JPH09234072A - 新規オリゴヌクレオチド、それから成るｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプ判別用プライマー及びそれを用いるｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 - Google Patents
新規オリゴヌクレオチド、それから成るｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプ判別用プライマー及びそれを用いるｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法Info
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- JPH09234072A JPH09234072A JP8038875A JP3887596A JPH09234072A JP H09234072 A JPH09234072 A JP H09234072A JP 8038875 A JP8038875 A JP 8038875A JP 3887596 A JP3887596 A JP 3887596A JP H09234072 A JPH09234072 A JP H09234072A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基
づいて正確に、かつ、簡便に分類するための手段を提供
すること。 【構成】 配列表の配列番号１〜４９及び６２〜６９の
いずれかで表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及びこれらに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを提供した。また、本発明は、これらのオリゴヌ
クレオチドから成るＨＣＶジェノタイプを判別するため
のプライマーを提供した。さらに、本発明は、検体中の
ＨＣＶゲノム又はその一部を鋳型としてｃＤＮＡを合成
する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型とし、上記本発明のオリ
ゴヌクレオチドのいずれかをプライマーとしてＰＣＲを
行い、増幅されたＤＮＡを検出することから成る、Ｃ型
肝炎ウイルスのジェノタイプを判別する方法を提供し
た。
づいて正確に、かつ、簡便に分類するための手段を提供
すること。 【構成】 配列表の配列番号１〜４９及び６２〜６９の
いずれかで表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及びこれらに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを提供した。また、本発明は、これらのオリゴヌ
クレオチドから成るＨＣＶジェノタイプを判別するため
のプライマーを提供した。さらに、本発明は、検体中の
ＨＣＶゲノム又はその一部を鋳型としてｃＤＮＡを合成
する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型とし、上記本発明のオリ
ゴヌクレオチドのいずれかをプライマーとしてＰＣＲを
行い、増幅されたＤＮＡを検出することから成る、Ｃ型
肝炎ウイルスのジェノタイプを判別する方法を提供し
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規オリゴヌクレ
オチド、それから成るＣ型肝炎ウイルスのジェノタイプ
判別用プライマー及びそれを用いるＣ型肝炎ウイルスの
ジェノタイプの判別方法に関する。
オチド、それから成るＣ型肝炎ウイルスのジェノタイプ
判別用プライマー及びそれを用いるＣ型肝炎ウイルスの
ジェノタイプの判別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】世界各地のＣ型肝炎ウイルス（以下、
「ＨＣＶ」ということがある）の遺伝子配列が決定され
（例えば特表平５−５００１５５号及び特開平５−３０
１８８７号）、その結果、世界各地に異なるタイプのＨ
ＣＶが存在することが明らかになった。従来、ウイルス
のタイプ分類は感染源の推定やその地理的分布等の分子
疫学的な調査研究を目的に汎用されていたが、ことＨＣ
Ｖに関しては、臨床上Ｃ型慢性肝炎患者のインターフェ
ロン治療効果を予測する上でも有用であることがわか
り、治療上どうしてもＨＣＶのタイプ分類が必要になっ
た。
「ＨＣＶ」ということがある）の遺伝子配列が決定され
（例えば特表平５−５００１５５号及び特開平５−３０
１８８７号）、その結果、世界各地に異なるタイプのＨ
ＣＶが存在することが明らかになった。従来、ウイルス
のタイプ分類は感染源の推定やその地理的分布等の分子
疫学的な調査研究を目的に汎用されていたが、ことＨＣ
Ｖに関しては、臨床上Ｃ型慢性肝炎患者のインターフェ
ロン治療効果を予測する上でも有用であることがわか
り、治療上どうしてもＨＣＶのタイプ分類が必要になっ
た。
【０００３】ウイルスを分類する場合、従来、ウイルス
の抗原性の違いを利用する血清型を利用してなされてき
た。しかしながら、血清型では正確なタイプ分類を行う
ことができないことがわかってきた。一方、ウイルスを
構成するタンパク質は遺伝子によりコードされている。
そして、その遺伝子の変異により進化していく。従っ
て、ウイルス間の比較をする場合、先に述べた血清型を
比較するより、ウイルス遺伝子間の違いを比較した方が
より本質的である。すなわち、ＨＣＶについても、ジェ
ノタイプ（遺伝子型）に基づき分類する方がより本質的
であり、正確である。
の抗原性の違いを利用する血清型を利用してなされてき
た。しかしながら、血清型では正確なタイプ分類を行う
ことができないことがわかってきた。一方、ウイルスを
構成するタンパク質は遺伝子によりコードされている。
そして、その遺伝子の変異により進化していく。従っ
て、ウイルス間の比較をする場合、先に述べた血清型を
比較するより、ウイルス遺伝子間の違いを比較した方が
より本質的である。すなわち、ＨＣＶについても、ジェ
ノタイプ（遺伝子型）に基づき分類する方がより本質的
であり、正確である。
【０００４】従来、ＨＣＶのジェノタイプの分類は、各
研究者によってまちまちであった。従って、ある研究者
があるジェノタイプに関する研究を発表したとしても、
他の研究者はそのジェノタイプが自分が使っている分類
のどれに該当するのかを明確に知ることができず、他の
研究者の成果を効率よく利用できなくなっており、問題
であった。そこで、国際的にＨＣＶのジェノタイプの分
類を統一するために、各国の研究者たちが共同で、統一
的なジェノタイプの分類方法を提唱した（Hepatology,
19: 1321-1334, 1994, Correspondence, "A Proposed S
ystem for theNomenclature of Hepatitis C Viral Gen
otypes"、以下、この分類方法を、便宜的に「国際統一
分類法」と呼ぶことがある）。この国際統一分類法は、
ＨＣＶのＮＳ−５領域の変異に基づいてＨＣＶを１ａ、
１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、５
ａ及び６ａの１１タイプに分類するものである。今後、
ＨＣＶのジェノタイプは、この分類に基づいて行われる
ものと予想される。従って、今後もたらされるＨＣＶに
関する種々の情報を効率良く利用するためには、ＨＣＶ
のジェノタイプを国際統一分類法に基づき分類する必要
がある。
研究者によってまちまちであった。従って、ある研究者
があるジェノタイプに関する研究を発表したとしても、
他の研究者はそのジェノタイプが自分が使っている分類
のどれに該当するのかを明確に知ることができず、他の
研究者の成果を効率よく利用できなくなっており、問題
であった。そこで、国際的にＨＣＶのジェノタイプの分
類を統一するために、各国の研究者たちが共同で、統一
的なジェノタイプの分類方法を提唱した（Hepatology,
19: 1321-1334, 1994, Correspondence, "A Proposed S
ystem for theNomenclature of Hepatitis C Viral Gen
otypes"、以下、この分類方法を、便宜的に「国際統一
分類法」と呼ぶことがある）。この国際統一分類法は、
ＨＣＶのＮＳ−５領域の変異に基づいてＨＣＶを１ａ、
１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、５
ａ及び６ａの１１タイプに分類するものである。今後、
ＨＣＶのジェノタイプは、この分類に基づいて行われる
ものと予想される。従って、今後もたらされるＨＣＶに
関する種々の情報を効率良く利用するためには、ＨＣＶ
のジェノタイプを国際統一分類法に基づき分類する必要
がある。
【０００５】特開平５−３０１８８７号は、ＰＣＲを利
用してＨＣＶのジェノタイプを判定する方法を開示して
いる。すなわち、各ジェノタイプに特異的な配列を選択
し、これらの配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、被検試料中のＨＣＶゲノ
ムのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによ
りＤＮＡが増幅されるか否か、さらには増幅されるＤＮ
Ａのサイズを測定することにより、ＨＣＶのジェノタイ
プを分類する方法が記載されている。
用してＨＣＶのジェノタイプを判定する方法を開示して
いる。すなわち、各ジェノタイプに特異的な配列を選択
し、これらの配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、被検試料中のＨＣＶゲノ
ムのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによ
りＤＮＡが増幅されるか否か、さらには増幅されるＤＮ
Ａのサイズを測定することにより、ＨＣＶのジェノタイ
プを分類する方法が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法では、ジェノタイプの分類が独自のものであり、国際
統一分類法に基づいて行われたものではない。従って、
この公開公報に記載されているプライマーを用いたので
は国際統一分類法に基づく分類を行うことはできない。
また、下記実施例で示されるように、この方法では、一
部の型について、ＨＣＶが試料中に存在するにもかかわ
らず、ＨＣＶ陰性と判定されることがかなりの頻度で起
きる。従って、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法
に基づいて正確に分類するための手段が求められてい
る。
法では、ジェノタイプの分類が独自のものであり、国際
統一分類法に基づいて行われたものではない。従って、
この公開公報に記載されているプライマーを用いたので
は国際統一分類法に基づく分類を行うことはできない。
また、下記実施例で示されるように、この方法では、一
部の型について、ＨＣＶが試料中に存在するにもかかわ
らず、ＨＣＶ陰性と判定されることがかなりの頻度で起
きる。従って、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法
に基づいて正確に分類するための手段が求められてい
る。
【０００７】従って、本発明の目的は、ＨＣＶのジェノ
タイプを国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便
に分類するための手段を提供することである。
タイプを国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便
に分類するための手段を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、多数の
被検試料を用いて鋭意研究の結果、ＨＣＶのジェノタイ
プを国際統一分類法に基づき重複することなく分類する
ことができ、かつ、ＰＣＲによる増幅が効率良く起きる
プライマー領域を設定することに成功し、本発明を完成
した。
被検試料を用いて鋭意研究の結果、ＨＣＶのジェノタイ
プを国際統一分類法に基づき重複することなく分類する
ことができ、かつ、ＰＣＲによる増幅が効率良く起きる
プライマー領域を設定することに成功し、本発明を完成
した。
【０００９】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
〜３０、４７及び４８のいずれかで表される塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド及びこれらに相補的な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発
明は、これらのオリゴヌクレオチドから成るＨＣＶジェ
ノタイプを判別するためのプライマーを提供する。さら
に、本発明は、検体中のＨＣＶゲノム又はその一部を鋳
型としてｃＤＮＡを合成する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型
とし、上記本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかをプ
ライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡを検出
することから成る、Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプを
判別する方法を提供する。
〜３０、４７及び４８のいずれかで表される塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド及びこれらに相補的な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発
明は、これらのオリゴヌクレオチドから成るＨＣＶジェ
ノタイプを判別するためのプライマーを提供する。さら
に、本発明は、検体中のＨＣＶゲノム又はその一部を鋳
型としてｃＤＮＡを合成する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型
とし、上記本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかをプ
ライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡを検出
することから成る、Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプを
判別する方法を提供する。
【００１０】なお、本願発明者らは、上記の国際統一分
類法による分類に加え、さらに６ｂ（７ａ）、６ｃ（７
ｂ）、６ｄ（８ａ）及び６ｇを加えた（GenBank Access
ionNo. D64170及びD64173）。これらのうち、本発明は
６ｂの判定を可能にするプライマーをも提供するもので
あり、６ｂには、ＶＮ７８７(GenBank Accession No.D1
7486)、ＶＮ８４３(GenBank Accession No. D17489)、
ＶＮ５４０ (GenBankAccession No. D14209) 、Ｂ５及
びＢ７株(GenBank Accession No. D64170 及びD64173)
が含まれる。
類法による分類に加え、さらに６ｂ（７ａ）、６ｃ（７
ｂ）、６ｄ（８ａ）及び６ｇを加えた（GenBank Access
ionNo. D64170及びD64173）。これらのうち、本発明は
６ｂの判定を可能にするプライマーをも提供するもので
あり、６ｂには、ＶＮ７８７(GenBank Accession No.D1
7486)、ＶＮ８４３(GenBank Accession No. D17489)、
ＶＮ５４０ (GenBankAccession No. D14209) 、Ｂ５及
びＢ７株(GenBank Accession No. D64170 及びD64173)
が含まれる。
【００１１】上述のように、本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、配列表の配列番号１〜３０、４７、４８、６６〜
６９で示されるものである。これらのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして用いる場合に、各プライマーがハ
イブリダイズするＨＣＶゲノム上の領域、該領域のセン
ス鎖又はアンチセンス鎖の別、そのプライマーによって
判別できる型及び本願発明者らが便宜的に付したプライ
マー名を下記表１に示す。
ドは、配列表の配列番号１〜３０、４７、４８、６６〜
６９で示されるものである。これらのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして用いる場合に、各プライマーがハ
イブリダイズするＨＣＶゲノム上の領域、該領域のセン
ス鎖又はアンチセンス鎖の別、そのプライマーによって
判別できる型及び本願発明者らが便宜的に付したプライ
マー名を下記表１に示す。
【００１２】
【表１】 ＊：「センス又はアンチセンス」の表示は、プライマーがハイブリダイズするＤ ＮＡ鎖がセンス鎖かアンチセンス鎖かを示す。
【００１３】なお、上記表１において、「コンセンサ
ス」は、全ての型に共通にハイブリダイズするプライマ
ーである。また、配列番号２において、「Ｎ」はＡ、
Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＩ（イノシン）を示す。
ス」は、全ての型に共通にハイブリダイズするプライマ
ーである。また、配列番号２において、「Ｎ」はＡ、
Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＩ（イノシン）を示す。
【００１４】なお、上記表１における、各ジェノタイプ
のゲノム上の領域の塩基番号の基準となるＨＣＶの株名
及び該塩基番号を記載した文献を下記表２に示す。
のゲノム上の領域の塩基番号の基準となるＨＣＶの株名
及び該塩基番号を記載した文献を下記表２に示す。
【００１５】
【表２】 ＊：１ａのうち、配列番号２５〜２８ 文献１：Ohno, T. et al., Thesis (1993) The University of Tokyo, "Hepatit is C Virus" 文献２：Wu Rong-Rong et al, Journal of Medical Virology (1994, in press) 文献３：Ohno Tomoyoshi et al., Journal of Gastroenterology (1994, in pre ss) 文献４：Ohno Tomoyoshi et al., Journal of Medical Virology 42: 409-413 ( 1994) 文献５：Bukh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8239-8243 (1994) 文献６：Choo, Q.-L., et al, "Genetic organization and diversity of the h epatitis C virus" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2451-2455 (1991)
【００１６】なお、後述のＰＣＲにより増幅されるもの
は二本鎖ｃＤＮＡであるから、上記各オリゴヌクレオチ
ドとそれぞれ相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
同士の組合せをプライマーとして用いても同じ領域が増
幅される。従って、これらの相補的なオリゴヌクレオチ
ドもＨＣＶのジェノタイプ判別のためのプライマーとし
て用いることができ、本発明の範囲内に入る。
は二本鎖ｃＤＮＡであるから、上記各オリゴヌクレオチ
ドとそれぞれ相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
同士の組合せをプライマーとして用いても同じ領域が増
幅される。従って、これらの相補的なオリゴヌクレオチ
ドもＨＣＶのジェノタイプ判別のためのプライマーとし
て用いることができ、本発明の範囲内に入る。
【００１７】上記の各オリゴヌクレオチドは、市販のＤ
ＮＡ合成機を用いた化学合成により容易に調製すること
ができる。
ＮＡ合成機を用いた化学合成により容易に調製すること
ができる。
【００１８】本発明の方法により、検体中のＨＣＶのジ
ェノタイプを分類するためには、先ず、検体中のＨＣＶ
のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡの調
製は、逆転写酵素とプライマーを用いて行うことがで
き、この方法自体は周知であり、その一例が下記実施例
にも記載されている。
ェノタイプを分類するためには、先ず、検体中のＨＣＶ
のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡの調
製は、逆転写酵素とプライマーを用いて行うことがで
き、この方法自体は周知であり、その一例が下記実施例
にも記載されている。
【００１９】次いで、得られたｃＤＮＡを鋳型として、
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
を行う。ＰＣＲの方法自体は、この分野において周知で
あり（Saiki et al., Science, 239, 487-491, 1988)、
センス鎖にハイブリダイズするプライマーとアンチセン
ス鎖にハイブリダイズするプライマーとを用い、これら
のプライマーと鋳型ＤＮＡと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の存在下で、アニーリング、伸長、変性の工程から成る
サイクルを２０回ないし４０回程度繰り返すことにより
行うことができる。ＰＣＲの一例も下記実施例に記載さ
れている。
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
を行う。ＰＣＲの方法自体は、この分野において周知で
あり（Saiki et al., Science, 239, 487-491, 1988)、
センス鎖にハイブリダイズするプライマーとアンチセン
ス鎖にハイブリダイズするプライマーとを用い、これら
のプライマーと鋳型ＤＮＡと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の存在下で、アニーリング、伸長、変性の工程から成る
サイクルを２０回ないし４０回程度繰り返すことにより
行うことができる。ＰＣＲの一例も下記実施例に記載さ
れている。
【００２０】ＰＣＲには常に少なくとも一対のプライマ
ーが必要であり、これらは鋳型ＤＮＡのセンス鎖及びア
ンチセンス鎖にそれぞれハイブリダイズする必要があ
る。従って、判別しようとする型のためのプライマー
（表１参照）を選び、これと反対側の鎖にハイブリダイ
ズするプライマー（コンセンサスプライマー又はその型
のためのプライマー）を選んで上記ＰＣＲを行う。特定
の型を判別するためのプライマーは、その型の鋳型ＤＮ
Ａにのみハイブリダイズし、他の型の鋳型ＤＮＡにはハ
イブリダイズできないので、そのプライマーを用いても
し増幅が起きれば、検体中のＨＣＶがその型のジェノタ
イプであることがわかる。
ーが必要であり、これらは鋳型ＤＮＡのセンス鎖及びア
ンチセンス鎖にそれぞれハイブリダイズする必要があ
る。従って、判別しようとする型のためのプライマー
（表１参照）を選び、これと反対側の鎖にハイブリダイ
ズするプライマー（コンセンサスプライマー又はその型
のためのプライマー）を選んで上記ＰＣＲを行う。特定
の型を判別するためのプライマーは、その型の鋳型ＤＮ
Ａにのみハイブリダイズし、他の型の鋳型ＤＮＡにはハ
イブリダイズできないので、そのプライマーを用いても
し増幅が起きれば、検体中のＨＣＶがその型のジェノタ
イプであることがわかる。
【００２１】もっとも、１対ずつのプライマーを用いて
ジェノタイプ判別を行っていたのでは、１つの検体につ
いてＰＣＲを何回も行わなければならないので、不便で
ある。もし、３種以上のプライマーを同時に用いてＰＣ
Ｒを行い、ジェノタイプに応じて異なるサイズの領域が
増幅されるのであれば、１回のＰＣＲで複数のジェノタ
イプの判別を行うことができるので有利である。本発明
のプライマーは、そのように選択されており、これらを
混合して用いてＰＣＲを行うと、各ジェノタイプに応じ
て異なるサイズの領域が増幅されるように設定されてい
る。
ジェノタイプ判別を行っていたのでは、１つの検体につ
いてＰＣＲを何回も行わなければならないので、不便で
ある。もし、３種以上のプライマーを同時に用いてＰＣ
Ｒを行い、ジェノタイプに応じて異なるサイズの領域が
増幅されるのであれば、１回のＰＣＲで複数のジェノタ
イプの判別を行うことができるので有利である。本発明
のプライマーは、そのように選択されており、これらを
混合して用いてＰＣＲを行うと、各ジェノタイプに応じ
て異なるサイズの領域が増幅されるように設定されてい
る。
【００２２】もっとも、本発明のプライマーを全て混合
してＰＣＲを行うと、後の電気泳動工程において検出す
べきバンドの数が多くなりすぎ、また、近いバンドを識
別して検出する必要があるので、型判別が容易ではなく
なる。もっとも、十分に大きなゲルを用いて時間をかけ
て電気泳動を行えば、近接したサイズのバンドでも離れ
た位置に検出することが可能であるので、全プライマー
を混合して用いることもできる。
してＰＣＲを行うと、後の電気泳動工程において検出す
べきバンドの数が多くなりすぎ、また、近いバンドを識
別して検出する必要があるので、型判別が容易ではなく
なる。もっとも、十分に大きなゲルを用いて時間をかけ
て電気泳動を行えば、近接したサイズのバンドでも離れ
た位置に検出することが可能であるので、全プライマー
を混合して用いることもできる。
【００２３】上述のように、全てのプライマーを混合し
て用いるとかえって不便であるので、３個以上のプライ
マーをセットで用いることが好ましい。この場合、各プ
ライマーセットにはコンセンサスプライマーを１対（セ
ンス及びアンチセンス）含めておくことが好ましい。一
対のコンセンサスプライマーを含めておくと、ＨＣＶが
検体中に存在すれば、そのジェノタイプにかかわらず、
必ず増幅バンド（以下、一対のコンセンサスプライマー
により増幅されたバンドをコンセンサスバンドと言うこ
とがある）が検出されるので、もしも、各ジェノタイプ
特異的プライマーによってバンドが全く検出されなかっ
た場合に、検体がＨＣＶ陰性なのか、検体に含まれるＨ
ＣＶの型が用いたプライマーでは検出できないものであ
るのかを知ることができるので好ましい。さらに、各プ
ライマーセットに１つのジェノタイプを検出するための
プライマーを複数含ませることもできる。このようにす
れば、１つのプライマーが増幅に失敗したとしても、同
じジェノタイプを検出する他のプライマーでうまく複製
が起きれば、そのジェノタイプを検出することができる
ので、判定の確実性を高めることができる。
て用いるとかえって不便であるので、３個以上のプライ
マーをセットで用いることが好ましい。この場合、各プ
ライマーセットにはコンセンサスプライマーを１対（セ
ンス及びアンチセンス）含めておくことが好ましい。一
対のコンセンサスプライマーを含めておくと、ＨＣＶが
検体中に存在すれば、そのジェノタイプにかかわらず、
必ず増幅バンド（以下、一対のコンセンサスプライマー
により増幅されたバンドをコンセンサスバンドと言うこ
とがある）が検出されるので、もしも、各ジェノタイプ
特異的プライマーによってバンドが全く検出されなかっ
た場合に、検体がＨＣＶ陰性なのか、検体に含まれるＨ
ＣＶの型が用いたプライマーでは検出できないものであ
るのかを知ることができるので好ましい。さらに、各プ
ライマーセットに１つのジェノタイプを検出するための
プライマーを複数含ませることもできる。このようにす
れば、１つのプライマーが増幅に失敗したとしても、同
じジェノタイプを検出する他のプライマーでうまく複製
が起きれば、そのジェノタイプを検出することができる
ので、判定の確実性を高めることができる。
【００２４】本願発明者らは、このような点を考慮に入
れて、実際に検体の分析を行う上で極めて好ましいプラ
イマーの組合せを設定することに成功した。下記表３〜
１７にそれらを示す。もっとも、プライマーの組合せ
は、下記具体例に限定されるものではなく、要は、各ジ
ェノタイプを増幅するためのセンス及びアンチセンスプ
ライマーがそれぞれ含まれていればよい。
れて、実際に検体の分析を行う上で極めて好ましいプラ
イマーの組合せを設定することに成功した。下記表３〜
１７にそれらを示す。もっとも、プライマーの組合せ
は、下記具体例に限定されるものではなく、要は、各ジ
ェノタイプを増幅するためのセンス及びアンチセンスプ
ライマーがそれぞれ含まれていればよい。
【００２５】(1) プライマーセット１（１ｂ、２ａ、２
ｂ、３ｂの型判別用）
ｂ、３ｂの型判別用）
【表３】
【００２６】(2) プライマーセット２（１ａ、３ａ、４
ａ、５ａ、６ａの型判別用）
ａ、５ａ、６ａの型判別用）
【表４】
【００２７】(3) プライマーセット３（１ｂ、２ａ、２
ｂの型判別用）
ｂの型判別用）
【表５】
【００２８】(4) プライマーセット４（１ａの型判別
用）
用）
【表６】
【００２９】(5) プライマーセット５（１ａ、１ｂ、２
ａ、２ｂの型判別用）
ａ、２ｂの型判別用）
【表７】
【００３０】(6) プライマーセット６（１ａ、１ｂの型
判別用）
判別用）
【表８】
【００３１】(7) プライマーセット７（１ｂ、２ａ、２
ｂの型判別用）
ｂの型判別用）
【表９】
【００３２】(8) プライマーセット８（１ｂ、２ａ、２
ｂ、３ｂの型判別用）
ｂ、３ｂの型判別用）
【表１０】 （なお、ＯＭＭ３ｂはＯＭＭ１５の配列を限定したもの
で、その塩基配列は配列表の配列番号４２に示されてい
る）。
で、その塩基配列は配列表の配列番号４２に示されてい
る）。
【００３３】(9) プライマーセット９（１ａ、３ａ、４
ａ、５ａの型判別用）
ａ、５ａの型判別用）
【表１１】 （なお、ＯＭＭ１ａＳ、ＯＭＭ１ａＡ、ＯＭＭ３ａ、Ｏ
ＭＭ４ａ及びＯＭＭ５ａは、それぞれＯＭＭ２１、ＯＭ
Ｍ２１１、ＯＭＭ２３、ＯＭＭ２４及びＯＭＭ２５の塩
基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列
番号４５、４６、４１、４３及び４４にそれぞれ示され
ている。）
ＭＭ４ａ及びＯＭＭ５ａは、それぞれＯＭＭ２１、ＯＭ
Ｍ２１１、ＯＭＭ２３、ＯＭＭ２４及びＯＭＭ２５の塩
基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列
番号４５、４６、４１、４３及び４４にそれぞれ示され
ている。）
【００３４】(10)プライマーセット１０（１ａ、３ａ、
４ａ、５ａ、６ａの型判別用）
４ａ、５ａ、６ａの型判別用）
【表１２】
【００３５】(11)プライマーセット１１（１ａ、３ａ、
４ａ、５ａ、６ａの型判別用）
４ａ、５ａ、６ａの型判別用）
【表１３】 （なお、ＯＭＭ２１ＴＣＳは、ＯＭＭ２１ＴＣの塩基配
列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号
４９に示されている）。
列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号
４９に示されている）。
【００３６】(12)プライマーセット１２（１ｂ、２ａ、
２ｂの型判別用）
２ｂの型判別用）
【表１４】 （なお、ＯＭＭ１ｂ、ＯＭＭ２ａＳ、ＯＭＭ２ａＡ及び
ＯＭＭ２ｂは、それぞれＯＭＭ１１、ＯＭＭ１２１、Ｏ
ＭＭ１３及びＯＭＭ１４の塩基配列を限定したもので、
その塩基配列は配列表の配列番号６２、６３、６４及び
６５にそれぞれ示されている）。
ＯＭＭ２ｂは、それぞれＯＭＭ１１、ＯＭＭ１２１、Ｏ
ＭＭ１３及びＯＭＭ１４の塩基配列を限定したもので、
その塩基配列は配列表の配列番号６２、６３、６４及び
６５にそれぞれ示されている）。
【００３７】(13)プライマーセット１３（１ａの型判別
用）
用）
【表１５】 （なお、ＯＭＭ２２Ｃは、ＯＭＭ２２の塩基配列を限定
したもので、その塩基配列は配列表の配列番号３５に示
されている）。
したもので、その塩基配列は配列表の配列番号３５に示
されている）。
【００３８】(14)プライマーセット１４（３ａ、４ａ、
５ａの型判別用）
５ａの型判別用）
【表１６】 （なお、ＯＭＭ５ａは、ＯＭＭ２５の塩基配列を限定し
たもので、その塩基配列は配列表の配列番号４５に示さ
れている）。
たもので、その塩基配列は配列表の配列番号４５に示さ
れている）。
【００３９】(15)プライマーセット１５（３ｂ、６ａ、
６ｂの型判別用）
６ｂの型判別用）
【表１７】
【００４０】上記から明らかなように、各プライマーセ
ットを単独で用いたのでは、各表の冒頭に記載したジェ
ノタイプの検出しか行うことができない。しかしなが
ら、上記のプライマーセットの複数を別個に用いて各検
体についてＰＣＲを行うことにより、より多くのジェノ
タイプの判別を行うことができる。例えば、上記プライ
マーセット１及び２を別個に用いてＰＣＲを行うことに
より、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、５
ａ及び６ａのジェノタイプを判別することができる。
ットを単独で用いたのでは、各表の冒頭に記載したジェ
ノタイプの検出しか行うことができない。しかしなが
ら、上記のプライマーセットの複数を別個に用いて各検
体についてＰＣＲを行うことにより、より多くのジェノ
タイプの判別を行うことができる。例えば、上記プライ
マーセット１及び２を別個に用いてＰＣＲを行うことに
より、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、５
ａ及び６ａのジェノタイプを判別することができる。
【００４１】下記実施例に記載するように、上記の各プ
ライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動
パターンが図１ないし図１５に示されている。
ライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動
パターンが図１ないし図１５に示されている。
【００４２】次いで、ＰＣＲにより増幅された増幅産物
を検出する。増幅産物の検出は、ゲル電気泳動により行
うことが好ましい。ＤＮＡのゲル電気泳動による分離、
検出方法は、この分野において周知であり、また、一例
が下記実施例に記載されている。
を検出する。増幅産物の検出は、ゲル電気泳動により行
うことが好ましい。ＤＮＡのゲル電気泳動による分離、
検出方法は、この分野において周知であり、また、一例
が下記実施例に記載されている。
【００４３】なお、ジェノタイプ特異的プライマーを用
いる増幅に先立ち、一対のコンセンサスプライマーを用
いてＰＣＲにより増幅し、次いで、ジェノタイプ特異的
プライマー（例えば、上記プライマーセット）を用いて
ＰＣＲを行うことにより、分析の感度をさらに高めるこ
とができる。好ましいプライマーとして、ＯＭＭ１とＯ
ＭＭ２の組合せを挙げることができる。
いる増幅に先立ち、一対のコンセンサスプライマーを用
いてＰＣＲにより増幅し、次いで、ジェノタイプ特異的
プライマー（例えば、上記プライマーセット）を用いて
ＰＣＲを行うことにより、分析の感度をさらに高めるこ
とができる。好ましいプライマーとして、ＯＭＭ１とＯ
ＭＭ２の組合せを挙げることができる。
【００４４】なお、上記本発明のオリゴヌクレオチド
は、プライマーとしてのみならず、適当な標識を付すこ
とにより、ＨＣＶジェノタイプ判別用のプローブとして
用いることも可能である。この場合には、上記各オリゴ
ヌクレオチドよりも延長されたものであってよく、特に
３’末端方向に数塩基延長されたものでもよい。
は、プライマーとしてのみならず、適当な標識を付すこ
とにより、ＨＣＶジェノタイプ判別用のプローブとして
用いることも可能である。この場合には、上記各オリゴ
ヌクレオチドよりも延長されたものであってよく、特に
３’末端方向に数塩基延長されたものでもよい。
【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダ
イズするＨＣＶゲノムの領域には、各ジェノタイプに特
異的なアミノ酸配列を有するペプチドをコードするもの
がある。従って、それらのアミノ酸配列と特異的に反応
する抗体をＨＣＶと反応させることにより、検体中に含
まれるＨＣＶの型判別を直接的に行うことができる。ま
た、それらのアミノ酸配列を含むペプチドを血清等の体
液と反応させることにより、該体液中に含まれる、各Ｈ
ＣＶジェノタイプに特異的な抗体を検出することがで
き、それによって、ＨＣＶの型判別を行うことができ
る。これらは、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡや放射
免疫測定法、ラテックス凝集法等の周知のイムノアッセ
イにより容易に行うことができる。
イズするＨＣＶゲノムの領域には、各ジェノタイプに特
異的なアミノ酸配列を有するペプチドをコードするもの
がある。従って、それらのアミノ酸配列と特異的に反応
する抗体をＨＣＶと反応させることにより、検体中に含
まれるＨＣＶの型判別を直接的に行うことができる。ま
た、それらのアミノ酸配列を含むペプチドを血清等の体
液と反応させることにより、該体液中に含まれる、各Ｈ
ＣＶジェノタイプに特異的な抗体を検出することがで
き、それによって、ＨＣＶの型判別を行うことができ
る。これらは、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡや放射
免疫測定法、ラテックス凝集法等の周知のイムノアッセ
イにより容易に行うことができる。
【００４６】本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダ
イズする領域のＨＣＶゲノムがコードする各ジェノタイ
プに特異的なアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０〜
６１に示されており、各オリゴヌクレオチドの名称、該
アミノ酸配列（配列番号で示す）及び該アミノ酸配列に
特異的なＨＣＶジェノタイプを下記表１８に示す。
イズする領域のＨＣＶゲノムがコードする各ジェノタイ
プに特異的なアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０〜
６１に示されており、各オリゴヌクレオチドの名称、該
アミノ酸配列（配列番号で示す）及び該アミノ酸配列に
特異的なＨＣＶジェノタイプを下記表１８に示す。
【００４７】
【表１８】
【００４８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。なお、下記実施例において用いたプラ
イマーは、そのプライマーを示す配列表に記載された配
列中に複数の塩基を示す記号が用いられている場合に
は、それらの記号により示される塩基の混合物を用い
た。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。なお、下記実施例において用いたプラ
イマーは、そのプライマーを示す配列表に記載された配
列中に複数の塩基を示す記号が用いられている場合に
は、それらの記号により示される塩基の混合物を用い
た。
【００４９】実施例１ (1) 試料の調製 ＨＣＶキャリアの血清１００μｌ（２１３検体）をＲＮ
ＡｚｏｌＢ（商品名、ｂｉｏｔｅｘ ｉｎｃ．，ＵＳ
Ａ）９００μｌ及びクロロホルム１５０μｌと混合し、
５秒間攪拌し、−２０℃で５分間インキュベートした。
次いで、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を５０
０μｌのイソプロパノール及び２０μｇのグリコーゲン
と混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。次
いで、これを１２０００ｒｐｍで２０分間遠心した。沈
殿に７５％エタノールを１ｍｌ加え、懸濁後、１２００
０ｒｐｍで３分間遠心した。この７５％エタノール処理
〜遠心操作をさらに２回行い、沈殿をデシケーター中で
１５分間乾燥させ、精製されたＲＮＡを得た。
ＡｚｏｌＢ（商品名、ｂｉｏｔｅｘ ｉｎｃ．，ＵＳ
Ａ）９００μｌ及びクロロホルム１５０μｌと混合し、
５秒間攪拌し、−２０℃で５分間インキュベートした。
次いで、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を５０
０μｌのイソプロパノール及び２０μｇのグリコーゲン
と混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。次
いで、これを１２０００ｒｐｍで２０分間遠心した。沈
殿に７５％エタノールを１ｍｌ加え、懸濁後、１２００
０ｒｐｍで３分間遠心した。この７５％エタノール処理
〜遠心操作をさらに２回行い、沈殿をデシケーター中で
１５分間乾燥させ、精製されたＲＮＡを得た。
【００５０】(2) プライマーの調製 オリゴヌクレオチド（プライマー）は、Model 394 DNA
シンセサイザ（商品名、Perkin-Elmer Corporation) 又
は8909 expedite (TM) Nucleic Acid synthesis system
（商品名、Milipore Corporation) で合成した。さら
に、ＯＰＣカラム又はＨＰＬＣを用いて常法により精製
した。
シンセサイザ（商品名、Perkin-Elmer Corporation) 又
は8909 expedite (TM) Nucleic Acid synthesis system
（商品名、Milipore Corporation) で合成した。さら
に、ＯＰＣカラム又はＨＰＬＣを用いて常法により精製
した。
【００５１】(3) ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡ合成は、精製乾燥したＲＮＡを１５μｌのＤＥ
ＰＣ処理水（Milli-Qreagent water system（ミリポア
社製）で精製した水に０．２％になるようにジエチルピ
ロカーボネートを加え、１６時間攪拌し、さらに高温高
圧滅菌（オートクレーブ）処理した水）に溶解し、６０
℃で５分加温後、１００単位のモロニーネズミウイルス
逆転写酵素（Molony murine virus reverse transcript
ase 、商品名；GIBCO-BRL, USA) を含む逆転写溶液（５
０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.3) 、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ MgCl2 、１０ｍＭジチオスレイトール）を１５μｌ
加え、４２℃で６０分加温し行った。なお、ｃＤＮＡ合
成のためのプライマーとしては、ＯＭＭ２を１０ｐｍｏ
ｌ用いた。
ＰＣ処理水（Milli-Qreagent water system（ミリポア
社製）で精製した水に０．２％になるようにジエチルピ
ロカーボネートを加え、１６時間攪拌し、さらに高温高
圧滅菌（オートクレーブ）処理した水）に溶解し、６０
℃で５分加温後、１００単位のモロニーネズミウイルス
逆転写酵素（Molony murine virus reverse transcript
ase 、商品名；GIBCO-BRL, USA) を含む逆転写溶液（５
０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.3) 、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍ
Ｍ MgCl2 、１０ｍＭジチオスレイトール）を１５μｌ
加え、４２℃で６０分加温し行った。なお、ｃＤＮＡ合
成のためのプライマーとしては、ＯＭＭ２を１０ｐｍｏ
ｌ用いた。
【００５２】(4) ＰＣＲ 検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、コンセ
ンサスプライマーＯＭＭ１及びＯＭＭ２を用いて上記ｃ
ＤＮＡをＰＣＲ増幅（Saiki ら、Science 239,481-491,
1988) した。反応溶液は１０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.
3)、１．５ｍＭＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、８００
μＭ ｄＮＴＰ、１．２５単位のAmpliTaq DNA polymer
ase （商品名、日本ROCHE)、プライマーＯＭＭ１、ＯＭ
Ｍ２がそれぞれ５ｐｍｏｌで行った。ＰＣＲ条件はサイ
クル３５、変性９４℃、３０秒、アニール５０℃、３０
秒、伸長７２℃、１分で行った。さらに増幅産物を上記
プライマーセット１、２、３又は４でそれぞれ２回目の
ＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル２５、変性９４℃、３０
秒、アニール６２℃、３０秒、伸長７２℃、１分）を行
った。
ンサスプライマーＯＭＭ１及びＯＭＭ２を用いて上記ｃ
ＤＮＡをＰＣＲ増幅（Saiki ら、Science 239,481-491,
1988) した。反応溶液は１０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.
3)、１．５ｍＭＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、８００
μＭ ｄＮＴＰ、１．２５単位のAmpliTaq DNA polymer
ase （商品名、日本ROCHE)、プライマーＯＭＭ１、ＯＭ
Ｍ２がそれぞれ５ｐｍｏｌで行った。ＰＣＲ条件はサイ
クル３５、変性９４℃、３０秒、アニール５０℃、３０
秒、伸長７２℃、１分で行った。さらに増幅産物を上記
プライマーセット１、２、３又は４でそれぞれ２回目の
ＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル２５、変性９４℃、３０
秒、アニール６２℃、３０秒、伸長７２℃、１分）を行
った。
【００５３】(5) 電気泳動 得られた増幅産物を、アガロースゲル（トリス−ボレー
トバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電
気泳動（１５０Ｖ低電流）した。電気泳動後、紫外線照
射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を
行った。バンド移動度の差異により型判定を行った。
トバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電
気泳動（１５０Ｖ低電流）した。電気泳動後、紫外線照
射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を
行った。バンド移動度の差異により型判定を行った。
【００５４】(6) 結果 各プライマーセット１、２、３及び４を用いて得られた
電気泳動パターンをそれぞれ図１、２、３及び４に示
す。各図において、一番左側のレーンは分子量マーカー
の泳動パターンを示す。また、各レーン中、コンセンサ
スバンドは、各プライマーセットに含まれるコンセンサ
スプライマーにより増幅された増幅産物のバンドであ
り、検体中にＨＣＶが存在すれば、そのジェノタイプに
関係なく、常に一定の位置に現れるものである。各ジェ
ノタイプに特有のバンドの右側には短い矢印を付して示
した。この矢印で示されるバンドが検出されれば、その
検体のＨＣＶジェノタイプは、そのバンドのあるレーン
の頂部に記載された型のジェノタイプである。各図から
明らかなように、本発明のプライマーを用いることによ
り、ＨＣＶのジェノタイプの分類を国際統一分類に従っ
て行うことができることが確認された。
電気泳動パターンをそれぞれ図１、２、３及び４に示
す。各図において、一番左側のレーンは分子量マーカー
の泳動パターンを示す。また、各レーン中、コンセンサ
スバンドは、各プライマーセットに含まれるコンセンサ
スプライマーにより増幅された増幅産物のバンドであ
り、検体中にＨＣＶが存在すれば、そのジェノタイプに
関係なく、常に一定の位置に現れるものである。各ジェ
ノタイプに特有のバンドの右側には短い矢印を付して示
した。この矢印で示されるバンドが検出されれば、その
検体のＨＣＶジェノタイプは、そのバンドのあるレーン
の頂部に記載された型のジェノタイプである。各図から
明らかなように、本発明のプライマーを用いることによ
り、ＨＣＶのジェノタイプの分類を国際統一分類に従っ
て行うことができることが確認された。
【００５５】実施例２ ｃＤＮＡ増幅の際に用いるプライマーとしてランダムヘ
キサマーオリゴヌクレオチドを用い、１回目のＰＣＲに
ＯＭＭ１、ＯＭＭ２及びＯＭＭ３をプライマーとして用
い、２回目のＰＣＲにプライマーセット５を用い、か
つ、プライマー濃度が１０ｐｍｏｌであることを除き、
実施例１と同様に行った。得られた電気泳動パターンを
図５に示す。
キサマーオリゴヌクレオチドを用い、１回目のＰＣＲに
ＯＭＭ１、ＯＭＭ２及びＯＭＭ３をプライマーとして用
い、２回目のＰＣＲにプライマーセット５を用い、か
つ、プライマー濃度が１０ｐｍｏｌであることを除き、
実施例１と同様に行った。得られた電気泳動パターンを
図５に示す。
【００５６】比較例１ 上記の２１３検体を、特開平５−３０１８８７号に記載
の方法により型判別を行った。その結果、上記本発明の
実施例により型判別可能であった２２検体（２ａ型２０
例、２ｂ型２例）について、どのプライマーを用いても
増幅が起きなかった（ＨＣＶ陰性）。なお、上記２１３
検体は全て、５’非翻訳領域に設定したプライマーＹＣ
Ｓ、ＹＣＳ２及びＭＳ１３を用いたＰＣＲ（特願平６−
１４２５６４号の第４０段落に記載）により、ＨＣＶ陽
性であることを各検体について３回確認しているＨＣＶ
陽性検体である。
の方法により型判別を行った。その結果、上記本発明の
実施例により型判別可能であった２２検体（２ａ型２０
例、２ｂ型２例）について、どのプライマーを用いても
増幅が起きなかった（ＨＣＶ陰性）。なお、上記２１３
検体は全て、５’非翻訳領域に設定したプライマーＹＣ
Ｓ、ＹＣＳ２及びＭＳ１３を用いたＰＣＲ（特願平６−
１４２５６４号の第４０段落に記載）により、ＨＣＶ陽
性であることを各検体について３回確認しているＨＣＶ
陽性検体である。
【００５７】実施例３、４ 塩基配列を決定したＨＣＶ株１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂそ
れぞれ５例ずつの血清から実施例１と同様にしてＲＮＡ
を抽出し、ＯＭＭ２のうち配列番号３１で示される塩基
配列を有するものを用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ合
成を行った。
れぞれ５例ずつの血清から実施例１と同様にしてＲＮＡ
を抽出し、ＯＭＭ２のうち配列番号３１で示される塩基
配列を有するものを用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ合
成を行った。
【００５８】次いで、ＯＭＭ２のうち配列番号３１で示
される配列を有するものと、ＯＭＭ１のうち配列番号３
２で示される塩基配列を有するものとをプライマーとし
て用い、１回目のＰＣＲを９４℃、３０秒、５０℃、３
０秒、７２℃、６０秒のサイクルで３５サイクル行っ
た。その５０分の１（１μｌ）をさらにＰＣＲで増幅し
た。この２回目のＰＣＲは、上記プライマーセット６
（実施例３）又はプライマーセット７（実施例４）を用
いて行った。もっとも、各プライマーセット中、ＯＭＭ
２１、ＯＭＭ２１１、ＯＭＭ２２、ＯＭＭ１１、ＯＭＭ
１２、ＯＭＭ１３及びＯＭＭ１４は、それぞれ、配列番
号３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９で示さ
れる塩基配列を有するものを用いた。２回目のＰＣＲは
９４℃、３０秒、６２℃、３０秒、７２℃、６０秒のサ
イクルで２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を実施例１と
同様にアガロース電気泳動で分離した。得られた電気泳
動パターンをそれぞれ図６及び図７に示す。
される配列を有するものと、ＯＭＭ１のうち配列番号３
２で示される塩基配列を有するものとをプライマーとし
て用い、１回目のＰＣＲを９４℃、３０秒、５０℃、３
０秒、７２℃、６０秒のサイクルで３５サイクル行っ
た。その５０分の１（１μｌ）をさらにＰＣＲで増幅し
た。この２回目のＰＣＲは、上記プライマーセット６
（実施例３）又はプライマーセット７（実施例４）を用
いて行った。もっとも、各プライマーセット中、ＯＭＭ
２１、ＯＭＭ２１１、ＯＭＭ２２、ＯＭＭ１１、ＯＭＭ
１２、ＯＭＭ１３及びＯＭＭ１４は、それぞれ、配列番
号３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９で示さ
れる塩基配列を有するものを用いた。２回目のＰＣＲは
９４℃、３０秒、６２℃、３０秒、７２℃、６０秒のサ
イクルで２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を実施例１と
同様にアガロース電気泳動で分離した。得られた電気泳
動パターンをそれぞれ図６及び図７に示す。
【００５９】実施例５〜８ 上記プライマーセット８（実施例５）、プライマーセッ
ト９（実施例６）、プライマーセット１０（実施例７）
又はプライマーセット１１（実施例８）を用いて２回目
のＰＣＲを行うことを除き、実施例３及び４と同様な操
作を行った。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図
８、図９、図１０及び図１１に示す。
ト９（実施例６）、プライマーセット１０（実施例７）
又はプライマーセット１１（実施例８）を用いて２回目
のＰＣＲを行うことを除き、実施例３及び４と同様な操
作を行った。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図
８、図９、図１０及び図１１に示す。
【００６０】実施例９〜１２ 血清は２００例のＣ型慢性肝炎患者由来のものを用い
た。ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌＢ（商品名；ＢｉｏＬａ
ｂ）で血清１５０μl より調整した。ｃＤＮＡ合成は、
300ng のランダムヘキサマー（商品名；ギブコＢＲ
Ｌ）、１００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ（商品名；ギブコＢＲ
Ｌ）、５０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（商品名；宝酒
造）を用い、３０μl の系で１時間、３７゜Ｃでインキ
ュベーションした。ｃＤＮＡ１０μl を、上記１ｓｔ−
ＰＣＲ用プライマーＯＭＭ１、２、３各１００ｎｇを用
い、５０μl の系で、９４゜Ｃ、２０秒、５０゜Ｃ、２
０秒、７２゜Ｃ、４５秒、３５回でＰＣＲを行った。そ
の１μl をそれぞれの型判別用プライマーセット１２
（実施例９）、１３（実施例１０）、１４（実施例１
１）、１５（実施例１２）で２ｎｄ−ＰＣＲを行った。
条件は９４゜Ｃ、２０秒、６２゜Ｃ、２０秒、７２゜
Ｃ、４５秒、２５回で増幅バンドを３％アガロース(0.5
% EtBr 含む）電気泳動（１５０Ｖ、３０分）でＤＮＡ
サイズマーカー、φX174/HaeIII digest（商品名；東洋
紡）で検出されるバンドと比較しジェノタイプを判定し
た。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図１２、図１
３、図１４及び図１５に示す。
た。ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌＢ（商品名；ＢｉｏＬａ
ｂ）で血清１５０μl より調整した。ｃＤＮＡ合成は、
300ng のランダムヘキサマー（商品名；ギブコＢＲ
Ｌ）、１００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ（商品名；ギブコＢＲ
Ｌ）、５０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（商品名；宝酒
造）を用い、３０μl の系で１時間、３７゜Ｃでインキ
ュベーションした。ｃＤＮＡ１０μl を、上記１ｓｔ−
ＰＣＲ用プライマーＯＭＭ１、２、３各１００ｎｇを用
い、５０μl の系で、９４゜Ｃ、２０秒、５０゜Ｃ、２
０秒、７２゜Ｃ、４５秒、３５回でＰＣＲを行った。そ
の１μl をそれぞれの型判別用プライマーセット１２
（実施例９）、１３（実施例１０）、１４（実施例１
１）、１５（実施例１２）で２ｎｄ−ＰＣＲを行った。
条件は９４゜Ｃ、２０秒、６２゜Ｃ、２０秒、７２゜
Ｃ、４５秒、２５回で増幅バンドを３％アガロース(0.5
% EtBr 含む）電気泳動（１５０Ｖ、３０分）でＤＮＡ
サイズマーカー、φX174/HaeIII digest（商品名；東洋
紡）で検出されるバンドと比較しジェノタイプを判定し
た。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図１２、図１
３、図１４及び図１５に示す。
【００６１】実施例１３ １１カ国のＣ型慢性肝炎患者由来の血清を用いて、ＨＣ
Ｖの型判別を行った。この検査は具体的には次のように
行った。
Ｖの型判別を行った。この検査は具体的には次のように
行った。
【００６２】（１）試料の調製等は、実施例１と同様に
行い、ｃＤＮＡ合成は、プライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ
２、ＯＭＭ３及び、ランダムヘキサマー（商品名；ギブ
コＢＲＬ）を使用した。
行い、ｃＤＮＡ合成は、プライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ
２、ＯＭＭ３及び、ランダムヘキサマー（商品名；ギブ
コＢＲＬ）を使用した。
【００６３】（２）ＰＣＲ 検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、コンセ
ンサスプライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ２およびＯＭＭ３を
用いて上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。さらに増幅産物
を下記表１９〜２２に示すプライマーセットＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄでそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル
２５、変性９４℃、１５秒、アニール６２℃、１５秒、
伸長７２℃、４５秒）をおこなった。
ンサスプライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ２およびＯＭＭ３を
用いて上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。さらに増幅産物
を下記表１９〜２２に示すプライマーセットＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄでそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル
２５、変性９４℃、１５秒、アニール６２℃、１５秒、
伸長７２℃、４５秒）をおこなった。
【００６４】プライマーセット １）プライマーセットＡ（１ｂ、２ａ、２ｂの型判別
用）
用）
【表１９】
【００６５】２）プライマーセットＢ（１ａの型判別
用）
用）
【表２０】
【００６６】３）プライマーセットＣ（３ａ、５ａ、４
の型判別用）
の型判別用）
【表２１】
【００６７】４）プライマーセットＤ（３ｂ、６ａ、６
ｂの型判別用）
ｂの型判別用）
【表２２】
【００６８】（３）電気泳動 得られた増幅産物を、３％アガロースゲル（トリス−ボ
レートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）
で電気泳動（１５０Ｖ定電流）した。電気泳動後、紫外
線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮
影を行った。バンド移動度の差異により型判定を行っ
た。
レートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）
で電気泳動（１５０Ｖ定電流）した。電気泳動後、紫外
線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮
影を行った。バンド移動度の差異により型判定を行っ
た。
【００６９】上記の方法において、各プライマーセット
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれについて得られた電気泳動
パターンを図１６ないし図１９にそれぞれ示す。また、
上記方法により判別された型を有する人数を地域別に下
記表２３に示す。
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれについて得られた電気泳動
パターンを図１６ないし図１９にそれぞれ示す。また、
上記方法により判別された型を有する人数を地域別に下
記表２３に示す。
【００７０】
【表１９】 ＊：パキスタン／バングラデシュ
【００７１】
【発明の効果】本発明により、ＨＣＶのジェノタイプを
国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便に分類す
るために用いることができる新規なオリゴヌクレオチ
ド、それからなるプライマー及びそれを用いるＨＣＶの
ジェノタイプの判別方法が提供された。
国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便に分類す
るために用いることができる新規なオリゴヌクレオチ
ド、それからなるプライマー及びそれを用いるＨＣＶの
ジェノタイプの判別方法が提供された。
【００７２】
配列番号１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 配列 CCGGGAGGTC TCGTAGACCG TGCANCATG 29
【００７３】配列番号２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列 SARNSCVCAY GTDAGGGTAT CGATGA 26
【００７４】配列番号３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CYTRCCCYCG KGYYGGBKAR 20
【００７５】配列番号４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AHRCYMACCG TCGCCCACAA 20
【００７６】配列番号５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 TAHRCYMACC GTCGCCCACA A 21
【００７７】配列番号６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CRCGYGGCTK GGAYCGCHMC 20
【００７８】配列番号７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GGCCCCAAKT AGGMCGAGAC 20
【００７９】配列番号８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CGCTCGGAAG TYTTACGTAC 20
【００８０】配列番号９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CGGTCGCARC CTCGWGGHAB A 21
【００８１】配列番号１０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CGYGCGCACA CCCAATCHA 19
【００８２】配列番号１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 ATGACCTTAC CCAVRTTRCG 20
【００８３】配列番号１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCCAGGAYCG GCCKTCGCTC 20
【００８４】配列番号１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCCGGRAAYT TWACRTCCAT 20
【００８５】配列番号１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 TAAYACCAAC CGYCGCCCMA T 21
【００８６】配列番号１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GARCCTCGRG GGGAGAGCWA 20
【００８７】配列番号１６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 GTGGGCAGGG TGGMTGCNC 19
【００８８】配列番号１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AGACCGTGCA CCATGAGCAC 20
【００８９】配列番号１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 TATCCGGGCT GAGCCCAGTG 20
【００９０】配列番号１９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 GCCATGTGCG AGCGCAGCC 19
【００９１】配列番号２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CTTTGGGCGG CGTCGCGGCT 20
【００９２】配列番号２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CGCCAGCCCC AGGGCAGGCA 20
【００９３】配列番号２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AATTGATCCC GTCCTCGACT 20
【００９４】配列番号２３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 RAARATAGAR AARGAGCAAC C 21
【００９５】配列番号２４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 配列 AAYGAGCAAC CRGGNADTTC CCYGTTGC 28
【００９６】配列番号２５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CCGCRYGGCC ATCARGTCC 19
【００９７】配列番号２６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 GCTTTATGTT GGGGGCCCTC TT 22
【００９８】配列番号２７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 TTACCACAGC TRGTTGTCAG T 21
【００９９】配列番号２８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列 TCGACAGGCK GCCCGGGCCT TGAT 24
【０１００】配列番号２９ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 配列 GGVSCGCCNA CGADVGGDAT GTAYCCCATG AG 32
【０１０１】配列番号３０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列 GAGCGGTCGC ARCCTCGWSK H 21
【０１０２】配列番号３１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列 GAAGCCGCAY GTRAGGGTAT CGATGA 26
【０１０３】配列番号３２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 配列 CCGGGAGGTC TCGTAGACCG TGCACCATG 29
【０１０４】配列番号３３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CGGTCGCAAC CTCGAGGTAG A 21
【０１０５】配列番号３４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CGCGCGCACA CCCAATCCA 19
【０１０６】配列番号３５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 ATGACCTTAC CCAAATTGCG 20
【０１０７】配列番号３６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCTGCCCTCG GGTTGGCTAG 20
【０１０８】配列番号３７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 ACACTAACCG TCGCCCACAA 20
【０１０９】配列番号３８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CGCGTGGCTG GGATCGCTAC 20
【０１１０】配列番号３９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GGCCCCAATT AGGMCGAGAC 20
【０１１１】配列番号４０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GGCCCCAAGT AGGACGAGAC 20
【０１１２】配列番号４１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCCAGGACCG GCCTTCGCTC 20
【０１１３】配列番号４２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CGCTCGGAAG TCTTACGTAC 20
【０１１４】配列番号４３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCCGGGAACT TAACGTCCAT 20
【０１１５】配列番号４４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GAACCTCGGG GGGAGAGCAA 20
【０１１６】配列番号４５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CGGTCGCAAC CTCGAGGTAG A 21
【０１１７】配列番号４６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CGCGCGCACA CCCAATCCA 19
【０１１８】配列番号４７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GGTCATTGGG GCCCCAATGT 20
【０１１９】配列番号４８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AGCGGTCGCA RCCTCSWSGH 20
【０１２０】配列番号４９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AGCGGTCGCA ACCTCGAGGY 20
【０１２１】配列番号５０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 7
【０１２２】配列番号５１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg 7
【０１２３】配列番号５２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg 7
【０１２４】配列番号５３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列 Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly 8
【０１２５】配列番号５４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln 7
【０１２６】配列番号５５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列 Gly Ser Arg Pro Thr Trp Gly Pro 8
【０１２７】配列番号５６ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Arg Lys Thr Ser Gln Arg 7
【０１２８】配列番号５７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Met Asp Val Lys Phe Pro Gly 7
【０１２９】配列番号５８ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 配列 Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Met 8
【０１３０】配列番号５９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser 7
【０１３１】配列番号６０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu 7
【０１３２】配列番号６１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 配列 Pro His Trp Gly Pro Asn Asp 7
【０１３３】配列番号６２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CCTGCCCTCG GGTTGGCTAR 20
【０１３４】配列番号６３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 TACACTAACC GTCGCCCACA A 21
【０１３５】配列番号６４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CACGTGGCTG GGATCGCTCC 20
【０１３６】配列番号６５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GGCCCCAATT AGGACGAGAC 20
【０１３７】配列番号６６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 GAGCGGTCGC AACCTCCAGG Y 21
【０１３８】配列番号６７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 ACCCGGGAAC TTAACGTCCA T 21
【０１３９】配列番号６８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CCGCTCGGAA GTCTTACGTA C 21
【０１４０】配列番号６９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CCCAGGTACG GCCCGTTTG 19
【図１】プライマーセット１を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図２】プライマーセット２を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図３】プライマーセット３を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図４】プライマーセット４を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図５】プライマーセット５を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図６】プライマーセット６を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図７】プライマーセット７を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図８】プライマーセット８を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図９】プライマーセット９を用いてＰＣＲを行って得
られた電気泳動パターンの模式図である。
られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１０】プライマーセット１０を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１１】プライマーセット１１を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１２】プライマーセット１２を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１３】プライマーセット１３を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１４】プライマーセット１４を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１５】プライマーセット１５を用いてＰＣＲを行っ
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
て得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１６】プライマーセットＡを用いてＰＣＲを行って
得られた電気泳動パターンの模式図である。
得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１７】プライマーセットＢを用いてＰＣＲを行って
得られた電気泳動パターンの模式図である。
得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１８】プライマーセットＣを用いてＰＣＲを行って
得られた電気泳動パターンの模式図である。
得られた電気泳動パターンの模式図である。
【図１９】プライマーセットＤを用いてＰＣＲを行って
得られた電気泳動パターンの模式図である。
得られた電気泳動パターンの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 溝上 雅史 愛知県知立市長田３ー７ー７
Claims (76)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列表の配列番号３で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列表の配列番号４で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列表の配列番号５で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列表の配列番号６で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 配列表の配列番号７で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】 配列表の配列番号８で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 配列表の配列番号９で示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１０で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号１１で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１２】 配列表の配列番号１２で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１３】 配列表の配列番号１３で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１４】 配列表の配列番号１４で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１５】 配列表の配列番号１５で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１６】 配列表の配列番号１６で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１７】 配列表の配列番号１７で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号１８で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１９】 配列表の配列番号１９で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２０】 配列表の配列番号２０で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２１】 配列表の配列番号２１で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２２】 配列表の配列番号２２で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２３】 配列表の配列番号２３で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２４】 配列表の配列番号２４で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２５】 配列表の配列番号２５で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２６】 配列表の配列番号２６で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２７】 配列表の配列番号２７で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２８】 配列表の配列番号２８で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２９】 配列表の配列番号２９で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３０】 配列表の配列番号３０で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３１】 配列表の配列番号３１で示される塩基
配列を有する請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３２】 配列表の配列番号３２で示される塩基
配列を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３３】 配列表の配列番号３３で示される塩基
配列を有する請求項９記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３４】 配列表の配列番号３４で示される塩基
配列を有する請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３５】 配列表の配列番号３５で示される塩基
配列を有する請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３６】 配列表の配列番号３６で示される塩基
配列を有する請求項３記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３７】 配列表の配列番号３７で示される塩基
配列を有する請求項４記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３８】 配列表の配列番号３８で示される塩基
配列を有する請求項６記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３９】 配列表の配列番号３９で示される塩基
配列を有する請求項７記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４０】 配列表の配列番号４０で示される塩基
配列を有する請求項７記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４１】 配列表の配列番号４１で示される塩基
配列を有する請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４２】 配列表の配列番号４２で示される塩基
配列を有する請求項８記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４３】 配列表の配列番号４３で示される塩基
配列を有する請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４４】 配列表の配列番号４４で示される塩基
配列を有する請求項１５記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４５】 配列表の配列番号４５で示される塩基
配列を有する請求項９記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４６】 配列表の配列番号４６で示される塩基
配列を有する請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４７】 配列表の配列番号４７で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４８】 配列表の配列番号４８で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４９】 配列表の配列番号６２で示される塩基
配列を有する請求項３記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５０】 配列表の配列番号６３で示される塩基
配列を有する請求項５記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５１】 配列表の配列番号６４で示される塩基
配列を有する請求項６記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５２】 配列表の配列番号６５で示される塩基
配列を有する請求項３９記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５３】 配列表の配列番号６６で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５４】 配列表の配列番号６７で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５５】 配列表の配列番号６８で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５６】 配列表の配列番号６９で示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５７】 請求項１ないし５６のいずれか１項記
載のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項５８】 請求項１ないし５６のいずれか１項に
記載のオリゴヌクレオチドから成る、Ｃ型肝炎ウイルス
のジェノタイプを判別するためのプライマー。 - 【請求項５９】 検体中のＨＣＶゲノム又はその一部を
鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、該ｃＤＮＡを鋳
型とし、請求項１ないし５６のいずれか１項に記載のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、増
幅されたＤＮＡを検出することから成る、Ｃ型肝炎ウイ
ルスのジェノタイプを判別する方法。 - 【請求項６０】 配列表の配列番号１７、３、４、６、
７、８及び１１に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプ
ライマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方
法。 - 【請求項６１】 配列表の配列番号１７、９、１０、１
２、１３、１５、１８及び１１に記載のオリゴヌクレオ
チドを同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請求
項５９記載の方法。 - 【請求項６２】 配列表の配列番号３、４、６、７、１
７及び１１に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプライ
マーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項６３】 配列表の配列番号９、１７、１１及び
１０を同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請求
項５９記載の方法。 - 【請求項６４】 配列表の配列番号３、４、６、７、
９、１０、１７及び１１に記載のオリゴヌクレオチドを
同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９
記載の方法。 - 【請求項６５】 配列表の配列番号１７、３３、３４、
３５及び３６に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプラ
イマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方
法。 - 【請求項６６】 配列表の配列番号１７、３６、３７、
３８及び３９に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプラ
イマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方
法。 - 【請求項６７】 配列表の配列番号１７、３、４、６、
７及び４２に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプライ
マーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項６８】 配列表の配列番号１７、４５、４６、
４１、４３、４４及び１１に記載のオリゴヌクレオチド
を同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５
９記載の方法。 - 【請求項６９】 配列表の配列番号１７、４６、４５、
４１、４３、４４、４７及び１１に記載のオリゴヌクレ
オチドを同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請
求項５９記載の方法。 - 【請求項７０】 配列表の配列番号１７、４６、４９、
４１、４３、４４、４７及び１１に記載のオリゴヌクレ
オチドを同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行う請
求項５９記載の方法。 - 【請求項７１】 配列表の配列番号１７、６２、６３、
６４及び６５に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプラ
イマーとして用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方
法。 - 【請求項７２】 配列表の配列番号１７、６６及び３５
に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプライマーとして
用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項７３】 配列表の配列番号１７、４１、６７及
び４５に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプライマー
として用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項７４】 配列表の配列番号１７、６８、４７及
び６９に記載のオリゴヌクレオチドを同時にプライマー
として用いてＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項７５】 配列表の配列番号１及び２に記載のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて１回目のＰ
ＣＲを行い、次いで、請求項６０ないし７０のいずれか
１項に記載のオリゴヌクレオチドの組合せを用いて２回
目のＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。 - 【請求項７６】 配列表の配列番号１、２及び２３に記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて１回
目のＰＣＲを行い、次いで、請求項７１ないし７４のい
ずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの組合せを用い
て２回目のＰＣＲを行う請求項５９記載の方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP03887596A JP3940446B2 (ja) | 1995-02-01 | 1996-02-01 | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3599795 | 1995-02-01 | ||
| JP7-352511 | 1995-12-30 | ||
| JP7-35997 | 1995-12-30 | ||
| JP35251195 | 1995-12-30 | ||
| JP03887596A JP3940446B2 (ja) | 1995-02-01 | 1996-02-01 | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2006214160A Division JP3940751B2 (ja) | 1995-02-01 | 2006-08-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234072A true JPH09234072A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3940446B2 JP3940446B2 (ja) | 2007-07-04 |
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ID=27288946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03887596A Expired - Lifetime JP3940446B2 (ja) | 1995-02-01 | 1996-02-01 | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
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-
1996
- 1996-02-01 JP JP03887596A patent/JP3940446B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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