JPH09172892A - 丸葉ユーカリのクローン苗生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 丸葉ユーカリにおいて、成木を材料とした組
織培養によるクローン増殖技術を提供し、優良形質を備
えた苗の確実で効率的、かつ簡便な生産方法を実現す
る。 【解決手段】 培養組織の増殖に先立ち、これをカイネ
チン 0.01 〜0.1mg/l 、または６−ベンジルアミノプリ
ン0.01〜0.05mg/lを添加した培地にて、３か月以上増殖
を抑制して培養する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】 本発明はユーカリ属、特に、そ
の葉が丸い形をしているところから、俗に丸葉ユーカリ
と呼ばれるユーカリプタス・グンニィ（Euca lyputus
gunnii、以下、Ｅ．グンニィと略す。）、ユーカリプタ
ス・シネレア（Eucalyputus cinerea 、以下、Ｅ．シ
ネレアと略す。）、ユーカリプタス・ブリジェシアナ
（Eucalyputus bridgesiana 、以下、Ｅ．ブリジェシ
アナと略す。）、ユーカリプタス・ダルリムプレアナ
（Eucalyputus dalrympleana、以下、Ｅ．ダルリムプ
レアナと略す。）、ユーカリプタス・ルビダ（Eucalypu
tus rubida、以下、Ｅ．ルビダと略す。）クローン苗の
大量生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ユーカリは、オーストラリアを原産地と
するフトモモ科に属する木本類であり、現在のところ約
６００種が知られ、種々の用途に利用されているが、中
でも、Ｅ．グンニィ、Ｅ．シネレア、Ｅ．ブリジェシア
ナ、Ｅ．ダルリムプレアナ、Ｅ．ルビダは、葉が丸く、
他種にはないその特異的な形態から俗に丸葉ユーカリと
呼ばれ、生け花用として生産、販売されている。

【０００３】生け花用ユーカリの生産は、種子から苗を
育成することから始め、この育成した苗を畑や圃場に植
栽してさらに育成し、ある程度生長させて萌芽枝を多く
発生させ、この萌芽枝を切り取って出荷する。しかし、
出荷時に萌芽枝が揃えにくいことの他、遺伝的に不均一
である種子より苗を育てるため、生産される萌芽枝の中
に、葉形が細長く、商品価値の全くないものが多く出現
するという問題があり、このため、苗の段階で形態によ
る選別を行わざるを得ず、その結果、過半数の苗を廃棄
しており、苗にかかるコストが高くなっている。また、
事前に任意の種子を選択することは、種間内交雑が激し
いため困難である。

【０００４】このように生け花用ユーカリの生産は、得
られる苗の形態の不均一及びコスト高、という二つの問
題を抱え、将来的にはその継続にも支障を来す状況に陥
っており、安価で効率的な生産方法の確立が望まれてい
る。

【０００５】これらの問題を解決する方法として、クロ
ーン化技術を用いて苗を生産する方法が考えられる。つ
まり、葉形が丸く、商品価値のある個体を複製（クロー
ン化）してクローン苗を作成し、そしてこの苗を定植し
て育成できれば、全く同じ形態の葉をした個体が生産で
き、商品の均一化が図られるとともに苗の選別の必要も
なくなり、生産効率の向上及び低コスト化が可能になる
のである。

【０００６】この場合、クローン化技術としては、主に
さし木による方法と組織培養を応用した方法とが想定で
きる。さし木によるクローン増殖については、既に樹木
を含めた多くの植物で試みられているが、これが可能で
ある種とそうでない種とがあり、前記した丸葉ユーカリ
については、従来のいかなる方法を用いても、そのさし
木による増殖は困難である。

【０００７】一方、組織培養によるクローン増殖は、ラ
ンやキク科植物の一部で実用化されている他、樹木にお
いては、ポプラ、ラジアータパイン等、一部の種で可能
になったと報告されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、クロー
ン化の主な目的は、優良形質を備えた個体のクローン化
であり、生長性、収量、材積・材質、耐病性等々の優良
形質は、樹木の場合、成木にならないとこれを的確に判
断することができない。例えば丸葉ユーカリでは、前記
したように、種子から苗を育て、その苗の段階で形態的
に商品価値の高いものを選抜しているが、にもかかわら
ず、選抜した苗を植栽後ある程度生長させると、商品価
値のない形態をした個体が数多く出現するのである。そ
れ故、優良形質を備えた個体をクローン化しようとすれ
ば、必然的に成木や、ある程度年数が経過した個体から
のクローン化技術を確立する必要が生ずる。

【０００９】一方、樹木ではその樹齢が増すごとにポリ
フェノール性物質等の二次代謝産物が細胞内に蓄積さ
れ、これが培地中に流出すること等が原因となって、そ
の組織培養の際、種々の障害が生ずる。このため、成木
組織を材料とした、組織培養によるクローン増殖は困難
であると一般的に考えられ、こうした培養阻害物質によ
る組織への影響を回避すべく、短期間での培地の交換
や、活性炭等の吸着剤の添加など、種々の試みがなされ
ている。しかし、これらはいずれも、労力の増大、有用
成分の吸着などの新たな問題の発生を伴ってしまい、結
局のところ現在までに有効な手段は見出されていない。

【００１０】このような現状から、成木組織を材料とす
る組織培養によるクローン増殖技術の開発は、さし木等
の困難な樹木の大量クローン苗生産を実用レベルで実施
するために、重要な技術を提供するものとして切望され
ており、本発明はかかる現状に鑑み、生け花用として有
用な丸葉ユーカリにおいて、こうした技術、即ち、組織
培養による、成木を材料としたクローン増殖技術を提供
し、その苗の効率的、かつ簡便な生産方法を実現するこ
とを目的としてなされたものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
丸葉ユーカリ、即ち、Ｅ．グンニィ、Ｅ．シネレア、
Ｅ．ブリジェシアナ、Ｅ．ダルリムプレアナ、Ｅ．ルビ
ダの、組織培養によるクローン増殖について鋭意検討を
重ねた結果、上記目的は、培養に供試した組織を、その
増殖に先立って３ヶ月以上、増殖を抑制して培養するこ
とにより達成されることを見出し、本発明を完成した。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明をさらに詳細に説明する。
まず、本発明において材料として用いる植物組織の調製
方法について説明する。本発明における材料組織の調製
は、常法により行うことができるが、例えば、屋外に栽
培されている丸葉ユーカリより材料を採取する場合に
は、商品価値の高い形態をしている個体よりその当年生
枝を採取し、腋芽を含む組織を調製して表面殺菌を行っ
た後、炭素源、無機塩類を含んだ人工培地に置床し、シ
ュートを発生させればよい。このとき、人工培地として
ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）を用いることができる。

【００１３】なお、本発明は丸葉ユーカリであれば、そ
の樹齢を問題とすることなく材料として使用できる。た
とえ樹齢の若い個体でも、屋外に植栽してしまうとポリ
フェノール性物質等の培養阻害物質（かかる物質は植物
にとって防御的な働きをする。）が増加してしまうの
で、このような個体を材料としてクローン苗を生産する
場合には、本発明はやはりその効果を発揮する。しか
し、本発明の効果をより発揮させるためには、樹齢６か
月以上のものを材料とすることが好ましい。樹齢６か月
未満の個体ではその形質を的確に判断することができ
ず、従って本発明の方法を適用して増殖すべき、優良形
質を備えた個体の選抜が難しいからである。

【００１４】次に本発明では、得られたシュートを切り
取り、植物生長調節物質としてカイネチン（Ｋ）0.2mg/
l 未満、好ましくは0.01〜 0.1mg/l、または６−ベンジ
ルアミノプリン（ＢＡＰ）0.1mg/l 未満、好ましくは0.
01〜0.05mg/lを添加した培地に置床し、３か月あるいは
それ以上、同組成の培地で適当に継代しつつ、増殖を抑
制して培養する。植物生長調節物質をこの範囲内とする
ことにより、置床した組織はその増殖が抑制され、しか
も枯死してしまうことなく生き続け、またその増殖抑制
期間を３か月以上とすることにより、その後の高い増殖
効率が保証される。ちなみに、この増殖抑制期間は３か
月以上でありさえすれば、本発明の目的を達成すること
ができる。しかし経済的な観点からは、９か月以内とす
ることが現実に即しており、好ましい。なお、その他の
培養条件は、本発明において特に限定されるものではな
いが、好ましい培地としては、ショ糖を 10 〜 30g/lと
したＭＳ培地を例示することができる。

【００１５】かかる増殖抑制培養を経たシュートは、増
殖培地に移植されると急速に増殖し、例えば、増殖培地
として、ショ糖を 10 〜 30g/lとしたＭＳ培地に、植物
生長調節物質としてＫ 0.2〜1.0 mg/lまたはＢＡＰ 0.1
〜 0.5mg/lを添加したものを用いることで、複数の茎
葉、即ち多芽体（マルチプルシュート）が非常に高い確
率で誘導される。このマルチプルシュートは、同組成の
培地に１か月ごとに植え継ぐことにより増殖させること
ができ、また、必要に応じて伸長したシュートを切り取
り、適当な発根培地にさし付けて発根を誘導させれば、
個体を再生することもできる。

【００１６】発根工程は、従来法により行うこともでき
るが、先に出願人が特願平７−３１３２１３において提
案した光独立栄養培養による方法を用いて行なうと、よ
り有利である。

【００１７】以下に、両手法を用いた場合の培養条件等
を例示すると、まず、従来法による場合、培地として、
ＭＳ無機塩溶液を２〜８倍に稀釈したものにショ糖 5〜
20g/l と、植物生長調節物質としてオーキシン類である
５、６−ジクロロインドール酢酸（Cl₂ −ＩＡＡ） 0.1
〜 1.0mg/l、インドール酪酸（ＩＢＡ） 0.1〜 1.0mg/
l、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ） 0.1〜 2mg/lもしくはイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）2〜10mg/lのいずれか一つを単
独で加え、寒天あるいはゲランガムで固化させた人工培
地を用い、これにシュートをさし付けて発根させる。ま
た、寒天、ゲランガム等の代わりに、培地支持体とし
て、発泡フェノール樹脂、ロックウール、パルプ、セラ
ミックウール等の多孔性物質を用い、これを、寒天、ゲ
ランガム以外は上記と同様の組成を持つ液体培地で湿潤
させて使用してもよい。

【００１８】一方、光独立栄養培養による方法を用いる
場合は、２〜８倍に稀釈したＭＳ無機塩溶液に上記オー
キシン類のいずれか一つを単独で加えた人工液体培地
（ショ糖含有せず。）で、発泡フェノール樹脂等、多孔
性物質の培地支持体を湿潤させてこれにシュートをさし
付け、湿度70％以上、照度1000〜6000ルクス、培養容器
内の炭酸ガス濃度を 200〜 3500ppmに調整した環境条件
下で培養を行い、発根させる。この方法によれば、発根
培地中にショ糖等の炭素源を含まないため、雑菌汚染の
おそれがなく、培養組織を非無菌下で培養することがで
き、従って、発根・順化工程を一段階で行うことができ
る。また、光条件下、炭酸ガスを付与して光独立栄養を
行わせるため、正常な気孔が発達した葉を持つ、強健な
苗を作出することができる。

【００１９】いずれの場合でも、発根した個体は３ない
し４週間で育苗容器あるいはポットなどに移植でき、以
後は通常の育成で、植栽可能な苗として生産することが
できる。なおこのとき、培地支持体として発泡フェノー
ル樹脂等の多孔性物質を用いると、根が旺盛に発達する
他、育苗容器等への移植時に、この支持体ごと苗を移植
できるため手間がかからず、また、苗の根を痛めること
もない。

【００２０】

【作用】従来の組織培養による増殖は、供試試料から直
接に、あるいは一旦シュート等を発生させた後、マルチ
プルシュート等の増殖体を誘導する。しかし一般に樹木
では、樹齢が増すに従って、内生的にポリフェノール性
物質、テルペン、有機酸等がその細胞中に増加し、かか
る細胞からなる組織を培養した場合、細胞が破壊される
などしてこれらの物質が細胞外へ流れ出し、近接の細胞
や器官に直接・間接の障害を与える。このため、本発明
の対象である丸葉ユーカリにおいても、従来の方法で増
殖体の誘導を試みると、これらの障害物質の影響により
組織の褐変化が起こり、極めて高い確率で増殖体の誘導
前に組織が死滅する。

【００２１】一方、若い未熟な組織（juvenile）は、成
熟した組織（mature）に比べ、生長速度や再分化能が高
い。本発明では、培養組織の増殖に先立ち長期間、増殖
を抑制して培養を行うが、この間に培地組成、環境条件
等が誘因となって組織の未熟性が部分的に回復する現象
（rejuvenation）が起こり、その結果、組織が活発な増
殖や再分化能を示すようになるものと考えられる。従っ
て、増殖誘導培養に移行しても組織の褐変は殆ど観察さ
れず、非常に高い確率で増殖体が誘導できるのである。

【００２２】

【実施例】

［実施例１］５年生Ｅ．グンニィの当年生枝を採取して
葉を切除した後、節ごとに切断して試料を調製し、これ
を１％アンチフォルミン溶液（１％有効塩素）にて１０
〜２０分間表面殺菌した後、滅菌水で数回洗浄して培地
に置床した。このとき培地は、ショ糖 20g/lとしたＭＳ
培地に、ＢＡＰ 0.1mg/l、ゲランガム2.4g/lを添加し、
pH5.8 に調製したものを使用した。また培養環境条件
は、１６時間日長、照度3000〜5000ルクス、温度２４℃
±１℃に設定して行った（以下、特に断らない限り同
じ。）。シュートの発生は組織の置床後約３週間で観察
された。

【００２３】このシュートを切り取り、これをショ糖 2
0g/l、Ｋ 0.01 、0.1 mg/lまたはＢＡＰ 0.01 、0.05mg
/lを含むＭＳ固体培地（ゲランガム2.4g/l）に移植し、
３ヵ月間、１ヶ月に一度その若干伸長した部分を切り取
り、同組成の培地で継代しつつ培養した。この間、置床
したシュート基部に新たなシュート原基が若干形成され
たが、完全なシュートの分化は観察されなかった。

【００２４】次いでこの組織を、ショ糖 20g/l、Ｋ 0.2
mg/lを含むＭＳ固体培地（ゲランガム2.4g/l）に移植し
て、マルチプルシュートの誘導を行った。移植後、約１
ヶ月で複数のシュートが発生してマルチプルシュートが
形成され、これは以後、同一組成の培地に約１ヶ月ごと
に継代培養することで無限に増殖した。なお表１に示す
ように、このときマルチプルシュート誘導率は、マルチ
プルシュート誘導培地に置床したシュートに対して73〜
85％、培養開始時の供試試料からの誘導率に換算すると
60〜81％であった。

【００２５】

【表１】

【００２６】発根は、このマルチプルシュートから２cm
以上に伸長したシュートを切り取り、Cl₂ −ＩＡＡ 0.2
〜 0.5mg/lを含む４倍希釈ＭＳ無機塩溶液で発泡フェノ
ール樹脂成型品（空隙率65％）を湿潤させた発根培地に
さし付け、１６時間日長、照度3000〜5000ルクス、温度
２４〜２８℃、炭酸ガス濃度 300〜 3000ppm、湿度９０
％以上の環境下で培養することにより行った。発根形成
は約３週間で観察され、４週間目には発泡フェノール樹
脂成型品を付けたままで育苗箱に移植し、コントロール
されていない温室で通常に育成することができた。発根
率は、発根培地にさし付けたシュートに対し95％であ
り、さらに育苗箱への移植に際しての活着率は 100％で
あった。

【００２７】［比較例１］供試試料から発生したシュー
トを、ショ糖 20g/l、Ｋ 1.0mg/lを含むＭＳ固体培地
（ゲランガム2.4g/l）にて培養した後に、マルチプルシ
ュート誘導培地に移植した他は、実施例１と同様の条件
下でクローン苗の生産を行った。表１に示すように、こ
の場合のマルチプルシュート誘導率は、シュートに対し
ても、また培養開始時の供試試料に対しても、1 ％に過
ぎなかった。

【００２８】［比較例２］供試試料から発生したシュー
トを、ショ糖 20g/l、Ｋ 0.1mg/lまたはＢＡＰ 0.01 、
0.05mg/lを含むＭＳ固体培地（ゲランガム2.4g/l）にて
増殖抑制培養を行なったが、その期間が３か月未満であ
った他は、実施例１と同様の条件下でクローン苗の生産
を行なった。表１に示すように、この場合のマルチプル
シュート誘導率も、対シュート、対供試試料ともに 1％
であった。

【００２９】［実施例２］植物生長調節物質として、増
殖抑制培養時にＢＡＰ0.05mg/l、発根培養時にＩＢＡ
0.5mg/lを培地中に添加した他は実施例１と同様の条件
下で、他の丸葉ユーカリ、即ちＥ．シネレア、Ｅ．ブリ
ジェシアナ、Ｅ．ダルリムプレアナ、またはＥ．ルビダ
のクローン苗生産を行なった。表１に示すように、この
ときのマルチプルシュート誘導率は、マルチプルシュー
ト誘導培地に置床したシュートに対して44〜79％、培養
開始時の供試試料からの誘導率に換算すると40〜60％で
あった。

【００３０】［比較例３］増殖抑制培養期間が３か月未
満であった他は、実施例２と同様の条件下で、Ｅ．シネ
レア、Ｅ．ブリジェシアナ、Ｅ．ダルリムプレアナ、ま
たはＥ．ルビダのクローン苗生産を行なった。表１に示
すように、この場合のマルチプルシュート誘導率は、シ
ュートに対しても、培養開始時の供試試料に対しても、
1％以下であった。

【００３１】

【効果】本発明によれば、丸葉ユーカリ成木を材料とす
るクローン苗の生産を、効率的、かつ簡便に行うことが
可能となる。

【００３２】従って、遺伝的に均一な、即ち形態の均一
な苗を、経済的に大量生産できるばかりではなく、商品
価値のある形態的に優れた個体をある程度樹齢を経てか
ら選抜し、クローン苗生産用の材料とすることができる
ので、その優良形質を有する個体を確実に大量生産する
ことも可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村上 邦睦 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 丸葉ユーカリ、即ちユーカリプタス・グ
   ンニィ（Eucalyputu s gunnii）、ユーカリプタス・シ
   ネレア（Eucalyputus cinerea ）、ユーカリプタス・
   ブリジェシアナ（Eucalyputus bridgesiana ）、ユー
   カリプタス・ダルリムプレアナ（Eucalyputus dalrym
   pleana）、ユーカリプタス・ルビダ（Eucalyputus ru
   bida）より選ばれるユーカリ属の組織培養によるクロー
   ン苗の生産方法であって、、その増殖に先立ち、培養組
   織をカイネチン 0.2mg/l未満、または６−ベンジルアミ
   ノプリン0.1mg/l 未満を添加した培地にて、３か月以上
   増殖を抑制して培養することを特徴とする方法。