JPH09220214A

JPH09220214A - 細胞機能測定用反応器及び細胞機能測定用キット

Info

Publication number: JPH09220214A
Application number: JP8031972A
Authority: JP
Inventors: Koji Kobayashi; 幸司小林; Kiyoshi Kuriyama; 澄栗山
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 1997-08-26

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の細胞機能測定方法の欠点を解消し、従
来よりも操作が簡単で危険性がなく、精度良く細胞機能
測定できる細胞機能測定用反応器及び細胞機能測定用キ
ットを提供する。【解決手段】血液と接触することにより該血液に、ミ
エロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）又はマトリックスメタ
ロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生を誘導する、中心線
平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、でこぼ
こ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にある凹
凸を表面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が減圧
にされた容器内に、血液と接触可能な状態とされている
ことを特徴とする細胞機能測定用反応器、並びに、上記
細胞機能測定用反応器と誘導されたＭＰＯ又はＭＭＰの
量を定量可能な試薬とからなる細胞機能測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫反応や炎症反
応等に関する細胞機能測定、特に顆粒球、単球、マクロ
ファージなどの貪食細胞機能の測定に用いられる細胞機
能測定用反応器及び細胞機能測定用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ
球等の白血球は、血液中や各臓器、器官において、炎症
反応、免疫反応などの種々の生体防御反応において様々
な役割を担っている。これらの細胞は、感染症；肝炎や
腎炎などの炎症性疾患；慢性関節リウマチや喘息などの
免疫・アレルギー性疾患；癌などの種々の病態において
重要な働きをしており、病態の変動と共にこれらの細胞
の機能が抑制されたり、増強されたりすることが知られ
ている。

【０００３】また、これらの疾患の治療に、抗炎症剤、
免疫抑制剤、免疫増強剤、抗癌剤等の種々の薬剤が用い
られており、その際にもこれらの細胞の機能が抑制され
たり、または増強されたりすることもまた知られてい
る。そのため、各種疾患の病態や薬剤の効果あるいは副
作用を把握し、治療指針を決定したり、薬剤の投与量や
タイミングを決定するために、これらの細胞の機能を調
べることが重要である。

【０００４】ミエロペルオキシダーゼ（以下、ＭＰＯと
いう）は、顆粒球の細胞内顆粒に存在し、食作用におけ
る殺菌反応を触媒する酵素であり、食作用とともに細胞
外に遊離され、種々の微生物感染症や炎症、アレルギー
性疾患の病態において重要な役割をしている。また、マ
トリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰとい
う）は、顆粒球や単球、マクロファージが炎症組織に遊
走する際、組織の細胞間マトリックスを分解する反応を
触媒する酵素で、ＭＰＯと同様に、種々の微生物感染症
や炎症、アレルギー性疾患の病態において重要な役割を
している。したがって、ＭＰＯやＭＭＰは、顆粒球、単
球、マクロファージなどの貪食細胞の細胞機能を推し量
る重要な動態指標の一つである。

【０００５】従来、病院の検査室や検査センターでは、
上記のような理由から、このような細胞機能を測定する
ため、顆粒球貪食機能試験、顆粒球殺菌能（活性酸素産
生能）試験、リンパ球幼若化試験等が行われてきた。ま
た、最近では、フローサイトメトリー装置と各種免疫担
当細胞表面抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体を
用いた表面抗原試験等が行われるようになってきた。

【０００６】また、細胞の機能を測定する別の方法とし
て、これらの細胞から分泌されるサイトカインなどの各
種免疫因子や酵素等を細胞機能の動態指標として測定す
る方法が考えられる。例えば、特表平５−５０２０９９
号公報には、細胞に活性化物質を接触させ、酵素基質を
供給して、酵素−基質反応の生成物を測定する方法が開
示されている。

【０００７】しかしながら、従来、病院の検査室や検査
センターで行われてきた細胞機能測定方法や前記の公開
特許公報に開示の方法には、以下のような問題点があっ
た。すなわち、これらの試験は、いずれも被検者から注
射器で血液を採血後、ピペッティングなどの用手法の手
段で血液を種々の反応容器に移し変えたり、白血球など
を分離するための細胞分離、機能測定のための細胞培養
等の特殊な操作が必要であった。そのため、検査従事者
は、血液に触れて、肝炎、エイズなどの種々の感染症に
感染する危険性があった。また、これらの操作中に、血
液試料中に種々の雑菌や埃などが混入する恐れがあり、
これらの汚染物あるいは操作による物理的刺激によっ
て、血液試料中の細胞が不必要に刺激され、測定結果に
悪影響を及ぼす恐れがあった。

【０００８】また、従来の試験法には、上記のような、
細胞分離、細胞培養、顕微鏡測定等の特殊な技術が要求
され、測定に時間がかかり、ＲＩ（ラジオアイソトー
プ）施設やフローサイトメーターなどの高価な装置が必
要であった。

【０００９】これらの問題のため、従来よりも、操作が
簡単で危険性がなく、精度の良い細胞機能測定方法が望
まれている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の細胞機能測定方法の欠点を解消し、従来よりも操作が
簡単で危険性がなく、精度良く細胞機能測定できる細胞
機能測定用反応器及び細胞機能測定用キットを提供する
ことにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の請求項１記載の
細胞機能測定用反応器は、血液と接触することにより該
血液に、ミエロペルオキシダーゼの産生を誘導する、中
心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、で
こぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にあ
る凹凸を表面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が
減圧にされた容器内に、血液と接触可能な状態とされて
いることを特徴とする。

【００１２】また、本発明の請求項４記載の細胞機能測
定用反応器は、血液と接触することにより該血液に、マ
トリックスメタロプロテイナーゼの産生を誘導する、中
心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、で
こぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にあ
る凹凸を表面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が
減圧にされた容器内に、血液と接触可能な状態とされて
いることを特徴とする。

【００１３】本発明で用いられる血液と接触することに
より該血液に、ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の産生を誘導す
る、凹凸を表面に有する材料とは、材料の種類を問わ
ず、中心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであ
り、かつ、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μ
ｍの範囲にある凹凸を表面に有するものであれば任意の
材料を用いることができる。後述する実施例から明らか
なように、中心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μ
ｍの範囲外の材料では、ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の誘導量
が低下する。また、中心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ
〜１０μｍの範囲にある材料でも、でこぼこ平均間隔Ｓ
ｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲外の材料では、やは
り、ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の誘導量が低下する。

【００１４】なお、上記Ｒａ値とは、ＪＩＳＢ０６
０１−１９８２における中心線平均粗さである。また、
上記でこぼこ平均間隔Ｓｍ値は、以下のようにして定義
される値である。

【００１５】でこぼこ平均間隔Ｓｍ値現在のＪＩＳ規格では、表面粗さの高さ方向の情報につ
いては規定されているが、面方向の情報に関しては規定
されていない。しかしながら、本発明における凹凸は、
凹凸の面方向における間隔によっても後述の実施例から
明らかなように限界付けられるものである。そこで、本
発明では、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値を用いることによ
り、凹凸の面方向の範囲を規定する。

【００１６】上記でこぼこ平均間隔Ｓｍ値は、以下のよ
うにして求められる。まず、図１に示す粗さ曲線Ａの中
心線Ｂに対して、それぞれ、一定の高さ及び深さの位置
に上側カウントレベル及び下側カウントレベルを引く。
次に、下側のカウントレベルと粗さ曲線Ａとが交差する
２点間において、上側カウントレベルと粗さ曲線とが交
差する点が一回以上存在するときに、一つの山として
「山」を定義する。そして、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値
は、図２に示すように、基準長さＬの間にある山の間隔
をＳｍｉとしたときに、下記の数式（１）で定義される
値である。

【００１７】

【数１】

【００１８】すなわち、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値とは、
基準長さＬの間にある山同士の間隔の平均値を示す。こ
のようにして、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値により、凹凸の
面方向の条件が定義される。

【００１９】本発明において用い得る上記材料として
は、人体に対して無害なもの、例えば血液と材料が接触
された際に有害な金属や可塑剤などの添加物の溶出がな
いものであれば、その種類を問わずに利用することがで
きる。すなわち、ガラス及びアルミナ等の無機材料、並
びに酢酸セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリテ
トラフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、パ
ーフルオロエチレン−プロピレン共重合体、ポリエチレ
ンテレフタレート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リウレタン、アクリル樹脂、エチルセルロース等の合成
及び天然の有機高分子材料などが例示できる。

【００２０】また、材料表面に凹凸（表面粗さ）を付与
する方法としては研磨法が一般的であるが、他の方法に
よって上記特定の表面粗さを有するように構成してもよ
い。例えば、材料表面に微粒子を物理的あるいは化学的
に固定する方法や、表面が多孔質の材料を用いる方法等
も利用することができる。

【００２１】材料表面に微粒子を固定する方法として
は、例えば０．１μｍ〜２０μｍの微粒子をコーティン
グする方法が挙げられ、それによってＭＰＯ（又はＭＭ
Ｐ）を産生誘導させ得る。ここで用いる微粒子は、例え
ばスチレン系やアクリル系などのビニル系モノマーの単
独あるいは２成分以上の混合物を乳化重合や懸濁重合す
ることにより調製することができる。これらの微粒子と
しては、望ましくは、例えば、ジビニルベンゼンのよう
な２官能基以上の多官能性モノマーとの共重合体からな
るものがよい。

【００２２】上記微粒子をコーティングする方法として
は、先ず、コーティングのための結合剤としての合成高
分子や天然高分子を０．１〜５重量％程度溶解させた液
に、これらの微粒子を懸濁させる。次に、この懸濁液に
予め成形しておいた有機もしくは無機材料からなるビー
ズ、繊維またはフィルム状の材料を浸漬し、その後乾燥
することにより本発明のＭＰＯ（又はＭＭＰ）産生誘導
材料を作製することができる。この場合のＲａ値の調整
は微粒子の大きさにより、またＳｍ値の調整は懸濁粒子
の濃度によって行い得る。

【００２３】また、多孔質材料の場合でも、その形状は
膜状、繊維状またはビーズ状の何れでもよく、かつ表面
のみが多孔性であってもよく、材料全体が多孔性であっ
てもよい。表面のみが多孔性の材料については、例えば
有機もしくは無機材料からなるビーズ、繊維またはフィ
ルム状の担体に、コーティング液として合成高分子や天
然高分子をそれらの良溶媒中に０．１〜５重量％程度溶
解させた液を、スプレーによって霧状に吹き付けて加熱
乾燥することによって得られる。また、材料全体が多孔
性になっているものの製法としては、一般的な多孔性膜
及び多孔性ビーズなどの製法を使用することができる。
例えば膜状の場合では、合成高分子を良溶媒に溶解させ
てガラス板上に流延させてキャスティングフィルムを作
製し、その後、合成高分子の貧溶媒にてフィルムを洗浄
し、良溶媒を抽出することによって多孔性膜を調製する
ことができる。

【００２４】多孔性材料の場合のＲａ値やＳｍ値の調整
は、細孔径や細孔量を調整することによって達成され、
細孔径や細孔量は材料を溶解させる溶媒の種類や量を変
えることにより容易に調節することができる。

【００２５】本発明の細胞機能測定用反応器において
は、上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の産生を誘導する材料
が、内部が減圧にされた容器内に、血液と接触可能な状
態とされている。上記血液と接触可能な状態としては、
例えば、上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の産生を誘導する材
料が上記容器内に収容されている場合が挙げられ、請求
項２及び５記載の細胞機能測定用反応器においては、こ
の場合に限定されるが、請求項１及び４記載の細胞機能
測定用反応器においては、この他に、該細胞機能測定用
反応器の内壁面が上記特定の表面粗さを有するように加
工されているものが含まれる。内壁面を上記特定の表面
粗さを有するように加工するには、例えば、梨地加工の
ように、砂などの適当な微粒子を金型に塗布、固着し、
しかる金型を使用して射出成形を行う方法や、該反応器
の内壁面に、前記のような微粒子を固定する方法が挙げ
られる。

【００２６】上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の産生を誘導す
る材料の形状としては、粒子状、繊維状、中空糸状、膜
状等いずれの公知の形状のものでもよく、上記容器中で
は前記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）誘導材料の表面に気泡が残
ると、転倒混和等により血液と接触させる際に過度の溶
血を引き起こし、測定系に影響する恐れがあるため、以
下に示すような希釈液に浸しておくのが好ましい。

【００２７】上記の希釈液としては、例えば、リン酸緩
衝液、ハンクス緩衝液などの緩衝液やＭＥＭ、ＲＰＭＩ
−１６４０等の通常の培地など、生理的緩衝液であれ
ば、いずれであっても利用できる。

【００２８】また、本発明の細胞機能測定用反応器は、
血液中の細胞機能測定に用いられるので、血液が凝固し
ないように、上記容器中に血液抗凝固剤が収容されてい
る必要がある。

【００２９】上記血液抗凝固剤は、該容器の中に液体又
は固体のいずれの状態で存在されても良い。

【００３０】上記血液抗凝固剤としては、例えば、ヘパ
リン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙
げられ、ヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応
を阻害しないので好ましい。

【００３１】上記ヘパリンナトリウムの該容器中の収容
量としては、該容器に血液が収容された時に、その血液
中の濃度が、低くなると血液凝固の恐れがあり、高くな
ると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがある
ので、６〜２０Ｕ／ｍｌになるように収容するのが好ま
しい。

【００３２】本発明の反応器の容器の材質としては、例
えば、プラスチックまたはガラスが挙げられるが、ＭＰ
Ｏ（又はＭＭＰ）の誘導反応後、上記ＭＰＯ（又はＭＭ
Ｐ）を測定するための遠心分離操作に耐えられるだけの
強度を有するものが好ましい。上記プラスチックとして
は、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられ
得る。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレ
ート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、
スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水
マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、
スチレン−メチルメタクリレート共重合体、エチレン−
プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、
エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられ
る。熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポリエステ
ル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等
が挙げられる。

【００３３】本発明の反応器には、その内部を減圧に維
持するために、通常、栓体を使用する。栓体の材質とし
ては、例えばブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性
エラストマー等が挙げられる。

【００３４】本発明の反応器の減圧の程度は、常圧の検
体血液と上記反応器が連通された時に、上記反応器の中
に常圧の検体血液が吸入されうる程度の圧力であればよ
く、その圧力は、吸入しようとする検体血液の量によっ
て決められる。すなわち、吸入しようとする検体血液の
量が多ければ多いほど減圧の程度を大きくする必要があ
る。

【００３５】本発明の反応器を用いて細胞機能を測定す
る場合の血液量は、反応器の容積によって異なるが、通
常、４〜５ｍｌの容積の反応器を用いる場合であれば、
０．５〜２ｍｌ程度でよい。

【００３６】本発明の反応器の製造方法の一例を挙げる
と、内部を減圧にすることが可能である容器に、前記Ｍ
ＰＯ（又はＭＭＰ）誘導材料及び血液抗凝固剤を加え、
容器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をするこ
とによって製造する。

【００３７】上記の容器としては、例えば、一端が開口
し他端が閉塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、
栓体によって閉塞可能なものが好ましい。上記有底管体
としては、例えば、ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の誘導反応
後、上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）量を測定するための遠心
分離操作に好適な試験管状のものがより好ましく、その
サイズとしては、外径が、５〜３０ｍｍ、高さ２０〜１
５０ｍｍ程度が好ましい。

【００３８】また、本発明の反応器は、エンドトキシン
や雑菌の混入を避けるため、できる限りクリーンな環境
で製造されるのが好ましく、また、製造後に公知の滅菌
処理を施すのが好ましい。

【００３９】本発明の反応器によって、細胞機能を測定
するには、採血容器と上記反応器とを連通させ、上記反
応器中に検体血液を吸入させる。次いで、上記反応器を
適度に振とうしながら、血液細胞と上記ＭＰＯ（又はＭ
ＭＰ）誘導材料とを反応させる。反応後、静置もしくは
遠心分離により、血球と血漿に分離して、血漿中のＭＰ
Ｏ（又はＭＭＰ）量を各々の測定試薬により定量する。

【００４０】上記の採血容器と上記反応器を連通させる
方法としては、例えば、採血容器を注射針付きの注射筒
としておき、上記注射針を上記反応器の栓体に突き刺す
方法が挙げられる。

【００４１】上記の血液と上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）誘
導材料との反応温度は、上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）の産
生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度
である１５〜４２℃が好ましく、より好ましくは、３０
〜４０℃である。反応時間は、上記ＭＰＯ（又はＭＭ
Ｐ）の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさ
ない反応時間である１〜１２時間が好ましく、より好ま
しくは、２〜６時間である。

【００４２】本発明の反応器を用いることにより誘導さ
れたＭＰＯ（又はＭＭＰ）を測定する方法としては、例
えば、測定しようとする上記ＭＰＯ（又はＭＭＰ）に対
するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵
素及び各々の酵素の発色基質を利用した酵素免疫測定方
法が挙げられる。

【００４３】以下に、本発明の反応器を用いて、ＭＰＯ
の産生を誘導する細胞機能測定の１態様を詳しく説明す
る。先ず、血液と上記ＭＰＯ誘導材料とを上記反応器の
中で反応させ、ＭＰＯを誘導し、誘導後の反応器を１２
００Ｇで遠心分離して、血球成分と血漿成分を分離させ
る。次いで、分離された血漿を、上記ＭＰＯに対するモ
ノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートのウェ
ルに、ピペッティングにより添加し、３７℃で２時間反
応させる。次いで、反応後の血漿液を吸引除去等の手段
で廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、Tween20 等
のノニオン系の界面活性剤を含有する、中性pHの洗浄用
緩衝液で上記ウェルを洗浄する。次いで、西洋わさびペ
ルオキシダーゼを固定化した上記ＭＰＯに対するポリク
ローナル抗体をピペッティングにより上記ウェルに添加
し、３７℃で１時間反応させる。次いで、未反応の西洋
わさびペルオキシダーゼ固定化抗体を除くため、上記ウ
ェルを上記洗浄用緩衝液で洗浄した後、過酸化水素、テ
トラメチルベンジジンを含む基質溶液を添加し、５〜１
０分間反応させる。次いで、１Ｍ硫酸溶液を添加して、
反応を停止させて、酵素反応による基質の発色を４５０
ｎｍの吸光度から測定する。この測定値と既知濃度の上
記ＭＰＯを用いて作成した検量線から、上記ＭＰＯの産
生誘導量を測定する。

【００４４】次に、本発明の請求項３記載の細胞機能測
定用キットは、請求項１又は２記載の細胞機能測定用反
応器と、誘導された前記ＭＰＯの量を定量可能な試薬と
からなることを特徴とする。

【００４５】本発明の細胞機能測定用キットに使用され
る試薬としては、誘導された上記ＭＰＯの量を定量可能
な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、定量し
ようとするＭＰＯに対するモノクローナル抗体もしくは
ポリクローナル抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素及び各々の酵素の発色基質など
を利用する酵素免疫測定法用試薬が挙げられる。

【００４６】上記細胞機能測定用キットの使用方法の１
例としては、前記の、本発明の細胞機能測定用反応器を
用いて細胞機能を測定する１態様を説明した方法と同様
である。

【００４７】次に、本発明の請求項６記載の細胞機能測
定用キットは、請求項４又は５記載の細胞機能測定用反
応器と、誘導された前記ＭＭＰの量を定量可能な試薬と
からなることを特徴とする。

【００４８】本発明の細胞機能測定用キットに使用され
る試薬としては、誘導された上記ＭＭＰの量を定量可能
な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、定量し
ようとするＭＭＰに対するモノクローナル抗体もしくは
ポリクローナル抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素及び各々の酵素の発色基質など
を利用する酵素免疫測定法用試薬が挙げられる。

【００４９】本発明による細胞機能測定用反応器及び細
胞機能測定用キットを用いれば、被検者から血液を採血
後、ピペッティングなどの用手法の手段で血液を種々の
反応容器に移し変えたり、細胞分離、細胞培養等の操作
を必要とせず、試験者は、肝炎、エイズなどの種々の感
染症に感染する危険性がほとんどない。また、血液試料
中に種々の雑菌や埃などが混入する恐れもなく、これら
の汚染物や種々の操作による細胞の不要な活性化または
活性低下が惹起される問題もない。また、細胞分離、細
胞培養、顕微鏡測定等の特殊な技術も必要なく、測定時
間も短縮でき、ＲＩ施設やフローサイトメーターなどの
高価な装置も必要としない。そのため、従来よりも、操
作が簡単で危険性がなく、精度良く細胞機能測定ができ
る。

【００５０】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明をさらに詳細に述べる。

【００５１】まず、後述の実施例１〜１１及び比較例１
〜８に用いたＭＰＯ及びＭＭＰ産生誘導材料の作製方
法、細胞機能測定用反応器の製造方法、並びにＭＰＯ及
びＭＭＰの誘導能の測定方法につき説明する。

【００５２】（１）研磨フィルムの作製方法（実施例１
〜６、比較例１〜６）後述の実施例１〜６及び比較例２、３、５、６において
は、ＭＰＯ及びＭＭＰ産生誘導材料として研磨フィルム
を使用したが、そのフィルムの作製方法は、まず、フィ
ルムを用意し、該フィルムの表面をメチルアルコールで
洗浄した後、ストルアス社（デンマーク）製、自動研磨
機（商品名；プラノボールペデマックス）に、後述の表
１に示すように、２２０、５００、１２００、２４０
０、又は４０００メッシュのサンドペーパーを取り付け
たものを用いて研磨し、表面の両側に表面粗さを持つ研
磨フィルムを作製する方法によった。なお、比較例１と
比較例４においては、比較のために未研磨のフィルムを
使用した。

【００５３】（２）表面粗さの測定方法後述の各実施例及び比較例において記した中心線平均粗
さＲａ値（カットオフ値、フィルムでは０．８ｍｍ、ビ
ーズでは０．０８ｍｍ）及びでこぼこ平均間隔Ｓｍ値
は、表面粗さ測定装置（（株）小坂研究所製、商品名；
サーフコーダＳＥ−３０Ｄ）により測定、または、走査
型レーザー顕微鏡（レーザーテック社製、商品名；1ML2
1W）により観察した表面画像を画像解析システム（三谷
商事社製、商品名；SUPER ASPECT ）にて処理して測定
したものである。

【００５４】（３）細胞機能測定用反応器の製造方法
（実施例１〜６、比較例１〜６）後述の実施例１〜６、比較例１〜６に記したフィルムを
３ｃｍ×４ｃｍの大きさに切り、これをさらに５ｍｍ×
５ｍｍの大きさの細片にした。これらを注射用生理食塩
水（大塚製薬社製）で洗浄後、洗浄後のフィルム細片を
ポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌの試験管（12.6
φ×75mm）に、かさ体積で０．５ｍｌ添加し、さらに、
４０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウム（ノボ・
ノルディスクA/S 社製、商品名: ノボ・ヘパリン注100
0）を含有させた注射用生理食塩水（大塚製薬社製）を
０．５ｍｌ添加した。

【００５５】次いで、管径に合うブチルゴム製の栓体を
上記試験管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽
く載せた後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減
圧にしてゆき、１ｍｌの血液を吸引できるように、上記
容器を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで、該試験管の
開口部を密栓した。このようにして製造された減圧試験
管をγ線滅菌し、細胞機能測定用反応器とした。

【００５６】（４）細胞機能測定用反応器の製造方法
（実施例７〜１１、比較例７、８）後述の実施例７〜１１、比較例７、８に記したビーズ
を、１５ｍｌ用γ線滅菌済みポリプロピレンチューブ
（岩城硝子社製）に、かさ体積で１ｍｌ入れ、注射用生
理食塩水（大塚製薬社製）を１２ｍｌ添加して軽く撹拌
後、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心分離後、上
澄みを吸引して捨てる操作を５回繰り返して洗浄した。
洗浄後のビーズをポリエチレンテレフタレート製の４ｍ
ｌの試験管（12.6φ×75mm）にかさ体積で０．５ｍｌ添
加し、さらに、４０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナト
リウム（ノボ・ノルディスクA/S 社製、商品名: ノボ・
ヘパリン注1000）を含有させた注射用生理食塩水（大塚
製薬社製）を０．５ｍｌ添加した。

【００５７】次いで、管径に合うブチルゴム製の栓体を
上記試験管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽
く載せた後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減
圧にしてゆき、１ｍｌの血液を吸引できるように、上記
容器を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで、該試験管の
開口部を密栓した。このようにして製造された減圧試験
管をγ線滅菌し、細胞機能測定用反応器とした。

【００５８】（５）ＭＰＯ及びＭＭＰの誘導能の測定方
法健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘパ
リン採血し、その注射針を上記（３）又は（４）のよう
にして製造した細胞機能測定用反応器のブチルゴム製の
栓体部分に突き刺し、検体血液を前記反応器に採取した
（採取検体血液量、約１ｍｌ）。次いで、予め３７℃に
保温しておいた恒温器中の転倒混和用ロッカープラット
フォームに血液を採取した各々の反応器をとりつけ、２
時間、転倒混和した。混和後、反応器を３０００ｒｐ
ｍ、１０分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を採
取した。採取した血漿中のＭＰＯ及びＭＭＰ量（ｎｇ／
ｍｌ）を以下の（６）及び（７）の方法で測定した。

【００５９】（６）血漿中ＭＰＯ濃度の測定方法ＭＰＯモノクローナル抗体を用いて、酵素抗体法（BIOX
YTECH.S.A.社製、商品名；MPO-EIA ）にて測定した。こ
の測定方法の検出限界濃度は1.6ng/mlであった。

【００６０】（７）血漿中ＭＭＰ濃度の測定方法（７−１）マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（９
２ＫＤａゼラチナーゼ）（ＭＭＰ−９）標準品の調製ＭＭＰ濃度の測定に使用するヒトＭＭＰ−９標準品を、
U.Bergmann等の方法（「Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA) for the Quantitative Determination o
f Human Leukocyte Collagenase and Gelatinase」J.Cl
inical.Chem.Clin.Biochem.Vol.27,1989,pp351-359）に
従って、ヒト血液のバッフィコートから調製した。

【００６１】（７−２）ＭＭＰ産生誘導試験後の血漿中
のＭＭＰ濃度を以下のようにして測定した。０．２ｇ／
ｌＮａＮ₃、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．６）に、調製したＭＭＰ−９標準品を０．２μｇ／
ｍｌになるように溶解し、９６穴マイクロタイタープレ
ート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに２００μｌずつ分注
し、１２時間、４℃に静置し、ＭＭＰ−９標準品を該プ
レート内面に物理吸着させた。１２時間後、未吸着のＭ
ＭＰ−９標準品を吸引除去し、０．１５Ｍ濃度で塩化ナ
トリウムおよび０．０５％濃度でＴｗｅｅｎ２０を含
む、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
（以下、洗浄液１という）で２回吸引洗浄した。

【００６２】次に、牛血清アルブミンが２％(W/V) とな
るように溶解された洗浄液１（以下、ＭＭＰ希釈液とい
う）で、ＭＭＰ−９標準品を段階希釈し、０〜１０００
ｎｇ／ｍｌの希釈系列を作製し、各々に抗ヒトＭＭＰ−
９モノクローナル抗体（マウス産生）（富士薬品工業社
製）を２０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。また、Ｍ
ＭＰ産生誘導試験後の各測定サンプル（血漿）は、各々
の測定サンプルに抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体
（マウス産生）（富士薬品工業社製）を２０ｎｇ／ｍｌ
になるように添加した。

【００６３】この抗原抗体混合液を２時間、２５℃で攪
拌後、前記のマイクロプレートの各ウエルに１００μｌ
ずつ分注し、２時間、２５℃で静置した。次に、プレー
トを洗浄液１で４回吸引洗浄し、西洋わさびペルオキシ
ダーゼで標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体（生化学工業
社製）をＭＭＰ希釈液で２０００倍に希釈した液を、各
ウェルに１００μｌずつ分注し、１時間、２５℃で静置
した。

【００６４】次に、プレートを洗浄液１で５回吸引洗浄
し、基質反応液〔０．５ｇ／ｌ２，２’−ａｚｉｎｏ
−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎ
ｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＡＢＴＳ）、１．
３ｍＭＨ₂Ｏ₂、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）〕を各ウェルに２０
０μｌずつ分注し、１時間、２５℃に静置後、ＯＤ４０
５ｎｍの吸光度をＳＪｅｉａＡＵＴＯＲＥＡＤＥＲ
（三光純薬社製）にて測定した。

【００６５】次に、ＭＭＰ−９標準品の各希釈系列（０
〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と上記吸光度値との関係より標
準曲線を作成し、この標準曲線にＭＭＰ産生誘導試験後
の各測定サンプルより得られた上記吸光度値をあてはめ
てサンプル中のＭＭＰ−９の濃度を算出した。なお、各
測定サンプル（血漿）中のＭＭＰ−９濃度が１０００ｎ
ｇ／ｍｌ以上となる場合には、サンプルをＭＭＰ希釈液
で希釈したものを用いて、上記と同様の操作を繰り返し
て測定した。

【００６６】実施例１〜３及び比較例１〜３ＰＥＴフィルム（ユニチカ社製、ポリエチレンテレフタ
レートフィルム、商品名；エンブレットＳ−７５）を用
い、上記（１）の研磨フィルムの作製方法に従って、５
段階に研磨されたフィルムを作製した（表１参照）。そ
して、未研磨のフィルム及び５段階に研磨されたフィル
ムのそれぞれについて、上記（２）に従ってＲａ値およ
びＳｍ値を求めた後、それぞれ上記（３）に従って細胞
機能測定用反応器を製造し、上記（５）に従ってＭＰＯ
及びＭＭＰの産生誘導試験を行った。結果を表１に示
す。

【００６７】

【表１】

【００６８】表１から明らかなように、Ｒａ値が０．２
μｍ未満の比較例に比べて、Ｒａ値が０．２〜１０μｍ
の範囲内にある実施例では、ＭＰＯ及びＭＭＰの産生誘
導は急激に増加した。なお、Ｓｍ値に関しては、比較例
１の未研磨フィルムでは４７５μｍであったのに対し
て、それ以外のフィルムでは３０〜１３０μｍの範囲で
あった。

【００６９】実施例４〜６及び比較例４〜６１２００メッシュのサンドペーパーを用いて研磨する際
の研磨時間を変化させたこと以外は実施例１と同様にし
て、表面粗さＲａ値が０．６μｍ以上、Ｓｍ値が３０〜
３８０μｍの範囲にある５種類の研磨フィルムを作成し
た（表２参照）。上記５種類の研磨フィルムと未研磨の
ＰＥＴフィルム（比較例４）とを用いて、それぞれ上記
（３）に従って細胞機能測定用反応器を製造し、上記
（５）に従ってＭＰＯ及びＭＭＰの産生誘導試験を行っ
た。結果を表２に示す。

【００７０】

【表２】

【００７１】表２からも明らかなように、Ｓｍ値が２０
０μｍを超えている比較例４〜６に比べて、Ｓｍ値が２
００μｍ以下である実施例４〜６では、ＭＰＯ及びＭＭ
Ｐの産生誘導が著しく大きいことがわかる。すなわち、
同程度のＲａ値を持っていても、Ｓｍ値が２００μｍ以
下でないとＭＰＯ及びＭＭＰの産生誘導の効果が小さい
ことがわかる。

【００７２】実施例７及び比較例７ナイロン６６ペレット（宇部興産社製、商品名；ウベ６
６２０２０Ｂ）を射出成形し、直径２．５ｍｍの球状
ビーズを作製した。ポットミル（東洋エンジニアリング
社製、商品名；５１−セラミックポットミルＢＰ−５）
に、上記ビーズ２００ｍｌ及び同容量の研磨材〔ＷＨＩ
ＴＥＡＢＲＡＸ（ＷＡ）＃３４（日本研磨材工業社
製）〕を投入し、さらにセラミックポットミル用ボール
（東洋エンジニアリング社製、商品名；ＢＢ−１３）数
個を投入し、ボール研磨機（日陶科学社製ポットミル、
商品名；ＡＮ−３Ｓ）により５時間研磨した。このよう
にして、Ｒａ値９．１μｍ及びＳｍ値１２３．５μｍの
ビーズを得た（実施例７）。比較のために、上記研磨処
理をしなかった、Ｒａ値０．１９μｍ及びＳｍ値２９
４．４μｍのビーズも用意した（比較例７）。次いで、
各々のビーズをメタノールで３回洗浄し、次いで注射用
生理食塩水（大塚製薬社製）で５回洗浄した。このビー
ズを用いて、それぞれ上記（４）に従って細胞機能測定
用反応器を製造し、上記（５）に従ってＭＰＯ及びＭＭ
Ｐの産生誘導試験を行った。結果を表３に示す。

【００７３】

【表３】

【００７４】表３からも明らかなように、Ｒａ値９．１
μｍ、Ｓｍ値１２３．５μｍのビーズでは、Ｒａ値０．
２μｍ以下、Ｓｍ値が２００μｍ以上のビーズより、Ｍ
ＰＯ及びＭＭＰの産生誘導が著しく大きいことがわか
る。

【００７５】実施例８〜１０ポリスチレン性多孔性ビーズダイヤイオンHP-50 （三菱
化成社製）、ポリアクリル酸エステル多孔性ビーズダイ
ヤイオンHP-1MG（三菱化成社製）、ポリアクリル酸エス
テル多孔性ビーズアンバーライトXAD-7 （オルガノ社
製）を蒸留水にて３回洗浄し、一晩室温にて静置した。
次いで、蒸留水にて３回洗浄し、メタノールにて洗浄
後、メタノールに懸濁して６時間静置した。これを蒸留
水、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄し、注射
用生理食塩水に懸濁して超音波洗浄を行い、吸引ポンプ
にて脱気した。

【００７６】このようにして、洗浄したビーズを用い
て、それぞれ上記（４）に従って細胞機能測定用反応器
を製造し、上記（５）に従ってＭＰＯ及びＭＭＰの産生
誘導試験を行った。結果を表４に示す。

【００７７】

【表４】

【００７８】実施例１１実施例８と同様にして洗浄したポリスチレン性多孔性ビ
ーズダイヤイオンHP-50 （三菱化成社製）を用いて、上
記（４）に従って１０本の細胞機能測定用反応器を製造
し、上記（５）に従ってＭＰＯ及びＭＭＰの産生誘導試
験を行った。結果を表５及び表６に示す。

【００７９】比較例８実施例１１と同様にして洗浄したポリスチレン性多孔性
ビーズダイヤイオンHP-50 （三菱化成社製）を、ポリエ
チレンテレフタレート製の４ｍｌの試験管（12.6φ×75
mm）１０本に、かさ体積で０．５ｍｌずつ添加し、さら
に、４０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウム（ノ
ボ・ノルディスクA/S 社製、商品名: ノボ・ヘパリン注
1000）を含有させた注射用生理食塩水（大塚製薬社製）
を０．５ｍｌ添加した。次いで、管径に合うブチルゴム
製の栓体で試験管の開口部に栓をし、γ線滅菌して、細
胞機能測定用反応器を製造した。次いで、実施例１１で
用いたものと同様の血液を１０本の反応器の各々に、栓
体を手ではずして、ピペットで１ｍｌずつ添加し、栓体
を閉めた後、予め３７℃に保温しておいた恒温器の中の
転倒混和用ロッカープラットフォームにとりつけ、２時
間、転倒混和した。混和後、各々の反応器を３０００ｒ
ｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を
採取した。採取した血漿中のＭＰＯ及びＭＭＰ量を実施
例１１と同様にして測定し、結果を表５及び表６に示し
た。

【００８０】

【表５】

【００８１】

【表６】

【００８２】表５及び表６の結果から、本発明の細胞機
能測定用反応器を用いた場合の方が良い再現性を示し
た。

【００８３】

【発明の効果】本発明の請求項１、２又は４、５記載の
細胞機能測定用反応器の構成は、上記の通りであり、上
記の細胞機能測定用反応器を用いると、被検者から血液
を採血後、ピペッティングなどの手段で血液を種々の反
応容器に移し変えたり、細胞分離、細胞培養等の操作を
必要としないため、試験者は、肝炎、エイズなどの種々
の感染症に感染する危険性がほとんどない。また、種々
の雑菌や埃などの混入の恐れがないため、これらの汚染
物や種々の操作による細胞の不要な活性化または活性低
下が惹起される問題もない。また、全血を用いるため、
測定時間を短縮でき、従来よりも、操作が簡単で精度良
く細胞機能測定できる。

【００８４】本発明の請求項３記載の細細胞機能測定用
キットの構成は、上記の通り、請求項１又は２記載の細
胞機能測定用反応器と、誘導されたＭＰＯの量を定量可
能な試薬とからなるので、従来よりも操作が簡単で危険
性がなく、精度良くより簡便に細胞機能測定できる。

【００８５】本発明の請求項６記載の細細胞機能測定用
キットの構成は、上記の通り、請求項４又は５記載の細
胞機能測定用反応器と、誘導されたＭＭＰの量を定量可
能な試薬とからなるので、従来よりも操作が簡単で危険
性がなく、精度良くより簡便に細胞機能測定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】でこぼこ平均間隔Ｓｍ値における山の定義を説
明するための図。

【図２】でこぼこ平均間隔Ｓｍ値を説明するための図。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血液と接触することにより該血液に、ミ
エロペルオキシダーゼの産生を誘導する、中心線平均粗
さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、でこぼこ平均
間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にある凹凸を表
面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が減圧にされ
た容器内に、血液と接触可能な状態とされていることを
特徴とする細胞機能測定用反応器。
【請求項２】血液と接触することにより該血液に、ミ
エロペルオキシダーゼの産生を誘導する、中心線平均粗
さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、でこぼこ平均
間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にある凹凸を表
面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が減圧にされ
た容器内に収容されていることを特徴とする細胞機能測
定用反応器。
【請求項３】請求項１又は２記載の細胞機能測定用反
応器と、誘導された前記ミエロペルオキシダーゼの量を
定量可能な試薬とからなることを特徴とする細胞機能測
定用キット。
【請求項４】血液と接触することにより該血液に、マ
トリックスメタロプロテイナーゼの産生を誘導する、中
心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、で
こぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にあ
る凹凸を表面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が
減圧にされた容器内に、血液と接触可能な状態とされて
いることを特徴とする細胞機能測定用反応器。
【請求項５】血液と接触することにより該血液に、マ
トリックスメタロプロテイナーゼの産生を誘導する、中
心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、で
こぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にあ
る凹凸を表面に有する材料及び血液抗凝固剤が、内部が
減圧にされた容器内に収容されていることを特徴とする
細胞機能測定用反応器。
【請求項６】請求項４又は５記載の細胞機能測定用反
応器と、誘導された前記マトリックスメタロプロテイナ
ーゼの量を定量可能な試薬とからなることを特徴とする
細胞機能測定用キット。