現場生成されるペンタフルオロエチルリチウムとの反応は、化合物IIa又はI Ibのヒドロキサメートをそれぞれ式IVa又はIVb化合物類へ転化するのに適した手 段である。この反応は、本質的にアンゲラストロ・エム・アールら、Tetrahedro n Letters 33巻3265頁(1992年)に記載されたとおりに実施される。最終生成物は 当業者に知られた慣用的な単離法によって適当に精製できる。 段階Ｄは、IVa又はIVbのｔ−ブトキシカルボニル保護基が酸に不安定であって 、酢酸エチル中の塩酸処理のような適当な酸処理によって除去できることを示す 。酸処理は式Va又はVbの対応する化合物類（各々4-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ- 1-オキソプロピル)-チアゾリジン一塩酸塩又は2-(2.2.3,3.3-ペンタフルオロ-1- オキシプロピル)ピロリジン塩酸塩）を生ずる。最終生成物は当業者に知られた 慣用法によって適当に精製できる。 段階Ｅは、一般に二つの適当に置換されたアミノ酸を縮合させて、2-[[2-(2,2 ,3.3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル]カルボニル]-1-ピ ロリジンカルボン酸フェニルメチルエステル（VIIb）又は4-[[2-(2,2,3,3,3-ペ ンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル]カルボニル]-3-チアゾリジン カルボン酸 フェニルメチルエステル(VIIa)等を生ずることを示す。２つの保護アミノ酸類を 縮合させて、２個の間にアミド結合を形成することは、この技術で周知である。 ジメチルホルムアミドのような適当な溶媒中で、化合物IVのカルボキシ末端の酸 を塩化オキザリルで転化させることを含めて、幾つかの縮合法が細られている。 次に、酸塩化物をVbのアルファーアミノ基と縮合できる。次に、最終生成物は当 業者に知られた慣用法を用いて精製できる。 段階Ｆは、4-[[4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-3-チアゾリジニル]カ ルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステルのような、化 合物VIIIのジチアゾリジン誘導体類の調製を示す。カップリング試薬によってIa のような化合物をIIIと縮合させて、２つの保護アミノ酸の間にアミド結合を形 成させることは、この技術で周知である。水溶性カルボジイミドのような種々の カルボジイミド類で行なわれる縮合を含めて、幾つかの縮合法が知られている。 次に縮合後、最終生成物は当業者に知られた慣用法を用いて精製できる。 段階Ｃでのように、末端メトキシメチルアミノカルボニルをもったジペプチド 類は、段階Ｇに示すように置換反応にかけられる。化合物VIIIは現場生成される ペルフルオロエチルリチウム（段階Ｃを参照）での置換を受けて、対応する4-[[ 4-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-3-チアゾリジニル]カルボニ ル]-3-チアゾ リジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステルを生ずる。置換後、最終生成物は 当業者に知られた慣用の単離技術を用いて精製できる。 天然のプロリン誘導体類はキラル炭素原子を含有している。詳細には、プロリ ンもチオプロリンも環窒素に対してアルファである炭素がキラルであることがわ かる。従って、プロリンとチアゾプロリン誘導体は、一つ以上の可能な立体異性 体として存在しうる。他に特定的に指示がなければ、本明細書で引用される光学 活性アミノ酸類はL-立体配置のものである。しかし、キラリティは特定的にはD- 又はL-立体配置のいずれかに指定される。 ケトン官能基は、ケトンとして、又は水和ケトンとして、又はこの二つの状態 の混合物として存在しうることが理解される。例えば、ペンタフルオロエチルケ トン基は2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1,1-ジヒドロキシプロピル又は2.2.3,3,3- ペンタフルオロ-1-オキソプロピル置換基と名付けられる。 ポリペプチド配列に導入される各アミノ酸と共に使用されるα-アミノ保護基 は、この技術で知られた任意のこのような保護基でありうる。考えられるα-ア ミノ保護基類には、(1)アシル型保護基、例えばホルミル、トリフルオロアセチ ル、フタリル、トルエンスルホニル（トシル）、ベンゼンスルホニル、ニトロフ ェニルスルフェニル、トリチルスルフェニル、o-ニトロフェノキシ アセチル、及びα-クロロブチリル；(2)芳香族ウレタン型の保護基、例えばベン ジロキシカルボニル、及び置換ベンジロキシカルボニル、例えばp-クロロベンジ ロキシカルボニル、p-ニトロベンジロキシカルボニル、p-ブロモベンジロキシカ ルボニル、p-メトキシベンジロキシカルボニル、1-(p-ビフェニル)-1-メチルエ トキシカルボニル、α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジロキシカルボニル、及び ベンズヒドリロキシカルボニル；(3)脂肪族ウレタン保護基、例えば第三ブチロ キシカルボニル（Boc）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピロキ シカルボニル、エトキシカルボニル、及びアリロキシカルボニル；(4)シクロア ルキルウレタン型の保護基、例えばシクロペンチロキシカルボニル、アダマンチ ロキシカルボニル、及びシクロヘキシロキシカルボニル；(5)チオウレタン型の 保護基、例えばフェニルチオカルボニル；(6)アルキル型の保護基、例えばトリ フェニルメチル（トリチル）及びベンジル；及び(7)トリメチルシランのような トリアルキルシラン基がある。好ましいα-アミノ保護基は第三ブチロキシカル ボニル（Boc）又はベンジロキシカルボニルである。 治療薬としての式１化合物類の用途とそれらの投与方式を以下に述べる。 治療的用途 記憶増強剤としての本発明化合物の用途は、精神的能 力の改善、認識的出来事の追想能力、及び学習した運動活動力を含んでいる。こ のようなものとして、本発明化合物類は失語症、失行症、失認症、又は退行性健 忘症や外傷後の健忘症を含めた任意のタイプの健忘症、良性の健忘性、及びコル サコフ症侯群にかかった患者に有用である［「メルク診断治療マニュアル」第15 版、1987年］。化合物類は記憶の増強と機能の治療に有用である可能性を有する から、これらは追加的に記憶不足を予防すること又は遅らせることに有用であり うる。治療的投与 本発明のペプチド誘導体を必要な患者の治療に使用する時に、その適当な投与 量は特定患者と選択されるペプチド誘導体に関わる他の要因にもよるが、１日当 たり患者体重kg当たり0.2mg/kg〜250mg/kgの範囲にある。特定患者に対する適し た投与量は、容易に決定できる。好ましくは１日1-4回の投与量で、典型的には 、投与量当たり活性化合物5-100mgが段与されよう。本発明のペプチドの必要量 は、当業者に容易に決定できる。 本明細書で使用される用語の「患者」は、ヒトを含めた霊長類、羊、馬、牛、 豚、犬、猫、ラット、及びハツカネズミのような哺乳類を意味するものとする。 ペプチド誘導体の幾つかは経口投与後、腸内を通過しても生残るが、出願人ら は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内、又は腹膜内投与；デポー注射によ る投与 ；インプラント製剤による投与；又は噴霧形式や乾燥粉末形式で本発明のペプチ ド誘導体を含有するアエロゾル缶などによる、鼻、のど、及び気管支のような粘 膜への適用を好ましいと考える。 非経口段与には、製薬上の担体を伴った生理学的に受入れられる増量剤中の化 合物の溶液又は懸濁液の注射可能な適量として化合物類を投与できる。担体は、 水や油のような滅菌液体であり得、これに表面活性剤その他の製薬上受入れられ る助剤を加えても、加えなくてもよい。これらの製剤に使用できる油類の例は、 石油、動植物、又は合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、及び鉱油である 。概して、水、食塩水、テキストロース及び関連する糖水溶液、エタノール、及 びプロピレングリコールやポリエチレングリコールのようなグリコール類が、特 に注射液用に好ましい液体担体である。 薬理学的に有用な薬剤として、所望の効果を達成するために、式１化合物類は 処置しようとする患者に種々の方法で投与でき、例えば化合物類を単独で、又は 製薬上受入れられる担体と組合せて投与できる。 本明細書で使用される以下の略字は、本発明の化合物類の例や用途を記載する 際に使用される。略字 Boc-L-Pro-OH N-第三ブトキシカルボニル-L-プロリン CBZ-L-Pro-OH N-カルボベンゾキシ-L-プロリン CBZ-L-Pro-Cl N-カルボベンゾキシ-L-プロリルクロライド CBZ-L-ThioPro-OH N-カルボベンゾキシ-L-チオプロリン CBZ-Gly-Pro-p-ニトロアニリド N-カルボベンゾキシ−グリシニル-L-プロ リン-p-ニトロアニリド cm センチメートル DMAP 4-ジメチルアミノピリジン DMSO ジメチルスルホキシド DTT ジチオスレイトール EDTA エチレンジアミン四酢酸 HEPES 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン−エタンスルホン酸 [I] 阻害剤濃度 Ki 阻害定数 KOH 水酸化カリウム NMM N-メチルモルホリン ¹H-NMR 水素-1核磁気共鳴 ¹⁹F-NMR フッ素-19核磁気共鳴 Ｍ モル濃度 MH+ プロトン化親イオン塊 ml ミリリットル min 分 mol モル mmol ミリモル nm ナノメートル pH 水素イオン濃度の対数に負号をつけたもの [S] 基質濃度 TLC 薄層クロマトグラフィ WSCDI 水溶性カルボジイミド。特定的には、1-(3-ジメチルアミノプロピル )-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 vo 初期反応速度（initial kinetic rate） 実施例 本発明は以下の実施例を考慮すると更に明確なものとなろう。これらの実施例 は、本発明の使用について純粋に例示的であることを意図している。本発明のそ の他の態様は、本明細書の考慮や関示された発明の実施から、当業者に明らかで あろう。本発明は、下の表１に記載の、また本明細書で更に説明されている非限 定的な以下の実施例によって例示されている。 実施例１ I． 2-[[2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル]カ ルボニル]-1-ピロリジンカルボン酸フェニルメチルエステル(反応経路Ｉ、化合 物VIIb)の合成 IA． (R)-2-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-1- ピロリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル(反応経路Ｉ、化合物IIb)の 合成 塩化メチレン(125ml)中のBoc-L-Pro-OH（4.31g，20.0mmol）とDMAP(2.44g，20 .0mmol)のかきまぜた溶液に、アルゴン下にN,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩 酸塩（1.95g，20.0mmol）とNMM(2.20ml，20.0mmol)を加える。次に、水溶性カル ボジイミド(3.83g，20.0mmol)を溶液に加える。反応を一夜進行させてから、約2 0mlに濃縮する。濃縮懸濁液を8×14cmシリカゲルカラムに充填し、酢酸エチル／ ヘキサン（60:40）で溶離することによって懸濁液をフラッシュ・クロマトグラ フィで精製する。表題の生成物を含有するフラクション(Rf=0.32)を一緒にし濃 縮すると、無色の油(3.21g)を生ずる。生成物の質量スペクトル分析は、MH+=259 .1655を与えた［C₁₂H₂₃N₂O₄の予測質量値＝259.1658］。 ピル)-1-ピロリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（反応経路Ｉ、化合 物IVb）の合成 エチルエーテル（35ml）中の2-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-1-ピロ リジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（実施例IAからの化合物、1.03g ，4.00mmol）のかきまぜた溶液に、アルゴン下に-78℃で、ヨウ化ペルフルオロ エチル(1.5ml，12.8mmol)を加え、続いてメチルリチウム・臭化リチウム(エチル エーテル中1.5M； 7.5ml，11.25mmol)を加えた。-78℃て30分後、溶液を氷水浴中で０℃に温めた。 H₂O(8ml)中のKHSO₄(1.36g，10.0mmol)を加えて、反応を停止させた。数分間激し くかきまぜた後、二相懸濁液の両層とも透明になり、H₂O(50ml)を含有する分液 ろうとに混合物を移した。層を分離し、有梳相をNaHCO₃の半飽和水溶液(50ml)に 続いて、塩水(25ml)で洗った。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮すると 、薄黄色の油（1.3g）を生じた。 生成物を酢酸エチル／ヘキサン(15:85)に続いて酢酸エチル／ヘキサン(60:40) 1.3リットルで溶離する5×15cmシリカゲルカラム上のフラッシュ・クロマトグラ フィによって精製した。生成物フラクションを一緒にし、濃縮すると、無色液体 (0.94g)を生じた。生成物の質量スペクトル分析は、MH+=318.1135を与えた［C₁₂ H₁₇F₅NO₃の予測質量は、（MH+）=318.1129］。 IC． 2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)ピロリジン塩酸塩（反 応経路Ｉ、化合物Vb）の合成 (2,2,3,3,3-ペンタフルオロ−1-オキソプロピル)-1-ピロリジンカルボン酸1,1- ジメチルエチルエステル（実施例IBからの化合物，121mg，0.38mmol）のかきま ぜた溶液に、HClガスを５分吹込んた。HClの吹込みを終えて、反応物にふたをし 、更に２時間かきまぜた。次に、反応物を無色の油まで濃縮し、高真空下にKOH ペレットで３時間乾 燥させると、固化した生成物(103mg)を生じた。 生成物の質量スペクトル分析は、MH+=218.0601を与えた［C₇H₉F₅NOの予測値は 、MH+=218.0604］。 ID． 2-[[2-(2,2,3,3.3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル] カルボニル]-1-ピロリジンカルボン酸フェニルメチルエステル（反応経路Ｉ、化 合物VIIb）の合成 塩化メチレン(10ml)中のCBZ-L-Pro-OH(0.62g，2.49mmol)と１滴のDMFとのかき まぜた溶液に、アルゴン下に塩化オキサリル（0.26ml，2.99mmol）を加えると、 激しいガス発生が起きた。ガス発生が止まった後、反応物を更に30分かきまぜた 。次に、反応物を濃縮すると、N-カルボベンゾキシ-L-プロリルクロライド（CBZ -L-Pro-Cl）を薄黄色の油として生じた。 塩化メチレン(10ml)をCBZ-L-Pro-Clに加え、次にこれをアルゴン下に、塩化メ チレン(7ml)中に溶解された2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ−1-オキソプロピル) ピロリジン塩酸塩（実施例ICからの化合物、2.49mmol）とN-メチルモルホリン（ 0.54ml，4.98mmol）の懸濁液と反応させた。2.5時間後、反応物を濃縮し、塩化 メチレン(1ml)中に取り上げ、生成物を酢酸エチル／ヘキサン(50:50)で溶離する シリカゲルカラム上のフラッシュ・クロマトグラフィによって精製した。生成物 フラクションを集めて濃縮すると、所望の生成物（0.52g）を無色の油とし て生じた。 生成物の質量スペクトル分析は、MH+=449.1508を与えた[C₂₀H₂₂F₅N₂O₄の予測 質量は、（MH+）=449.1500]。 II． 4-[[2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル]カ ルボニル]-3-チアソリジンカルボン酸フェニルメチルエステル（反応経路Ｉ、化 合物VIIa） IIA． チアゾリジン-3,4-ジカルボン酸3-フェニルメチルエステル（反応経路 Ｉ、化合物VIa） 氷水浴中で冷却されたL-チアゾリジン-4-カルボン酸（13.32g，0.10mole）の 激しくかきまぜた溶液に、ベンジルクロロフォルメート（15.70ml，0.11mmol） と2N水酸化ナトリウム（55ml）を加えるが、20分間にわたり5ml量ずつ交互に添 加した。添加10分後に、反応物を室温にもっていき、更に30分かきまぜた。次に 、反応物をエチルエーテル（3×75ml）で抽出し、水層を6N HCl（約20ml）で酸 性にした。分離した有機物を集め、エチルエーテル(100ml)中に溶解し、塩水(50 ml)で洗った。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次に粘性の無色の油（20.4g） まで濃縮した。 IIB． 4-[[(2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニ ル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸フェニルメチルエステル（反応経路 Ｉ、化合物VIIa）の合成 アルゴン下に-17℃に冷却された塩化メチレン(15ml)中のCBZ-L-ThioPro-OH（ 実旌例IIaからの化合物、267mg，1.00mmol）とNMM（0.12ml，1.05mmol）のかき まぜた溶液に、イソブチルクロロフォルメート（0.13ml，1.00mmol）を加えた。 20分後、追加のNMM(0.12ml，1.05mmol)を加え、続いてアセトニトリル(10ml)中 の2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)ピロリジン塩酸塩（化合物I C；253mg，1.00mmol）の薄い懸濁液を数分間にわたって添加した。-20℃で1.5時 間後、反応物を室温に温め、１時間かきまぜた。次に、反応物を濃縮し、塩化メ チレン(3ml)を残留物に加え、これを4×15cmのシリカゲルカラムに充填した。カ ラムを酢酸エチル／ヘキサン（30:70）400mlに続いて酢酸エチル／ヘキサン（35 :65）で溶離した。生成物を含有するフラクションを一緒にし濃縮すると、無色 粘性の油(63mg)を与えた。生成物の¹質量スペクトル分析は、MH+=467.1053を与 えた[C₁₉H₂₀F₅N₂O₄Sの予測値は、（MH+）=467.1064]。 III． 4-[[4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-3-チアゾリジニル]カルボニ ル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（反応経路Ｉ、化合 物VIII）の合成 IIIA． チアゾリジン-3,4-ジカルボン酸3-(1,1-ジメチルエチル)エステル（反 応経路Ｉ、化合物Ia）の合成 THF/H₂O(1:1，100ml)中のL-チアゾリジン-4-カルボン 酸（10.0g，75.09mmol）の激しくかきまぜた懸濁液に、炭酸ナトリウム（11.94g ，0.11mole）に続いてジ第三ブチルジカーボネート（16.39g，75.09mmol）を加 えた。生ずる懸濁液を室温で一夜かきまぜた。次に、反応物を濾過し、濾液をジ エチルエーテル（100ml）の入った分液ろうとに移し、層を分離した。水層を新 しいジエチルエーテル(200ml)で覆い、1N塩酸で酸性化した。有機層を0.5N塩酸 水溶液に続いて塩水(50ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮すると白色 固体（14.56g）を生じた。¹H-NMRスペクトルは予想の構造と一致していた。10.5 6(s-1H，CO₂H)，4.78(m-1H，CH)，4.59,及び4.39(pr d，2H，J=8Hz；NCH₂S)，3. 22-3.36(m，2H，CH₂S)，1.43[s，9H，OC(CH₃)₃]。 IIIB． 4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1, 1-ジメチルエチルエステル（反応経路Ｉ、化合物IIa）の合成 塩化メチレン（40ml）中のチアゾリジン-3,4-ジカルボン酸3-(1,1-ジメチルエ チル)エステル（2.33g，9.99mmol）とDMAP（1.22g，9.99mmol）のかきまぜた溶 液に、アルゴン下に、塩化メチレン(15ml)中のN,O-ジメチルヒドロキシアミン塩 酸塩（0.98g，9.99mmol）とNMM（1.10ml，9.99mmol）の懸濁液を加えた。次に、 水溶性カルボジイミド（1.92g，9.99mmol）を溶液に加え、反応を一夜進ませた 。次に、反応物を約15mlに濃縮し、懸濁液を 6×10cmのシリカゲルカラムに充填し、酢酸エチル／ヘキサン(50:50)で溶離する ことにより、フラッシュ・クロマトグラフィで精製した。生成物を含有するフラ クション（Rf=0.39）を一緒にし、濃縮すると無色の油(1.95g)を生じた。生成物 の質量スペクトル分析は、MH+=277.1216を与えた[C₁₁H₂₁N₂O₄Sの予測質量は、（ MH+）=277.1222]。 IIIC． N-メトキシ-N-メチル-4-チアゾリジンカルボキサミド一塩酸塩（反応 経路Ｉ、化合物III）の合成 氷水浴中で冷却された酢酸エチル中の4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル] -3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（実施例IIIBからの化 合物；1.05g，3.80mmol）のかきまぜた溶液に、HClガスを10分間吹込んだ。ガス 添加後、反応物にふたをし、更に２時間かきまぜた。次に、反応物を無色の油ま で濃縮し、高真空下にKOHペレットで３時間乾燥すると、固化した白色固体（0.7 6g）を生じた。 IIID． 4-[[4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-3-チアゾリジニル]カル ボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（反応経路Ｉ、 化合物VIII）の合成 塩化メチレン(20ml)中の3,4-チアソリジンカルボン酸3-(1.1-ジメチルエチル) エステル（実施例IIIAからの化合物；0.81g，3.49mmol）とDMAP（0.43g，3.49mm ol）の かきまぜた溶液に、アルゴン下に、NMM（0.38ml，3.49mmol）に続いて塩化メチ レン(10ml)中のN-メトキシ-N-メチル-4-チアゾリジンカルボキサミド一塩酸塩（ 実施例IIICからの化合物；0.76g，3.49mmol）、及び水溶性カルボジイミド（0.6 7g，3.49mmol）を加えた。反応終了後、反応物を約10mlに濃縮し、5×13cmシリ カゲルカラムに充填し、アセトン／酢酸エチル（8:92）で溶離するフラッシュ・ クロマトグラフィにかけた。生成物を含有するフラクション(Rf=0.66)を一緒に し、濃縮すると白色フォーム（0.35g）を生じた。生成物の質量スペクトル分析 は、MH+=392.1324を与えた[C₁₅H₆₀N₃O₅S₂の予測質量は、（MH+）=392.1314]。 IV． 4-[[4-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-3-チアゾリジニル] カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（反応経路 Ｉ、化合物IX）の合成 IVA． 4-[[4-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ−1-オキソプロピル)-3-チアゾリジ ニル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエステル（反 応経路Ｉ、化合物IX）の合成 エチルエーテル(30ml)中の4-[[4-[(メトキシメチルアミノ)カルボニル]-3-チ アゾリジニル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸1,1-ジメチルエチルエス テル（実施例IIIDからの化合物；0.33g，0.84mmol）のかきまぜ た溶液に、アルゴン下に-78℃で、ヨウ化ペルフルオロエチル（0.32ml，2.70mmo l）に続いてメチルリチウム・臭化リチウム（1.57ml，2.36mmol，エチルエーテ ル中1.5M溶液）を加えた。TLCは、反応が終了したことを示した。シリカゲル25g を含有するエチルエーテル100ml中に反応物を注いた。フラスコ内の生成物の残 留量をエチルエーテルに溶解し、シリカノエーテル溶液に加えた。続いて、有機 相を除去し、シリカゲルをエチルエーテル（2×100ml）で洗った。一緒にした有 機物を硫酸マグネシウム及び硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して蒸発させると、 油状の白色フォーム（0.34g）を生じた。次に、材料を酢酸エチル／ヘキサン（3 0:70）0.4リットルに続いて酢酸エチル／ヘキサン（75:25）0.5リットルで溶離 する、4×10cmのシリカゲルカラム上でフラッシュ・クロマトグラフィにかけた 。生成物を含有するフラクションを一緒にし、油(49mg)まで濃縮した。 生成物の質量スペクトル分析は、（MH+）=451.0799を与えた[C₁₅H₂₀F₅N₂O₄S₂ の予測質量は、（MH+）=451.0785]。合成検定 合成反応は、一般的に酢酸エチル：ヘキサン溶媒で展開されるアナルテク製の シリカゲルプレート上でのTLCによって追跡された。化合物類は、プレートをア ルカリ性過マンガン酸カリウムで処理し、続いて加熱すること によって同定された。 Ｖ． 酵素阻害検定 トリス緩衝液の代わりに50mM HEPES（pH 7.4）を使用する以外は、本質的にヨ シモトら［Biochem．94巻1179頁(1983年)］に記載されるように、プロリルエン ドペプチダーゼを牛の脳から部分的に精製した。この酵素製剤は定常的な阻害測 定に適しているが、酵素を下記のように更に精製できる。酵素の精製状態は、測 定されるKiに影響するとは予想されない。50-80％硫酸アンモニウムカットから のペレットを均質化緩衝液に再溶解し、ファーマシア製モノＱカラム（0.5×5cm ）に毎分１mlの速度で通して説塩し、カラムを緩衝液Ａ〜緩衝液Ｂ5ml（全量20m l；緩衝液Ａ＝50mM HEPES、pH 7.4、1mM EDTA、及び１mM DTT；緩衝液Ｂ＝緩衝 液Ａ＋0.5M NaCl）で洗う。酵素活性は約［NaCl］=0.25Mで溶出される。予備的 データは、酵素が長期（１〜２か月以上）の保存に安定でなく、従って新しい酵 素製剤が好ましいことを示唆している。 酵素は、20μMの基質（CBZ-Gly-Pro-p-ニトロアニリド）を含有する緩衝液Ａ （3.0ml）中で37℃で検定される。410 nmでの吸光度の増加をモニターする（410 nm=8.4 nM^-1cm^-1）。阻害剤原液は、DMSO中でつくられる。可逆的な競争的阻害 剤の特性を決定するために、３つの阻害剤濃度の存在下における初期速度を、[S ]=50μM（基質K_Mは11μM）を用いて測定する。遅い結合が観察され る場合は、最終平衡速度を使用する。 競争的阻害剤のKiは、既知の式： v_o/v_i = (1 + [I]/K_i，app)、及び K_i = K_i，_app/(1 + [S]/K_M) を用いて計算される。式中、v_oは阻害剤の非存在下における初期速度、v_iは濃度 [I]における阻害剤の存在下での初期速度であり、また[S]は基質濃度である。「 遅い結合」が観察される場合（すなわち、結合平衡への接近が遅い場合）は、初 期速度よりも最終定常状態速度をv_iとする。 酵素阻害定数は、種々の式１化合物類について記載された方法を用いて見出さ れる。表２は、指定の試験化合物について見出されたデータを挙げている。 化合物類は阻害について、アタック［アタック、Eur．J．Pharm．205巻157-16 3頁（1991年）］によって記載されたものや、この技術で知られ記載されたその 他の方法を含めて、種々の方法で生体内でも試験できる。例えば、化合物類を食 塩水に入れて、又はメチルセルロースのような担体と共に、雄BKTOハツカネズミ （20〜30g）の腹膜内に注射し、適当な時期に屠殺し、脳と腎臓を除去できる。 氷冷された検定緩衝液10ml（約20倍容量）中で器官をホモジナイズできる。次に 、ホモジネートのアリコートを使用して、ローリー（Lowry）らの方法［ローリ ー、J．Biol．Chem．193巻265頁（1951年）］等に よって、蛋白質濃度を決定できる。阻害剤の解離は、室温で２分の培養を用い、 動物の屠殺と検定終了との間の全時間を約３分として、粗製ホモジネートの199u l量を使用して最小限にすることができる。活性は、蛋白質mg当たりの活性とし て表現でき、ビヒクル処理動物に対するパーセントとして表現できる。 化合物類による記憶への行動上の影響は、アタック［アタック、Eur．J．Phar m．205巻157-163頁(1991年)］に記載されたものを含めて種々の方法で試験でき る。記憶への化合物類の影響は、ハツカネズミの受動回避モデルで、スコポラミ ン誘発性の記憶欠損の逆転を測定することによって試験できる。このようなモデ ルでは、ハツカネズミは(1)ビヒクル、(2)ビヒクルとスコポラミン（すなわち、 〜0.2mg/kg）、又は(3)種々の適量の化合物（すなわち、〜0.1mg/kg-1.0mg/kg） 、の注射を受ける種々の群に振りわけられる。次に、ハツカネズミは、明るい箱 と暗い箱の二つに分けられた室内の照明された側に入れられる。箱の暗い側に入 ると、動物は短い電気ショック（すなわち〜２秒、〜0.4mA）を受ける。暗い室 に入るのに要する時間（ステップスルー潜在期、step-through latency）を記録 する。翌日、ハツカネズミを箱の明るい側に戻し、暗い側に抜けるのに要する時 間を記録する。このモデルでの記憶欠損は、２日連続で暗い側に抜けるのに要す る時間の差に直接関連している。 第２日めのより長いステップスルー時間は記憶の表示であり、ステップスルー時 間の差がないのは、記憶不足を示す。 特定の記載された態様の変化と変更を、本発明の範囲から逸脱せずに行うこと が出来、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図され る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１２月１日 【補正内容】 １． その立体異性体類の全部を含めた式１ ［式中Ａはベンジル又はｔ−ブチル保護基であり、 X₁は-S-、又はCH₂であり、 X₂は-S-、又はCH₂であり、 ＢはCF₃又はCF₂CF₃であるが、但しX₁又はX₂の少なくとも一つは-S-であること を条件とする］の化合物、又は式１の化合物の製剤組成物の有効量を投与するこ とを含む、記憶増強用製剤組成物。 ２． その立体異性体類の全部を含めた式１ ［式中Ａはベンジル又はｔ−ブチル保護基であり、 X₁は-S-、又はCH₂であり、 X₂は-S-、又はCH₂であり、 ＢはCF₃又はCF₂CF₃であるが、但しX₁又はX₂の少なくとも一つは-S-であること を条件とする］の化合物又は式１の化合物の製剤組成物の有効量、及び製薬上受 入れられる担体を投与することを含む、記憶不足を予防又は遅らせる為の製剤組 成物。 ３． 該化合物が、4-[[2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオ ロ-1-オキソプロピル)-1-ピロリジニル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸 フェニルメチルエステルである、請求項１又は２の製剤組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 403/06 ２０７ 9159−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 403/06 ２０７ 417/06 ２７７ 9053−4Ｃ 417/06 ２７７ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バークハート，ジヨゼフ，ピー. アメリカ合衆国 45069 オハイオ州 ウ ェストチェスター バレットローゼ 7290 (72)発明者 メーディ，シュジャース アメリカ合衆国 45213 オハイオ州 シ ンシナチ ウェルトン ストリート 6430

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． その立体異性体類の全部を含めた式１ ［式中Ａはベンジル又はｔ−ブチル保護基であり、 X₁は-S-、又はCH₂であり、 X₂は-S-、又はCH₂であり、 ＢはCF₃又はCF₂CF₃であるが、但しX₁又はX₂の少なくとも一つは-S-であること を条件とする］の化合物。 ２． 化合物が4-[[2-(2.2,3,3.3-ペンタフルオロ-1-オキソプロピル)-1-ピロ リジニル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸フェニルメチルエステルであ る、請求項１項の化合物。 ４． 請求項１〜２のいずれか一の化合物と製薬上受入れられる担体とを含め てなる製剤組成物。 ５． 請求項１〜２のいずれか一の化合物又は製剤組成物の有効量と製薬上受 入れられる担体との製剤組成物を投与することを含めてなる、記憶増強のための 製剤組成物。 ６． 請求項１〜２のいずれか一の化合物の有効量と製薬上受入れられる担体 とを投与することからなる、健忘症の影響を予防又は遅らせるための製剤組成物 。 ７． 請求項１〜２のいずれか一の化合物の有効量と 製薬上受入れられる担体とを投与することを含めてなる、記憶不足を予防又は遅 らせるための製剤組成物。 ８． 立体異性体類の全部を含めた式１ ［式中Ａはベンジル又はｔ−ブチル保護基であり、 X₁は-S-、又はCH₂であり、 X₂は-S-、又はCH₂であり、 ＢはCF₃又はCF₂CF₃であるが、但しX₁又はX₂の少なくとも一つは-S-であること を条件とする］の化合物の製法であって、下に与えられる適当に保護されたアミ ノ酸類 を縮合させることからなる製法。 ９． 化合物が4-[[2-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロ-1-オキシプロピル)-1-ピロ リジニル]カルボニル]-3-チアゾリジンカルボン酸フェニルメチルエステルであ る、請求項１項の化合物の製法。