JPH09503224A

JPH09503224A - ワクチンの内部及び関連部分の改善

Info

Publication number: JPH09503224A
Application number: JP7510696A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダー，ジェームス; マクドナルドブルーワー，ジェームス
Original assignee: プロテウスモレキュラデザインリミテッド
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-10-05
Publication date: 1997-03-31
Also published as: EP0722341B1; GB9320597D0; DE69422632T2; ZA947828B; DE69422632D1; US5876721A; AU7789194A; AP9400683A0; WO1995009651A1; EP0722341A1

Abstract

(57)【要約】小嚢少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える。捕縛抗原を以って小嚢は免疫学的佐剤として作用し得る。これらに基礎を置く小嚢は従来型の投薬経路と共に経口投薬でも活性であり、Ｔｈ１Ｔリンパ球経路経由で抗体生成を刺激する。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチンの内部及び関連部分の改善本発明は斬新な組成を有する小嚢及び佐剤としての小嚢の使用方法に係り、特に従来型の非経口経路での投与ワクチンに加えて経口投与のワクチンに対しても使える小嚢に関する。両親媒性分子の種々なタイプのものから成る小嚢が知られている。これらの小嚢にはリン脂質の２重層を有するリポソーム及び本質的にはポリオキシエチレン脂肪族エーテルのような非イオン活性剤（ＮＩＳ）から形成された非イオン活性剤小嚢（ＮＩＳＶ）が含まれる。両タイプの小嚢共、内部に溶質として種々な分子を捕縛し得る２重層又は層板に囲まれた小水室を有する。リン脂肪２重層から成る小嚢は自然発生のもので、生物組織では例えばミクロソームとして重要である。非イオン活性剤小嚢（ＮＩＳＶ）は、化粧品分野で例えば湿潤付与物質として使用される。分子を捕縛乃至はカプセル封じする能力の効果でこれらの小嚢は、医療分野では例えば薬物配達用担体として使用される。１９９３年４月６日出願の我々の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９３／００７１６に記載したように、捕縛抗原を含む非イオン活性剤小嚢は効力のある免疫佐剤として活躍する。粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸、及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力をゆうする分子と共に非イオン活性剤を包含する新型の小嚢構造体（以下運搬増強剤と云う）は、抗原を中に捕縛する時に効力のある免疫佐剤として活動する能力を有し、佐剤の効果は特に経口投与をするこの種のワクチンに迄波及し得る。かくして１つの観点に従えば、本発明は少なくとも１つの非イオン活性剤と、粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力を持つ少なくとも１つの分子と、を備えた小嚢の中に捕縛される少なくとも１つの抗原を準備する。更なる観点に従って我々は、薬学的に受容可能な担体乃至は部賦形剤と共に本発明による捕縛抗原を伴った小嚢を備えた構成を提供する。好適なる観点では、この構成は経口投与に適する形態にされる。佐剤は、免疫反応を刺激することにおいて、或る抗原、特に担体と結合した時でさえも本来的に弱い免疫性システムの刺激物質でしかないペプチドのような低分子量抗原に対して非常に望ましい特性を助長する物質である。佐剤の使用がこれらの問題を解決し得るとしても、尚多くの佐剤が更なる困難な問題を持ち込んで来る。人間での使用を現在公認されている唯一の佐剤は水酸化アルミニウムである。しかしながら、水酸化アルミニウムは、ワクチンの成功、特にリーシュマニア、トキソプラスマ及びウイルスのような細胞内病原体に対するワクチンの成功には欠かせない特性である細胞介在免疫性（ＣＭＩ）を適切に増大させることが出来ないので、全ての抗原に対する適切な佐剤とは考えられない。フロイントの完成佐剤（ＦＣＡ）は細胞免疫を刺激しはするが、肉芽腫形成、癒着及びその他の毒性サイドの効果の促進をするので、人への使用或は獣医学的使用には不適当である。ＦＣＡは又何ヶ月も存続するかも知れない局部的炎症性反応を引き起こす。細胞介在免疫性を促進する新しい無毒性佐剤の緊急的ニーズが存在する。事実、このような佐剤は、ペプチド抗原を基本とするワクチンのポテンシャルを全面的に現実のものとする時には本質的な必要なものとなるであろう。このニーズは少なくとも主要な範囲に対しては本発明の佐剤によって満足される。かくて１つの観点に従えば、本発明は、少なくとも１つの非イオン活性剤と、粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力を有する少なくとも１つの分子と、を備えた小嚢の中に捕縛される少なくとも１つの抗原を包含したワクチンを提供する。又別の観点に従えば、本発明は哺乳類網の被験者或は非哺乳類網の被験者の中での少なくとも１つの抗原に対する免疫学的反応の効力を高める方法を提供しており、この方法は少なくとも１つの非イオン活性剤と、粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力を有する少なくとも１つの分子と、を備えた小嚢の中に捕縛される前記少なくとも１つの抗原の投与を包含する。尚更なる観点に従えば、本発明は少なくとも１つの非イオン活性剤と、粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力を有する少なくとも１つの分子と、を備えた小嚢の中に少なくとも１つの抗原を捕縛して構成されたワクチンの準備方法を包含する。本発明のこれらの観点の中では、小嚢成分は勿論薬学的に受容可能なものであって欲しい。本発明の佐剤は、一般に知られるように、ただ弱いだけの免疫性システム刺激物質である合成ペプチド抗原のようなペプチド抗原を含む種々なタイプの抗原に対しても、又、病原体の或る抗原的部分のみを含有するサブユニットワクチンのように抗原効力を高揚された形態に対しても適合し得る。本発明の佐剤は、又、本来ワクチンとして作用し得る能力を有する抗原に対しても、又ワクチン特性が増強され得る効果的な佐剤で編み出された抗原に対しても使用可能である。この佐剤の効果は、一般には我々のＰＣＴ／ＧＢ９３／００７１６に記載したように、少なくとも非イオン活性剤単体から構成される小嚢で達成されるものと同等であり、時には、特に経口投与をおこなうときにはより大きくなることが判明した。本発明の小嚢に要求される運搬特性を有する種々な分子が使用可能ではあるが、側鎖のＣ²³炭素原子がカルボン酸を持つコレステロール誘導体や前記の分子の誘導体が特に望ましい。このような誘導体の中には、“胆汁酸”であるコール酸及びケノデオキシコール酸、グリコール酸やタウロコール酸のようなグリシン又はタウリンを伴ったこれらの接合製品、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体と、これらの酸各々の塩がある。これらの分子を備える小嚢は、特に本発明の好適な観点を構成する。胆汁塩は薬の粘膜投与を助ける浸透増強剤として、又特に鼻から投与される蛋白薬又はペプチド薬に対する浸透増強剤として知られているが、胆汁塩は以前には小嚢の中に組み込まれたり経口投与物質に対する免疫性反応の効力高揚に利用されたりしたことはなかった。事実上、“胆汁塩”の洗浄特性は小嚢の無傷の状態の上に分裂性効果を及ぼすと云う期待を持ち得るであろう。又、アシルオキシ化アミノ酸、好ましくはアシルカルニチン及びその塩、特にパルミトイルカルニチンのようなＣ₆-₂₀アルカノイル又はアルケノイル成分を含むこれらのものは、本発明の運搬増強剤として望ましい。これらの化合物も又以前は非イオン活性剤小嚢の中に組み込まれたことはない。この明細書の中で使われるものとして、用語アシルオキシ化アミノ酸はα、β、γアミノ酸と共に第１、第２、第３アミノ酸をもカバーするものと考えている。アシルカルニチンはアシルオキシ化γアミノ酸の例である。本発明の小嚢形成用に使用される非イオン活性剤は、適切な表面活性特性を備えるどのような材料であっても差支えない。しかしながら、抗原との関連において免疫学的佐剤として作用する小嚢基部の形成においては、表面活性剤は勿論薬学的に受容可能であることが望まれる。このような材料の好適な例としてはグリセロールを基礎とする表面活性剤に繋がるエステルがある。このようなグリセロールエステルは、１乃至２ランク上の脂肪族アシル基、例えば少なくとも１０炭素原子をそれぞれのアシル成分の中に備えるものを包含し得る。このようなグリセロールエステルに基礎を置く表面活性剤は、２以上の、望ましくは２以上５以下の、更に、望ましいのは４つのグリセロールユニットを備えるものであり得る。グリセロールモノエステルが望ましく、特に、例えばカプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、オレイル又はステアロイル等のＣ₁₂〜Ｃ₂₀アルカノイル又はアルケノイル成分を包含するものが望まれる。特に望ましい表面活性剤は１−モノパルミトイルグリセロールである。エーテル結合の表面活性剤は又、本発明に従った小嚢を構成する非イオン活性剤として使用が可能である。このような材料の好適な例としては、グリセロール又はグリコールを、望ましいものとしては４炭素原子以下の低級脂肪族グリコールを、最も望ましいものとしてはエチレングリコールを基礎とするエーテル結合の表面活性剤がある。このようなグリコールを基礎とした表面活性剤は、２以上のグリコールユニットを、望ましくは５以下のグリコールユニットを、更に望ましいのは例えばグリコールセチルエーテル又はポリオキシエチレン−３−ラウリルエーテルのような２乃至３のグリコールユニットを備え得る。グリコール又はグリセロールのモノエーテルが望ましく、特に、例えばカプリル、ラウリル、ミリスチル、セチル、オレイル又はステアリルのようなＣ₁₂〜Ｃ₂₀のアルカニル又はアルケニル成分を包含するものが望ましい。本発明の中で使用可能な酸化エチレン濃縮製品はＷＯ８８／０６８８２即ちポリオキシエチレン高級脂肪族エーテル及びアミン表面活性剤、の中に開示されたものを包含する。特に望ましいエーテル結合の表面活性剤は、１−モノセチルグリセロールエーテル及びグリコールセチルエーテルである。しかしながら本発明の佐剤の観点で使用されるためには、薬学的に受容可能な材料を選択することが必要であり、望ましくは哺乳網の組織体内で容易に生分解可能な材料である必要がある。この理由故に、皮下、筋肉、皮内又は腹腔内のいずれかの注射により、或は例えば口部、鼻部、気管支部、尿性器部又は直腸部への投与による粘膜経路経由で投与されるべき小嚢を用意するためには、前記のグリセロールエステルが望ましく、中でも経口投与が特に望ましいのである。効果的な小嚢形成のためには、小嚢成分は２重層形成能力を有する高分子量の適切な疎水性を有する材料、特にステロイド、例えばコレステロールのようなステロールと混合されることが望ましい。ステロイドの存在は、小嚢の物理的特性依存の対象になる２重層の形成を助けることになる。本発明に従う小嚢は又、負電荷性を呈する要因を形成する電荷生成性両親媒性と結合し得る。このことが小嚢を安定させ、効果的分散を助長する。高級アルカン酸及びアルケン酸（例えばパルミチン酸、オレイン酸）のような酸性材料、或いは例えばジアルキル、望ましくは高級アルキルのジアルキルのようなリン酸エステルやジセチルリン酸エステル又はホスファチジン酸又はホスファチジルセリンのようなリン酸エステルやセチル硫酸エステルのような高級アルキル硫酸エステル等の如く酸性基を含むその他の化合物は、全てこの目的に使用され得る。本発明の小嚢においては、運搬増強剤は例えば重量で非イオン活性剤の２０００％にも達し得るものであり、望ましくは４０乃至４００％であって欲しい。もし存在するならばステロイドは例えば重量で非イオン活性剤の２０乃至１２０％にも達し得るもので、望ましくは６０乃至１００％であって欲しい。負の電荷を生成する両親媒性材料は、例えば重量で非イオン活性剤の１乃至３０％に達し得る。本発明による小嚢は、継続中の我々の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９３／００７１６の中に引用しているような非イオン活性剤を包含した小嚢を準備する既知の技法からの修正がなされ得る。望ましい技法は回転フィルム気化法で、この技法の中では非イオン活性剤のフィルムは、例えば炭化水素或いはクロロホルムの如き塩化炭化水素溶媒のような有機溶媒からの回転気化法によって準備される（ラッセル及びアレキサンダ、免疫学会誌１４０第１２７４頁（１９８８年））。生産された薄フィルムはそれから運搬増強剤の存在するの重炭酸塩緩衝剤の中で再び水和される。他の望ましい本発明の小嚢生産方法は、コンリズ他によって調剤及び薬理学会誌４２第５３頁（１９９０年）の中に開示されたものである。これは、水性緩衝剤の存在の下で強力に混合される、非イオン活性剤、（もし使用されていれば）ステロイド、両親媒性薬品の混合剤の溶解及び水和を含んでいる。運搬剤分子は、溶解混合剤の中の他の成分と共に含有されることにより、或いは、以下に述べるような抗原捕縛に用いられる工程の中で隨伴的に合体され得る。非イオン活性剤及び他の膜形成材料は、又、剪断力の存在の下での水和により本発明の小嚢に変換され得る。このような剪断力の供給装置は、例えばＷＯ８８／０６８８２の中に記述した適合装置がよく知られている。音波破砕及び超音波破砕も又、小嚢形成のための或いはその粒子サイズ変更のための効果的な装置である。本発明のワクチン形成のためには、抗原が小嚢の中に包み込まれ、即ち捕縛されなければならない。好適な回転フィルム気化技術の中でこのことは、運搬剤分子と共に抗原の存在する中でのフィルムの水和によって達成される。他の方法では、抗原は脱水−水和法により事前形成の小嚢内に捕縛され得る（キルビ及びグレゴリアデイス、生物工学２第９７９頁（１９８４年）が、この中では水性相中に存在する抗原がフラッシュ冷凍とそれに続く凍結乾燥又は凍結解氷技術によって捕縛される（ピック、生物化学的及び生物物理学的構造２１２第１９５頁（１９８１年））。後者の技術の中で小嚢は、抗原と混合され、液体窒素の中でのフラッシュ冷凍と例えば６０℃オーダの温度（即ち関係表面活性剤の遷移温度以上）への加温とを繰り返し加えられる。抗原捕縛に加えての脱水−水和法及び冷結−解氷技術は、運搬剤分子を小嚢の中に随伴的合体させる能力を有する。このアプローチが運搬剤分子の小嚢中への合体に採用される場合には凍結解氷技術が望ましい。小嚢は、例えば洗浄及び遠心分離による非捕縛抗原除去の工程を更に推進され得る。我々の実験結果は、非イオン活性剤単独では効果的佐剤ではあり得ないこと、即ち望みの効果を得るための小嚢形成が不可欠なことを明白に示していることに着目すべきである。抗原は、望みの佐剤効果を得るためには、小嚢内に捕縛されなければならない。これらの方法のそれぞれにおいては、小嚢成分の懸濁液は、小嚢形成混剤を溶融状態で保持するのに充分な高温で微小孔構造のポリ炭酸エステル膜を通して数回押し出され得る。このことは均一サイズの小嚢の生産を可能にする効果を有する。本発明によるワクチン基盤形成のための小嚢は、１０ｎｍ乃至５μｍの直径であり得るが、望ましいのは１００ｎｍ乃至１μｍのものである。本発明のワクチンはペプチド抗原を含む種々なタイプの抗原での使用に適している。今では、化学合成又は組換えＤＮＡ技術のいづれかにより、抗原性的にも充分な自然抗体のエピトープを擬態した合成抗原の生産が可能である。これら合成抗原は、従来型のワクチンに比し、純粋で安定で、特異性を有していて、免疫化被検者内に時に深刻な反応を起こさせるような病原体特性を欠いたワクチンの如き効果を有する。本発明の小嚢は、本来的にワクチン作用能力のある抗原及び効果的佐剤と共に編み出された抗原を包含したどのような形態のワクチンとでも一緒に使用可能である。合成的な或いは組換え型の起源を有する好適なペブチドは、例えば８乃至５０、望ましくは１０乃至２０のアミノ酸ユニットを含んでいる。抗原は、例えば１以上のＢ細胞の、或いはＢ細胞及びＴ細胞の病原体的生体のエピトープを擬態し得るので、ワクチンは、中和抗体と、生体に対抗するＴ細胞反応との両方を引き出すことになる（例えば、我々のＷＯ８８／１０２６及びＷＯ９１／１３９０９の中のＨＩＶに対する合成抗原の開示を参照）。代替案としてペプチドは、他の生物学的作用物質、特にホルモン作用を有する物質に対する免疫反応を引き出し得る。後者のカテゴリーの例としては、内因性の黄体形成ホルモン解除ホルモン（ＬＨＲＨ）に対する免疫反応の誘発があるであろう。このような処置は、例えばアンドロゲン及びエストロゲン依存の癌腫の治療のためにも、農場や家庭内動物の免疫去勢における性ステロイドホルモンレベルの抑制のためにも使用され得る（我々のＧＢ−Ｂ−２１９６９６９参照）。いくつかのケースでは、免疫抗原性増強のために、ペプチドを担体に結合することが望ましいことになり得る。適切な担体は業界ではよく知られており、例えば、ツベルクリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）、テタヌストキソイド、コレラトキシンとそのＢサブユニット、オボアルブミン、牛の漿液アルブミン、ダイズトリプシン抑制因子、ムラミルジペプチドとその類似品、及びサイトカイン又はその分画のような蛋白担体がある。ツベルクリンの精製蛋白誘導体を担体として使用する時は、ワクチン受容替が例えばＢＣＧワクチン接種の効力によって既にツベルクリンに感応し得るようになっていると抗体の滴定濃度がより高くなる。本発明の小嚢の中に捕縛された抗原は、例えば無菌の非経口受容の可能な水性媒体の中への懸濁によるような、従来からの製薬方法を使ったワクチンに編み出され得る。捕縛抗原入りの非イオン活性剤小嚢も又凍結乾燥され貯蔵され得る。合成或いは組み換え型のペプチドは本発明の中で使用される好適な抗原ではあるけれども、蛋白抗原が本発明の小嚢中に捕縛されるときには強力な佐剤効果も又観測された。例えば、牛の漿液アルブミン（ＢＳＡ）を抗原として使うと強いプラスの結果が現れた。本発明のワクチンは経口投与されると抗体レベルも又増幅されるけれども、特に細胞介在反応の刺激に対して特別な効果を有することが判明した。しかしながら、皮下、筋肉或いは腹腔内注射、及び鼻や気管支や尿性器や或いは直腸ルートのような他の粘膜経由の注入の両者を含む他の従来方式の投与モードも可能である。それ故本発明は、少なくとも１つの非イオン活性剤と、粘膜の膜を通って脂肪、脂肪酸及び脂質を運搬する乃至は運搬を容易化する能力を有する少なくとも１つの分子と、を備えた小嚢内に抗原を捕縛してなる経口作用ワクチンとして抗原を編み出す方法を提供する。例えば合成ペプチドのようなものの経口投与による佐剤効果の達成能力は、本発明のワクチンの可成り高度に有用な特性であり、従来の技術の中では予め予期されてはいるものの未だに実現されていない特性ｔｈである。経口投与のルートは注射による以前の投与ルートに対して幾つかの利点を有する。例えば非無菌針の使用から生ずるような注射に伴う感染の危険性が避けられる。全身系の免疫反応の誘発に加え、経口投与は又粘膜反応の誘発も可能である。このような粘膜反応は、例えばＨＩＶやトキソプラスマのような多くの病原体に対する免疫学的防護において重要なものと考えられる。患者への受容性は又、経口組成のものの方がより高い。それ故伝統的な非経口のワクチン養生に比べ、より高レベルの母集団内ワクチン接種が達成され得る。特に経口で投与されるべきワクチンとして使用される小嚢の編み出しでは、エステル結合の表面活性剤が好適であるが、エーテル結合の表面活性剤であっても特に１−モノセチルグリセロールエーテル及びグリコールセチルエーテルは使用が可能である。本発明による経口ワクチンは単に抗体生成、即ち、全身系免疫反応を刺激する能力があるだけでなく、最初の挑戦で達成された有意反応が小さい場合には第２回目の挑戦でも抗体生成へ導くことが可能になっている。本発明の小嚢は又、特に経口投与の場合には、続いてなされる挑戦での抗体生成に対抗する免疫システムを準備する捕縛抗原との共存能力を有している。これが、捕縛抗原随伴小嚢をしてワクチンとしての高度の適合能力を有するものたらしめている。更に、本発明の斬新なワクチンによって作られる免疫反応の分析は、ＢＳＡ単独での免疫化と比較すると、引き出されたＩｇＧ２ａ抗体のレベルが著しく高く、１０乃至２０倍の差にも達することを示している。高レベルのＩｇＧ２ａは、細胞介在免疫の展開を仲介するＴｈ１細胞からのインタフェロン−γの生成と結び付くものと信じられている。かくして本発明の小嚢は、免疫反応のこの小関節面刺激作用の必要なワクチンとしての作用に理想的に適合するように見える。佐剤としての本発明の小嚢の効果は、その安定性と実質的な非毒性とにある。本発明の意図するワクチンは、主として哺乳類に適用可能なものであり、かくて人と獣医との両方の薬品として有用である。又本発明の小嚢は、非哺乳類網種、例えば魚や家禽に対しても効果的な佐剤を提供し得る。これらの小嚢や佐剤の特性が以下の非制約的実施例の中で図解される。実施例１回転フィルム気化による雄牛胆汁包含小嚢の準備小嚢は１−モノパルミトイルグリセロールエステル（ＭＰＧ）から、ＭＰＧ：コレステロール：ジセチルリン酸エステルの質量比５：４：１（即ち、２４.８ｍｇ：２３.２ｍｇ：８.２ｍｇ）で形成された。小嚢はラッセル及びアレキサンダの記述のようなクロロホルムからの回転フィルム気化（Ｓｕｐｒａ）によって準備された。薄いフィルムに形成された１５０μモルの表面活性剤が１００ｍｇの牛の漿液アルブミン＋１００ｍｇの雄牛胆汁包含の５ｍｌ炭酸塩緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）の中で水和された。混合剤は２時間６０℃で振られ、６０℃の水浴音波破砕装置の中で５分間音波破砕され、それから振動水浴の中で２時間培養された。非捕縛抗原は２回に亘る炭酸塩緩衝剤洗浄と１００,０００ｇ４０分間の遠心分離とによって除去された。洗浄小嚢準備作業中の胆汁酸の存在は、薄層のクロマトグラフィによって確認された。使用された雄牛胆汁は乾燥雄牛胆嚢粉である。これは実質的に例えばコール酸、デオキシコール酸及びタウロコール酸のような胆汁酸から構成される。同一手順が個々の胆汁酸包含小嚢の準備にも使用された。実施例２パルミトイルカルニチン包含小嚢の準備小嚢は、水和段階での雄牛胆汁を１００ｍｇのパルミトイルカルニチンに置き換える以外は実施例１で記述した技術で準備される。実施例３凍結解氷による雄牛胆汁又はパルミトイルカルニチン包含小嚢の準備小嚢は１−モノパルミトイルグリセロールエステル（ＭＰＧ）から、ＭＰＧ：コレステロール：ジセチルリン酸エステルの質量比５：４：１(即ち、２４.８ｍｇ：２３.２ｍｇ：８.２ｍｇ)で形成された。小嚢はコリンズ他の（Ｓｕｐｒａ）による記述のような融解法を用いて準備され、振動水浴の中で６０℃２時間培養された。抗原は事前形成の小嚢の中に捕縛され、パルミトイルカルチニン又は胆汁（雄牛胆嚢又は個別の胆汁酸塩）が、ピックの（Ｓｕｐｒａ）による記述のような凍結解氷技術を用いて小嚢の層板中に付随的に結合された。炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９.４）中の小嚢２.５ｍｌ（７５μモル）が５ｍｇのパルミトイルカルニチン（Ｓｉｇｍａ）又は２０ｍｇの胆汁と混合された。混合剤は液体窒素中でフラッシュ冷凍されて６０℃に解氷された。これが５回繰返された。小嚢は炭酸塩緩衝剤を使って１００,０００ｇでの４０分間の遠心分離により２回洗浄された。洗浄小嚢準備におけるパルミトイルカルニチン又は胆汁の存在は、薄層クロマトグラフィによって確認された。実施例４小嚢内捕縛の牛の漿液アルブミンでのマウスの経口免疫化雄牛胆汁包含小嚢が実施例１の手順に従って準備された。小嚢は同様に雄牛胆汁を省略しても準備された。年令８乃至１０週間の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスが各処置グループ毎に５匹づつ使用された。各グループは以下の中の１つの処置を受けた。ａ）炭酸塩緩衝剤中の牛の漿液アルブミンｂ）２０ｍｇ／ｍｌの雄牛胆汁の存在下で準備された１−モノパルミトイルグリセロールエステルの非イオン活性剤小嚢中の牛の漿液アルブミンマウスは１日目に栄養チューブを通して投与される最初の経口服用量０.１ｍｌ（１マウス当り２４０μｇの牛の漿液アルブミン）を受容した。１２日目に第２回目の経口服用量が投与された（１マウス当り５００μｇの牛の漿液アルブミン）。血液サンプルが２０日目と２４日目とに集められ、ＥＬＩＳＡ（ブリューワ及びアレキサンダ、免疫学７５第５７０乃至５７５頁（１９９２年））による抗漿液アルブミンＩｇＧ滴定濃度分析が行われた。最後の接種後８日目と１２日目とでの２回の出血に対するＩｇＧ反応は非常に良く似ていて、１２日目の出血に対するデータが図１及び図２に示されている。図１は得られた全体漿液ＩｇＧ滴定濃度を示す。胆汁塩包含小嚢内捕縛の牛の漿液アルブミンは、牛の漿液アルブミン単独（Ｐ＜０．０５）で引き出されるものに比し非常に増大したＩｇＧ反応を誘発したことが明白に読み取れる。図２は抗体反応のアイソタイプ分析を示す。絶対的限定期間内での雄牛胆汁包含小嚢内の牛の漿液アルブミンが、牛の漿液アルブミン単独より高いＴｇＧ１反応を誘発する（約３倍）一方、引き出されたＩｇＧ２ａ反応は牛の漿液アルブミン単独で達成されるものより大凡１０乃至２０倍高いものであった。このことは細胞介在反応が誘発されたことを強く示唆している。実施例５小嚢内捕縛の牛の漿液アルブミンでの経口免疫化マウスの追想反応小嚢は、実施例に記載されたのと同様１−モノパルミトイルグリセロールエステル（ＭＰＧ）から形成された。薄いフィルムに形成された１５０μモルの表面活性剤は、以下の中の１つを包含する炭酸塩緩衝剤５ｍｌの中で水和された。即ち１００ｍｇの牛の漿液アルブミン、１００ｍｇの牛の漿液アルブミン＋１００ｍｇの雄牛胆汁（Ｓｉｇｍｅ）、又は１００ｍｇの牛の漿液アルブミン＋１００ｍｇのデオキシコール酸エステル（ＤＯＣ）（Ｓｉｇｍａ）とである。混合剤は６０℃で２時間振られた。年令８乃至１０週間の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスが各処置グループ毎に５匹づつ使用された。各グループは以下の中の１つの処置を受けた。ａ）炭酸塩緩衝剤中の牛の漿液アルブミンｂ）２０ｍｇ／ｍｌの雄牛胆汁の存在下で準備された１−モノパルミトイルグリセロールエステルの非イオン活性剤小嚢中の牛の漿液アルブミンｃ）２０ｍｇ／ｍｌのデオキシコール酸エステルの存在下で準備された１−モノパルミトイルグリセロールエステルの非イオン活性剤小嚢中の牛の漿液アルブミンマウスは１日目に栄養チューブを通して投与される最初の経口服用量０.１ｍｌ（１マウス当り２４０μｇの牛の漿液アルブミン）を受容した。第２回目の経口服用量（１マウス当り５００μｇの牛の漿液アルブミン）が２週間の時点で投与された。４週間後各々のマウスは（ＰＢＳ中の１００μｇの）牛の漿液アルブミンの皮下注射を実施された。牛の漿液アルブミン注射後２週間で血液サンプルが採集され、ＥＬＩＳＡによる抗漿液アルブミンＩｇＧ滴定濃度に関する分析が行われた。各処置グループの平均値が図３に記録された。小嚢中に結合された抗原の２回の服用量を受容したマウスは、全身系に投与された時に、牛の漿液アルブミンに対して対照グループの動物よりも遙かに大きな漿液ＩｇＧ反応を起こした。最高滴定濃度は、非イオン活性剤に加え、個別の或いは雄牛胆汁のいづれかとしての胆汁塩を包含する小嚢を伴う時に得られた。これらの結果は、小嚢形成における胆汁の存在が小嚢の準備効果（即ち抗原限定免疫細胞のメモリ貯留池発生）を改善することを示唆する。実施例６個別胆汁酸準備小嚢内捕縛の牛の漿液アルブミンでの経口免疫化マウスの追想反応小嚢は実施例５同様１−モノパルミトイルグリセロールエステルから形成された。薄いフィルムに形成された１５０μモルの界面活性剤が実施例５の如く１００ｍｇの牛の漿液アルブミン＋１００ｍｇのグリココール酸（Ｇｌｙ）（Ｓｉｇｍａ）を含む炭酸塩緩衝剤５ｍｌの中で水和された。小嚢がマウスに投与され、実施例５に従った分析の為の血液サンプルが採られ、そのデータが図３に示された。実施例７漿液抗体反応上の小嚢内捕縛漿液アルブミンの径口投与回数の効果この実験目的は、経口投与回数が特定ＩｇＧ生産を誘発する抗原形成能力に影響を与えるか否かを試験するものであった。小嚢は実施例１に記載したように回転フィルム気化法により１−モノパルミトイルグリセロールエステル（ＭＰＧ）で形成された。年令８乃至１０週間の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスが各処置グループ毎に３匹づつ使用された。各グループは以下の中の１つを投与された。ａ）炭酸塩緩衝剤中の牛の漿液アルブミン（Ａ１−Ａ３）ｂ）２０ｍｇ／ｍｌの雄牛胆汁の存在下で準備された１−モノパルミトイルグリセロールエステルの非イオン活性剤小嚢中の牛の漿液アルブミン（Ｂ１−Ｂ３）マウスは１週間に亘って栄養チューブを通して０.２ｍｌ（１マウス当り５００μｇの牛の漿液アルブミン）の経口服用量を１回、２回又は３回投与された。１回の服用量を投与されたマウスは第１日目に投与され、２回の服用量を投与されたマウスは第１日目及び第４日目に、３回の服用量を投与されたマウスは第１日目、第４日目及び第７日目に投与された。この免疫化養生は２週間後にも繰返され、血液サンプルが次の２週間後に採集された。この時点での牛の漿液アルブミン特定ＩｇＧ反応が図４に示されている。単純な蛋白抗原の経口投与に対して期待されるように、服用回数に係りなく炭酸塩に（即ち小嚢なしに）入れられた抗原を服用した動物の中ではＩｇＧ生成が検出されなかった。非イオン活性剤小嚢／胆汁の１回服用を２回繰返した後（Ｂ１）には３匹のマウスの中の１匹が反応した一方で、服用頻度を上げて１週間に２回の服用を２回繰返した服用（Ｂ２）では反応に何らの影響も現れなかったのに対し、１週間に３回の服用を２回繰返した服用（Ｂ３）では１匹の反応者も生じなかった。免疫化養生が３回繰返されたが、この反応パターンには殆んど変化は現れなかった。２週間後各マウスはＰＢＳ中の牛の漿液アルブミン１００μｇの皮下注射を受けた。図５に結果を示す如く、注射２週間後には追想漿液ＩｇＧ反応が全グループに現れた。しかしながら抗原単独投与のものよりもより高い抗体の生成は、非イオン活性剤小嚢／胆汁内に捕縛された抗原を１週間に１回乃至２回経口服用したマウスの中にのみ見られた。かくて捕縛抗原を有する本発明の小嚢は、少ない回数の経口服用での漿液抗体反応の引き出しに特に効果がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブルーワー，ジェームスマクドナルドイギリス国，ジー12 ９ティージェー，グラスゴー，ヒンドランド，ポルワースストリート 46，フラット 31

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を包含する製品。２．前記脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する分子が、側鎖のＣ²³炭素原子がカルボキシル基又はカルボキシル基誘導体を携えてなるコレステロール誘導体である、請求項１に記載した製品。３．前記コレステロール誘導体が、胆汁酸、胆汁酸接合製品又は誘導体、或いは胆汁酸塩である、請求項２に記載した製品。４．前記コレステロール誘導体が、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸又はウルソデオキシコール酸である、請求項３に記載した製品。５．前記脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する分子が、アシルオキシ化アミノ酸である、請求項２に記載した製品。６．前記アシルオキシ化アミノ酸がアシルカルニチンである、請求項５に記載した製品。７．前記アシルカルニチンが、パルミトイルカルニチンである、請求項６に記載した製品。８．前記非イオン活性剤がグリセロールエステルを包含してなる、前記請求項のいずれかに記載した製品。９．前記グリセロールエステルが、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀のアルカノイル成分又はアルケノイル成分を備えるグリセロールモノエステルである、請求項８に記載した製品。 10．前記グリセロールエステルが１−モノパルミトイルグリセロールである、請求項９に記載した製品。 11．前記非イオン活性剤が、グリセロール又は低級脂肪族グリコールに基礎を置くエーテルを包含してなる、請求項１乃至７のいずれかに記載した製品。 12．前記エーテルが、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀のアルカニル成分又はアルケニル成分を備える低級脂肪族グリコールに基礎を置くグリセロールモノエーテル又はモノエーテルである、請求項１１に記載した製品。 13．ワクチンとして使用するための、請求項１乃至１２のいづれかに記載した製品。 14．予防又は治療に使用するための、請求項１乃至１２のいづれかに記載した製品。 15．薬学的に受容可能な担体乃至は賦形剤を伴った、前記請求項のいづれかに記載した製品を包含する薬学的組成。 16．経口投与に適する形態にされた、請求項１５に記載した組成。 17．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を包含するワクチンの準備方法。 18．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された１つの抗原を包含するワクチンとして該抗原を編み出す方法。 19．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された１つの抗原を包含する経口作用性ワクチンとして該抗原を編み出す方法。 20．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された１つの抗原を包含する細胞介在免疫展開を仲介する該抗原を編み出す方法。 21．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された１つの抗原を包含するＴｈ１Ｔリンパ球経路経由で抗体生成を刺激する該抗原を編み出す方法。 22．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を投与することを包含する、哺乳網又は非哺乳網の被検者内で該抗原に対する免疫反応の効力を高める方法。 23．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を投与することを包含する、哺乳網又は非哺乳網の被検者内でのＴｈ１Ｔリンパ球経路経由で該抗原に対する免疫反応を刺激する方法。 24．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された１つの抗原を哺乳網又は非哺乳網の被検者に投与することを包含する、該被検者内での該抗原に対する細胞介在性乃至は液素性の免疫性を刺激する方法。 25．前記抗原が経口投与されてなる、請求項２２乃至２４のいづれかに記載した方法。 26．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備え、細胞介在及び／又は液素性の免疫性を刺激するために中に捕縛した少なく１つの抗原を有する小嚢の使用。 27．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備え、免疫学的佐剤として中に捕縛した少なくとも１つの抗原を有する小嚢の使用。 28．哺乳網又は非哺乳網の被検体内で少なくとも１つの抗原に対する免疫学的反応の効力を高めるのに使用される製品の製造中に、少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を使用すること。 29．哺乳網又は非哺乳網の被検体内で少なくとも１つの抗原反応における細胞介在の及び／又は液素性の免疫性を刺激するのに使用される製品の製造中に、少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を使用すること。 30．哺乳網又は非哺乳網の被検体内で少なくとも１つの抗原反応におけるＴｈ１Ｔリンパ球経路経由での抗体生成を刺激するのに使用される製品の製造中に、少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を使用すること。 31．前記被検者が哺乳網である、請求項２８乃至３０のいづれかに記載した使用。 32．少なくとも１つの非イオン活性剤と、脂肪、脂肪酸及び脂質を粘膜の膜を横切って運搬する乃至は運搬を容易にする能力を有する少なくとも１つの分子と、を備える小嚢内に捕縛された少なくとも１つの抗原を包含する、粉末、タブレット、シロップ、カプセル又は顆粒の形態を有する製品。