JPH09501505A - 薬理学的作用物質の迅速定量検定のための試薬及び方法 - Google Patents

薬理学的作用物質の迅速定量検定のための試薬及び方法

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JPH09501505A JP7530449A JP53044995A JPH09501505A JP H09501505 A JPH09501505 A JP H09501505A JP 7530449 A JP7530449 A JP 7530449A JP 53044995 A JP53044995 A JP 53044995A JP H09501505 A JPH09501505 A JP H09501505A
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Abstract

(57)【要約】 生物学的サンプル中の薬理学的試薬の濃度を迅速に定量検定するための二座配位子試薬が記載されている。この試薬は所望のあらかじめ選択された薬理学的試薬、例えばベンゾイルエクゴニン、コカイン、麻薬、PCP、ジゴキシゲニン、アセタミノフェン、カルバマゼピン、フェニトイン、プリミドン、テオフィリン、アミノグリコシド抗生物質、バンコマイシン、キニジンまたはカンナビノイドなどの濃度を測定するための免疫検定フォーマットに用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 : 薬理学的作用物質の迅速定量検定のための試薬及び方法発明の分野 : 本発明は生物学的サンプル中の薬理学的作用物質濃度を迅速かつ定量的に検定 するための試薬及び方法に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明 は所望のあらかじめ選択した薬理学的作用物質、例えばコカイン、アセタミノフ ェンまたはジゴキシンなどの濃度を決定できるビオチニル化された二座配位子試 薬及び免疫検定フォーマットの作成及び使用に関するものである。発明の背景 : 人が薬理学的作用物質にさらされているかどうかを評価でき、生物学的サンプ ル中のそのような物質の濃度を決定できることは、医学、法の執行及びその他の 領域において非常に重要である。 特に、物質濫用(コカイン、大麻類、アヘン剤など)の医学的及び社会的効果 を考えるとき、このような物質類を検出できる検定法の開発が必要である。コカ インの直接使用はこの10年間に劇的に増加した(ローゼンバーグ(Rosenberg, N.M.)ら、Amer.J.Dis.Child.145:1430−1432ページ(1991) )。このような使用は、米国のいくつかの都市部においては新生児、幼児及び青 少年の潜在的被曝率を5%近いレベルにまで増加させた(ローゼンバーグら、Am er.J.Dis.Child.145巻、1430−1432ページ(1991))。 その他の有益な薬剤、例えば鎮痛性アセタミノフェン、また心臓作用性グリコ シド ジゴキシンでさえ、濫用或いは誤用した場合には生命をおびやかす症状を 誘起する。実際、過剰量のアセタミノフ ェンの血液毒性は十分証明されている(ブラック(Black,M.)、Gastroenterol. 78巻、382−392ページ(1980))。若干の患者ではアセタミノフェ ンの腎毒性も報告された(ネルソン(Nelson,S.D.)、J.Med.Chem.25巻、7 53−765ページ(1982))。ジゴキシン中毒または−過量投与は心室性 不整脈または頻脈をおこすことがある。これらの薬理学的活性物質の広範囲の使 用、並びにそれら濃度の正確な検定の重要性に鑑み、多数の患者をスクリーニン グすることのできる種々の方法が開発された。 免疫検定とは特定の標的分子を特異的に識別し、それに結合する抗体の能力を 活用する検定システムである。抗体によって識別され、その抗体が結合する分子 領域を“エピトープ”と呼ぶ。大きい分子、例えば蛋白質またはその他の“抗原 ”などは、複数のエピトープを有するとはいえ、低分子量の分子、例えば大部分 の薬理学的活性物質は、たった1つのエピトープを有する。このようは低分子を ここでは“ハプテン”と呼ぶ。免疫検定は近代診断学に広く利用されている(フ ァックレル(Fackrell)、J.Clin.Immunoassay、8巻、213−219ページ( 1985))。多数の異なる免疫検定フォーマットが報告されている(ヨルケン (Yolken,R.H.)のRev.Infect.Dis.4巻、35ページ(1982);コリンズ (Collins.W.P.)のAlternative Immunoassay、John Wiley & Sons,NY(19 85);ヌゴ(Ngo T.T.)ら、:酵素仲介性免疫検定(Enzyme Mediated Immuno assay)Pleyym Press,NY(1985))。このような大規模使用に適した免 疫検定フォーマット類が開発された(参照、リー(Lee,T.T.T.)らのヨーロッパ 特許出願第203238号、これは参照して明細書中に取り込まれる)。 最も簡単な免疫検定法はあらかじめ決めた分子(すなわち“被検体”)と結合 できる抗体を、被検体を含むことが疑われるサンプルと共にインキュベートする だけである。標的分子の存在は、抗体と被検体との結合によって生成する免疫コ ンプレックスの存在によって確認され、上記免疫コンプレックス濃度に比例する 。このような免疫コンプレックスと最初に存在する未結合の抗体との分離を容易 にするために、普通は固相が用いられる。より複雑な免疫検定では、抗体を支持 体に結合させ、結合した抗体を被検体含有サンプルの存在のもとでインキュベー トすることによって標的分子の濃度を決定する。 固定抗体に結合した標的分子は種々の方法のいずれかによって検出することが できる。例えば支持体を標的分子の第2のエピトープに結合できる標識化した第 2の抗体の存在下でインキュベートする(すなわち“サンドイッチ”免疫検定) 。こうして標識化抗体の支持体への固定はその標的の存在を必要とし、サンプル 中の標的の濃度に比例する。これに代わる検定では、サンプルを既知量の標識化 標的及び抗体結合部位と共にインキュベートする。サンプル中における標的分子 の存在は、抗体結合部位に対して標識化標的分子と競合する。こうして抗体と結 合できる標識化標的分子の量はサンプル中の標的分子濃度に反比例する。これは 競合免疫検定として公知である。 種々の免疫検定フォーマット類は、その検定が結合種と未結合種との分離を必 要とするかどうかによって、さらに2つの主要クラスに分けられる。非均質免疫 検定はこのような精製を必要とし、そのため分離段階を含む。これに対して、均 質免疫検定は、結合種を未 結合種から除去する必要がないように設計されている。均質検定法には分離段階 がなく、より容易に自動化されるため、これらの方法は多数の患者のスクリーニ ングを含む用途においては非均質検定より好ましい。 ジゴキシンの非均質検定はテクニコン(Tecnicon)及びトライトンバイオサイ エンシズ(Triton Biosciences)によって開発された。この検定は捕捉抗体、ジ ゴキシン−酵素結合体、及び磁気粒子固相を使用する。この検定法は報告による とテクニコンImmuno- 1TM免疫検定Statem(マック(Mak,A)ら、Clin.Cliem. 36巻、1103ページ(1990)]を用いて自動使用するように設計されて いる。ジゴキシン濃度を検定するためのまた別の自動免疫検定フォーマット(St ratusR.バクスター ヘルスケア社)の使用が報告されている(ウェルヒ(Welc h,C)ら、Clin.Chem.36巻:1187ページ(1990))。このような検 定類は概して有用であるとはいえ、ジゴキシンFAB抗体療法を受けている患者 ではこれら検定法の使用はジゴキシン濃度の著しい誤解に導きかねない(Ujhely i,M.R.ら、Clin.Phsrmscol.Thevap.49巻、131ページ(1991))。 上記の免疫検定フォーマット類は概して、使用する抗体の感度に左右されやす い。例えば抗体感度が低い場合は、密接に関連する代謝産物類がこの検定によっ て間違って確認されるかも知れない。そこでこのような検定は明らかな“偽のポ ジティブの(false-positive)”検出率を出しがちである(シュヴァルツ(Schw artz,J.G.)ら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166−170ページ(1991) ;コーン(Cone,E.J.)ら、J.Forens.Sci.35巻、786−78 1ページ(1990))。その上不均質検定では、未結合の標識化被検体を完全 に除去することができなければ、それは検定の誤差率に影響する。これらの理由 により、免疫検定(特にコカイン及びその他の濫用物質の免疫検定)は概して、 定量的検定というよりむしろ予備的定性的スクリーニング法として用いられる( コーン(Cone,E.J.)ら、J.Forens.Sci.35巻、786−781ページ(19 90);スタンデファー(Standefer,J.C.)ら、Clin.Chem.37巻、733− 738ページ(1991))。コカイン濃度を測定するその曲の確認法としては 質量分析及びクロマトグラフィーがある(リーら、ヨーロッパ特許出願第203 238号、シュヴァルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166−170ページ( 1991);フィッチェ(Fytche,L.M.)ら、、J.Forens.Sci.37巻、155 0−1556ページ(1992);ワーンリー(Wernly,P)ら、Anal.Chem.64 巻、2155−2159ページ(1992);ベイリー(Bailey,D.N.)ら、Am er.J.Clin .Pathol.99巻、123−127ページ(1993))。 免疫検定フォーマットには無関係に、被検体の検出を目的とする免疫検定の有 用性は、その免疫検定法が、用いる抗体と存在または濃度を確認すべき被検体と の免疫コンプレックスの生成程度を測定する能力に依って決まる。この能力を増 強するためには概して2つの独立的アプローチがある。第1のアプローチは1つ 以上の試薬を標識化することを含む。第2のアプローチは免疫コンプレックスの サイズを大きくすることを含む。 免疫コンプレックスの検出を容易にするために広範囲の標識(例えば放射性同 位体、酵素、蛍光部分、化学ルミネッセント部分、ま たはビーズなどの巨視的標識)が用いられている[参照、チャード(Chard,T) ら、分子生物学における実験法及び生化学(Laboratory Techniques and Bioche mistry in Molecular Biology)(Work,T.S.編集)、北オランダ出版社(North Holland Pudlishing Company)、NY(1978);ケメニー(Kemeny,D.M.) ら(編)、ELISA及びその他の固相免疫検定(ELISA and Other Solid Phas e Immunoassays)、Wiley & Sons、NY(1988)]。放射性同位体は長い間 免疫検定に用いられてきた。例えばオレアリー(O'leary,T.D.)はジゴキシン血 清濃度のための放射性免疫検定(“RIA”)を報告した(オレアリーら、Clin .Chem.25巻、332−334ページ(1979))。RIAは簡便で、感度 が高く、使用法が簡単であるという利点を有する。放射性標識は比較的小さい、 原子大の大きさであり、普通は反応動態に影響を与えない。しかしこのような検 定は次のような欠点を有する:放射性同位体の崩壊のために、試薬の保存寿命が 短く、試薬は特殊の取り扱い及び廃棄を必要とし、複雑で高価な分析機器の使用 を必要とする。このような危険物質の取り扱いのむずかしさ、並びに放射能崩壊 の問題のために、その他の標識を使用する免疫検定が開発されるに至った。 特に酵素類は今や免疫検定フォーマットの標識として広く用いられている。多 元酵素免疫測定法(EMITR、Syva社)は生物学的液中のコカインの存在を分 析するために用いられている。この方法は限られた量だけ存在する抗体上の結合 部位を抗原(例えばコカイン代謝産物ベンゾイルエクゴニン)と抗原- 酵素結合 物とが競争することに基づく(コーンら、J.Forens.Sci.35巻、786−78 1ページ(1990);バウ(Baugh,L.D).)ら、J.Forens.Sci.3 6巻79−85ページ(1991);スタンデファー(Standefer,J.C.)ら、Cl in.Chem.37巻、733−738ページ(1991))。この方法は80−9 0%の効率をもつことがわかった;誤差の大部分は“false-positive”結果であ った(シュヴァルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166−170ページ(19 91);コーンら、J.Forens.Sci.35巻、786−781ページ(1990) ]。EMITRフォーマットは血清中のアセタミノフェンの検定にも用いられる (ヘルパー(Helper,B.)ら、Amer.J.Clin.Pathol.81巻、602−610ペ ージ(1984);キャンベル(Cambell,R.S.)ら、J.Clin.Chem.Clin.Biochem .24巻、155−159ページ(1986);カンナ(Khanna,P.)米国特許 第5103021号)。アセタミノフェン毒性は蛋白質結合アセタミノフェン複 合体の形成によって仲介され、このような結合アセタミノフェン濃度がアセタミ ノフェン毒性の程度の測定のために用いられるという考えに基づいた、アセタミ ノフェンの間接的検定も報告された(ロバート(Robert,D.W.)ら、J.Pharmaco l.Exper.Therap.241巻、527−533ページ(1987);バルトロン( Bartolone,J.B.)ら、Bioehem.Pharmacol.37巻、4763−4774ページ( 1988))。酵素免疫抗体法(“ELISAs”)は、安価な機器を用いて実 施でき、無数の異なる酵素と共に、多数の検出法−−比色法、pH、ガス発生な ど−−を用いてその検定を定量化することができるという利点を有する。その上 、酵素試薬は比較的長い有効寿命をもち、RIA使用時にみられるような放射線 汚染の危険がない。ELISAsは、ケメニーら編、“ELISA及びその他の 固相免疫検定(ELISA and Other Solid PhaseImmunoassays)”、Wi ley & Sons,NY(1988)に記載されている;これは参照して明細書中に取 り込まれる。 酵素の他に、蛍光部分が標識としてよく用いられる。コカインのための蛍光偏 光免疫法(TDxR,アボット社)はEMITRフォーマットにほぼ等しいことが わかった(シュヴァルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166−170ページ( 1991))。TDxRフォーマットはアセタミノフェン血清濃度(コイズミ(K oizumi,F.)ら、Tohoku J.Exper.Med.155巻、159−(1988);エデ ィンボロ(Edinboro,L.E.)ら、Clin.Toxicol.29巻、241−(1991) ;オクロドゥドゥ(Okurodudu,A.O.)ら、Clin.Chem.38巻、1040ページ( 1992))、血清ジゴキシン濃度(オクロドゥドゥら、Clin.Chem.38巻、 1040ページ(1992))及びテオフィリン濃度(クロッツ(Klotz,U.)Th er.Drug.Monitor.15巻、462−464ページ(1993))の検定にも用い られた。ウォング(Wong,S.H.Y.)らは自動(OPUS)分析器を用いてモノク ローナル抗体−仲介、蛍光ベース検定プロトコールでジゴキシン濃度を測定した ことを報告した[ウォングら、Clin.Chem.38巻、997ページ(1992) ]。リー(Lee,D.H.)らもジゴキシン濃度検定のための蛍光偏光検定及び化学ル ミネッセント検定フォーマットの使用を開示した(リー(Lee,D.H.)ら、CLin.C hem.36巻、1121ページ(1990))。 既述のように、免疫検定の感度は、免疫検定において生成する免疫コンプレッ クスのサイズを大きくすることによって高めることができる。免疫コンプレック スが十分大きいならば、それは光を散乱させ、または自発的沈殿をおこすことが できるようになる。このよ うな場合、凝集、またはネフロメトリーまたは濁度測定免疫検定法が行われる。 ネフロメトリーは粒子の懸濁によって散乱する光または光の直接経路にない検出 酉の方向に反射する光を測定する(スターンバーグ(Stern-berg,J.C.)、Clin .Chem.23巻、1456−1464ページ(1977))。対照的に、濁度測定 法は、粒子または凝集物の懸濁液を透過する光の減少を測定する。その減少は凝 集による光の反射、散乱及び吸収によっておきる。ネフロメトリーも濁度測定法 も光散乱の変化率も測定し、存在する抗原の量の指標を提供する。凝集検定法は 抗体−抗原コンプレックスの沈殿を測定する。このような検定は極めて鋭敏で、 自動化に適する。ネフロメトリー及び濁度測定法は最初に存在する抗体と検定中 に生成した免疫コンプレックスとの分離を必要としないから、このような検定は 均質免疫検定である。コカインの凝集阻害検定は市販されているが(OnTrakTM、 ホフマン−ラロッシュ)、上記の諸方法に比較して実質的に非効率的であるよう にみえる(シュヴァルツら、Amer.J.Emerg.Med.9巻、166−170ページ( 1991))。 大きい免疫コンプレックスを生成する必要から、ネフロメトリー、濁度制定ま たは凝集免疫検定の適用は、数個のエピトープ(すなわち抗体結合部位)を有す る高分子、例えば蛋白質などに限定された。特に、多くの薬理学的作用物質は単 一のエピトープをもち、それだけではこのような免疫検定のために必要な大きい 免疫コンプレックスを形成することはできない。 小分子被検体の凝集検定を行うために2つのアプローチが利用された。1つの アプローチは抗体被覆粒子を多エピトープ種または最低2つの共有結合したハプ テン同族体を含むデベロッパー抗原(例 えば、BSAのような蛋白質担体)で凝集することを含む(Mongkolsorichaikul ,D ら、J.Immunol.Meth.157巻、189−195ページ(1993))。凝 集反応はデベロッパー抗原または多エピトープ種の使用を必要とした、なぜなら ば1つのエピトープ部位しかもたない分子は2つの抗体を結合させることはでき ないし、したがって2つの抗体を架橋して1つにすることはできないからである 。しかしこのような架橋は大きい免疫コンプレックスの生成においては必須の段 階である。第2のアプローチはハプテン被覆粒子と凝集反応のための抗体との凝 集を含んでいた。 どちらの方法でもサンプル中のハプテンまたは薬剤は抗体結合部位に結合し、 免疫凝集の阻止または減少をおこす。治療薬及び濫用薬を、ハプテン被覆粒子を 使用して粒子凝集検定するためのキットは市場で入手できる。このような検定法 の例はPETINIA(ドュポン)及びAbuScreen(ロッシュ)、Ad visor(アボット)及び三菱のものである。 この問題の第3の解決は最近オー(Oh,C.S.)らが米国特許第5168057 号に報告し、ハリス(Harris,P.C.)らが米国特許第5196351号に報告し た。どちらも引例によってここに挿入され、二座配位子−または三座配位子被検 体試薬の使用を含む。これら試薬は関心とする被検体を1つか2つの付加的分子 部分に結合させることによって形成される。それらの部分は、各々が独立的に抗 体または特異的結合パートナーに結合できるように選択される。こうして例えば 単一エピトープ分子、テオフィリンをテオフィリン−ビオチン共役体(conjugat e)に変換することができる。その分子のテオフィリン部分は抗テオフィリン抗 体に結合することができ、そ の分子のビオチン部分は例えばアビジンに結合できる。このようなやり方で、二 座配位子及び三座配位子試薬は単エピトープ分子を二−または三−エピトープ分 子に変換する。付加的エピトープの存在によって試薬は光散乱または凝集反応に 参加できるほど十分大きい免疫コンプレックスを形成することができる。 オーらの方法(米国特許第5168057号)及びハリスらの方法(米国特許 第5196351号)の成功にもかかわらず、免疫コンプレックス形成速度及び コンプレックスの大きさ両方を高める方法の方が、医学的に重要な薬理学的活性 物質の濃度測定のための、より効率的、より効果的免疫検定法を提供するかも知 れない。本発明はこのような改良された免疫検定を行うための試薬及び方法を提 供する。発明の概要 : 本発明は生物学的サンプル中のあらかじめ選択した薬理学的作用物質の濃度を 検定するために使用できる試薬、特に二座配位子試薬に関するものである。本発 明はこのような試薬を用いる検定フォーマットにも関係する。 詳しく言えば、本発明は: (A)テストサンプルを (i)ビオチンメンバー、被検体メンバー、及びビオチンと被検体メンバーとの 間にあるスペーサーメンバーを含んでなる溶解性二座配位子試薬であって (a)試薬のビオチンメンバーはアビジンとストレプトアビジンとからなる 群から選択されるビオチン結合試薬に結合することができ;ビオチン結合試薬は 固体支持体(特にラテックス支持体)に 固定され、 (b)試薬の被検体メンバーは標的被検体に結合できる抗体に特異的に結合 可能であり; (c)中間スペーサーメンバーは、被検体メンバーと抗標的被検体抗体との 結合及びビオチンメンバーとビオチン結合リガンドとの結合を可能にさせる程十 分に長い 溶解性二座配位子試薬と; (ii)抗標的被検体抗体と; (iii)ビオチン結合試薬と 接触させることによって反応混合物を形成し; (B)その反応混合物を、二座配位子試薬と抗標識被検体抗体とビオチン結合試 薬との複合体の形成を十分可能にする条件下でインキュベートし; (C)サンプル中の標識被検体の濃度に反比例する、上記複合体の形成の程度を 測定する 各工程を含んでなる、テストサンプル中の標的被検体の存在を決定する検定法を 提供する。 本発明は、抗体がベンゾイルエクゴニン、コカイン、麻薬の1つ、PCP、ジ ゴキシゲニン、アセタミノフェン、カルバマゼピン、プリミドン、フェニトイン 、アミノグリコシド抗生物質、バンコマイシン、キニジンまたはカンナビノイド のような被検体に結合することができる土記検定の態様と特に関係づけられる。 本発明はラテックスとアビジンとをN−ヒドロキシスクシンイミド及び1−エ チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの存在下で、アビジ ンをラテックスに固定するのに十分な条 件のもとでインキュベートすることによって形成されるアビジン−ラテックス結 合体も提供する。 本発明は、 (A)ラテックス粒子の水性懸濁液を結合剤及び水溶性カルボジイミドの存在下 で、pH約6でインキュベートし; (B)そのインキュベーションにアビジンを加え、アルカリ性pHでその結合剤 によってアビジンをラテックス粒子に結合せしめる各工程を含んでなるアビジン のラテックスへの固定法も提供する。 本発明は、ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、ビオチンと被検体との間 にあるスペーサーメンバーとからなり、ビオチンメンバーがビオチン結合リガン ドと結合でき、被検体メンバーが抗体と結合できる十分な長さをもつ二座配位子 試薬の製法において、 (A)被検体前駆物質の反応性アミノ基をイソチアシアネート基に変換し; (B)イソチアシアネートをアルキアミドビオチンと凝縮させ、そのアルキアミ ドビオチンはスペーサー−及びビオチンメンバーからなる 各工程を含んでなる二座配位子試薬の製法も提供する。 本発明はビオチンメンバーと、被検体メンバーと、ビオチンと被検体との間に あるスペーサーメンバーとからなり、ビオチンメンバーがビオナン結合リガンド と結合でき、被検体メンバーが抗体と結合できる十分な長さをもつ二座配位子試 薬の製法において、 (A)被検体前駆物質の反応性アミノ基をカルボキシル基に変換し; (B)そのカルボキシル基をアルキアミドビオチンのアミノ基と凝 縮させ、そのアルキアミドビオチンはスペーサー及びビオチンメンバーからなる 各工程を含んでなる製法も提供する。 本発明はビオチンメンバーと、被検体メンバーと、ビオチンと被検体との間に あるスペーサーメンバーとからなり、ビオチンメンバーがビオチン結合リガンド と結合でき、被検体メンバーが抗体と結合できる十分な長さをもつ二座配位子試 薬の製法において、 (A)被検体前駆物質のヒドロキシル基をアミノ基に変換し; (B)そのアミノ基をアミド基に変換し; (C)そのアミド基をアルキアミドビオチンのアミノ基と縮合させ、そのアルキ アミドビオチンはスペーサー及びビオチンメンバーからなる 各工程を含んでなる製法をも提供する。 本発明は、ビオチンメンバーと、被検体メンバーと、ビオチンと被検体との間 にあるスペーサーメンバーとからなり、被検体メンバーが抗被検体抗体と結合で きビオチンメンバーがビオチン結合リガンドと結合できる十分な長さをもち、上 記被検体メンバーがベンゾイルエクゴニン、コカイン、麻薬の1つ、PCP、ジ ゴキシゲニン、アセタミノフェン、カルバマゼピン、プリミドン、フェニトイン 、アミノグリコシド抗生物質、キニジン、バンコマイシン、またはカンナビノイ ドである二座配位子試薬にも関係する。図面の簡単な説明 : 図1は本発明の粒子増大免疫検定のための3試薬系の概略図である。 図2は本発明の粒子増大免疫検定のための2試薬系の概略図であ る。 図3は本発明のベンゾイルエクゴニン−ビオチン試薬を生成する合成スキーム を示す。 図4は本発明のアセタミノフェン−ビオチン試薬を生成する合成スキームを示 す。 図5はバンコマイシン−ビオチン二座配位子を生成する合成スキームを示す。 図6はバンコマイシン−BSA結合物の構造を示す。 図7はプリミドン−ビオチン二座配位子を生成する合成スキームを示す。 図8はキニジン−ビオチン二座配位子を生成する合成スキームを示す。 図9はテトラヒドロカンナビオール(1)及びその代謝産物、△9−THC− カルボン酸(2)の構造を示す。 図10はテトラヒドロカンナビオール−ビオチン二座配位子の合成のために用 いられる合成スキームを示す。 図11はフェンサイクリジン−ビオチン二座配位子の合成のために用いられる 合成スキームを示す。 図12は新規のO3−(ビオチニル)モルヒネ誘導体の合成のために用いられ る合成スキームを示す。 図13は新規のフェニトイン−ビオチニル二座配位子の合成のために用いられ る合成スキームを示す。好ましい態様の説明 : 本発明はサンプル中のあらかじめ選択された作用物質の濃度を測定するための 免疫検定フォーマット類に用いることにできる検定及 び試薬に関する。本発明は特に、薬理学的作用物質のような低分子の検出及び定 量に関する。 既述のように、オーら(米国特許第5168057号)及びハリスら(米国特 許第5196351号)は低分子、単一エピトープ分子のネフロメトリー及び濁 度測定免疫検定を行うために用いることができる二座配位子及び三座配位子試薬 の合成及び使用について報告した。本発明の1態様は二座配位子試薬を用いて形 成される免疫コンプレックスのサイズを増大させる巨大分子の使用に向けられる 。発明の第2の態様はこのような二座配位子試薬を形成する改良法に向けられる 。 こうして、本発明は、二座配位子分子を用いる改良免疫検定フォーマットを提 供し、ベンゾイルエクゴニン、コカイン、ジゴキシゲニン、プリミドン、アセタ ミノフェン、バンコマイシン、カルバマゼピン、テオフィリン、アミノグリコシ ド抗生物質、キニジン及びカンナビノイドなとの薬理学的作用物質の存在及び濃 度を確認できる方法及び試薬を提供することによってオーら(米国特許第516 8057号)及びハリスら(米国特許第5196351号)の業績を拡大するも のである。 I.本発明の免疫検定フォーマット 二座配位子免疫検定法(オーらの米国特許第5168057号;ハリスらの米 国特許第5196351号;オーら著、非放射性免疫検定法、Ngo,T.T.編、Plen umPress、NY、457−476ページ、1988)において、免疫コンプレック スは2つの異なる結合反応によって生成する。1つの反応は、ビオチンメンバー と被検体メンバーとを有するビオチニル化二座配位子のビオチンメンバーにアビ ジ ンを結合させることを含む。他の反応は二座配位子のハプテン部分に対する抗体 の免疫反応である。抗体は2つのハプテン結合部位を有し、アビジンは4つのビ オチン結合部位を有するから、抗体と二座配位子試薬とアビジンとを一緒に混ぜ ると免疫コンプレックスが形成される。免疫コンプレックスの生成は速やかで、 アビジンとビオチンとの強力な結合の他に、アビジンの約35のリジン末端の正 電荷(pl 10)と関連があるようにみえる。この特殊の電荷補助免疫沈殿反 応がビオチン−アビジン法の特徴である。同様な条件Fでもストレプトアビジン (pl 5)または電荷を中和したアビジンは高速度で免疫沈殿反応を生起する ことができない。 実際には、抗体のFab部分(すなわち抗体のハプテン結合部分)とアビジン との間の立体阻害がアビジンの4つのビオチン結合部位のいくつかをブロックす る。このようなブロックは免疫コンプレックス形成の速度及び程度を制限する。 例えば、ハプテンとビオチンとの間のスペーサーの長さが約27Å以下である場 合には、アビジンと抗体のFab部分との間の立体阻害がアビジンの4ビオチン 結合部位のうちの2つをブロックする(オーら著、非放射性免疫検定法、Ngo,T. T.編、PlenumPess、NY、457−476ページ、1988)。このようなブロ ックは免疫コンプレックスを直線状にする: 線型ポリマーは濁度変化または光散乱をおこし、それらはそれぞれ濁度測定器 または比濁計でネフロメーターでモニターされる。もしもサンプル中にハプテン が存在するならば、それは抗体に関して二座配位子試薬のハプテンメンバーと競 合するであろう。このような競合は免疫コンプレックス形成速度の低下につなが る。こうしてネフロメトリー−または濁度測定−応答速度はサンプル中のハプテ ン濃度に反比例する。 II.本発明の粒子増大免疫検定フォーマット 本発明は分子量の小さい被検体、特にハプテンの存在を検出または定量するた めの改良免疫検定法に向けられる。免疫検定はオーら(米国特許第516805 7号)及びハリスら(米国特許第5196351号)によって記載されたビオチ ン二座配位子試薬を利用する。免疫検定はさらにビオチン結合試薬で標識化した 粒子の使用を含む。このような標識化を実現するためには種々の方法のいずれを 用いてもよい(例えば共有−、イオン−またはアフィニティー結合)。 ビオチン結合試薬は抗ビオチン抗体(またそのような抗体の断片)、ストレプ トアビジンまたはアビジンである。アビジンは卵白に見いだされる比較的大きい 巨大分子蛋白質である;ストレプトアビジンは細菌ソースから単離される構造的 に類似の分子である。 アビジンは本発明の最も好ましいビオチン結合試薬である。アビジンは4つの サブユニットを含む。アビジン分子の4サブユニットの各々はビオチン分子に特 異的に結合することができる。アビジンとビオチンとの結合反応は非常に強く、 結合定数は約1015 l/molである。この結合の非常に強い性質は、ビオチ ンがそのカル ボキシル基によって他の分子に結合していても、またはアビジンが他の分子に付 着していても持続することが判明した。ビオチンが他の分子に結合しているとき 、生成した共役体は普通はビオチニル化化合物と呼ばれる;例えばビオチニル化 二座配位子。ビオチニル化分子は例えば対応するアビジン付着分子に強く結合す る。このビオチニル化化合物とアビジン結合物との結合の特徴は大部分の不均質 免疫検定に利用され、種々の程度の成功をおさめている。例えば米国特許第42 28237号ではサンドイッチ免疫検定において、測定すべきリガンドのための ビオチニル化特異的結合パートナーを酵素標識アビジンと組合わせて用いる。米 国特許第4298685号に開示されているまた別のフォーマットでは、サンド イッチ免疫検定において形成されるサンドイッチの不溶性末端にビオチン:アビ ジン結合が用いられる。 本発明の方法により用いられる粒子はプラスチック、ラテックス、ガラス、金 属などの巨大粒子である。それらの粒子はビーズ、球などであってもよい。1態 様において、粒子は磁気ビーズからなる。このような巨大粒子の使用は光散乱ま たは反射の識別可能の変化を得るために必要なコンプレックスの生成程度を減ら すことができる。例えば巨大粒子の存在のために、さもなくば小さ過ぎて検出で きなかった免疫コンプレックスが容易に測定できる。粒子の存在は検出可能の錯 化合物形成速度にも、ネフロメトリーまたは濁度測定法によって検出できる被検 体の下限にも影響を与える。 ラテックス粒子、特に、カルボキシル化ラテックス粒子は最も好ましい粒子で ある。ラテックス粒子のサイズは50nm以下から100μm以上にまで変化す る。濁度測定又はネフロメトリー手段に よって被検体濃度を測定する免疫検定には小粒子(38−100nm)の使用が 好ましい。このような免疫検定では、60−100nm粒子の使用が特に好まし い。このような粒子はセラジン社(Seradynlnc.)(インディアナポリス、IN 、米国)から入手できる。各60nm粒子は平均約10000のカルボキシル基 を含み、各100nm粒子は共有結合のために使用できる基を約25000含む 。しかしながらより大きい粒子(10−100μm)の使用は免疫コンプレック スによる赤外線吸収を可能にし、それによって近赤外、又は赤外または熱検出器 を用いる被検体濃度の測定を可能とする。 アビジンのカルボキシル化ラテックスへの最適カップリングは、アビジン対ラ テックスの比、反応メジウムのpH、及びデタージェントの含有をモニターする ことによって達せられる。好適カップリング法は2段階からなる:カルボジイミ ド及びN−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を活性化し、その後アビ ジンと反応させる。アビジンは等電点(pl)10を有するから、反応の第2段 階のpHは若干塩基性(pH8.5ないし9)に維持するのが好ましい。このよ うな条件のもとでは十分な数のアビジン分子が遊離塩基の形にとどまり、したが ってラテックス粒子上の活性化カルボキシル基との求核反応に使用できる。pH 8以下では、ラテックス粒子はアビジンが添加されるやいなや凝集し始める。低 pHでは若干の凝集がおこる、これは多分アビジンとラテックス粒子との電荷的 相互反応によるか、または物理的吸着という方法で粒子がアビジンに捕捉される ためであろう。pH8.5ないし9でも粒子にアビジンが過負荷になるとやはり 粒子凝集がおきる。ツイーン−20を界 面活性剤として反応混合物中0.13%の濃度で用いるとき、セラジン社から入 手した60nm粒子にカップリングさせるためにはラテックス粒子1個につき総 計150のアビジン分子が最適であることが判明した。より多くのツイーン−2 0を用いない限り、この量を超えるアビジンは残念ながら粒子の凝集をひきおこ す。100nm粒子はより大きい表面積をもち、ラテックスの単位重量あたりの カルボキシル含量は比較的低いにもかかわらず、60nm粒子の約2倍の数のカ ルボキシル基をもっている。100nm粒子では粒子あたり700ものアビジン 分子がカップリング反応のために用いられる。 本発明のアビジン標識化粒子は、ラテックス粒子をヒドロキシスクシンイミド 及びカルボジイミドの存在下で4℃でインキュベートすることによって作られる 。その混合物のpHはその後約9.0に高められ、アビジンが加えられる。ラテ ックス−アビジン複合体は、好適には透析してカップリング試薬を除去した後、 クロマトグラフィー法によって回収される(例えばセファロースCL−6B精製 、または大きい有孔膜を用いる限外濾過などによる)。 これらの試薬をカップリングする特に好ましい方法において、カルボキシル化 ラテックスを約0.1M[3(N−モルフォリノ)]プロパンスルフォン酸(“ MOPS”)(pH6)、約0.5%ポリオキシエチレン(20)ソルビタン( “ツイーン−20”)(pH6)の溶液に懸濁する。その懸濁液を約4℃に冷や し、63mg/ml N−ヒドロキシスクシンイミドを含む冷0.1M MOP S(pH6)を1/9容量加える。それから46mg/ml水溶性カルボジイミ ドを含む0.1M MOPS(pH6)を1/10容 量加える。生成混合物をその後pH5.5−6に調節し、約1時間約4℃で撹拌 する。その後pHを約9に高め、その反応物と、約0.6mg/mlのアビジン を溶解して含む冷0.02M硼酸塩緩衝液(pH9)約2容量とを、さらに5時 間反応させる。 その後BSAを最終濃度約2mg/mlになるまで加え、その溶液を1晩中約 4℃で撹拌する。このインキュベーション後、ラテックス−アビジン混合物を0 .2%ツイーン−20を含む0.02Mトリス(pH9)緩衝液3交換に対して 1.5時間透析し、セファロースCL−6Bカラムを通過させるか、またはその 他の手段(例えばペリコン カセット装置(PCS))及び分子量カットオフ( MWCO)300kを有する膜によって精製する。このようなアビジン標識粒子 はビオチニル化二座配位子試薬を用いるここに記載の免疫検定フォーマットのい ずれと組合わせても用いられる。 この二座配位子またはラテックス−アビジン−二座配位子結合体そのものにカ ップリングする前にこのラテックス−アビジンを3−6日間45℃で熱ストレス にさらすと、免疫反応性及び検定感度は高まる(用量−反応曲線はより急勾配に なる)。 粒子増大二座配位子検定は液体処方二座配位子法に比べていくつかの利点をも っている。粒子の使用はより良い感度を提供し、液体ベースの方法より少ない試 薬と小さいサンプル量を必要とする。同じか、またはより鋭敏な用量−反応曲線 を得るために、抗体の利用性ではファクター10以上の改良と、サンプル容量の 1.3分の1ないし5分の1の減少が実現する。より多く希釈した抗体及びより 少ないサンプルの使用は、これら物質及びsample-to-sample基質変化に由来する バックグラウンド−シグナルの影響を低下させる。 このような使用は付加的に、サンプルや抗体基質に由来する妨害、例えば非特異 的沈殿などを減らし、適したcalibrator基質を選択する場合により大きいフレキ シビリティが与えられる。例えば、脂肪血サンプルまたは富トリグリセリド−サ ンプルは液体処方二座配位子検定を実質的に妨害する。250mg/dl以上の トリグリセリド濃度では、被検体濃度測定において10%以上の定量誤差が認め られた。このような妨害はラテックス処方では認められなかった。 粒子増大免疫検定の次の2態様は特に好ましい:3試薬系及び2試薬系。これ らの態様はアビジンに関して記載されているが、上記のようにその他のビオチン 結合試薬も用いられる。このような粒子の使用は、以下に種々の薬理学的作用物 質のいずれかを検出するための免疫検定に関して説明される(例えばベンゾイル エクゴニン、コカイン、ジゴキシゲニン、アセタミノフェン、カルバマゼピン、 プリミドン、テオフィリン、アミノグリコシド抗生物質、バンコマイシン、キニ ジン及びカンナビノイド)。 A.3試薬系 本発明の“3試薬系”態様において、免疫検定は3成分:アビジン標識粒子、 二座配位子及び抗被検体抗体を用いて行われる。免疫コンプレックスは抗被検体 抗体の存在下におけるアビジン−被覆粒子と二座配位子試薬との反応によって生 成する。発明のこの面は図1に説明される。 図1に示すように、免疫コンプレックスの生成はラテックス−アビジン粒子と 二座配位子のビオチン部分との結合、及び抗被検体抗体と二座配位子の被検体部 分の抗被検体抗体結合部位との結合に依 存する。大規模なコンプレックス生成が可能である、なぜならば抗体もラテック ス−アビジン粒子も多数の二座配位子分子に結合できるからである。図示されて いるように被検体は1個のエピトープしかもたないから、評価すべきサンプル中 に存在する被検体は、二座配位子と抗体結合部位を争うことによって免疫コンプ レックス生成を阻止する。コンプレックス生成程度はこうしてサンプル中の被検 体の濃度に反比例する。 B.2試薬系 発明の“2試薬系”態様においては免疫検定は2成分だけを用いて行われる: すべてのビオチン結合部位が二座配位子ビオチニル化試薬のビオチンメンバーで 飽和されているアビジン標識粒子と、抗被検体抗体。発明のこの面は図2に示さ れる。 図2に示すように、発明のこの態様では、ラテックス−アビジン粒子は二座配 位子過剰の条件下で二座配位子と共にあらかじめインキュベートされ、実質的に すべてのビオチン結合部位が二座配位子のビオチンメンバーで満たされるように する。サイズ排除カラムクロマトグラフィー、透析またはその他の手段によって 過剰の二座配位子を除去した後、生成したラテックス−アビジン−被検体粒子を 、結合した二座配位子の被検体部分がその後抗被検体抗体と結合しやすいような 仕方で二座配位子に結合させる。この試薬はこうして阻害免疫検定における一般 的“デベロッパー抗原”としてはたらき、その後抗被検体抗体の存在下でインキ ュベートしたときに免疫コンプレックスを形成することができる。3試薬系にお けるように、評価すべきサンプル中に被検体が存在すると、被検体結合部位を争 い、コンプレックス生成程度が減少する。免疫コンプレックス形成程度はサンプ ル中の被検体濃度に反比例する。 好適2試薬系の固有の利点は、製造すべき試薬数の減少のために製造過程が簡 単になり、したがって資料調査及び品質管理も簡単になることである。他方、3 試薬系ではアビジン−ラテックス試薬はどんな低分子−被検体にとっても“普遍 的”試薬であり、異なる二座配位子試薬及び抗体と組合わせて、種々の凝集テス トキットに用いることができる。2試薬系は自動処理法により利用しやすい、な ぜならばこれらの方法は、緩衝液とサンプルを挿入した後、概ね2つだけの試薬 を反応室に入れればよいからである。 検定及び試薬最適化領域においては3試薬系と2試薬系との間にはこの他にも 違いがある。アビジン−ラテックス−二座配位子−共役体を用いる2試薬系では 従来の液体試薬系とは異なり、用量反応曲線が共役体:抗体の比を変化させても 容易に変化しない。しかしながら、ラテックス上のアビジン負荷及び(程度は少 ないが)これら粒子の大きさの変化によって用量反応曲線は変化し得る。これに 関して、3試薬系からなるラテックス−アビジン一般的試薬の使用の際にはフレ キシビリティーがあり、所望の用量−反応が得られる。トリガー二座配位子濃度 によって、種々の用量−反応曲線が得られる。このように3試薬系の方が検定及 び試薬最適化のためには使いやすい。 3試薬系の二座配位子トリガー試薬は別個に処方されるから、免疫化学的試薬 成分の究極的化学的安定性のために最適の緩衝液組成物を選択することができる 。例えばコカイン二座配位子などの二座配位子は加水分解に対して不安定なエス テル結合をもっているため緩衝液の選択は重要である。例えばコカイン二座配位 子の場合、緩衝液は約pH6に保たれ、エステル結合に関してかなり長い保存寿 命が得られる。 3試薬系では抗体希釈及びラテックス−アビジン濃度を一定にして二座配位子 濃度を種々変えると、期侍される“ベル型”速度プロフィールが得られる[参照 、アイゼン(Eisen,H.N.):微生物学(Microbiology)、2版(デイヴィス(Da vis,B.D.)ら編集)、Harper & Row、NY、370−386ページ(1973) ]。過量の二 座配位子使用は抗体結合部位を飽和し、及び/または、そのラテックス凝集への 参加はアビジンによって阻止され、この結果反応速度は減少した。他方、使用す る二座配位子の量が不十分である場合、ラテックス粒子上のアビジン結合部位の 少数のみが凝集に用いられ、低い反応速度が認められた。 III.被検体の検出 本発明の免疫検定は生物学的サンプル(例えば血液、血清、痰、尿、脳脊髄液 (CFS)など))並びに法医学的サンプル(例えば衣類、化学的残留物、塵芥 または粉末など)中の被検体の存在また濃度を検定するために用いられる。 好ましい態様において、被検体の検出は上記ハリスらのネフロメトリーまた濁 度測定免疫検定を用いて実施される(米国特許第5196351号)。 しかし本発明の試薬はこれに代わる種々の不均質または均質免疫検定フォーマ ットのいずれにも使用できる。例えば、或る決められた量の二座配位子試薬を、 二座配位子の被検体メンバーと結合することができる抗体の存在下でサンプルの 1部とインキュベートすることができる。このような検定ではその抗体に結合す る二座配位子試薬量はサンプルに存在するハプテンの量に反比例する。1態様に おいて、二座配位子試薬のビオチンメンバーは放射性標識化される。所望ならば 、その抗体を固体支持体に固定することができ、結合程度をアビジン−酵素また はアビジン−ビオチン−酵素複合体を用いて決定することができる。この代わり に、このような検出を抗ビオチン抗体の使用によって実現することができる。既 述のようにより大きい粒子を使用すれば熱検出器によって免疫コンプレックスを 検出することができる。 1均質免疫検定フォーマットにおいて、アビジンは本発明の試薬のビオチンメ ンバーのキャパシティの調節物として用いられ、ビオチン要求酵素の補因子とし て機能することができる。こうしてそれらは、バケット(Bacquet)ら(米国特 許第4550075号)またはホラビー(Horaby)ら(米国特許第423856 5号)によって報告されたものと類似の方法に使用することができる。 しかし、特に本発明の二座配位子試薬及びビオチン結合粒子を用いてハプテ ン性被検体のための新規の2サイトーまたは“サンドイッチ”免疫検定を行うこ とができる。サンドイッチ検定では、反応の1成分(抗原かまたはその抗原に結 合する抗体かどちらか)には第2の抗体が結合する(すなわち“サンドイッチ” される)。本発明の好適“ザンドイッチ”検定では、二座配位子試薬は(その被 検体メンバー及びそのビオチンメンバーの結合によって)抗被検体抗体とビオチ ン結合分子とにサンドイッチされる。重要なことは、このような構造は、単一の 抗体種のみを使用して形成されるという点で従来の“サンドイッチ”検定とは異 なることである。 従来の免疫検定は多エピトープ分子を含む。このようなサンドイッチ免疫検定 フォーマットは種々報告されている。一般的1フォーマットにおいては、2つの 抗体が用いられる。第1の抗体は関心とする抗原に結合することができ、固体支 持体(例えばミクロタイタープレート、試験管、計量棒など)に結合する。支持 体は評価すべきサンプルと接触して置かれ、サンプル中に存在するすべての抗原 を固定するために用いられる。その後支持体を洗い、第2の抗体と接触するよう に置かれる。第2抗体は普通は標識化され、抗原の第 2のエピトープに結合することができる。標識抗体が固定された抗原と複合体化 する第2インキュベーション期間後、支持体の2回目の洗浄を行い、未反応の標 識抗体を除去する。このタイプの前進サンドイッチ検定は、抗原が存在するかど うかを決定する簡単な“イエス/ノー”検定であってもよいし、または保持され た標識抗体の量を既知量の抗原を含むサンプルで得られたものと比較することに よって定量的に行われてもよい。このような検定はワイド(Wide)によって放射 免疫検定法(Radioimmune Assay Method)(キルカム(Kirkham)ら編、E.& S.L ivingstone、エジンバラ、199−206ページ(1970)、引例によってこ こに挿入される)に記載されている。支持体に固定された、検出可能に標識化さ れた抗体は評価すべきサンプル中の抗原濃度に正比例する。 別の一般的フォーマットにおいては、特定抗原に特異的な固定抗体をサンプル 及び検出可能に標識化された未結合抗体と共にインキュベートする。インキュベ ーション終了後、固体支持体を洗って残っている液体サンプル及び複合体化しな かった標識抗体を除去する。その後固体支持体に結合した標識抗体の存在を、従 来の“前進”サンドイッチ検定で用いられる方法で調べる。本発明のアビジン− ラテックス粒子及び二座配位子を用いて、固定された分子及びサンプルを一緒に 標識化分子の存在のもとで単にインキュベートすることによって同時免疫検定を 行うことができる。 非標識化抗原を支持体に結合する。このような免疫検定では、抗原に結合でき る非標識化抗体をサンプルと共にインキュベートし、それから固体支持体に接触 させる。サンプルの抗原に結合していない抗体は固定抗原に結合し、第1の抗体 に結合できる第2の標識抗 体を用いて検出できる。逆検定では、支持体に結合した第2の標識抗体の量はサ ンプル中の抗原の量に反比例する。 述べたように、本法の試薬を用いてハプテンのためのサンドイッチ免疫検定を 設計することができる。1態様においては、例えば本発明のアビジン−ラテック ス粒子を固体支持体に固定し、二座配位子試薬と組合わせて用いる;その二座配 位子試薬の被検体メンバーはサンドイッチ免疫検定において抗ハプテン抗体及び 標識抗被検体抗体(すなわち抗ハプテン抗体)に結合できる。種々の固体支持体 がこの目的のために用いられる。実際1態様においてはラテックス粒子の代わり にラテックスシート、シリンダーなどが用いられ、アビジン分子はこのような支 持体に直接結合することができる。あるいは支持体をビオチニル化し、アビジン 標識粒子がビオチン−アビジン相互作用によって支持体に固定されるようにして もよい。 1つのサブ態様において、検出可能に標識化された分子の限定量が用いられ、 非固定標識分子の量が決定される。支持体に固定されていない検出可能に標識化 された分子の爪は評価すべきサンプル中の被検体濃度に正比例する。 二座配位子のビオチンメンバーを固体支持体に直接固定することによって、本 発明を用いてまた別のサンドイッチ免疫検定法を行うことができる。この態様に おいては固定二座配位子の被検体部分をサンプルの存在のもとで(またはサンプ ルと共にインキュベートした後に)標識抗被検体抗体と共にインキュベートする 。サンプルに存在する被検体は抗体結合に関して固定被検体と競争する。抗体結 合の程度はこうしてサンプル中の被検体の量に反比例する。 その最も好適な実施態様において、本発明の免疫検定はモノクロ ーナル抗体を用いる。このような抗体が次のようにして形成されることが最も好 ましい、すなわちマウス、ラット、ウサギなどを、抗原蛋白質に結合した、また はアジュバントと協力した関心とする被検体で免疫し、その動物の脾臓白血球を 収穫し、それを適した骨髄腫細胞と融合させる。1態様においてこのような抗体 を引き裂きまたは処理して、被検体に結合する能力を保有する断片を形成する。 このような断片の例にはF(ab’)、(F(ab’)2)断片がある。 上で論じた固体支持体は例えばガラス、紙、ポリスチレン、ポリプロピレン、 ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改質セルロース 、ポリアクリルアミド、アガロースまたはマグネタイト(磁鉄鉱)などの材料か らなる。支持体の性質は本発明の目的のためには若干溶解性であるか、または不 溶性であってよい。支持体材料は実質上、あり得るいかなる構造的形もとること ができる。例えば支持体の形はビーズのように球形であってもよいし、試験管の 内面または棒の外面のようにシリンダ状でもよい。さもなければ表面はシート、 試験片などのように平らでもよい。熟練せる当業者はモノクローナル抗体と結合 するための多くの他の担体を知っており、または日常的実験によってこれを確か めることができる。1態様において、支持体はポリスチレン製ミクロタイタープ レートである。 フォーマットには無関係に、免疫検定のプロセッシングは自動サンプルプロセ ッシング装置を用いて自動化するのが最も好ましい。本発明の二座配位子試薬を 用いていかなる適した装置も用いられるとはいえ、米国特許第5162236号 に記載されているパング( Pang,W.S.)らの自動的方法は特に好ましい(参照して明細書中に取り込まれる )。概ねパングらの方法は温度及び試薬量をコントロールする装置を用いる。免 疫検定はネフロメトリー光学的モジュール内のキュベットで行われる。装置のセ ンサーがキュベットに流入する反応緩衝液体の温度を感じ取り、熱交換器が必要 に応じて緩衝液の温度を上昇または下降させる。温度センサーに反応するコント ロール回路が熱交換器をコントロールして緩衝液及びキュベットの温度を選択し た温度範囲に維持する。装置は好適にはサンプル ピックアップステーション、 そのサンプルピックアップステーションから選択したサンプルを引き出すための サンプルプローブ、サンプル調製ステーション及び上記サンプルをサンプル調製 ステーションから反応キュベットに運ぶためのサンプル運搬体を含む。好適実施 例において、装置は抗体ピックアップステーション、抗体を抗体ピックアップス テーションから引き出すための抗体プローブ、抗体調製ステーション及び抗体を 抗体調製ステーションから反応キュベットへ運ぶための運搬体も含む。 IV.本発明の試薬 本発明は上記の固定支持体(特にラテックス粒子)と、被検体メンバーを含む 二座配位子共役体と、抗被検体抗体を用いるのが好ましい。最も好適には本法は ハリスら(米国特許第5196351号)が報告した二座配位子共役試薬を用い る。このような試薬はスペーサーメンバーによって分離された2つの化学的メン バーを含む。第1のメンバーは被検体メンバーである。ここに用いる“被検体” とは、検出すべき薬理学的作用物質かまたは1つの“類似”作用物質である。も しも上記両作用物質が上記薬理学的作用物質に結合可 能の抗体に結合することができるならば、ここに用いられる1作用物質は、1薬 理学的作用物質に“類似”である。 上記共役体の第2のメンバーは最も好適にはビオチンであり、アビジン、スト レプトアビジンまたは抗ビオチン抗体に結合できる。最も簡単な態様において、 本発明の被検体メンバーはあらかじめ選択された薬理学的作用物質そのものの誘 導体形(例えばアセタミノフェン検定に用いられるアセタミノフェン−ビオチン 誘導体)からなる。別法では、被検体メンバーは構造が、あらかじめ選択した薬 理学的作用物質の構造と関連せる代謝産物またはその他の化合物からなる。こう して例えば、コカインに向けられた免疫検定では、被検体メンバーはコカインの d、l、またはd,l体、ベンゾイルエクゴニン、エクゴニンメチルエステル、 エクゴニン、ベンゾイルノルエクゴニン、ノルコカインなどのビオチニル化誘導 体からなる。同様に、ジゴキシンまたはそのアグリコン誘導体、ジゴキシゲニン もビオチンに結合して、ジゴキシン免疫検定に用いられる試薬を作り出す。本発 明はさらにカルバマゼピン、ブリミドン、テオフィリン、アミノグリコシド抗生 物質、バンコマイシン、キニジン、カンナビノイド並びにその他の薬理学的活性 物質を検出するために適した二座配位子試薬を形成するための方法を提供する。 V.本発明の二座配位子試薬の合成 二官能性共役体のメンバーをスペーサーメンバーによって結合する技術におい ては多くの方法が記載されている。参照;例えば米国特許第4134792号、 米国特許第4238565号及びグリーン(Green,N.M.)、コニエツニー(Koni eczny,L)、トムス(Toms,E.J.)、及びバレンチン(Valentine,R.C.)著、ア ビジンのサブ ユニットの配列決定のための二官能性ビオチニル化合物の利用、Biochem.J.、1 25巻、781−791ページ(1971)。これらの方法は概して化学的部分 の典型的縮合、付加及び置換反応を含む(上記化学的部分はこのような反応の前 にあらかじめ活性化されることもある)。 ハリスら(米国特許第5196351号)が開示したように、約20原子のス ペーサーが、それらの結合パートナーに対するそれぞれの結合能力に悪影響を与 えずに、共役体のメンバーを互いに結合させることができる。だがより長いか、 またはより短いスペーサーも用いられる。米国特許第5196351号に記載さ れた二座配位子分子はヒドロキシスクシンイミドエステルをアミンと反応させる ことによって形成される。例えばビオチンのN−ヒドロスクシンイミドエステル を関心とする薬理学的作用物質のアルキルジアミン(例えばヘキサンジアミン) 誘導体と反応させることによって、関心とする薬理学的作用物質が20原子スペ ーサーを介してビオチン分子に結合した二座配位子分子が形成される。アルキル 鎖が20炭素原子より長い、または短いアルキルアミドビオチン誘導体の使用に よって、スペーサーの長さを調節することができる。 好適スペーサーの性質は被検体メンバーの官能基(1つまたは複数)の性質に 依存する。被検体メンバーがカルボキシル基を含む場合、そしてビオチンメンバ ーがこのカルボキシル基に結合することが所望される場合には、スペーサーは好 適にはアルキルジアミン及びアルキルアミノ酸を用いて形成される。こうして被 検体のカルボキシル基はアルキルジアミン(例えばヘキサンジアミン)のアミノ 基と反応してペプチド結合を形成し、アルキルジアミンの未反応の アミノ基はアルキルアミノ酸(例えばn−アミノヘキサン酸)のカルボキシル基 と反応して第2のペプチド結合を形成する。生成した分子はこうして遊離アミノ 基(アルキルアミノ酸から誘導された)を有するスペーサーを含む。この基はビ オチンのカルボキシル基と反応して二座配位子分子を形成する。 被検体メンバーがヒドロキシル基を含み、ビオチンメンバーとこのヒドロキシ ル基との結合が所望である場合、スペーサーは好適にはアルキルジアミンとハロ ゲン化酸を用いて形成される。こうして被検体のヒドロキシル基はハロゲン化ア ルキル酸(例えば1−ブロモ−n−ペンタン酸)のハロゲンと反応して遊離カル ボキシル基を有するアルキル化付加物を与える。この付加物のカルボキシル基は アルキルジアミンのアミノ基と反応する。アルキルジアミンの遊離アミンはその 後ビオチンのカルボキシル基とペプチド結合を形成することによって所望の二座 配位子を作り出す。 被検体メンバーがアミノ基を含み、ビオチンメンバーをこのアミノ基に結合さ せることが所望である場合、いくつかの好適方法がある。ヘキサンジアミン琥珀 酸無水物スペーサーが好適である。この誘導体のスペーサー長さは2つのヘキサ ンジアミン誘導体をアミノ酸と組合わせて用いるか、またはより長いか短い長さ のアルキルジアミンを用いることによって調節される。好適アルキルアミドビオ チン誘導体は4段階で形成される。ビオチンを無水ジメチルホルムアミド(DM F)中で高温(60−80℃)で1,1’−カルボニルジイミダゾールとともに インキュベートし、それから周囲温度にまで冷やすことによって活性化する。V MFに溶解した1,6−ヘキサンジアミン(HD)をそれから活性化ビオチンに 添加する。反 応が生起した後、ビオチン−ヘキサンジアミン(BIOTIN−HD)生成物を シリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。 ビオチンヘキサンアミンのサイドアームをその後ピリジン中琥珀酸無水物(SA )で延ばすとBIOTIN−HD−SAが得られる。合成の最終段階はCDlに よるBIOTIN−HD−SAの活性化とその後の1,8−オクタンジアミン( OD)添加及び所望BIOTIN−HD−SA−ODアルキルアミドビオチン誘 導体のシリカゲル上での精製を含む。上記の代わりに、アルキルアミドビオチン 誘導体、カプロアミドビオチンを用いてもよい。所望ならば、上記ジアミンの遊 離アミノ基を、所望長さを有するアミノ酸に結合することによってスペーサーの 長さを延ばすことができる。 別の態様では、被検体のアミノ基をアミノ酸のカルボキシル基と反応させるこ とによって(すなわちジアミンも琥珀酸無水物もないところで上記反応を行う) スペーサーを形成する。 上記の方法は、被検体がイソチオシアネート基を含み、その基とビオチンメン バーとのカップリングが所望である場合にも用いられる。 こうして本発明は所望の二座配位子分子を生産する別の合成経路を提供する。 本発明によると、このような分子を形成する第1の一般的方法は、被検体の反応 性アミンをイソチオシアネート基に変換し、それからその基を1つの上記アルキ ルアミドビオチン誘導体のアミノ基と縮合させることを含む。 若干の場合、例えばベンゾイルエクゴニン−ビオチン誘導体を製造する場合な どには被検体は多数の反応基をもつかも知れない。こ のような基は例えばアルキルエステルに変換するなどの方法で保護するのが好ま しい。本発明のこの面は図3にベンゾイルエクゴニン−ビオチン誘導体の製法に 関連して説明される。 このような誘導体を合成する好適方法において、コカイン(I)を酸(例えば 0.75N HCl)と熱とで加水分解してエクゴニン(II)を形成する。エ クゴニンの新たに形成されたカルボキシル基はその後酸及びメタノールと反応し てエクゴニンメチルエステル(III)を生成する。エクゴニンメチルエステル はその後4−ニトロベンゾイルクロリド及びトリエチルアミンと反応し、4−ニ トロベンゾイルエクゴニンメチルエステル(IV)を与える。ニトロベンゾアー ト部分のニトロ基を上記のように水素とPd−Cを用いてアミン(V)に変換す る。これが行われるやいなや、メチルエステル基を水及び熱との反応によって脱 エステル化すると4−アミノベンゾイルエクゴニン(VI)が生ずる。チオフォ スゲン及び酸(例えば2N HCl)との反応によってそのアミノ基はイソチオ シアネート基に変換され、ベンゾイルエクゴニンイソヂオシアネート(VII) を与える。 ベンゾイルエクゴニンイソチオシアネート(VII)をそれからアルキルアミ ドビオチン誘導体(VIII)と直接反応させ、所望のベンゾイルエクゴニン− ビオチン二座配位子共役体を得る。 別の第2の一般的方法においては、被検体の適したアミノ基をカルボキシル基 に変換する。実際、試薬を適切に選択すれば、このような化学を用いて関連分子 を所望被検体作用物質に変換することができる。本発明のこの態様によって被検 体のアミノ基はピリジンまたはピリジン誘導体のような有機塩基の存在のもとで アルキル無水 物と反応する。より長いまたはより短いアルキル無水物を選択することによって 、二座配位子分子のスペーサーを調節できる。好適アルキル無水物はN−琥珀酸 無水物である。インキュベートション反応はその無水物のカルボニル炭素の1つ を被検体のアミノ基に結合させ、それによって遊離カルボキシル基を有する被検 体のアミド化誘導体が生成する。このカルボキシル基をその後アルキルアミドビ オチン誘導体のアミンと反応させると、所望の二座配位子共役体が生成する。 本発明のこの面をアセタミノフェン−ビオチン誘導体の製法に関して図4に説 明する。 このような誘導体を合成する好適方法において、構造的にアセタミノフェンに 関連のある化合物であるパラヒドロキシアニリン(I)をトリエチルアミンと塩 化メチレンの存在下でトルエンスルホニルクロリドと反応させる。この反応はパ ラヒドロキシアニリンのヒドロキシル基をスルホニルトルエン基に変換する(I I)。ピリジンの存在下で無水琥珀酸と反応させると、アニリンのアミノ基のス クシニル化がおきる(III)。スクシニル化産物を塩基(例えば6N NaO H)及びメタノールと反応させ、スルホニルトルエン基を除去し、芳香族ヒドロ キシル基を回復する(IV)。元に戻った分子をそれからアルキルアミドビオチ ン誘導体のアミンに直接カップリングすると、所望の二座配位子共役体が生成す る。 第3の一般的方法においては、関心とする被検体のヒドロキシル基をアミノ基 に変換し、二座配位子分子を形成する。好適にはこれは関心とする作用物質を、 無水酢酸アンモニウム及びシアノボロハイドライドナトリウム(sodium cyanobor ohydride)のメタノール溶 液中で窒素雰囲気下で室温で反応させることによって実現する。関心とする作用 物質が反応性部分、例えばエーテルまたはラクトン環などを含む場合のような或 る状況下では、アミノ化反応を行う前にその反応性部分を保護することが必要で ある。 このような誘導体の好適合成法において、ジゴキシンのアグリコン誘導体であ るジゴキシゲニン(I)は、ジゴキシンをエタノール及び塩酸中で加水分解し、 その後中和し、再結晶することによって作られる。ジゴキシゲニンは3つのヒド ロキシル基を有するが、炭素3にある部分のアミノ化が好ましい。ジゴキシゲニ ンはラクトン環部分ももっており、そのためアミノ化を行う前にその環を保護す るのが好ましい。 好適保護スキームではジゴキシゲニンを金属酸化物、例えば酸化白金[IV] 一水加物などと水素の存在下で反応させることが必要である。この反応はラクト ンのエーテル結合を水素化し、それによって環は開裂し、ジゴキシゲニンのカル ボン酸誘導体中間物質(II)が生成する。この中間体はさらに水素化され、ゲ ム ジオール誘導体(III)を与える。ゲム(gem)ジオール誘導体(III )はそのケト型(IV)とケト−エノール型との平衡状態にある;ケト型の方が 明らかに好ましい。その後ケト誘導体(IV)と触媒とをジゴキシゲニン−アセ トン溶液中で空気流下、撹拌下でインキュベートする。この反応はジゴキシゲノ ン(V)を生成し、それを例えば酢酸エチルを用いて再結晶させる。 この段階では、ラクトン部分は保護されており、ジゴキシゲノンを無水酢酸ア ンモニウム及びsodium cyanoborohydrideのメタノール溶液中でインキュベート するとジゴキシゲノンの炭素3はアミ ン化され、3−アミノジゴキシゲノン(V)が得られる。3−アミノジゴキシゲ ノン(V)のアルカリ処理は環を変化させ、3−アミノジゴキシゲニン(VI) が生成する。 無水ピリジン中で3−アミノジゴキシゲニンと琥珀酸無水物とを反応させると 、シリカゲル精製後、ジゴキシゲニンの3−アミド琥珀酸が得られる。この化合 物はその後アルキルアミドビオチン誘導体のアミンに直接カップリングし、所望 二座配位子共役体を形成する。 今本発明を概略説明したが、これは次の例を参照することによってより容易に 理解される。これらの例は説明のためのものであり、特に記載がない限り本発明 を制限するものではない。 例1 ジゴキシンの均質免疫検定 上記のジゴキシゲニン−ビオチン二座配位子を用いてジゴキシンの均質免疫検 定を行った。免疫検定は免疫沈殿反応に基づき、ネフロメトリーまたは濁度測定 法によってモニターすることができる。この検定はアビジン、ストレプトアビジ ン、変形アビジン、または好適には担体物質(すなわち粒子、巨大分子、コロイ ド状金属、コロイド状酸化金属)に付着したアビジンを用いる。二座配位子分子 の合成及び免疫検定の詳細を以下に述べる。 ジゴキシゲニンの3−アミド琥珀酸の製法 ジゴキシンをエタノール及び塩酸中で2時間還流することによって加水分解し た。中和及び再結晶後、ジゴキシゲニンのアグリコンを得た。酸化白金(IV) −水加物と水を45psi(3.2kg/cm2)水素圧力下のパール反応器に 1時間置き、その後真空下 で水素を除去した。触媒をジゴキシゲニン−アセトン溶液に移し、その溶液を撹 拌しながら、薄層クロマトグラフィー(“TLC”)分析の結果が反応が終わり に近づいたことを示すまで、溶液に空気を通した。触媒を除去し、ジゴキシゲノ ンを酢酸エチルから再結晶した。 無水酢酸アンモニウムのメタノール溶液をsodium cyanoborohydrideと一緒に し、ジゴキシゲノンに加え、周囲温度で窒素気流下で1晩撹拌した。 反応物を蒸発乾固し、残渣を0.1M塩酸に再溶解した。ジクロロメタンで抽 出し、不純物を除去した後、溶液をアルカリ性にし、ジクロロメタンで抽出して 3−アミノジゴキシゲニンを回収した。 無水ピリジン中で3−アミノジゴキシゲニンと琥珀酸無水物とを反応させると 、シリカゲル精製後、ジゴキシゲニンの3−アミド琥珀酸が得られた。 ビオチン(BIOTIN)−HD−SA−OD製法 BIOTIN−HD−SA−ODを4段階で作った。ビオチンを無水DMF中 で70℃、30分間1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI)で活性化し 、それから周囲温度に冷やした。1、6−ヘキサンジアミンをOMFに溶解し、 それから活性化ビオチンに加えた;混合物をそれから1晩周囲温度で撹拌した。 ビオチン−ヘキサン アミン(BIOTIN−HD)をシリカゲル上カラムクロ マトグラフィーによって精製した。ビオチン−ヘキサン アミンのサイドアーム をピリジン中琥珀酸無水物で延ばし、その後精製するとBIOTIN−HD−S Aが得られた。最終段階はBIOTIN−HD−SAのCDIによる活性化とそ れに続く1、1’−オク タンジアミン添加及びシリカゲル精製であった。 DIG−NH−SA−OD−SA−HD−BIOTIN製法 ジゴキシゲニン−3−アミド琥珀酸(DIG−NH−SA)を無水ジメチルホ ルムアミドに溶解した。それからN−ヒドロキシ−スクシンアミド及びジシクロ ヘキシルカルボジイミドを加え、その溶液を周囲温度で3時間撹拌した。混合物 の薄層クロマトグラフは、出発材料が消え、より高い相対的移動値(“Rf値” 、すなわちクロマトグラフィー溶媒が移動した総距離に対する特定化合物の移動 の比率)をもつ新しいスポットが出現していることを示した。BIOTIN−H D−SA−ODをその反応混合物に加え、周囲温度で1晩撹拌した。反応物を蒸 発乾固した;残渣をメタノールで洗い、クロマトグラフィーにかけると二座配位 子、DIG−NH−SA−OD−SA−HD−BIOTINが得られた。DIG−NH−SA−OD−SA−HD−BIOTIN−アビジン(AVIDI N)の製法 アビジンを0.1M 燐酸緩衝液(pH7.4)に10mg/ml濃度で溶解 し、その後HABA[2(4−ヒドロキシフェニル−アゾ)安息香酸)]中10 mMにした。溶液は黄挑色に変色した。DMF中5.0mg/mlDIG−NH −SA−OD−SA−HD−BIOTINストック溶液を作り、50μl部分を アビジン−HABA溶液に加えた。添加は一滴づつ行われ、滴下間に混合しなが ら溶液が黄色になるまで続けられた。溶液を1時間放置した。その反応混合物を 12−14000MWカットオフを有する6.4mm透析チューブに移した;そ の際0.2mlクエン酸緩衝食塩液(CBS)pH6.0を用いた。透析はCB SpH6.0、250ml 中で4℃で行われ、3日間に透析液を6回代えた。 反応溶液を回収し、UVスペクトルにより、波長280nmで定量した(1m g/mlアビジンの280nmにおける吸光度は約1.45である)。結果は、 回収した材料が7.5mg/mlのアビジン濃度をもつことを示した。 ジゴキシゲニン−ビオチン共役体及び抗体の力価(タイター)をICSIITM M33カードを用いて評価した。M33カートはICSIITM分析器と共に含ま れるゲインセッティング アジャスターである。ARRAY分析器またはその他 の同様な装置を用いても実質的に等価の結果が得られる。検定プロトコールは下 記のようであり、結果を表1に示す: ICSTM緩衝液:600μl 抗体:42μl(CBSまたはICSTM緩衝液中 1/10、1/15、または 1/20) サンプル:42μl(CBSまたはICSTM緩衝液) 共役体:42μl 検定をさらに較正するために、共役体0.10mg/mlと抗体の1/10希 釈を用いて標準曲線を作成した。このような較正のために、8%BSAを含むD MF中10mg/mlのジゴキシン標準溶液を調製した。標準を希釈し、8%ウ シ血清アルブミン(“BSA”)を含むジメチルホルムアミド中、1000、1 00、10、1.0、0.1μg/ml濃度とした。検定は二重に行われた。検 定条件(ICSIITM、M33カードを用いる)は次のようであった: ICSTM緩衝液:600μl 抗体: 42μl(ICSTM緩衝液中1/10 サンプル: 42μl(ICSTM緩衝液中1/20) 共役体: 42μl(0.10mg/ml) 検定結果を表2に示す。 例2 ジゴキシンのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 例1に記載の試薬及び免疫検定を変形して、高度に鋭敏なラテックス粒子−増 大均質ジゴキシン検定法を得る。 このような検定の第1段階はラテックス−アビジン粒子の生成である。下記の 方法のいずれかを用いて適切な粒子を得た:方怯A 1.3.5mlMOPS緩衝液(0.1M、pH6.0)、0.28ml 10 %ツイーン−20及び0.64mlカルボキシル化改質ラテックス(“CML” )(直径38nm、ドューク サイエンティフィック社からの10%固溶液)を 50mlエルレンマイヤーフラスコ中で合一した。 2.0.86mlMOPS緩衝液(0.1M、pH6.0)中44mgN−ヒド ロキシスクシンイミド(NHS)及び0.8mlMOPS緩衝液(0.1M、p H6.0)中30mgl−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボ ジイミド(EDAC)を反応液に加え、約4℃で1時間撹拌した。 3.pHを測定し、その後3NNaOHで約8.0に調節した。 4.MOPS緩衝液(20mM、pH8.0)16mlにアビジン11mgを混 ぜ合わせることによってアビジン溶液を調製した。その溶液を反応液に加え、そ の反応液を4℃で5時間撹拌した。 5.それからpHを再測定し、BSAを最終濃度2mg/mlBSAになるまで 加えた。 6.生成したラテックス−アビジン調製液をチューブ透析(4℃、3回交代、1 00x容量透析チューブMWCO 12−14000、20nMトリス緩衝液p H9.0、0.2%ツイーン−20及び0.09%アジ化ナトリウムで平衡化) を用いてその他の反応体を除去することによって精製した。 7.精製し、元の容量まで濃縮した後、200mgBSAを加えてBSA中2m g/mlの溶液を作る。その反応液を室温で1時間、またはBSAが完全に溶解 するまで混合する。 8.ラテックス試薬の容器は完全にシールし、45℃オーブン中で3日間(72 時間)インキュベートした。 9.インキュベーション後、試薬をオーブンから取り出し、室温に冷やし、約7 .0のpHにする。PBS,7.4、に2−(4−ヒドロキシフェニルアゾ)安 息香酸(HABA)を溶かした10mM溶液(“HABA溶液”)120μlを 加えると、溶液は橙黄色になった。 ジゴキシン−ビオチン試薬2mgを秤取し、その材料をジメチルホルム、アミ ド1mlに溶解することによって所望のジゴキシン−ビオチン二座配位子−アビ ジン複合体を作った。ビオチン被検体(2mg/ml溶液)300μlを100 μlDMF及び600μlト リス緩衝液(20mMトリス、pH7.0、0.2%ツイーン−20、0.01 %アジ化ナトリウム)と合一した。最終溶液はジゴキシン−ビオチン600μg /ml濃度となった。 橙黄色溶液をジゴキシン−ビオチン溶液で滴定した。これは溶液が明黄色に変 わるまで100μl部分づつ添加することによって行われ、その後10%過剰を 添加した。総添加量は約400μlであった。反応体類を約30分間室温で撹拌 した。 未結合の反応体類を分子量カットオフ12−14kdを有する25mm透析チ ューブ(バクスター)を用いる透析によって除去した。透析は20mMトリス、 pH9.0、0.2%ツイーン−20及び0.01%アジ化ナトリウムに対して 行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液4交換を用いた(約10リットルづつ) 。方法B (例8−12の免疫検定に用いられる) 1.D.I.水 19.5ml、MOPS緩衝液6.0ml(0.1M、pH6 .0)、10%ツイーン20 1.5ml、及びカルボキシル化改質ラテックス (CML、直径60nm、セラジン社からの10%固溶液)3.0mlを200 mlエルレンマイヤーフラスコ中で合一し、室温で約5分間ゆっくり混合した。 2.199mgN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び148mgl−エ チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を反応 液に加え、約4℃で1時間撹拌した。 3.pHを測定し、それから1N NaOHで約9.0±0.1に調節した。 4.75mgアビジンと3.4ml 10%ツイーン−20と67.5mlMO PS緩衝液(20mM、pH9.0)を混合すること によってアビジン溶液を調製した。その溶液を反応液に加え、反応液をそれから 5時問4℃で撹拌した。 5.pHを再測定し、200mgBSAを加え、反応体を4℃で1晩混合した。 生成したラテックス−アビジン調製液をその容量によって2方法のいずれかを 用いてその他の反応体から精製した。 a.小規模製造ではチューブ透析(4℃、3交換、100x 容量透析チュー ブMWCO 12−14000)をセファロース CL−6Bサイジングカラム (20mMトリス緩衝液pH9.0、0.2%ツイーン−20及び0.09%ア ジ化ナトリウムで平衡化)と組合わせて用いた。 b.より大規模の製造では、ペリコン カセット システム(PCS)及び膜 MWCO300Kを用いた。 7.精製し、元の容量にまで濃縮した後、200mgBSAを加えてBSA中2 mg/ml溶液を作った。反応液を室温で1時間、またはBSAが完全に溶解す るまで混合した。 8.ラテックス試薬容器を完全にシールし、45℃オーブン中で3日間(72時 間)インキュベートした。 9.インキュベーション後、試薬をオーブンから取り出し、室温にまで冷やし、 pH約7.0に調節した。200μlの2−(4−ヒトロキシフェニルアゾ)安 息香酸(HABA)10mMPBS溶液、pH7.4(“HABA溶液”)を加 えると溶液は橙黄色に変色した。 3mgジゴキシン−ビオチン試薬を秤取し、その材料をジメチルホルムアミド :20mMトリス(pH7.0)40:60混合物5 mlに溶解することによって所望のジゴキシン−ビオチン二座配位子−アビジン 複合体を調製した。最終溶液はジゴキシン−ビオチン濃度600μg/mlのも のであった。 橙黄色溶液をジゴキシン−ビオチン溶液で滴定した。これは溶液が明黄色にな るまで50μlづつ加え、その後10%過剰量を加え、総添加量約500μlに することによって行われた。反応体を室温で約30分間撹拌した。 分子量カットオフ12−14kdを有する25mm透析チューブ(バクスター トラベノール社)を用いて透析することによって未反応反応体類を除去した。透 析は20mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン−20、及び0.9%アジ 化ナトリウムに対して行った。透析は4℃で行われ、緩衝液の4交換を用いた( 各約10リットル)。 上記試薬をラテックス粒子増大均質ジゴキシン検定に用いた(表3)。この検 定は高感度及び高処理量を示し、一方抗必要な血清量は減少した。この方法は基 質問題も排除または減少し、特に自動処理に適していた。 例3 コカインのための均質免疫検定 既述のように、ベンゾイルエクゴニンは尿中の主要コカイン代謝産物であり、 その化学的構造はコカインと関係がある(図3)。上記のベンゾイルエクゴニン −ビオチン二座配位子を用いる免疫検定が開発された。この分子の合成及び免疫 検定の詳細を以下に述べる。 I.ベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子(IX、図3) A.製法の概略(図3) 1.コカイン(I)からエクゴニン(II)へ酸加水分解 2.エクゴニン(II)のエステル化によるエクゴニンメチルエス デル(III)の生成 3.(III)とp−ニトロベンゾイルクロリドとの反応によって、芳香族環の パラ位にニトロ基を有するコカイン(IV)が生成する 4.(IV)を水素化してアミノ−コカイン誘導体(V)を生成する 5.(V)を加水分解するとアミノベンゾイルエクゴニン誘導体(VI)が生成 する 6.(VI)をチオホスゲンで処理してベンゾイルエクゴニンイソチオシアナー ト(VII)を得る 7.アルキロアミフォビオチン(VIII)と(VII)との反応により所望の ベンゾイルエクゴニン−ビオチン 二座配位子誘導体(IX)(TLC:Rf= 0.07(1:1MeOH/CHCl3))を与える。 B.ベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子(IX)の免疫反応性の試 験 上記の新規ベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子化合物は尿サンプル中 のコカイン及びベンゾイルエクゴニンをスクリーニングするための均質免疫検定 に用いられる。ベンゾイルエクゴニン−ビオチン(IX)の免疫力価を下記のよ うにEMITRコカイン代謝産物キット試薬で評価した。 1.ベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子(x)の溶液を製造業者の指 示通りEMITR緩衝液中500、100、10及び1μg/ml濃度で調製し た。 2.調製したサンプルを未知検体としてEMITR試薬で検定し た。結果を表4に示す。 上記EMITR結果はベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子が免疫反応 性であることを示した。 II.ラテックス−アビジンの製法 アビジンをラデックスに結合させ、免疫検定に使用するアビジン−ラテックス 共役体を生成した。0.59%ツイーン−20を含むMOPS緩衝液(0.1M )4.65mlに、ドューク サイエンティフィックス社から入手した38−n mサイズのラテックス粒子の懸濁液0.62mlと、冷MOPS 0.66ml 中N−ヒドロキシスクシンイミド41mgの溶液と、冷MOPS 0.63ml 中水溶性カルボジイミド28.8mgの溶液を加えた。4℃で1時間おだやかに 撹拌した後、ラテックス反応混合物をpH9に高め、硼酸緩衝液(0.02M、 pH9)15ml中アビジン9mgと4℃でさらに5時間反応させた。ウシ血消 アルブミン(BSA;44mg)を加えた。周囲温度で撹拌を1時間続け、その 後ラテックス−アビジン混合物を0.2%ツイーン−20を含む0.02Mトリ スに対してpH8かpH9で1晩透析した。その後ラテックス−アビジンをセフ ァローズCL−6Bカラム上で精製した。溶出液とし てトリス透析緩衝液を用いた。ラテックス−アビジンの2ロットのフラクション 合一物のUVスペクトルは実質的に同一であり、実質的吸収ピークが約230n mにあることを証明した。 UVスペクトルをとった後、BSAをラテックス−アビジンに加え、最終濃度 0.2%になるようにし、生成した物質に3日間45℃の熱ストレスをかけ、そ の後上記ベンゾイルエクゴニン−ビオチン二座配位子にカップリングする。 III.ラテックス−アビジン−ビオチン−ベンゾイルエクゴニン共役体 A.共役体の製法 ラテックス−アビジン−ビオチン−ベンゾイルエクゴニン共役体は、燐酸緩衝 液中5mM HABA(2(4−ヒドロキシフェニル−アゾ)安息香酸)の少量 をpH8に調製したラテックス−アビジン懸濁液15mlに加え、その懸濁液の pHを7に調節することによって作った。HABAはアビジンに結合し、溶液の 色を無色からピンク色に変えた。それからメタノール中にベンゾイルエクゴニン −ビオチン 二座配位子(VI)7.5mg/mlを含む溶液を、ピンク色が消 失するまでアビジン溶液に滴下した;桃色の消失はHABAに代わって二座配位 子がアビジンに結合したことを示す。加えた二座配位子量は0.68mgであっ た。反応混合物を1時間室温に放置した。セファロースCL−6Bカラム上で0 .2%ツイーン−20を含む0.02トリス、pH8、で溶出すると、ラテック ス−アビジン−ビオチン−ベンゾイルエクゴニン共役体が得られた。共役体をベ ックマンDU−70スペクトロメーターで200nmから500nmまで走査し 、約230nmに単一の吸収ピークがあ ることを見いだした。 ラテックス−アビジン−ビオチン−ベンゾイルエクゴニン共役体はpH9に調 製したラテックス−アビジンからも作られた;ただしラテックス−アビジン段階 及び共役体段階両方に用いたトリス緩衝液のpHが8でなく9だった場合を除く 。共役体をベックマンDU−70スペクトロメーターで200nmから500n mまで走査し、約230nmに単一の吸収ピークをもつことを見いだした、しか しながら260nmに実質的に肩(shoulder)があることもわかった。 B.ICS IITMを用いた免疫反応性の試験 pH8に調製されたベンゾイルエクゴニン−ビオチン−アビジン共役体ロット の免疫反応性をビオスパシフィック社から得た抗体を利用するICS IITMを用 いて評価した。検定プロトコールは下記のようであった: ゲイン:3 RATX:10 ICSTM緩衝液:600μl 抗体:42μl(ICSTM緩衝液で1/50希釈) サンプル:42μl(ICSTM緩衝液で1/6希釈) 共役体:42μl(生、ICSTM緩衝液で1/2または1/3希釈) 結果は表5に示される: 上記ICSTM結果から、(a)ラテックス−ベンゾイルエクゴニン−ビオチン −アビジン共役体は、ビオデザイン社からの抗体と対にしたとき良い免疫反応性 及びベンゾイルエクゴニンに関して十分な用量−反応関連性を示し、(b)標準 曲線の用量−反応関係は尿中のベンゾイルエクゴニンのスクリーニング試験とし て容認できることが判明した。 IV.尿サンプル中のベンゾイルエクゴニンをスクリーニングするためにベンゾ イルエクゴニン−ビオチン−アビジン−ラテックス共役体の利用 ベンゾイルエクゴニン−ビオチン−アビジン及び抗体試薬類を、尿で調製され たベンゾイルエクゴニン標準を用いてARRAY360分析器で最適化した。最 適化後、試薬類及び標準を用いて尿サンプル中のベンゾイルエクゴニンをARR AYでスクリーニングし、その結果をガスクロマトグラフィー/質量分析(GC /MA)によって得た結果と比較した。検定緩衝液類及び試薬類、検定プロトコ ール、ARRAY用量−反応曲線、及びGC/MSとの相関関係の 結果を以下に示す。ARRAY用量−反応曲線は表6に示す。緩衝液及び試薬 a.トリス緩衝液(0.02M、0.2%BSA、pH9.0)中ベンゾイル エクゴニン−ビオチン二座配位子−アビジン共役体 b.ビオスパシフィック社から入手したベンゾイルエクゴニン抗体の抗体希釈 液(ベックマン P/N668579) c.検定緩衝液としてのICSTM緩衝液(ベックマンインスツルメント、IC STM試薬)ARRAY検定プロトコールNo.24、RATX=10 緩衝液: 500μl 抗体: 43.5μl(1.75.5希釈) サンプル:100μl(1/6 on-line 希釈) 共役体: 42μl(1/3希釈) (トリガー試薬) GC/MSとの相関関係 免疫検定の有効性を試験するために、GC/MSでベンゾイルエクゴニン陽性 であることが判明した85尿サンプルで検定を行った 。この試験の結果を表7に示す。 表7に示すように、上記免疫検定を用いてGC/MSとの良い相関性が得られた 。ARRAYカットーオフ値 0.15μg/mlを用いて、ベンゾイルエクゴ ニン二座配位子法は85GC/MS陽性ザンプル中たった1つのfalse-negative または予測力98.8%という結果をもたらした。こうして、ベンゾイルエクゴ ニン二座配位子試薬は、尿サンプル中のベンゾイルエクゴニンをスクリーニング するための簡単、迅速かつ信頼できる均質検定を提供する。 検定の有効性をさらに試験するために、ボランティアによって供給された17 の尿サンプルを試験した。ベンゾイルエクゴニン二座配位子法を用いて17尿サ ンプルのすべてが陰性であることがわかった。 例4 コカインのためのラッテクス粒子増大−均質免疫検定 コカインの免疫検定も、もう一つの合成法によって生成したラッテクス−アビ ジン共役体を用いて行われた。 アビジン−ラッテクス共役体を形成する別法において、MOPS緩衝液(0. 1M,pH6.0)3.5mlを10%ツイーン−2 0 0.28ml及びカルボキシル化改質ラッテクス(CML、直径60nm、 セラジン社からの10%固溶液)0.64mlと共に50mlエルレンマイヤー フラスコに入れた。 新たに調製したN−ヒドロキシスクシンイミド−MOPS溶液0.86ml( 0.1M、pH6.0、MOPS 0.86ml中N−ヒドロキシスクシンイミ ド(NHS)44mgを含む)をフラスコに加え、同時に、新たに調製した1− エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)−MO PS溶液0.8ml(0.1M、pH6.0、MOPS 0.8ml中EDC3 0mg)を加えた。その溶液を約4℃で1時間撹拌した。 このようなインキュベーション後、pHを3N NaOHで約8.0に調節し た。アビジン溶液(16mlMOPS 6mg、20mM、pH8.0)を加え 、混合物をさらに5時問約4℃で撹拌した。 その後BSAを、最終濃度2mg/mlになるようにその溶液に加えた。 こうして生成したラッテクス−アビジン共役体を精製するために、その溶液を 分子量カット−オフ 12−14000を有する100x容量透析チューブに移 し、4℃で20mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン−20及び0.01 %NaN3に対して4℃で透析した。透析液は3回交換した。 透析した物質をそれから200mlセファロース、CL−6Bサイジングカラ ムで篩化し、平衡させ、20mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン−20 及び0.01%NaN3で溶出した。 精製し、再構成して元の容量に戻した後、その溶液にBSAを最 終濃度2mg/mlになるまで加えた。生成した溶液を45℃オーヴンに72時 間保存した。 オーヴンから取り出し、室温にまで冷やした後、溶液pHをほぼ中性に調節し 、その後HABA溶液(2−(4−ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸、PBS 中10mM、pH7.4)を加えると溶液は橙黄色になった。 コカイン−ビオチン溶液を作るために、コカイン−ビオチン2mgをDMF 1mlに溶解し、溶液300μlをDMF100μl及びトリス600μlと混 ぜ合わせた。最終溶液は、DMF/トリス緩衝液40/60混合物中コカイン− ビオチン濃度600μg/mlである。 上記の橙黄色アビジン−HABA溶液をコカイン−ビオチン溶液100μl部 分で、黄色に変色するまで滴定した。それから10%過剰のコカイン−ビオチン を加え、最終容量400μlにした。混合物を室温で約30分間撹拌した。 試薬調製の第1段階は必然的に透析を含み、分子量カットーオフ12−140 00を有する25mm透析チューブ(バクスター)を用いた。透析は4℃で3リ ットルの20mMトリス20mM、pH9.0、0.2%ツイーン−20及び0 .01%NaN3に対して行われた。透析液は4回交換し、各回に3リットルを 用いた。 ここに記載の免疫検定フォーマットにおいてラテックス−アビジン共役体をア ビジンの代わりに用いることができる。ラテックスco-conjugateの存在は検定感 度を増大させ、使用抗血清の量を減らし、基質の問題を減少(または除去)した 。その上サンプルの予備処理は必要なく、検定は容易に自動化された。 例5 アセタミノフェンの均質免疫検定 上記のアセタミノフェン−ビオチン二座配位子化合物を合成し、血清サンプル 中のアセタミノフェン(図4)の均質免疫検定に用いて成功した。合成法及び検 定プロトコールの詳細を次に記す。 I.アセタミノフェン−ビオチン二座配位子(VI、4) A.製法の概略(図4) 1.p−ヒドロキシアニリンのOH基をp−トルエンスルホニル基で保護し 、(II)を与える。 2.ピリジン中で(II)のアミノ基をを琥珀酸無水物でスクシニル化して 、(III)を得る。 3.(III)のp−トルエンスルホニル基をNaOH/MeOHで除去し て(IV)を得る。 4.(IV)とアルキルアミドビオチン(V)とをジエチルシアノホスホネ ートでカップリングすると所望のアセタミノフェン−ビオチン二座配位子(VI )(m.p.180℃、分解)が得られる(TLC Rf=0.25(EtOA c/MeOH/CH3Cl/NH4OH=3:3:1:0.6))。 B.アセタミノフェン−ビオチン二座配位子の免疫反応性の試験 アセタミノフェン−ビオチン(VI)の免疫力をEMITRアセタミノフェン キット試薬で下記のように評価した。 1.アセタミノフェン−ビオチン二座配位子(VI)溶液をEMITR緩衝液 中1100、550、370及び220μg/ml濃度に調製した。 2.サンプルをそれから未知検体としてEMITR試薬で検定し た。結果を表8に示す。 表8のEMITR結果は、アセタミノフェン−ビオチン二座配位子が免疫反応 性であることを示した。 II.アセタミノフェン−ビオチン−アビジン共役体 アセタミノフェン−ビオチン−アビジン共役体を作るために、上記のように燐 酸緩衝液中10mM HABA(2(4−ヒドロキシフェニル−アゾ)安息香酸 )数滴を0.1M燐酸緩衝液(pH7.4)中アビジン溶液に加えた。HABA はアビジンに結合し、溶液の色を無色からイエローピンクに変えた。アセタミノ フェン−ビオチン二座配位子(VI)を含むメタノール溶液をアビジン溶液にその ピンク色が消失するまで滴下した;ピンク色の消失はHABAのアビジンが二座 配位子によって完全に置換されたことを示す。反応混合物は1時間放置され、そ の後共役体緩衝液(クエン酸緩衝食塩液pH6.0)で4℃で大規模に透析し、 上記のような共役体濃度を得た。 濃縮液をクエン酸緩衝食塩液で1:10に希釈し、得られた溶液をベックマン DU−70スペクトロメーターで340から240nmまで走査した。共役体は 280nmに広いピークの吸収をもつこ とがわかった。その先導端は約255nmの波長のところに、ピーク値の約80 %の谷を示した。吸収は250nm以下の波長では急激に上昇した。共役体濃縮 液の濃度をA280単位で示した、それは280nm付近のピーク最大値の吸光度 (共役体1/10希釈=1.184A280単位)によって、11.84A280単位 であることが明らかにされた。共役体濃縮液をそれからクエン酸緩衝食塩液で希 釈し、検定に適した使用濃度にした。 上記のアセタミノフェン−ビオチン−アビジン共役体の免疫反応性をICS IITM分析器で、ビオデザイン社から入手した2抗体を用いて評価した。検定プロ トコールは: 緩衝液: 600μl 抗体: 42μl(ICSTM緩衝液で1/20及び1/10希釈) サンプル:42μl(ICSTM緩衝液で1/6希釈) 共役体: 42μl(濃度=0.58 A280 単位) 検定結果を表9に示す。 表9の結果は、(a)アセタミノフェン−ビオチン−アビジン共役体が良い免 疫反応性を示し、ビオデザイン社からのヒツジ抗体(ロット339)と対合した ときに十分な用m反応関係を示すこと、及び(b)標準曲線の用量反応関係がア セタミノフェンの定量のために満足できることを示した。 III.血清サンプル中のアセタミノフェンの定量のためにアセタミノフェン− ビオチン−アビジン共役体の使用 アセタミノフェン−ビオチン−アビジン及び抗体試薬をARRAY360で、 正常ヒト血清で調製したアセタミノフェン標準を使用して最適化した。最適化後 、ARRAYで血清サンプル中のアセタミノフェンを定量するためにこれらの試 薬及び標準を用いた。その結果をTDxRによって得られるものと比較した。そ の検定緩衝液/試薬、ARRAY検定プロトコール、ARRAY用量−反応曲線 及びTDxRとの相関性の結果を以下にまとめる。緩衝液及び試薬 1.ICSTM薬剤共役体希釈液(ベックマンP/N 663574)で希釈し たアセタミノフェン−ビオチン二座配位子−アビジン共役体 2.ICSTM抗体希釈液(ベックマンP/N663579)で希釈したビオデ ザイン社アセタミノフェン抗体 3.検定緩衝液としてのICSTM緩衝液(ベックマンP/N662612)ARRAY検定プロトコールNo.:27 緩衝液: 621μl 抗体: 43.5μl(1/20希釈) サンプル:21μl(1/12 on-line 希釈) 共役体: 42μl(濃度=0.145A280 単位)(トリガー試薬) 上記用量−反応検定の結果を表10に示す。 該検定とTDxRとの相関関係を調べた。その相関関係は、この検定結果がT DxRによって得られたそれに直線的に比例することを明らかにした。理論的比 例関係は次のように示される: ARRAY=1.0043* TDxR + 1.3(N=25) ここでR=0.99 ARRAY(平均)=35.5μg/ml TDxR(平均)=34.0μg/ml 結果は、該検定を用いてサンプル中のアセタミノフェン濃度を定量することが できることを示した。 例6 アセタミノフェンのためのラテックス粒子増大−均質免疫検定 上記アセタミノフェン−ビオチン二座配位子を2試薬ラテックス粒子増大−均 質免疫検定に用いた。このような用途のために、二座配位子を次のようにしてラ テックス−アビジンに結合した。 0.1M MOPS(pH6.0)8.75mlと、10%ツイーン−20含 有0.1M MOPS(pH6)と、カルボキシル化ラテックス(直径60nm )1.25ml(約125mg)とを含む懸濁液を作った。その懸濁液を4℃に 冷却後、撹拌下で、冷0.1M MOPS(pH6)1.31ml中N−ヒドロ キシスクシンイミド82mgを含む溶液、及び冷0.1M MOPS(pH6) 1.25ml中水溶性カルボジイミド57.5mgを含む溶液を加えた。 生成した混合物をそれからpH5.5−6に調節し、約4℃で約1時間撹拌し 、pH9に高め、冷0.02Mホウ酸塩緩衝液(pH9)30ml中アビジン1 8mgと共にさらに5時間反応させた。BSA(88mg)を加え、4℃で1晩 撹拌し続け、その後ラテックス−アビジン混合物を1.5日間、0.2%ツイー ン−20含有0.02M トリス(pH9)3交換に対して透析した。生成ラテ ックス−アビジンをセファロースCL−6Bカラムで、溶出液としてトリス透析 緩衝液を用いて精製した。これらの物質をその後45℃で3日間熱ストレスにさ らした。その物質は0.41ないし0.46のA500、及び0.19ないし0 .21のA600を有していた。 ラテックス−アビジン−アセタミノフェン共役体を形成するために、0.1M 燐酸緩衝液(pH7.4)中10mM HABA(2(4−ヒドロキシフェニル −アゾ)安息香酸)30μlをラテック ス−アビジン懸濁液に加えた。HABAはアビジンに結合し、懸濁液の色をわず かにピンク色に変えた。この変色はやっと目に見える程度のものであった。アセ タミノフェン二座配位子6.5mg/mlを含むメタノール溶液をそれからラテ ックス−アビジン溶液に滴下した。するとピンク色は消失した。添加二座配位子 量は0.455mgまたは70μlであった。反応物を室温に1時間放置し、セ ファロースCL−6Bカラム上で0.2%ツイーン−20含有0.02Mトリス 、pH9、で溶出すると、ラテックス−アビジン−アセタミノフェン二座配位子 共役体25mlが得られた。その共役体は500及び600nmでそれぞれ0. 3333及び0.1726の吸光度を示した。 この共役体を上記のアセタミノフェン均質免疫検定に用いた。5−200μg /ml範囲のアセタミノフェン濃度では満足すべき用量反応曲線が得られた。反 応速度は約0.30△(吸収単位)/minであった。該検定の“行程内(with in-run)”分散は5.5%以下であった。 アセタミノフェン濃度0μg/mlから約200μg/mlまでの52サンプ ルの群をTDxシステム及びシンクロンシステム(本発明の共役体を使用するよ うに適合させた)によって評価した。表11には使用試薬の処方が概略記される 。表12にはシンクロン検定パラメーターが示される。 データの線型回帰は次の等式を与えた: シンクロン=0.9855TDx + 2.63 r=0.9952 シンクロン平均値=26.49μg/ml TDx平均値=24.41μg/ml こうして結果は、本発明の2試薬系ラテックス粒子増大検定がアセタミノフェ ン濃度を正確に測定できることを示した。 例7 アセタミノフェンのラテックス粒子増大−均質免疫検定 上記のアセタミノフェン−ビオチン二座配位子を3試薬ラテックス粒子増大− 均質免疫検定に用いた。上記のように、この免疫検定はいくつかの点で2試薬系 と異なるが、最も注目すべき点は二座配位子試薬をラテックス−アビジン粒子に “予備的複合体化”しないということである。例えば検定はビオチニル化二座配 位子試薬、抗アセタミノフェン抗体及びラテックス−アビジンを未知量のアセタ ミノフェンの存在が疑われるサンプルに添加することによって行われる。サンプ ル中のアセタミノフェンの存在はラテックス−アビジン粒子とビオチニル化二座 配位子との凝集を阻止する。 2試薬系の場合のように、アセタミノフェン濃度5−200μg/ml範囲で は満足すべき用量反応曲線が得られた。反応速度は約0.22 △(吸収単位) /minであった。検定の“行程内”分散は5.4%以下であった。 アセタミノフェン濃度0μg/mlからほぼ200μg/mlまでの57サン プルの群をTDxシステム及びシンクロンシステム(本発明の共役体を用いるよ うに適合させた)によって評価した。表 13は使用試薬の処方を概略示す。表14はシンクロン検定パラメーターを示す 。 データの線型回帰は次の等式を与えた: シンクロン=0.9719TDx + 3.86 r=0.9927 シンクロン平均値=28.58μg/ml TDx平均値=25.44μg/ml こうして結果は、本発明の3試薬系ラテックス粒子増大検定もアセタミノフェ ン濃度を正確に測定できることを示した。 既述のように、2試薬−及び3試薬ラテックスベース二座配位子検定は両方と も対応する液体処方の方法に比べて実質的により少ない試薬類及びサンプルを使 用した。ラテックス試薬の挿入がなければ、ARRAYで開発されたアセタミノ フェン検定10は満足すべき 用量反応のためには、生の(希釈しない)抗血清2.18μl(1/20希釈で 43.5μl)及び生のサンプル1.75μlが必要であった。ARRAYにお ける試薬及びサンプル使用はシンクロンにおけるそれらの2.5分の1以下であ る。シンクロンでは生の抗血清5.45μl及び生のサンプルを4.38μlも 使用しなければならない。ラテックス試薬では生のサンプル3μlと生の抗血清 0.21μl(1/150希釈で31μl)で液体処方対応物より急勾配の用量 反応曲線を十分与えることがわかった。こうしてラテックス法は27分の1の抗 体及び1.46分の1のサンプルしか使用しなかった。 例8 プロカインアミドのためのラテックス粒子増大−均質免疫検定 上記方法及び試薬を変形してプロカインアミドまたはN−アセチルプロカイン アミドの高感度ラテックス粒子増大均質検定法を作り出すことができる。 このような検定の第1段階はラテックス−アビジン粒子の形成である。例2の 方法を用いて適した粒子を得た。 N−アセチルプロカインアミド−ビオチン試薬またはプロカインアミド−ビオ チン試薬のどちらかを含む溶液を検定に使用するために調製した。N−アセチル プロカインアミド−ビオチン試薬3mgを秤量し、それをジメチルホルムアミド :20mMトリス(pH7.0)40:60混合物5mlに溶解することによっ て、N−アセチルプロカインアミド−ビオチン試薬の溶液を作った。最終溶液の N−アセチルプロカインアミド−ビオチン濃度は600μg/mlであった。プ ロカインアミド−ビオチン試薬10mgを秤取し、そ れをメタノール2mlに溶解することによってプロカインアミド−ビオチン試薬 の溶液を作った。最終溶液はプロカインアミド−ビオチン濃度5mg/mlであ った。 ラテックス−アビジンに結合したHABAを、ビオチン−二座配位子試薬溶液 50μl部分をその橙黄色HABA−ラテックス−アビジン溶液に、その溶液の 色が明黄色になるまで添加することによって滴定し、それから10%過剰量を添 加した。総添加量は500μlであった。反応体を室温で約30分間撹拌した。 結合しなかった反応体類は、分子量カットオフ12−14kdを有する25m m透析チューブ(バクスター)を用いて透析することによって除去した。透析は 20mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン−20、及び0.9%アジ化ナ トリウムに対して行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液4交換を用いた(各回 約10リットル)。 回収したラテックス−アビジン−ビオチニル化二座配位子試薬共役体を均質免 疫検定に用いた。プロカインアミドの場合、21サンプルの分析に基づくデータ の線型回帰は次の等式を与えた: Array=1.04 TDx + 0.24 r=0.9954 N−アセチルプロカインアミドの場合は20サンプルに基づくデータの線型回 帰は次の等式を与えた: Array=0.996 TDx − 0.183 r=0.9946 こうして結果は、本発明のラテックス粒子増大検定がプロカインアミドまたは N−アセチルプロカインアミド濃度を正確に測定できることを示した。ラテック ス粒子増大均質N−アセチルプロカインアミド及びプロカインアミド検定はどち らも高い感度及び処理量を示した:一方抗血清の必要量は減少した。この方法は 基質問題も排除または減少させ、特に自動処理に利用できる。 例9 アミノグリコシド抗生物質のためのラテックス粒子増大−均質免疫検定 アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、トブラマイシン、アミカシ ン及びゲンタマイシンなどはグラム陰性菌感染症、特にシュードモナスの治療及 び処置に広く使用される強力な広域スペクトル抗生物質である(パンコースト( Pancoast,S.J.)、Med.Clin.Nor.Amer.72巻、581−612ページ、198 8)。この抗生物質はブドウ球菌の2、3の菌株(トラチェット(Truchet,A) ら、Ann.Biol.Clin.48巻:541−546ページ、1990)及びグラム陽性 菌の或る菌株、例えばコリネバクテリウム及びナイセリアなどに対しても活性で ある。これら抗生物質のそれぞれの活性スペクトル及び臨床的利用は非常に似て いる(パンコースト、Med.Clin.Nor.Amer.72巻581−612ページ、198 8)。アミカシンは手に入るアミノグリコシド抗生物質のなかで最も広いスペク トルを有する。そこでそれは術後感染症の処置に用いられ、また他の抗生物質と 組合わせて、エイズ患者における二次性細菌感染症の処置に用いられる(パンコ ースト、Med.Clin.Nor.Amer.72巻581−612ページ、1988)。 アミノグリコシド抗生物質の使用は副作用(例えば腎毒性及び耳毒性)のため に制限されてきた(コスタシルバ(CostaSilva、V.L.)ら、Renal Physiol.10 巻:327−337ページ、1987;フィー(Fee,W.E.)ら、Rev.Infect.Dis .5巻(付録2):304ページ、1983;レーン(Lane,A.Z.)ら、Amer.J .Med.62巻、911ページ、1977)。しかし治療量と毒性誘起性過剰投与 量との間には狭い余地がある(ウィッチツ(Witchiz,J.L.)ら、Nouv.Presse M d.11巻、489−491ページ、1982;ダミーン(Damien,J.M.)ら、An n.Biol.Clin.48巻、217−220ページ(1984))。そこで薬剤の血中 濃度の正確な測定いより不都合な副作用の発生率を減らすことができる(ダミー ンら、Ann.Biol.Clin.48巻、217−220ページ(1984))。アミノグ リコシド濃度は迅速バイオアッセイ、酵素免疫測定法(EMITR,Syva など )及び蛍光免疫測定法(エーメス、TDA)によって測定される(ダミーンら、 Ann.Biol.Clin.48巻、217−220ページ(1984);ホワイト(White ,L.O.)ら、抗菌剤化学療法(Antimicrob.Agents.Chemother.)19巻、106 4−1066ページ(1981))。 上記の方法及び試薬を変形してアミノグリコシド抗生物質、例えばトブラマイ シン、アミカシン、またはゲンタマイシンなどの高感度ラテックス粒子増大−均 質検定を作り出すことができる。 このような検定における第一段階はラテックス−アビジン粒子の形成である。 例2の方法を用いて適した粒子を得た。 検定すべきアミノグリコシドのアミノグリコシド抗生物質−ビオチン二座配位 子を含む溶液を検定に使用するために調製した。例え ばトブラマイシン、ゲンタマイシンまたはアミカシンの検定のためには、アミノ グリコシド−ビオチン試薬(すなわちトブラマイシン−ビオチン試薬、ゲンタマ イシン−ビオチン試薬またはアミカシン−ビオチン試薬)の溶液を調製した。試 薬溶液を作るために、アミノグリコシド−ビオチン試薬15mgを新たに調製し たメタノール:水1:1混合液2mlに溶解した。最終溶液はアミノグリコシド −ビオチン濃度7.5mg/mlをもっていた。 ラテックス−アビジンに結合したHABAを、ビオチン−二座配位子試薬溶液 50μl部分をその橙黄色HABA−ラテックス−アビジン溶液に、その溶液の 色が明黄色になるまで添加することによって滴定し、それから10%過剰量を添 加した。総添加量は500μlであった。反応体を室温で約30分間撹拌した。 結合しなかった反応体は、分子量カットオフ12−14kdを有する25mm 透析チューブ(バクスター)を用いて透析することによって除去した。透析は2 0mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン−20、及び0.9%アジ化ナト リウムに対して行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液の4交換を用いた(各回 約10リットル)。 こうして上記試薬はアミノグリコシド抗生物質のラテックス粒子増大均質検定 を可能にした。 上記検定をTDx検定と比較した。トブラマイシンの免疫検定では45サンプ ルの分析に基づくデータの線型回帰は次の等式を与えた: シンクロン=1.04 TDx + 0.16 r=0.9847 ゲンタマイシンの免疫検定では33サンプルの分析に基づくデータの線型回帰 は次の等式を与えた: シンクロン=1.1TDx − 0.34 r=0.9516 アミカシンの免疫検定では15サンプルの分析に基づくデータの線型回帰は次 の等式を与えた: Array=0.991 TDx + 0.36 r=0.9618 こうして結果は、本発明のラテックス粒子増大検定がアミノグリコシド抗生物 質の濃度を正確に測定できることを示した。 例10 バンコマイシンのためのラテックス粒子増大−均質免疫検定 バンコマイシンは両性グリコペプチド抗生物質である(アノン(Anon.)、J. Antimicrob.Chemother.14巻(付録 D)、1−109ページ、1984;ジ ョーダン(jordan)ら:Antibiotics、3巻、コルコラン(Corcoran,J.W.)編 、Springer-Verlag、NY、704−718ページ(1975))。薬剤使用は 不都合な副作用と関連するから、バンコマイシン血清濃度を正確に測定できるこ とが極めて重要である。 そこで上記のバンコマイシン−ビオチン二座配位子試薬の製法が開発され、バ ンコマイシンの正確な免疫検定法が確立された。バンコマイシンは構造的に複雑 であるにもかかわらず、緩和な条件のもとでビオチンまたはその他の作用物質と カップリングしやすい3つの非ヒドロキシル官能基をもっているに過ぎない。こ れらの基は第1アミノ基1つ、第2アミノ基1つ及びカルボキシル基1つである 。これらの基のうちカルボキシル基は完全に立体阻害され、アミノ基は反応でき ないか、もしくは不十分なバンコマイシン免疫原性を有する生成物を形成した。 しかしながら次の方法は適したバンコマイシン二座配位子を生成するものであ る。この方法を用いて種々のリガンドのいずれかをバンコマイシンの非官能性カ ルボキシル基に結合させることができる。特に、BSAの二座配位子及びビオチ ンの二座配位子を作った。 それらの二座配位子は 100mg(0.24mmoles)のビオチニル化アミン、 28mg(0.24mmoles)のN−ヒドロキシスクシンイミド、 50mg(0.24mmoles)のジシクロヘキシルカルボジイミド、 及び痕跡量(70μl)のトリエチルアミン を塩酸バンコマイシン300mg(0.2mmol)のDMF(20ml)溶液 に加えることによって作った。50℃で6時間撹拌した後、反応を完了した;こ れは薄層クロマトグラフ上の新しいスポットの出現によって明らかにされた。新 しいスポットはUV吸収をあらわし、シンナムアルデヒド噴霧に対して陽性であ った(ビオチンの存在を示す)。 減圧下で溶媒を除去した後、反応混合物をシリカゲルカラム上でメタノール/ 15%水酸化アンモニウム(9:1)を用いてクロマトグラフィーにかけ、所望 最終産物を得た。メタノールから再結晶すると純粋なバンコマイシン−ビオチン 二座配位子が得られた(180mg)。反応体の構造及び反応の合成スキームは 図5に示され る。 バンコマイシン−ビオチン二座配位子の免疫原性をSyvaEMITR及びア ボットTDxキット両方で評価した。SyvaEMITR標準曲線の作成に用い た数値は表15に示す。 未知としてバンコマイシン二座配位子実験でEMIT試薬で得られた数値を表 16に示す。 未知としてバンコマイシン二座配位子実験でアボットTDxキットで得られた 数値を表17に示す。 使用できる抗バンコマイシン抗体はバンコマイシンに対して低いアビジチー( 親和力)を示す、そこでバンコマイシン免疫検定の感度をより親和性の大きい抗 体の開発によって改良することができるかも知れない。このような抗体は、免疫 原性分子をバンコマイシンに結合させ、それからその結合物を動物に注射するか もたはその結合物を抗体産生細胞の存在下でインキュベートすることによって得 られる。BSAに結合したバンコマイシンはこのような抗バンコマイシン抗体の 産生を誘起するために特に適している。 このようなバンコマイシン−BSA共役体は次のようにして生産される。トリ エチレン(1ml)、N−ヒドロキシスクシンイミド(140mg、1.2mm oles)及びジシクロヘキシルカルボジイミド(250mg、1.2mmol es)をDMF20ml中バンコマイシン塩酸1485mg(1mmole)の 懸濁液に導入する。室温で1時間撹拌後、反応混合物を真空下で35℃以下で濃 縮し約5mlにする。BSA140mg(水25mlに溶解)をその後加えた。 反応体類を室温で3時間撹拌し、その後反応混合物を濾過し、濾液を4℃、食塩 液中で透析するとバンコマイシン−BSA共役体(40ml)が得られた。共役 体の構造は図6に示される。共役体はTDx検定を用いて得た結果に基づき3. 5mg/mlのBSA濃度及び34.1μg/mlのバンコマイシン濃度ををも つことがわかった。これらの数値は共役体のバンコマイシン:BSAモル比が5 :1であることを示した。 バンコマイシン−BSA共役体はTDx検定結果によって示されるように、良 い免疫反応性を示すことがわかった(表18)。 こうして結果は、本発明の方法がバンコマイシンの免疫検定に用い得るバンコ マイシン−ビオチン二座配位子を産生する能力がある ことを証明した。特にビオチニル化バンコマイシン二座配位子をここに記載のよ うにアビジン−ラテックス粒子と結合せしめることによって、このような二座配 位子をここに記載のラテックス粒子増大均質免疫検定に用いることができる。結 果はさらに、発明の方法を用いて高度に免疫原性のバンコマイシン−蛋白質共役 体を産生することができることを示した。バンコマイシンのラテックス−アビジ ン二座配位子検定を用いて得られた結果を表19に示す。検定はサンプル希釈1 /54でARRAY360で行われた。 例11 テオフィリンのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 テオフィリン(1、3ジメチルキサンチン)は喘息及び閉塞性気道疾患急性憎 悪を阻止また軽減するために用いられる。成人ではテオフィリンは急性肺浮腫及 び鬱血性心不全を治療するために用いられている(ダルネグロ(Dal Negro,R.) ら、J.Int.Med.Res.15巻、391−396ページ(1987))。この薬剤 は再発性新生児無呼吸にも用いられる(フロヴ(Frowe,D.J.)ら、Ann.Clin.Bio ch em.25巻4−26ページ(1988))。血清または血漿テオフィリン濃度が 正確に測定できるということは非常に重要である、なぜならばテオフィリン過剰 量は生命をおびやかす副作用をあらわすことがあるからである(フロヴら、Ann. Clin.Biochem.25巻、4−26ページ(1988))。テオフィリンとカフェ インとの間の構造的類似性は、血清テオフィリン濃度の正確な測定のための努力 を著しく複雑にする(フロヴら、Ann.Clin.Biochem.25巻、4−26ページ( 1988))。テオフィリン濃度は概ね免疫検定、例えばベックマンICSシス テム、アボット蛍光偏光免疫検定TDxシステムなどによって(クロツ(Klots, U.)Ther.Drug.Monitor.15巻、462−464(1993))またはEMIT Rシステムによって(ヒル(Hill,M.)、J.Allergy Clin.Immunol.82巻、3 0−34ページ(1988))測定される。 上記の諸方法及び試薬類を用いてテオフィリンの高感度ラテックス粒子増大均 質検定法を作成した。 このような検定の第1段階はラテックス−アビジン粒子の形成である。適した 粒子は例2の方法を用いて得た。 検定に使用するテオフィリン−ビオチン 二座配位子試薬溶液を作った。テオ フィリン−ビオチン 二座配位子はハリスらの方法(米国特許第5196351 号)によって作った。試薬溶液を作るために、テオフィリン−ビオチン二座配位 子試薬10mgをメタノール2mlに溶解した。最終溶液はテオフィリン−ビオ チン濃度5.0mg/mlであった。 ラテックス−アビジンに結合したHABAを、ビオチン二座配位子試薬溶液5 μl部分を橙黄色HABA−ラテックス−アビジン溶 液にその溶液が明黄色になるまで加えることによって滴定し、その後10%過剰 量を加えた。総添加量は500μlであった。反応体を室温で約30分間撹拌し た。 結合しなかった反応体類は分子量カットオフ12−14kdを有する25mm 透析チューブ(バクスター)を用いて透析することによって除去した。透析は2 0mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン20、及び0.9%アジ化ナトリ ウムに対して行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液の交換は4回であった(各 約10リットルづつ)。 上記の試薬をテオフィリンのラテックス粒子増大均質検定に用いた。51サン プルの分析に基づくデータの線型回帰は次の等式を与えた: シンクロン=1.06TDx − 0.14 r=0.9836 この検定は高感度及び高処理量を示し、一方抗血清の必要量は減少することが わかった。この方法は基質の問題を除去または軽減し、自動処理に特に適してい た。 例12 カルバマゼピンのラテックス粒子増大均質免疫検定 カルバマゼピンは情緒疾患、例えばてんかん、急性躁病及びうつ病などに広く 用いられている(バレンジャー(Ballenger,J.C.)J.Clin.Psychiatry 49巻( 付録):13−19ページ(1988);ルッソー(Loiseau,P.)ら、抗てんか ん薬(Antiepilectic Drug)、3版(Levy,R.ら編集)、Raven Press、NY、 533−554ページ(1989))。その治療的価値にもかかわらず、カルバ マゼピンの使用は皮疹、不都合な挙動的効果及び稀ではあるが無形成貧血と関連 がある(ルッソーら、“抗てんかん薬”、3版(Levy,R.ら編集)、Raven Pres s、NY、533−554ページ(1989))。こうして血清カルバマゼピン 濃度を正確に測定することがカルバマゼビンの治療的使用には欠かせない。 上記の諸方法及び試薬類を用いてカルバマゼピンの高度に敏感なラテックス粒 子増大均質検定が行われた。 このような検定の第1段階はラテックス−アビジン粒子の形成である。適した 粒子を例2の方法を用いて得た。 検定に使用するためのカルバマゼピン−ピオチン二座配位子含有溶液を作った 。試薬溶液を作るためにカルバマゼピン−ビオチン二座配位子試薬10mgをメ タノール2mlに溶解した。最終溶液はカルバマゼピン−ビオチン濃度5.0m g/mlであった。 ラテックス−アビジンに結合したHABAを、ビオチン二座配位子試薬溶液5 μl部分を橙黄色HABA−ラテックス−アビジン溶液にその溶液が明黄色にな るまで加えることによって滴定し、その後10%過剰量を加えた。総添加量は5 00μlであった。反応体を室温で約30分間撹拌した。 結合しなかった反応体類は分子量カットオフ12−14kdを有する25mm 透析チューブ(バクスター)を用いて透析によって除去した。透析は20mMト リス、pH9.0、0.2%ツイーン20、及び0.9%アジ化ナトリウムに対 して行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液の交換は4回であった(各約10リ ットルづつ)。 上記の試薬をテオフィリンのラテックス粒子増大均質検定に用い た。50サンプルの分析に基づくデータの線型回帰は次の等式を与えた: シンクロン=1.09TDx − 0.2 r=0.9886 この検定は高い感度及び処理量を示し、抗血清の必要量は減少することがわか った。この方法は基質の問題も除去または軽減し、自動処理に特に適していた。 例13 プリミドンのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 プリミドン(5−エチルジヒドロ−5−フェノール−4、6(1H,5H)ピ リミジンジオン)はバルビタール酸塩同族体の抗けいれん剤である。これは大発 作、精神運動性及び焦点性てんかん発作及びその他のけいれん性疾患の治療及び 処置に用いられる(スミス(Smith,D.B.):抗てんかん薬、3版(Levy,R.ら編 集)、RavenPress,NY、533−554ページ(1989))。投与量とその 結果としての血中濃度との間には個々人によって広い変動がある;しかしながら プリミドンの血中濃度と脳濃度との間には十分相関性がある(スミス(Smith,D. B.):抗てんかん薬、3版(Levy,R.ら編集)、Raven Press、NY、533− 554ページ(1989))。こうしてこの薬剤の有効使用のためにはこの薬剤 の血清濃度を正確に測定することが必要である。 上記の諸方法及び試薬類を用いてプリミドンの高感度ラテックス粒子増大均質 検定が行われた。 このような検定の第1段階はラテックス−アビジン粒子の形成である。適した 粒子は例2の方法を用いて得た。 プリミドン−ビオチン二座配位子は、先ず第一にカルボキシルプリミドン誘導 体を形成し、その後この誘導体をアルキロアミドビオチンと縮合することによっ て作られた。カルボキシルプリミドン誘導体の好適合成法は図7に記載されてい る。合成の第1段階において、プリミドン(1)を硝酸及び硫酸を用いてニトロ 化し、対応するニトロ誘導体(2)を得る。ニトロ誘導体を触媒的水素化にさら し(10%Pd/C;アセチルアルコール)ニトロ基をアミノ基(3)に還元す る。その後アミノ化誘導体(3)のアミノ基を無水琥珀酸と求核置換することに よって(KOH,ピリジン)アルキル化して、カルボキシルプリミドン(4)を 得る。上記のようにジメチルポルムアミド中におけるヒドロキシスクシンアミド とカルボニルジイミダゾール(CDI)との反応により、カルボキシルプリミド ン(4)をアミドビオチン(HD−ビオチンなど)にカップリングさせる。 プリミドン−ビオチン二座配位子を含む溶液を作り、検定に使用した。試薬溶 液を作るために、プリミドン−ビオチン二座配位子試薬10mgをメタノール2 mlに溶解した。最終溶液のプリミドン−ビオチン濃度は5.0mg/mlであ った。 ラテックス−アビジンに結合したHABAを、ビオチン二座配位子試薬溶液5 μl部分を橙黄色HABA−ラテックス−アビジン溶液にその溶液が明黄色にな るまで加えることによって滴定し、その後10%過剰量を加えた。総添加量は5 00μlであった。反応体を室温で約30分間撹拌した。 結合しなかった反応体類は分子量カットオフ12−14kdを有する25mm 透析チューブ(バクスター)を用いて透析によって除 去した。透析は20mMトリス、pH9.0、0.2%ツイーン20、及び0. 9%アジ化ナトリウムに対して行われた。透析は4℃で行われ、緩衝液の交換は 4回であった(各約10リットルづつ)。 上記のプリミドン−ビオチン アビジン共役体をrateネフロメーターTDM試 薬として、下記の条件でベックマンICS分析器IIを用いて評価した:使用した 試薬:プリミドン−HD−ビオチンアビジン 共役体(CBS緩衝液中0.3m g/ml);ヤギ抗プリミドン抗体(1/15希釈);8%BSA中プリミドン 標準。実験結果を表20に示す。 該検定は高感度及び高処理量を示し、一方抗血清の必要量を減らすことがわか った。この方法は基質問題も除去または軽減し、自動処理に特に適していた。こ れとは別に上記試薬はプリミドンのラテックス粒子増大均質検定に用いることが できる。 例14 キニジンのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 キニジン(6−メトキシ−a−(5−ビニル−2−キヌクリジニル)−4−キ ノリンメタノールまたは6’メトキシシンコニン−9−オル)は、心不整脈の治 療及び処置に用いられるシンコナ(キナ皮)アルカロイドである(アリアド(Ar iado,M)ら、j.Clin.Pharmacol.15巻、477ページ(1975))。キニジ ン治療を行う場合は、投与患者におけるこの薬剤の血清濃度を注意深くモニター することが必要である(ディートマン(Dietman,K.)ら、薬剤研究(Arzneimitt el-Forsch.)27巻、589ページ(1977))。 本発明の方法を用いてキニジン−ビオチン二座配位子を作り、その後これを上 記ラテックス−アビジン粒子と共に用いてキニジンの均質免疫検定法を提供する ことができる。 キニジン−ビオチン二座配位子の作成に使用される合成スキームを図8に示す 。図8に示すように、キニジン(1)を先ず最初に低温(−78℃)で塩化メチ レン中で三臭化ポウ素と反応させて脱メチル化すると、対応するフェノール(2 )が得られる。この反応は分子の残部には再配列を起こさなかった。それからフ ェノール(2)をエチル5−ブロモバレレートを用いてアルキル化し、エチルエ ステル(3)を形成する。エチルエステル(3)をメタノール中で水酸化カリを 用いて加水分解すると、酸(4)が生成する。上記のN−ヒドロキシスクシンイ ミド/カルボニルジイミダゾール法を用いて酸(4)をアミドビオチン(5また は6)にカップリングすると所望ビオチニル化キニジン(8)が得られる。 ビ オチニル化キニジン(8)をアビジン−コーテド ラテックス粒子にカップリン グさせ、上記のように透析を行い、キニジンの均質免疫検定に用いることができ る二座配位子試薬を得た。その検定はシンクロンCX5分析器(ベックマン イ ンスツルメント)を用いて最適化された。抗体はヤギ抗キニジンであった;DA DE TDMコントロールで試験し、この検定がサンプル中の正しいキニジン量 を検出していることを確認した。検定は感度も高く、信頼できることがわかった 。結果を表21及び22にまとめる。 例15 カンナビノイドのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 本発明の方法を用いてカンナビノイド、特にテトラヒドロカンナビノール(“ THC”、図9(1))及びその代謝産物、例えば△9 −THC−カルボン酸(図9(2))の均質免疫検定法を確立した。 該検定はテトラヒドロカンナビノール−ビオチン二座配位子を用いる;これは 図10に示すように合成される。この合成スキームはオキシ塩化燐の存在下でオ リベトール(I)及びa−アセトグルタール酸(II)によって開始し、クマリ ン誘導体(III)を与えた。水素化ナトリウムを用いてアルキルエステル基を 環化すると(IV)が得られた。IVのケト基をエチレングリコールで保護する と(V)が得られる。ヨウ化メチルマグネシウムを用いて化合物VをVIに転化 し、その後酸(HCl)メジウム中でエチレングリコール保護基を除去する。化 合物VIを液体アンモニウム中でリチウムと反応させて二重結合を還元すると( VII)が得られる。生成物(VII)は融点162−163℃であることがわ かり、したがって純粋であることが証明された。 化合物VIIはカルボキシルメトキシルアミンとの反応によってカルボキシル THC誘導体(VIII)に変換した。生成物の純度を薄層クロマトグラフィー によって確認した。生成物は1:4メタノール:クロロホルム中で約0.13の Rfを示した。 化合物VIIIをアルキロアミドビオチン(IX)と反応させると所望THC −ビオチン二座配位子(X)が得られた。この化合物の融点は80−82℃で、 酢酸エチル:メタノール:クロロホルム:アンモニウムの5:5:14:1混液 中の薄層クロマトグラフィーにおけるRfは0.34であった。 THC−ビオチン二座配位子の免疫反応性をSyva EMITRTHCキッ ト試薬を用いて評価した。そこでXをEMITR陰性 カリブレーターで希釈することによってTHC−ビオチン二座配位子(X)の8 500、850及び100ng/ml溶液を作った。サンプルをその後EMITR 試薬をを用いて検定した。検定結果を表23に示す。 ラテックス増大免疫検定フォーマットをデザインした。免疫検定に用いるラテ ックス−アビジン共役体は次のように作った。0.59%のツイーン−20を含 むMOPS緩衝液(0.1M)9.3mlに、(1)カルボキシル化改質60n mラテックス粒子(セラジン)1.25mlの懸濁液、(2)冷MOPS緩衝液 1.32ml中N−ヒドロキシスクシンイミド82mg溶液、及び(3)冷MO PS緩衝液1.25ml中水溶性カルボジイミド58mgの溶液を加えた。pH 6及び4℃でおだやかに1時間撹拌後、ラテックス反応混合物のpHを9に高め 、硼酸塩緩衝液(0.02M、pH9)30ml中で4℃でアビジン18mgと さらに5時間反応させた。BSA(88mg)を加え、4℃で1晩撹拌し続け、 その後ラテックス−アビジン混合物を0.2%ツイーン−20を含む0.02M トリス(pH9)に対して透析した。透析後、ラテックス−アビジ ンをセファロースCL−6Bカラムで精製した。その際トリス−ツイーン緩衝液 を溶出液として用いた。収量は47mlに達した。BSAの添加後(最終濃度0 .2%)、精製した材料に45℃で3日間熱ストレスをかけ、その後THC−ビ オチン二座配位子にカップリングした。 ラテックス−アビジン材料10mlの懸濁液をpH7に調節した。燐酸緩衝液 中5mM HABAの少量をその懸濁液に加えた。HABAがアビジンに結合し 、混合物の色を少しピンク色に変えた。メタノール中THC−ビオチン二座配位 子5.8mg/mlを含む溶液をそれからラテックス−アビジン溶液に、ピンク 色が消失するまで滴下した。ピンク色の消失はTHC−ビオチン二座配位子が完 全にラテックス−アビジンのHABAに取って代わったことを示す。総計0.1 7mgのTHC−ビオチンを加えた。 反応混合物を室温に1時間放置し、それからセファロースCL−6Bカラム上 で0.2%ツイーン−20含有0.02MトリスでpH9で溶出した。ラテック ス−アビジン−ビオチン−THC共役体の収量は12mlであった。 上記ラテックス−アビジン−ビオチン−THC共役体をTHC及びその代謝産 物の均質免疫検定に用いた。検定プロトコールは次の条件のもとでベックマンI CS分析器11を用いた: ICS緩衝液: 60μl 抗体: 42μl カリブレーター 尿中△9−THC−COOH 42μl(生) ラテックス−アビジン−ビオチン−THC 共役体(トリガー試薬) 42μl(生) (0.02M トリス緩衝液中共役体、0.2%ツイーン、pH9) ゲイン: 2 RatX: 10 検定結果を表24に示す。 結果により、こうして△9−THC−カルボン酸、尿中主要THC代謝産物の 極めて低濃度が本発明の方法によるラテックス−アビジン−ビオチン−THC共 役体を用いてネフロメトリー阻害免疫検定によって検出できることを示した。 例16 PCPのための、ラテックス粒子が増大された均質免疫検定 フェンサイクリジン(“PCP”としても知られる)は単にその強力な幻覚作 用のために用いられる濫用薬である。新規のビオチニル化PCP誘導体を合成し 、本発明の方法によって用い、フェンサイクリジンの均質免疫検定を行った。 PCP誘導体を製造するために用いる合成スキームを図11に示す。図11を 参照すると、PCP(1)をH2SO4/NHO3で硝酸化し、硝酸化PCP誘導 体(II)を得た。5%Pd/Cを触媒として硝酸化PCP誘導体(II)を水素化 すると、アミノPCP誘導体(III)が得られる。アミノPCP誘導体(II I)とホスゲンとを反応させて、PCPイソチオシアネート(IV)を形成した 。イソチオシアネート誘導体(IV)をその後ビオチンアミン(V)と反応させ 、所望のPCP−ビオチン二座配位子(V)を得る。 PCP−ビオチン二座配位子(V)が抗PCP抗体によって識別される能力( すなわちこの二座配位子の免疫反応性)をEMITRPCPキットを用いて評価 した。二座配位子(VI)をEMITR緩衝液で希釈することによってPCP− ビオチン二座配位子(VI)のサンプルを1000、100及び10ng/ml 濃度で作った。PCP−ビオチン二座配位子サンプルをその後濃度未知としてコ バスビオ(CobasBio)でEMIT試薬を用いて検定し、PCP−ビオチン二座配 位子(VI)の免疫反応性を測定した。この実験結果は表25に示され、PCP −ビオチン二座配位子が免疫反応性であることを示した。 PCP−ビオチン二座配位子をラテックス増大免疫検定に用い、尿中のPCP を検出した。このような免疫検定に用いるラテックス−アビジン共役体は次のよ うにして得た。0.55%ツイーン−20を含むMOPS緩衝液(0.1M)8 .75mlにセラジン社から入手した60nmサイズのラテックス粒子1.25 mlの懸濁液と、冷MOPS 1.32ml中N−ヒドロキシスクシンイミド8 2mgの溶液と、冷MOPS1.26ml中水溶性カルボジイミド57.6mg の溶液を加えた。4℃で1時間おだやかに撹拌後、ラテックス反応混合物のpH をpH9に高め、混合物を硼酸塩緩衝液(0.02M、pH9)30ml中で4 ℃でアビジン18mgとさらに5時間反応させた。ウシ血清アルブミン(BSA )(88mg)を加え、混合物を4℃で1晩撹拌し、こうして所望のラテックス −アビジン粒子を得た。その後ラテックス−アビジン混合物を0.2%ツイーン −20を含む0.02Mトリス(pH9)に対して透析した。ラテックス−アビ ジン粒子をセファロースCL−6Bカラムで精製した。その際0.2%ツイーン −20含有0.02Mトリ ス、pH9、を溶出液として用いた。 上記のPCP−ビオチン二座配位子をラテックス−アビジン粒子に結合させ、 発明の2試薬系実施例によってPCPを検定するためにもちいることができる試 薬を形成した。こうして、pH7に調節したラテックス−アビジン粒子25ml の懸濁液に、メタノール中PCP−ビオチン二座配位子(VI)6.5mg/m lを含む溶液を10μlづつ加えた。加えた二座配位子の量は0.52mg(8 0μl)であった。反応混合物をセファロースCL−6Bカラムに適用した後、 振動機上で1時間しずかに混合した。ラテックス−アビジン−PCP−ビオチン 共役体をカラムから0.2%ツイーン−20含有0.02M トリス、pH9、 で溶出した。共役体をベックマンDU−70スペクトロメーターで走査した。観 察したスペクトル特性のいくつかを表26に示す。 ラテックス−アビジン−PCP−ビオチン共役体及び抗体試薬をARRAY3 60で、尿で調製された決められた濃度のPCP溶液を用いて最適化した。最適 化後、本発明のラテックス増大二座配位 子法をARRAY分析器と共に用いて、標準並びにいくつかののPCP尿サンプ ルをスクリーニングした。 ARRAY分析器に用いた検定緩衝液及び試薬を以下に記す: a.トリス緩衝液(0.02M、0.2%BSA,pH9.0)で希釈した PCP−ビオチン二座配位子−アビジン共役体 b.ビオデザイン社から入手し、ARRAY抗体希釈剤で希釈したヒツジ抗 PCP抗体。 c.ICS緩衝液(検定緩衝液として用いる) d.カリブレーター(ヒト−ボランティアから供給された尿プールで調製さ れた) ARRAY検定プロトコールには下記を用いた: RATX=10、ゲイン=2 緩衝液: 500μl 抗体: 43.5μl(1/120希釈)、トリガー試薬 サンプル 100μl(1/6 on-line 希釈) ラテックス共役体:42μl(1/2希釈) ARRAY用量反応曲線で得られた数値を表27に示す。 ARRAY結果をガスクロマトグラフィー/質量分析(“GC/MS”)法に よって得られたものと比較した。この比較の結果を表28に示す。表28に示す ように、確認のためのGC/MS試験とARRAY検定との間には十分な相関関 係が認められた。カットオフ濃度30ng/mlに基づくと、ARRAY PC Pスクリーニング法はPCPのGC/MSによって確認された全陽性サンプル( n=13)、及び全陰性サンプル(n=17)を正しく予測した。こうしてラテ ックス二座配位子法の予測性はPCP陽性サンプルでもPCP陰性サンプルでも 100%であった。 同一サンプルをコバスビオ分析器でSyva EMITR試薬で試験した。E MITR試薬の結果は1つが偽のネガティブ(false negative)で、偽のポジティ ブ(false positive)はなかった。言い換えると陽性サンプルの予測性は91.7 %で、陰性サンプルでは予測性は100%であった。この結果を表29に示す。 こうして新規のPCP−ビオチン二座配位子(図11、VI)が作られ、これを 用いてPCPの高感度ラテックス増大免疫検定が行われた。PCP- ビオチン二 座配位子試薬はPCPのこれに代わる、または同等の検定を行うためのあらゆる 種々の免疫検定フォーマットに用いられる。 例17 麻薬(opiate)のためのラテックス粒子−増大均質免疫検定 ヘロインを摂取した場合、この薬剤の若干はモルヒネ及びコデインに代謝され る。こうしてヘロイン、モルヒネ及びコデインすべてがヘロイン常用者の尿中に 見いだされる。本発明の方法を用いて新規のO3−(ビオチニル)モルヒネ誘導 体を作った。この新規のモルヒネ誘導体を用いて、血液または尿中の麻薬の存在 をスクリーニングするために用いることのできるラテックス増大均質免疫検定を 確立した。 新規のO3−(ビオチニル)モルヒネ誘導体の合成は図12に示される。図1 2を参照すると、モルヒネ(I)をエチル4−ブロモブチレートでアルキル化し 、エステル誘導体(II)を生成した。エステルを酸と反応させるとO3−アルキ ル化モルヒネ カルボン酸 (III)が生成した。カルボン酸(III)をそれからアミノビオチン(IV)にカ ップリングさせ、所望のモルヒネ−ビオチン二座配位子(V)を得た。 モルヒネ−ビオチン二座配位子(V)の免疫反応性をEMITR麻薬キットで 評価した。二座配位子(V)をEMITR緩衝液で希釈することによって、モル ヒネ- ビオチン二座配位子(V)の375、37.5、3.75及び0.375 μg/mlのサンプルを調製した。モルヒネ−ビオチン二座配位子サンプルを未 知のものとしてコバスビオ(Cobas Bio)分析器でEMIT試薬を用いて検定し 、モルヒネ- ビオチン二座配位子(V)の免疫反応性を測定した。この実験結果 は表30に示され、モルヒネ−ビオチン二座配位子が免疫反応性であることを示 した。 モルヒネ−ビオチン二座配位子をラテックス増大免疫検定に用い、尿中のモル ヒネを検出した。このような免疫検定に用いるラテックス−アビジン共役体は次 のようにして得た。0.55%ツイーン−20を含むMOPS緩衝液(0.1M )8.75mlにセラジン 社から入手した60nmサイズのラテックス粒子1.25mlの懸濁液と、冷M OPS1.32ml中N−ヒドロキシスクシンイミド82mgの溶液と、冷MO PS1.26ml中水溶性カルボジイミド57.6mgの溶液を加えた。4℃で 1時間おだやかに撹拌後、ラテックス反応混合物のpHをpH9に高め、混合物 を硼酸塩緩衝液(0.02M、pH9)30ml中で4℃でアビジン18mgと さらに5時間反応させた。ウシ血清アルブミン(BSA)(88mg)を加え、 混合物を4℃で1晩撹拌し、こうして所望のラテックス−アビジン粒子を得た。 その後ラテックス−アビジン混合物を0.2%ツイーン−20を含む0.02M トリス(pH9)に対して透析した。ラテックス−アビジン粒子をセファロース CL−6Bカラムで精製した。その際0.2%ツイーン−20を含む0.02M トリス、pH9、を溶出液として用いた。 上記のモルヒネ−ビオチン二座配位子をラテックス−アビジン粒子に結合させ 、発明の2試薬系実施態様によってモルヒネを検定するために用いることのでき る試薬を形成した。こうしてpH7に調節したラテックス−アビジン粒子25m lの懸濁液に、メタノール中PCP−ビオチン 二座配位子(V)7.6mg/ mlを含む溶液を10μlづつ加えた。加えた二座配位子の量は0.76mg( 100μl)であった。反応混合物をセファロースCL−6Bカラムに適用した 後、振動機上で1時間しずかに混合した。ラテックス−アビジン−モルヒネ−ビ オチン共役体をカラムから0.2%ツイーン−20含有0.02Mトリス、pH 9、で溶出した。共役体をベックマンDU−70スペクトロメーターで走査した 。観察したスペクトル特性のいくつかを表31に示す。 ラテックス−アビジン−モルヒネ−ビオチン共役体及び抗体試薬をARRAY 360で、尿で調製した決められた濃度のモルヒネ溶液を用いて最適化した。最 適化後、本発明のラテックス増大二座配位子法をARRAY分析器と共に用いて 、標準並びにいくつかののモルヒネ尿サンプルをスクリーニングした。 ARRAY分析器で用いた検定緩衝液及び試薬を以下に記す: a.トリス緩衝液(0.02M、0.2%BSA、pH9.0)で希釈した モルヒネ−ビオチン二座配位子−アビジン共役体 b.モルヒネ抗体(ビオストライド社から入手し、ARRAY抗体希釈剤で 希釈した) c.ICS緩衝液(検定緩衝液として用いる) d.カリブレーター(Utak社から購入した尿基質で調製した) ARRAY検定プロトコールには下記を用いた: RATX=10、ゲイン=2 緩衝液: 614μl 抗体: 43.5μl(1/120希釈)、トリガー試薬 サンプル 28μl(1/18 on-line 希釈) ラテックス共役体:42μl(1/2希釈) ARRAY用量反応曲線で得られた数値を表32に示す。 ARRAY結果をガスクロマトグラフィー/質量分析(“GC/MS”)法に よって得たものと比較した。この比較の結果を表33に示す。表33に示すよう に、確認のためのGC/MS試験とARRAY検定との間には十分な相関関係が 認められた。カットオフ濃度0.3μg/mlに基づくと、ARRAYモルヒネ スクリーニング法は、モルヒネのGC/MSによって確認された全陽性サンプル (n=46)、及び陰性サンプル16のうち15サンプルを正しく予測した。こ うしてラテックス二座配位子法の予測性はモルヒネ陽性サンプル及びモルヒネ陰 性サンプルでそれぞれ100%及び93.3%であった。 しかしARRAY結果は表34に示すように、コバスビオ分析器を用いたSy vaEMITR試薬試験で得られたものとは完全に一致した。 シンクロンを用いて尿サンプル中のモルヒネを検出するために、モルヒネ−ビ オチン−アビジン共役体及び抗体試薬類も最適化した。シンクロンに用いた検定 緩衝液及び試薬は下記のようであった: a.トリス緩衝液(0.02M、0.2%BSA、pH9.0)で希釈した モルヒネ−ビオチン二座配位子−アビジン共役体 b.モルヒネ抗体(ビオストライド社から入手し、ARRAY抗体希釈剤で 希釈した) c.ICS緩衝液(検定緩衝液として用いる) d.カリブレーター(Utak 社から購入した尿基質で調製した) 検定は下記の条件で行われた: 緩衝液:ICS緩衝液、220μl 抗体:30μl(1/50希釈)、トリガー試薬 サンプル:5μl(生 ) ラテックス共役体:60μl(生) リードウィンドウ:24秒間トリガーを添加後8秒 ARRAY用量反応曲線で得られた数値を表35に示す。 上記のARRAY−GC/MS相関に用いた同一サンプルをシンクロン研究に 用いた。表36に示される相関性の結果によって示されるように、シンクロンを 用いたラテックス二座配位子麻薬検定はGC/MSモルヒネ陽性(n=46)及 び陰性サンプル(n=16)両方共、100%の予測性を示した。 こうして新規のモルヒネ−ビオチン二座配位子(図12、V)を作り、使用し て、麻薬のための高感度のラテックス増大免疫検定を確立することができた。ア ボット及びEMITR検定と同様に、上記の麻薬のラテックス−ベース二座配位 子検定はモルヒネのみならず、尿中のその他の麻薬、例えばコデイン、ヒドロコ デイン及びヒドロモルヒネも認識した。二座配位子試薬は、このような麻薬の検 定を行うためのあらゆる種々の免疫検定フォーマットに用いられる。 例18 フェニトインのためのラテックス粒子増大均質免疫検定 フェニトインはてんかん及びその他の情緒障害の治療に用いられる抗けいれん 剤である(フィリップ(Philip,J)ら:薬剤物質の分析的プロフィール(Analyt icalProfiles of Drug Substances)、13巻、フロリー(Florey,K)ら編集、A cademic Press、NY(417−445ページ(1984));ドレヒュス(Dre ifus)ら、Amer.Heart J.80巻、709−713ページ(1970);どちら も引例によってここに挿入される)。フェニトインは強い発癌性物質であるから (IARC Monogr.13巻、201−225 ページ(1977))、患者のフェニトイン濃度をモニターして過量投与を避け ることが重要である。 本発明の方法を用いてフェニトイン−ビオチン二座配位子を作った。この新規 二座配位子を用いて、血中及び尿中の麻薬の存在をスクリーニングするために用 いることのできるラテックス増大均質免疫検定を確立した。 新規のフェニトイン−ビオチン二座配位子の合成は図13に示される。図13 を参照すると、フェニトイン(I)をω ブロモバレレートでN−アルキル化し 、その後NaOH中で加水分解することによってフェニトイン酸誘導体(II) を得た。それからカルボニルジイミダゾール(CDI)及びN−ヒドロキシスク シンイミド(NHS)を用いてフェニトイン酸誘導体(II)をヘキサンジアミ ンとカップリングさせると、フェニトインアミン誘導体(III)が生じた。そ の後CDI及びNHSを用いてフェニトインアミン誘導体(III)をカルボン 酸ビオチン誘導体(IV)にカップリングさせると、所望のフェニトイン−ビオ チン二座配位子が生成した。 フェニトイン−ビオチン二座配位子を用い、上記の3試薬系型及び2試薬系型 両方を用いて尿サンプル中のフェニトインを検出した。両検定共、シンクロン分 析器を用いて分析した。 フェニトインの検出は、ハイブリドーマ クローンAS3またはAS8から産 生した抗フェニトインモノクローナル抗体を用いて行われた。これらのクローン から生成した抗体は実質的に等価である。適した別のモノクローナル抗体がビオ スペシフィック社及びビオデザイン社から市場で入手できるし、またはその他の ソース、例え ばLinscott's Directoryに記載されているものから得られる。 3試薬系型において、免疫反応をトリガーするために二座配位子(V)そのも のが用いられた(すなわちトリガー試薬として)。こうしてこの検定は3つの試 薬成分から成っていた: a.フェニトイン−ビオチン 二座配位子−アビジン共役体(トリス緩衝液 (0.02M、0.2%BSA、pH9.0)で希釈) b.モノクローナル抗フェニトイン抗体(クローンAS8によって産生され、 ARRAY抗体希釈剤で1:50に希釈) c.ラテックス−アビジン粒子(トリス緩衝液(0.02M.0.2%BSA 、pH9.0)で希釈)。ラテックス物質(100nm)はセラジンから購入し た。ラテックス粒子をアビジンにカップリングさせると、ラテックス−アビジン 物質が得られる。ラテックス1mgに対しアビジン0.3mgの質量比を用いる 。 検定緩衝液はApo Diluent(ベックマンインスツルメント)80%及びリウマ トイド緩衝液(ベックマンインスツルメント)20%の混合物であった。カリブ レーターはヒトの脂質除去血清で作った。シンクロン分析器は3試薬検定のため に次のように構成された: a.試薬カートリッジコンパートメントAには検定緩衝液:220μl b.コンパートメントBには抗体(1/50)/ラテックス・アビジン混合物 (容量で1:1):62μl c.サンプル:3μl(生) d.コンパートメントCにはトリガーとしてのフェニトイン−ビオチン二座配 位子(1.5μg/ml):20μl e.トリガー添加時間:サンプル添加後16秒 f.反応リードウィンドウ:36秒間トリガーを添加した後8秒 g.検出波長:340nm 標準曲線を作成するために、いくつかの標準を用いて検定が行われた。標準曲 線の数値を表37に示す。 上記の3試薬検定を38名の患者群でTDx検定と平行して行った。3試薬シ ンクロン数値とTDxフォーマットを用いて得た数値との間には良い相関関係が 認められた。分析の結果次の関係式が得られた。 シンクロン=1.0000(TDx) + 0.07 r=0.9470 n=38 既述のように、上記2試薬型を用いるシンクロン免疫検定も行われた。2試薬 検定型はラテックス−アビジン−ビオチン−フェニトイン共役体と、ラテックス 凝集反応をおこす抗体とからなっていた。こうした2試薬検定フォーマットにお いてフェニトイン−ビオチン二座配位子が共役成分として処方された。検定には 下記の試薬及び緩衝液が用いられた: a.ベックマンインスツルメントが産生したモノクローナルフェニトイン抗 体AS8を用いた。抗体を検定用ARRAY抗体希釈剤(ベックマンP/N66 8579)で1:50に希釈した。 b.ラテックス−アビジン−ビオチン−フェニトイン共役体(トリス緩衝液 (0.02M、0.2%BSA、pH9.0)で希釈)。ラテックス材料(10 0nm)をセラジンから購入した。ラテックス粒子をラテックス1mgに対しア ビジン0.3mgの質量比でアビジンにカップリングさせた。ラテックス−アビ ジンをそれからフェニトイン二座配位子と複合体化し、所望共役体を得た。 検定緩衝液は70% Apo Diluent(ベックマンインスツルメント)と30%リ ウマトイド緩衝液(ベックマンインスツルメント)との混合物であった。カリブ レーターをヒト脱脂血清で作成した。シンクロン分析器を2試薬検定のために次 のように構成した: a.試薬カートリッジコンパートメントAには検定緩衝液:220μl b.コンパートメントCにはラテックス−アビジン−フェニトイン−ビオチ ン共役体:62μl c.サンプル:3μl(生) d.コンパートメントBには抗体トリガー:30μl e.トリガー添加時間:サンプル添加後16秒 f.反応リードウィンドウ:トリガーを36秒間添加後8秒 g.検出波長:340nm こうしていくつかの標準を用いて検定が行われ、標準曲線が作成された。標準 曲線の数値を表38に示す。 上記2試薬検定を62名の患者群においてTDx検定と平行して行った。2試 薬シンクロン数値とTDxフォーマットを用いて得られた数値との間には良い相 関性が認められた。分析の結果は次の関係式を与えた: シンクロン=1.10292(TDx) − 0.12 r=0.9798 n=62 検定感度または検定要求事項に対するラテックス−アビジン粒子の影響を調べ るために比較を行った。例えばフェニトインのための2試薬シンクロン検定が上 記ラテックス−アビジン粒子の存在下または不在下で行われた。両検定共同じ抗 フェニトインモノクローナル抗体(ハイブリドーマクローンAS3によって産生 される)を用いた。検定は表39に示す最適化条件のもとで行われた。 ラテックス粒子なしで行われた検定(すなわち“液体処方フェニトイン二座配 位子検定”)では1/3.25の抗体希釈が必要であることがわかった。これに 対して、アビジンをラテックス粒子に結合させた場合は(すなわち“ラテックス 増大”免疫検定処方)、1/100の抗体希釈を行うことができた。こうして液 体処方検定は“ラテックス増大”免疫検定処方に必要な抗体の最低30倍もの抗 体を必要とした。その上、液体処方はラテックス処方に比較してずっと感度の低 い用量反応曲線を生じた。 これらの検定を1組のフェニトイン標準溶液を用いて評価し、液 体処方−及びラテックス増大検定法の標準曲線を作成した。標準曲線を表40に 示す(Abs=吸光度、Min=分)。 液体処方−及びラテックス増大検定の結果は、どちらの検定もフェニトイン濃 度を正確に測定することができることを示した。 本発明をその特定の態様と関係づけて説明したが、本発明はさらに変更可能で あり、この出願が、発明が関係する分野の公知のまたは従来の実際面にあるよう な、そしてこれまでに示し並びに添付の請求の範囲の範囲内にある本質的特徴に 適合するような発明の精神に概ねしたがう本開示からの逸脱を含むすべての変形 物、用途または応用を包含するものとすることは当然である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チョン、アンソニー ケイ アメリカ合衆国 92817 カリフォルニア 州 アナハイム ピーオーボックス 17455

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.テストサンプル中の標的被検体の存在を測定する検定であって、 (A)テストサンプルを (i)ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被 検体メンバーとの間にあるスペーサーメンバーを含んでなる溶解性二座配位子試 薬であって、 (a)前記試薬の前記ビオチンメンバーがアビジン及びストレプトアビ ジンからなる群から選択されるビオチン結合試薬に結合でき;前記ビオチン結合 試薬は固体支持体に固定され、 (b)前記試薬の前記被検体メンバーは前記標的被検体に結合できる抗 体に特異的に結合でき; (c)前記中間スペーサーメンバーは前記被検体メンバーと抗標的被検 体抗体との結合、並びに前記ビオチンメンバーとビオチン結合リガンドとの結合 を可能にする十分な長さをもつ二座配位子試薬; (ii)前記抗標的被検体抗体;及び (iii)前記ビオチン結合試薬 と接触させて反応混合物を形成し、 (B)前記二座配位子試薬と前記抗標的被検体抗体と前記ビオチン結合試薬との 複合体の形成を可能にする十分な条件のもとで前記反応混合物をインキュベート し;そして (C)前記サンプル中の前記標的被検体濃度に反比例する、前記複合体の形成の 程度を測定する、 各工程を含んでなる検定。 2.前記二座配位子試薬の前記スペーサーメンバーがアルキルジアミン、アル キル無水物及びアルキルアミノ酸からなる群から選択される試薬の付加物を含ん でなる請求の範囲第1項記載の検定。 3.前記試薬がアルキルジアミンである請求の範囲第2項記載の検定。 4.前記アルキルジアミンがペンタンジアミン、ヘキサンジアミンまたはオク タンジアミンである請求の範囲第2項記載の検定。 5.前記スペーサーメンバーが約20原子の伸長長さをもつ請求の範囲第2項 記載の検定。 6.前記スペーサーメンバー及び前記ビオチンメンバーがカプロアミドビオチ ンを含む請求の範囲第1項記載の検定。 7.前記抗体がベンゾイルエクゴニン及びコカイン、麻薬及びPCPからなる 群から選択される被検体に結合できる請求の範囲第1項記載の検定。 8.前記標的被検体がジゴキシゲニンである請求の範囲第1項記載の検定。 9.前記標的被検体がアセタミノフェンである請求の範囲第1項記載の検定。 10.前記標的被検体がカルバマゼピンである請求の範囲第1項記載の検定。 11.前記標的被検体がプリミドン及びフェニトインからなる群から選択され る請求の範囲第1項記載の検定。 12.前記標的被検体がテオフィリンである請求の範囲第1項記載の検定。 13.前記標的被検体がアミノグリコシド抗生物質である請求の範囲第1項記 載の検定。 14.前記アミノグリコシド抗生物質がトブラマイシン、ゲンタマイシン及び アミカシンからなる群から選択される請求の範囲第13項記載の検定。 15.前記標的被検体がバンコマイシンである請求の範囲第1項記載の検定。 16.前記標的被検体がキニジンである請求の範囲第1項記載の検定。 17.前記標的被検体がカンナビノイドである請求の範囲第1項記載の検定。 18.前記カンナビノイドがテトラヒドロキシカンナビノイドである請求の範 囲第17項記載の検定。 19.前記ビオチン結合試薬がストレプトアビジンである請求の範囲第1項記 載の検定。 20.前記ビオチン結合試薬がアビジンである請求の範囲第1項記載の検定。 21.前記固定支持体がラテックス支持体である請求の範囲第20項記載の検 定。 22.前記ラテックスがカルボキシレート改質ラテックスである請求の範囲第 21項記載の検定。 23.前記ラテックス支持体がラテックス粒子である請求の範囲第21項記載 の検定。 24.前記ラテックス粒子に熱ストレスがかけられる請求の範囲第21項記載 の検定。 25.前記ビオチン結合試薬がアビジンであり、前記アビジンは、N−ヒドロ キシスクシンイミド及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カル ボジイミドの存在下で、このような固定を実現するために十分な条件のもとで、 ラテックスとアビジンとをインキュベートすることによって前記ラテックス支持 体に固定される請求の範囲第21項記載の検定。 26.ラテックスとアビジンとをN−ヒドロキシスクシンイミド及び1−エチ ル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの存在下で前記アビジ ンを前記ラテックスに固定するのに十分な条件のもとでインキュベートすること によって形成されるアビジン−ラテックス結合体。 27.アビジンをラテックスに固定する方法であって、 (A)ラテックス粒子の水性懸濁液を結合試薬及び水溶性カルボジイミドの存在 下でアルカリ性pHの条件下でインキュベートし; (B)アビジンを前記インキュベーションに添加し、前記結合試薬が前記アビジ ンの前記ラテックス粒子との結合を可能とする各工程を含んでなる方法。 28.前記ラテックス粒子がカルボキシレート改質ラテックス粒子である請求 の範囲第27項記載の方法。 29.前記結合試薬がN−ヒドロキシスクシンイミドである請求の範囲第27 項記載の方法。 30.前記水溶性カルボジイミドが1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ ロピル)カルボジイミドである請求の範囲第27項記載の方法。 31.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメ ンバーと被検体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記ビオチ ンメンバーをビオチン結合リガンドに結合させ、かつ前記被検体メンバーを抗体 に結合させる十分な長さをもつ二座配位子試薬の製法であって、 (A)被検体前駆物質の反応性アミノ基をイソチオシアネート基に変換し;そし て (B)前記イソチオシアネート基をアルキアミドビオチンのアミノ基と縮合させ 、前記アルキアミドビオチンが前記スペーサーメンバー及びビオチンメンバーを 含む 各工程を含んでなる製法。 32.前記被検体がベンゾイルエクゴニンであり、工程(A)において前記変 換が (i)4−ニトロベンゾイルクロリド及びトリエチルアミンの存在下でニトロベ ンゾイル部分と被検体との間にエステル結合を作り出すのに十分な条件のもとで ベンゾイルエクゴニン前駆物質をインキュベートし; (ii)結合したニトロベンゾイル部分のニトロ基を、Pd−Cの存在下で水素ガ スとの反応によりアミン基に変換し;そして (iii)前記アミン基をチオホスゲン及び酸との反応により前記イソチオシアネ ートに変換する ことによって仲介される請求の範囲第31項記載の製法。 33.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記ビオチンメンバーを ビオチン結合リガンドに結合させ、前記被検体メンバーを抗体に結合させる十分 な長さをもつ二座配位子試 薬の製法であって、 (A)被検体前駆物質の反応性アミン基をカルボキシル基に変換し;そして (B)前記カルボキシル基をアルキアミドビオチンのアミン基と縮合させ、前記 アルキアミドビオチンが前記スペーサー及びビオチンメンバーを含む 各工程を含んでなる製法。 34.工程(A)において前記変換が、有機塩基の存在下で前記被検体前駆物 質をアルキル無水物と共にインキュベートすることによって仲介される請求の範 囲第33項記載の製法。 35.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記ビオチンメンバーを ビオチン結合リガンドに結合させ、かつ前記被検体メンバーを抗体に結合させる のに十分な長さをもつ二座配位子試薬の製法であって、 (A)被検体前駆物質のヒドロキシル基をアミン基に変換し; (B)前記アミン基をアミド基に変換し;そして (C)前記アミド基をアルキアミドビオチンのアミン基と縮合させ、前記アルキ アミドビオチンが前記スペーサー及びビオチンメンバーを含む 各工程を含んでなる製法。 36.工程(A)において、前記被検体前駆物質を無水酢酸アンモニウム及び シアノボロハイドライドナトリウムのメタノール溶液の存在下、窒素雰囲気中、 室温でインキュベートすることによって前記変換が仲介される請求の範囲第35 項記載の製法。 37.工程(B)において、前記アミノ化被検体前駆物質を有機塩基の存在下 でアルキル無水物と共にインキュベートすることによって前記変換が仲介される 請求の範囲第35項記載の製法。 38.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結合さ せるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがベン ゾイルエクゴニン、麻薬、PCP及びコカインからなる群から選択される二座配 位子試薬。 39.前記スペーサーメンバーが少なくとも1つのアルキルジアミンを含むア ルキルジアミンコハク酸無水物付加物を含む請求の範囲第38項記載の二座配位 子試薬。 40.前記アルキルジアミンの少なくとも1つがヘキサンジアミンである請求 の範囲第39項記載の二座配位子試薬。 41.前記アルキルジアミンの少なくとも1つがオクタンジアミンである請求 の範囲第39項記載の二座配位子試薬。 42.前記スペーサーメンバーが約20原子の伸長長さを有する請求の範囲第 39項記載の二座配位子試薬。 43.前記スペーサーメンバー及び前記ビオチンメンバーがカプロアミドビオ チンを含む請求の範囲第38項記載の二座配位子試薬。 44.前記試薬がベンゾイルエクゴニン、PCP及びコカインからなる群から 選択される被検体メンバーを有し、前記試薬が(A)前記ベンゾイルエクゴニン 、PCPまたはコカイン被検体メンバー のベンゾイル基からニトロベンゾイル基への変換;(B)前記ニトロベンゾイル 基からベンゾイルイソチオシアネート基への変換;及び(C)前記ベンゾイルイ ソチオシアネート基の前記イソチオシアネートと前記スペーサー及びビオチンメ ンバーを含むアルキアミドビオチンとの縮合によって形成される請求の範囲第3 8項記載の二座配位子試薬。 45.前記試薬が麻薬被検体メンバーを有し、前記試薬が(A)麻薬のヒドロ キシル基のアルキル化によるエステル化された麻薬誘導体の形成;(B)前記エ ステル化麻薬誘導体からカルボン酸誘導体への変換;及び(C)前記カルボン酸 誘導体のカルボン酸基とアルキアミドビオチンのアミン基との縮合によって形成 され、前記アルキアミドビオチンが前記スペーサー及びビオチンメンバーを含む 請求の範囲第38項記載の二座配位子試薬。 46.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結合さ せるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがジゴ キシゲニンである二座配位子試薬。 47.前記試薬が(A)前記ジゴキシゲニンと金属酸化物とを前記ジゴキシゲ ニンをジゴキシゲノンに変換するのに十分な条件のもとでインキュベートし(B )前記ジゴキシゲニンのヒドロキシル基をアミン基に変換し、前記変換により前 記ジゴキシゲノンからアミノジゴキシゲノンが形成され;(C)前記アミノジゴ キシゲノンをアルカリ中で、前記アミノジゴキシゲノンをアミノジゴキシゲニン に変換するのに十分な条件のもとでインキュベートし;そして(D)前記アミノ ジゴキシゲニンの前記アミン基を前記スペーサー及びビオチンメンバーを含むア ルキアミドビオチンと縮合することによって形成される請求の範囲第46項記載 の二座配位子試薬。 48.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結合さ せるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがアセ タミノフェンである二座配位子試薬。 49.前記試薬が(A)パラヒドロキシトルエンをトルエンスルホクロリドの 存在下で、前記パラヒドロキシトルエンのヒドロキシル基をスルポニルトルエン 基に変換するのに十分な条件のもとでインキュベートし;(B)前記変換した分 子とアルキル無水物とを前記アニリンのアミン基をアルキル化するのに十分な条 件のもとで反応させてカルボキシル誘導体を形成し;(C)前記アルキル化分子 をアルカリ中で、前記スルホニルトルエン基をヒドロキシル基に置換するのに十 分な条件のもとでインキュベートし;(D)(C)の前記カルボキシル基を前記 スペーサー及びビオチンメンバーを含むアルキアミドビオチンのアミン基と縮合 させることによって形成される請求の範囲第48項記載の二座配位子試薬。 50.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、かつ前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結 合させるのに十分な長さを もつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがカルバマゼピンである二座 配位子試薬。 51.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、かつ前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結 合させるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーが プリミドンである二座配位子試薬。 52.前記試薬が(A)前記プリミドンのニトロ誘導体を形成するのに十分な 条件下におけるプリミドンの反応;(B)前記ニトロ誘導体の水素化による前記 ニトロ基のアミン基への還元;前記アミン基のアルキル無水物によるアルキル化 によるカルボキシルプリミドン誘導体の形成;及び(C)前記カルボキシルプリ ミドン誘導体と、前記スペーサー及びビオチンメンバーを含むアルキアミドビオ チンのアミン基との縮合により形成される請求の範囲第51項記載の二座配位子 試薬。 53.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、かつ前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結 合させるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーが アミノグリコシド抗生物質である二座配位子試薬。 54.前記アミノグリコシド抗生物質がトブラマイシン、ゲンタマイシン及び アミカシンからなる群から選択される請求の範囲第53項記載の二座配位子試薬 。 55.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記ビオチンメンバーと被検 体メンバーとの間のスペーサーメンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗 被検体抗体に結合させ、かつ前記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結 合させるのに十分な長さをもつ二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーが バンコマイシンである二座配位子試薬。 56.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記メンバー間のスペーサー メンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗被検体抗体に結合させ、かつ前 記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結合させるのに十分な長さをもつ 二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがキニジンである二座配位子試薬 。 57.ビオチンメンバー、被検体メンバー、及び前記メンバー間のスペーサー メンバーを含んでなり、前記被検体メンバーを抗被検体抗体に結合させ、かつ前 記ビオチンメンバーをビオチン結合リガンドに結合させるのに十分な長さをもつ 二座配位子試薬であって、前記被検体メンバーがカンナビノイドである二座配位 子試薬。 58.前記カンナビノイドがテトラヒドロカンナビノイドである請求の範囲第 57項記載の二座配位子試薬。
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