JPH09136923A

JPH09136923A - ポリマー

Info

Publication number: JPH09136923A
Application number: JP8201541A
Authority: JP
Inventors: M Hashem Akhavan-Tafti; アクハバン − タフティエム．ハシェム
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1996-07-31
Publication date: 1997-05-27
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: EP0561033B1; US5393469A; US5431845A; JP2648423B2; US5582775A; US5474725A; JP3471530B2; US5439617A; DE69230787T2; JPH05287267A; ATE190724T1; DE69230787D1; EP0561033A1

Abstract

(57)【要約】【課題】１，２−ジオキセタンからの化学ルミネッセ
ンスの増感剤となるポリマーを提供する。【解決手段】トリアルキル又はトリアラルキルホスフ
ィンとポリビニルポリマーとを反応させて得られるポリ
マー。そのポリマーは、好ましくは水溶性であり、酵素
で刺激可能な１，２−ジオキセタンと共に、免疫検査及
び核酸検査で使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、増感された化学ルミネ
ッセンスを発生させるために光発生１，２−ジオキセタ
ンと共に使用される増感剤ポリマーの類を記述する。

【０００２】

【従来の技術】増感剤は１，２−ジオキセタンから放出
される化学ルミネッセンスの量を増加させる物質であ
る。増感剤ポリマーは、１，２−ジオキセタンの量子収
量を増加させる作用を行うことができ、１，２−ジオキ
セタンの分解で作られる励起種によって励起され次に光
を放出する蛍光エネルギー受容体化合物を含むことが出
来る。増感剤は電子的に励起された生成物とより多くの
光とを発生させる１，２−ジオキセタン分子の比率を増
加させる作用をし得る。この発明の目的のため、増感さ
れた化学ルミネッセンスとは、バックグラウンドと比較
したときの放出される全光、最大光強度及び／又は反応
の光強度比率が、増感剤の不存在時に観察されるそれよ
りも大きいということを意味する。好ましい１，２−ジ
オキセタン反応は以下の通りである。

【０００３】

【化１】

【０００４】ここで、Ｒ₁、Ｒ₃及びＲ₄は種々の有機
基、Ｒ₂はＯＸ（Ｘ−オキシ）基によって置換されたア
リール基である。

【０００５】（１）ジオキセタンに関係しない化学ル
ミネッセンス反応の増感剤ペルオキシダーゼ酵素の存在下、過酸化物によるルミノ
ールの酸化からの化学ルミネッセンス出力を増感する、
４−置換フェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール
及びその誘導体並びに種々の芳香族アミンを含む種々の
物質が知られている（欧州特許第００８７９５９号明細
書；英国特許出願第ＧＢ２１６２９４６Ａ：Ｔ．Ｐ．ホ
ワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）等のネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）１５８（１９８３年））。増感剤の性
質は、よく知られておらず、酵素反応におけるレドック
ス媒介体として作用する増感物質によると考えられてい
る（Ｌ．Ｊ．クリッカ（Ｋｒｉｃｋａ）、Ｇ．Ｈ．Ｇ．
ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）及びＲ．Ａ．Ｗ．ストット（Ｓ
ｔｏｔｔ）、ＰｕｒｅａｎｄＡｐｐｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、５９（５）、６５１頁（１９８７年）；Ｇ．Ｈ．
Ｇ．ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）及びＬ．Ｊ．クリッカ（Ｋ
ｒｉｃｋａ）、生物ルミネッセンスと化学ルミネッセン
スの新しい眺望（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａ
ｎｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＮｅｗ
Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，１９９頁（１９
８７年））。増感は、いずれの場合であれ、励起された
アミノフタレート生成物の蛍光発生量の増加のためや、
或いは蛍光体へのエネルギー移行或いは化学的に作られ
る励起状態の生成量の増加によるものとは考えられてい
ない。

【０００６】（２）ジオキセタンに関係しない化学ル
ミネッセンスの界面活性剤による増感界面活性剤によるルミノールの化学ルミネッセンス酸化
反応が界面活性剤によって促進されることが報告されて
いる（Ｋ．Ｄ．ガンダーマン（Ｇｕｎｄｅｒｍａｎ
ｎ）、生物ルミネッセンスと化学ルミネッセンス（Ｂｉ
ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ頁１７，（１９８１年）；Ｄ．
Ｉ．メテリザ（Ｍｅｔｅｌｉｔｚａ）、Ａ．Ｎ．エリオ
ミン（Ｅｒｙｏｍｉｎ）及びＶ．Ａ．シバエフ（Ｓｃｈ
ｉｂａｅｖ）、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．ａｎｄＣｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎ．７，２１（１９８２年））。ルシフェ
リン（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）の化学的酸化からの化学ル
ミネッセンスは、種々の界面活性剤の存在下で、励起状
態生成物の蛍光量子収量の増加によって、増加すること
が報告されている（Ｔ．ゴトウ（Ｇｏｔｏ）及びＨ．フ
カツ（Ｆｕｋａｔｓｕ）、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬ
ｅｔｔ．、４２９９、（１９６９年））。他方では、ル
シフェリンの酵素酸化は、非イオン性の界面活性剤の存
在下で、酵素の変換率（ｔｕｒｎｏｖｅｒｒａｔｅ）の
増加によって増加することも発見されている（Ｌ．Ｊ．
クリッカ（Ｋｒｉｃｋａ）及びＭ．デルカ（ＤｅＬｕｃ
ａ）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２
１７、６７４（１９８２年））。カチオン界面活性剤に
よってアクリジニウムエステルの化学ルミネッセンス酸
化が増感されたのは、競合する非化学ルミネッセンス側
の反応を抑制したことによるものと報告されている
（Ｆ．マッカプラ（ＭｃＣａｐｒａ），Ａｃｃ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｒｅｓ．、９、２０１（１９７６年））。チャン
（Ｃｈａｎｇ）の米国特許第４，９２７，７６９号明細
書は種々の増感剤を開示する。

【０００７】（３）ジオキセタンの化学的刺激（trig
gering）文献の最初の例は、２，３−ジアリール−１，４−ジオ
クセンから誘導されたヒドロキシ置換ジオキセタンにつ
いて記述している（Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａａｐ）
及びＳ．ギャノン（Ｇａｇｎｏｎ）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ、１０４、３５０４（１９８２年））。
しかし、ヒドロキシ置換ジオキセタン、及びジアリール
−１，４−ジオクセンから誘導されるジオキセタンの他
の例は全て、２５℃において数時間の半減期しかなく比
較的不安定である。更に、これら安定化されていないジ
オキセタンは、少量のアミン（Ｔ．ウィルソン（Ｗｉｌ
ｓｏｎ）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．：Ｃｈｅｍ．Ｓｅ
ｒ．Ｔｗｏ，９，２６５（１９７６年）及び金属イオン
（Ｔ．ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｍ．Ｅ．ランディ
ス（Ｌａｎｄｉｓ），Ａ．Ｌ．バウムスターク（Ｂａｕ
ｍｓｔａｒｋ），及びＰ．Ｄ．バートレット（Ｂａｒｔ
ｌｅｔｔ）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９
５，４７６５（１９７３年）；Ｐ．Ｄ．バートレット
（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）、Ａ．Ｌ；バウムスターク（Ｂａ
ｕｍｓｔａｒｋ），及びＭ．Ｅ．ランディス（Ｌａｎｄ
ｉｓ），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６，５５
５７（１９７４年）で分解され、双方の成分は、生物学
的検査のための水性の緩衝液中で使用されている。

【０００８】安定化されたジオキセタン類が化学的に刺
激される例は、最初、Ｓｃｈａａｐの米国特許第４，８
５７，６５２号明細書及び文献（Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓ
ｃｈａａｐ），Ｔ．Ｓ．チェン（Ｃｈｅｎ），Ｒ．Ｓ．
ハンドレイ（Ｈａｎｄｌｅｙ），Ｒ．デシルバ（ＤｅＳ
ｉｌｖａ），及びＢ．Ｐ．ジリ（Ｇｉｒｉ），Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１１５５（１９８７年）
に報告された。これらのジオキセタンは数年の熱半減期
を呈するが、必要により刺激されて効果的な化学ルミネ
ッセンスを生じる。

【０００９】（４）ジオキセタン類の酵素による刺激ジオキセタンの酵素による刺激の最初の例は、シャープ
（Ｓｃｈａａｐ）の米国特許第４，８５７，６５２号明
細書、及び一連の文献（Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａａ
ｐ），Ｒ．Ｓ．ハンドレイ（Ｈａｎｄｌｅｙ），及び
Ｂ．Ｐ．ジリ（Ｇｉｒｉ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，９３５（１９８７年）；Ａ．Ｐ．シャープ
（Ｓｃｈａａｐ），Ｍ．Ｄ．サンディソン（Ｓａｎｄｉ
ｓｏｎ），及びＲ．Ｓ．ハンドレイ（Ｈａｎｄｌｅ
ｙ），ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１１５９
（１９８７年）及びＡ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａａ
ｐ），Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，４
７Ｓ，５０Ｓ（１９８８年））に記述されている。保護
されたヒドロキシアリール置換基を有する極めて安定な
アダマンチル置換ジオキセタンは、保護基を除去する酵
素の作用により刺激されて光を放出して分解する。ヒド
ロキシアリール基は、引続きｐＨ＞９において、分解速
度を劇的に増加させる強い電子ドナーであるアリールオ
キサイドアニオンに変換される。その結果、ゆっくりと
した熱分解から生ずる強度よりも数次のオーダーの大き
さの強度の化学ルミネッセンスが放出される。ブロンス
タイン（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）のＰＣＴ８８００６９５
号はやはり、酵素で刺激され得るジオキセタンを、ブロ
ンシュタイン（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）の米国特許第４，
９７８，６１４号、４，９５２，７０７号５，０３
２，３８１号、及び４，９３１，２２３号明細書と同様
に記載している。これら参照文献に記述された刺激可能
なジオキセタンからの化学ルミネッセンスは、本発明の
ポリマーにより増感され得る。

【００１０】（５）ジオキセタン類に共有結合により
結合された蛍光増感剤。付加された蛍光基を有する安定で刺激可能なジオキセタ
ンは、シャープ（Ｓｃｈａａｐ）の米国特許第５，０１
３，８２７号明細書に記載されている。これらの化合物
は、化学ルミネッセンスの増感が初期に励起されたメタ
−オキシ−安息香酸塩発色団からもっと高い蛍光フルオ
ロ燐酸団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）への無放射の分子
間エネルギー移行により起るという点において、本発明
と異なっている。

【００１１】（６）界面活性剤の存在下でのジオキセ
タン類からの増感された化学ルミネッセンス単離できないジオキセタンに関係すると考えられている
化学ルミネッセンス反応が、膠質溶液で増感された
（Ｓ．新海（Ｓｈｉｎｋａｉ），Ｙ．石川（Ｉｓｈｉｋ
ａｗａ），Ｏ．マナベ（Ｍａｎａｂｅ）及びＴ．国武
（Ｋｕｎｉｔａｋｅ）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５２３
（１９８１年）。増感のメカニズムは、依然として証明
されていないが、筆者等は、励起状態の生成物の収量
は、疏水性の膠質環境のもとでは、水に比較して増加し
得るものと示唆している。

【００１２】シャープ（Ｓｃｈａａｐ）等は、アンモニ
ウム界面活性剤と蛍光体とを含む水溶性の物質の存在下
で、酵素で刺激され安定な１，２−ジオキセタンの分解
によって生じる化学ルミネッセンスが増感されることを
最初に報告している。蛍光性の膠質成分であるセチルト
リメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）及び５−（Ｎ
−テトラデカノイル）アミノフルオレセインは、中間体
のヒドロキシ置換ジオキセタンを捕捉し、化学ルミネッ
センス量子収量を４００倍に増加させる。増感は、励起
状態のエステルのアニオンの形から、極めて近接して捕
捉されているフルオレセイン化合物への効果的な分子間
エネルギー移行と、界面活性剤の疏水的環境のために起
る。（Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａａｐ），Ｈ．アクハ
バン（Ａｋｈａｖａｎ）及びＬ．Ｊ．ロマノ（Ｒｏｍａ
ｎｏ），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５（９），１８６３
（１９８９年））。

【００１３】

【化２】

【００１４】シャープ（Ｓｃｈａａｐ）の米国特許第
４，９５９，１８２号及び第５，００４，５６５号明細
書は、アンモニウム界面活性剤及び蛍光体の存在下で、
安定なジオキセタン類を化学的及び酵素的に刺激して化
学ルミネッセンスを増感する別の例を記述する。

【００１５】ＣＡＴＢと上述のフルオレセイン界面活性
剤若しくは１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシベンゾチ
アキシアミドのいずれかとから形成される蛍光体膠質
は、ヒドロキシ−、及びアセトキシ−置換ジオキセタン
の塩基刺激による分解からの化学ルミネッセンスを増感
し得る。ＣＡＴＢそれ自身が、ジオキセタン１の化学ル
ミネッセンスを増感し得ることも報告されている。（シ
ャープ（Ｓｃｈａａｐ）の米国特許第４，９５９，１８
２号及び第５，００４，５６５号明細書）。燐酸塩で保
護されたジオキセタン１（Ｌｕｍｉｇｅｎ^RＰＰＤ）
は、アルカリ性のホスファターゼの感度の高い検出用と
して商業的に有用であることが証明されている。既製の
液処方Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R５３０を使用しての化学ル
ミネッセンスの検出が、サザンブロッティング（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）（Ｄ．ポラード−ナイ
ト（Ｐｏｌｌａｒｄ−Ｋｎｉｇｈｔ），Ａ．Ｃ．シモン
ズ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ），Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａ
ａｐ），Ｈ．アクハバン（Ａｋｈａｖａｎ），及びＭ．
Ａ．Ｗ．ブラディ（Ｂｒａｄｙ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１８５，３５３（１９９０年））、ＤＮＡプロ
ーブサンドイッチ検査に基づいたマイクロ滴定板（Ｊ．
Ｍ．クライン（Ｃｌｙｎｅ），Ｊ．Ａ．ラニング（Ｒｕ
ｎｎｉｎｇ），Ｒ．サンチェツ−ペスカドール（Ｓａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ），Ｄ．ベセマー（Ｂｅｓ
ｅｍｅｒ），Ｍ．ステピーン（Ｓｔｅｍｐｉｅｎ），
Ａ．Ｐ．シャープ（Ｓｃｈａａｐ）．Ｒ．Ｓ．ステフェ
ン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ），Ｍ．Ｓ．アーディー（Ｕｒｄ
ｅａ），Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎ．２，１９３（１９８８年））、及びウェスタンブロ
ッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）
（Ｒ．オバーフェルダー（Ｏｂｅｒｆｅｌｄｅｒ），Ｆ
ｏｃｕｓ，１３，５０（１９９１年）；Ｇ．Ｓ．サンデ
ュー（Ｓａｎｄｈｕ），Ｂ．Ｗ．エクロフ（Ｅｃｋｌｏ
ｆｆ），Ｂ．Ｃ．クライン（Ｋｌｉｎｅ），ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｑｕｅｓ１１，１４（１９９１年））において
採用された。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】ブロンスタイン（Ｂｒ
ｏｎｓｔｅｉｎ）の米国特許第４，９７８，６１４号明
細書及び英国特許出願第８９／１４７４９．０号（ＧＢ
２，２３３，４５１Ａ）は、単独若しくはフルオレセ
インとの混合での高分子第４級アンモニウム化合物によ
るジオキセタン化学ルミネッセンスの増感を開示する。
化学ルミネッセンスを増感すると報告されている他の物
質には、牛のアルブミンのような球状のプロテイン、第
４級アンモニウム界面活性剤、窒素含有ポリマー及びポ
リエーテルが含まれる。ホスホニウムポリマーは開示さ
れていない。

【００１７】（７）高分子ホスホニウム塩ポリビニルベンジルトリメチルホスホニウム塩、ポリビ
ニルベンジルトリメエルホスホニウム塩、及びポリビニ
ルベンジルトリブチルホスホニウム塩は、報告されてい
ない。ポリビニルベンジルトリヘキシルホスホニウム塩
は、ジビニルベンゼンとの共重合体として調製されたも
のが特許において開示されている（ＰＣＴ国際出願Ｗ
Ｏ８９０６３８０Ａｌ１９８９年７月１３日）。ポ
リビニルベンジルジエチルフェニルホスホニウム塩は、
スチレンとの共重合体として調製されたものが特許にお
いて開示されている（特開昭第６３−２４３９６４号公
報、１９８８年１０月１１日）。ポリビニルベンジルト
リオクチルホスホニウム塩は、一連の特許（米国特許第
４，３３８，０９５号明細書、Ａ１９８２年７月６日
及びＥＰＡ２８，１２３欧州特許出願ＥＰ第８２３３
号、１９８０年２月２０日、欧州特許出願ＥＰ第２８
１２３号、１９８１年５月６日）において、ビリルビン
（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）の蛍光検出に有用であると開示
されている。ポリビニルベンジルトリフェニルホスホニ
ウム塩は、文献において、界面活性剤、相転移触媒及び
有機合成における試薬として使用されるものとして周知
である。ポリビニルベンジルトリフェニルホスホニウム
塩のアクリル酸、ブタジエン及びジビニルベンゼンとの
共重合体は公知である。前述のポリマー及びコポリマー
のいずれも、１，２−ジオキセタンの化学ルミネッセン
スの増感のために使用されていない。これら高分子ホス
ホニウム塩と共有結合した蛍光体の報告はされていな
い。混合されたペンダント基を有するポリビニルベンジ
ルトリアルキルホスホニウム塩は報告されていない。

【００１８】本発明は、高分子ホスホニウム塩、特に水
溶性ポリビニルホスホニウム塩ポリマーを提供すること
を目的とする。本発明はまた、蛍光性の基が化学結合に
より又はイオン的若しくは疎水的相互作用により結合さ
れた高分子ホスホニウム塩を提供することを目的とす
る。

【００１９】本発明は、更に、高分子ホスホニウム塩の
存在下で酵素を含む化学試薬により刺激されて増感され
た化学ルミネッセンスを発生し得る安定な１，２−ジオ
キセタンを包含する方法及び組成物を提供することを目
的とする。

【００２０】更に本発明は、イオン的若しくは疎水的相
互作用により、ポリマーに結合され若しくはポリマーに
組み合わされる得る蛍光性化合物或いは蛍光性基にエネ
ルギーを移転することにより、化学ルミネッセンスをさ
らに増感するための方法及び組成物を提供することを目
的とする。更に本発明は、酵素の検出方法及び組成物、
並びに、免疫検査及びこの分野で一般に知られている酵
素に結合された核酸、抗体及び抗原の検出に使用される
方法及び組成物に関連している。

【００２１】

【課題を解決するための手段】

一般的な説明本発明は、高分子ホスホニウム塩の存在下で安定な１，
２−ジオキセタンからの増感された化学ルミネッセンス
を発生させる方法に関するもので、光を発生させる溶液
若しくは表面に、安定な１，２−ジオキセタン及び高分
子ホスホニウム塩を含む溶液を供給すること；及び活性
化剤により前記１，２−ジオキセタンを刺激して、増感
された化学ルミネッセンスを発生させること；を含む方
法である。その方法は、特に、プローブ若しくは酵素に
組み合わされる検査に関係している。

【００２２】更に、本発明は、安定な１，２−ジオキセ
タン及び高分子ホスホニウム塩を含む組成物であって、
増感された化学ルミネッセンスが、高分子ホスホニウム
塩の不存在の場合に得られる化学ルミネッセンスに比し
て、高分子ホスホニウム塩の充分な量の存在下で溶液内
若しくは表面上に発生する組成物に関する。

【００２３】本発明は、トリＡホスフィンをポリビニル
ポリマーと反応させることにより調製されるポリビニル
リンク（Ｌｉｎｋ）トリＡホスホニウム基を有するポリ
マーに関し、リンクは、ポリマーと１〜２０の炭素原子
を含有するホスホニウムカチオンとを結合する結合基
（ｌｉｎｋｉｎｇｇｒｏｕｐ）であり、Ａは、１〜２
０個の炭素原子を含有するアルキル又は夫々が１〜２０
個の炭素原子を含有するアルキル基及びアラルキル基か
らなる群から選択される。

【００２４】本発明は、ポリビニルリンクトリＡホスホ
ニウム塩及び蛍光性基を有するポリマーに関し、リンク
は、ポリマーと１〜２０の炭素原子を含有するホスホニ
ウムカチオンとを結合する結合基であり、Ａは、１〜２
０の炭素原子を含有するアルキル又は夫々が１〜２０の
炭素原子を含有するアルキル基及びアラルキル基からな
る群から選択され、更に、蛍光性基はポリマーに結合し
ている。

【００２５】本発明は、更に、Ａが１〜２０の炭素原子
を含有するアルキルと１〜２０の炭素原子を含有するア
ルキル又はアラルキル基とから成る群から選択されるも
のとして、反応混合物においてポリビニルリンク（Ｌｉ
ｎｋ）ハライドポリマーと、ポリビニルハライドの有機
溶媒中のトリＡホスフィンを反応させること；及び反応
混合物からポリマーを分離することを含むポリビニルホ
スホニウム塩で置換されたポリマーの製造方法に関す
る。反応温度は、約０〜１００℃の間である。

【００２６】本発明は、特に、高分子ホスホニウム塩
と、酵素を含む化学試薬により刺激されて化学ルミネッ
センスを発生し得る安定な１，２−ジオキセタンとを含
有する組成物に関する。本発明の実施に有用な安定なジ
オキセタンは次の化学式のものであり得る：

【００２７】

【化３】

【００２８】式中、Ｒ₃及びＲ₄は、相互に結合可能な
有機基であり、Ｒ₁はＲ₂と結合可能な有機基であり、
またＲ₂は、酸、塩基、塩、酵素、無機及び有機触媒及
び電子ドナーから選択される活性化剤により刺激されて
化学的に不安定な基Ｘを除去したときに不安定な酸化物
中間体ジオキセタン化合物を生成するＸ−オキシ基で置
換されたアリール基を表す。ＯＸ基は、ヒドロキシル、
トリアルキル、若しくはアリールシリルオキシ、無機酸
素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリール及
びアルキルカルボキシルエステルから選択され得る。不
安定な酸化物中間体ジオキセタンは、分解し、電子エネ
ルギーを放出して光と、次の化学式の化合物を有する２
つのカルボニルを生じる：

【００２９】

【化４】

【００３０】本発明を実施する好適な方法は、次の化学
式の安定なジオキセタンを使用する

【００３１】

【化５】

【００３２】式中、Ｒ₆は、１〜２０個の炭素原子を含
有する低級アルキル若しくはアルカリルから選ばれ、ま
た付加的にヘテロ原子を含むことができ、Ｒ₅Ｃは、６
〜３０個の炭素原子を含有するスピロ縮合環、及び多環
式の有機基から選ばれ、また付加的にヘテロ原子を含有
することができ、更に、Ａ_rは、置換され得若しくは置
換され得ないアリール、バイアリール、ヘテロアリー
ル、縮合環の多環式アリール若しくはヘテロアリール基
から選択され、ＯＸは、酸、塩基、塩、酵素、無機及び
有機触媒及び電子ドナーから選ばれる活性化剤によって
刺激されて化学的に不安定な基Ｘを除去したときに、不
安定な酸化物中間体を形成するＸ−オキシ基である。

【００３３】本発明は、ポリビニルホスホニウム塩増感
剤の存在下で活性化剤により刺激されて化学ルミネッセ
ンスを発生させる安定な１，２−ジオキセタンを含有す
る組成物に関連している。本発明を実施する上で特に有
用な増感剤は次の化学式

【００３４】

【化６】

【００３５】を有する。式中、Ａは１〜２０個の炭素原
子を含有する低級アルキル、アリール、若しくはアラル
キル基、ｍは１と１４の間の整数、ｎ及びｐは約１０と
１００の間の整数である。特定の燐原子上にあるＡ基
は、全て同じ基であり得、また２つの異なる基であり
得、若しくは全ての３つが異なることも出来る。隣接す
る燐原子上のＡ基の組合わせは、同じ組合わせにでき、
或いは異なる組合わせとすることができ、その場合、組
合わせは上述に従う。芳香環上の置換基の相対的位置
は、オルト、メタ、パラ、若しくはいかなる比率であれ
その３つの型の混合とすることが出来る。

【００３６】本発明は、特に、ポリビニルホスホニウム
塩の存在下で活性化剤により刺激されて化学ルミネッセ
ンスを発生させ得る安定な１，２−ジオキセタンを含有
する組成物に関連しており、ポリビニルホスホニウム塩
には下記式に従い蛍光基が結合している：

【００３７】

【化７】

【００３８】式中、Ａは１〜２０個の炭素原子を含有す
る低級アルキル、アリール、アラルキル基から選ばれ、
ｍは１と１４の間の整数、ｎ及びｐは約１０と１００の
間の整数、Ｆｌは蛍光基である。特定の燐原子上にある
Ａ基は、全て同じ基であり得、また２つの異なる基であ
り得、若しくは全ての３つが異なることも出来る。隣接
する燐原子上のＲ基の組合わせは、同じ組合わせにで
き、或いは異なる組合わせとすることができ、その場
合、組合わせは上述に従う。芳香環上の置換基の相対的
位置は、オルト、メタ、パラ若しくはいかなる比率であ
れその３つの型の混合とすることが出来る。結合された
蛍光基は、ポリマーと化学的に結合でき且つジオキセタ
ン生成物の励起状態と対比してシングレットの電子的励
起状態の低いエネルギーを有するいかなる蛍光剤とする
ことも出来る。蛍光基は、ジオキセタンの化学ルミネッ
センス効率を、光の形のエネルギー受容体として作用す
ることにより高め、光の形で励起エネルギーを放出す
る。本発明を実施する上で有用な蛍光剤の例には、もっ
ともこれらの何れにも制限されるものではないが、いか
なるものであれ蛍光染料、並びに、多環式の芳香族化合
物、ビフェニル、ターフェニル、スチルベンゼン、複素
芳香族及び多環式複素芳香族化合物を含む芳香族、例え
ば、アクリジン、クマリン、フタロシアニン、フラン、
オキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、キサンテ
ン、フルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体、例え
ばアミドフルオレセイン、エオシン、及びエオシン誘導
体、ローダミン、及びレソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉ
ｎｓ）が含まれる。

【００３９】本発明は、以下の化学式：

【００４０】

【化８】

【００４１】のポリビニルホスホニウム塩に関する。な
お、式中、Ａは１〜２０個の炭素原子を含有する低級ア
ルキル、アリール、アラルキル基から選ばれ、ｍは１と
１４の間の整数、ｎ及びｐは約１０と１００との間の整
数である。特定の燐原子上にあるＡ基は、全て同じ基で
あり得、また２つの異なる基であり得、若しくは全ての
３つが異なることも出来る。隣接する燐原子上のＡ基の
組合わせは、同じ組合わせにでき、或いは異なる組合わ
せとすることができ、その場合、組合わせは上述に従
う。芳香環上の置換基の相対的位置は、オルト、メタ、
パラ若しくはいかなる比率であれその３つの型の混合と
することが出来る。

【００４２】本発明は、以下の化学式に従って蛍光基と
結合しているポリビニルホスホニウム塩ポリマーに関す
る：

【００４３】

【化９】

【００４４】式中、Ａは１〜２０個迄の炭素原子を含有
する低級アルキル、アリール、アラルキル、アルキアリ
ル基から選ばれ、ｍは１と１４の間の整数、ｎ及びｐは
約１０と１００の間の整数、Ｆｌは蛍光基である。特定
の燐原子上にあるＡ基は、全て同じ基であり得、また２
つの異なる基であり得、若しくは３つの全てが異なるこ
とも出来る。隣接する燐原子上のＡ基の組合わせは、同
じ組合わせにでき、或いは異なる組合わせとすることが
でき、その場合、組合わせは上述に従う。芳香環上の置
換基の相対的位置は、オルト、メタ、パラ若しくはいか
なる比率であれその３つの型の混合とすることが出来
る。結合された蛍光基は、ポリマーと化学的に結合でき
且つジオキセタン生成物の励起状態と対比してシングレ
ットの電子的励起状態の低いエネルギーを有するいかな
る蛍光剤とすることも出来る。蛍光基は、ジオキセタン
の化学ルミネッセンス効率を、光の形のエネルギー受容
体として作用することにより高め、光の形で励起エネル
ギーを放出する。本発明を実施する上で有用な蛍光剤の
例には、もっともこれらの何れにも制限されるものでは
ないが、いかなるものであれ蛍光染料；並びに、多環式
の芳香族化合物、ビフェニル、ターフェニル、スチルベ
ンゼン、複素芳香族及び多環式複素芳香族化合物を含む
芳香族、例えば、アクリジン、クマリン、フタロシアニ
ン、フラン、オキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリ
ン、キサンテン、フルオレセイン、及びフルオレセイン
誘導体、例えばアミドフルオレセイン、エオシン、及び
エオシン誘導体、ローダミン、及びレソルフィンが含ま
れる。特に有用な増感剤は、フルオレセインを共有結合
で結合された蛍光体として利用する。ポリマーと結合さ
れた蛍光基の量は、重量比で（Ｗ／Ｗ）約０．００１％
から約１０％の範囲であり、好ましくは、約０．０１％
から約１％である。

【００４５】本発明は、更に、高分子ホスホニウム塩の
存在下でジオキセタンにより放出される化学ルミネッセ
ンスの量が、増感剤物質の不存在下での光放出量よりも
大きい組成物に関連している。増感の程度は、燐原子を
置換するＡ基の性質に依存する。増感の程度は、使用さ
れる増感剤の濃度にも依存する。化学ルミネッセンス強
度の増幅は、約０．００１％から約１０％の範囲にある
増感剤の濃度と共に生ずる。増感剤は好ましくは重量比
で約０．０１％と約０．１％の間の濃度で使用される。

【００４６】本発明は、ポリビニルホスホニウム塩増感
剤を、下記式の安定な１，２−ジオキセタン存在下で供
給することを含む、光を発生させる改良された方法に関
する：

【００４７】

【化１０】

【００４８】式中、Ｒ₃及びＲ₄は、相互に結合可能な
有機基であり、Ｒ₁はＲ₂と結合可能な有機基で、Ｒ₂
は、酸、塩基、塩、酵素、無機及び有機触媒及び電子ド
ナーから選択される活性化剤により刺激されて化学的に
不安定な基Ｘを除去したときに不安定な酸化物中間体ジ
オキセタン化合物を生成する、Ｘ−オキシ基によって置
換されたアリール基を示す。ＯＸ基は、ヒドロキシル、
トリアルキル、若しくはアリールシリルオキシ、無機酸
素酸塩、燐酸塩、硫酸塩、酸素ピラノシド、アリール及
びアルキルカルボン酸エステルから選択され得る。不安
定な酸化物中間体ジオキセタンは、分解し、電子エネル
ギーを放出して、光と次の化学式の化合物を有する２つ
のカルボニルとを形成する：

【００４９】

【化１１】

【００５０】この化合物は、化学ルミネッセンスを発生
させるために、活性化剤により高分子ホスホニウム塩の
存在下で刺激される。

【００５１】本発明は、ポリビニルホスホニウム塩増感
剤の存在下で活性化剤により刺激されて化学ルミネッセ
ンスを発生させ得る安定な１，２−ジオキセタンを供給
することを含む、光を発生させるための改良された方法
に関する。本発明の実施で有用な増感剤は次の式である
とすることが出来る：

【００５２】

【化１２】

【００５３】式中、Ａは１〜２０個の炭素原子を含有す
る低級アルキル、アリール、アラルキル基から選ばれ、
ｍは１と１４の間の整数、ｎ及びｐは約１０と１００と
の間の整数である。特定の燐原子上にあるＡ基は、全て
同じ基であり得、また２つの異なる基であり得、若しく
は全ての３つが異なることも出来る。隣接する燐原子上
のＡ基の組合わせは、同じ組合わせとでき、或いは異な
る組合わせとすることができ、その場合、組合わせは上
述に従う。

【００５４】本発明は、蛍光基（Ｆ１）が下記式にした
がって結合したポリビニルホスホニウム塩増感剤の存在
下で、活性化剤により刺激されて化学ルミネッセンスを
発生させ得る安定な１，２−ジオキセタンを供給するこ
とを含む、光を発生させるための改良された方法に関す
る：

【００５５】

【化１３】

【００５６】式中、Ａは１〜２０個の炭素原子を含有す
る低級アルキル、アリール、アラルキル基から選ばれ、
ｍは１と１４の間の整数、ｎ及びｐは約１０と１００と
の間の整数、Ｆｌは蛍光基である。特定の燐原子上にあ
るＡ基は、全て同じ基であり得、また２つの異なる基で
あり得、若しくは３つの全てが異なることも出来る。隣
接する燐原子上のＡ基の組合わせは、同じ組合わせにで
き、或いは異なる組合わせとすることができ、その場
合、組合わせは上述に従う。芳香環上の置換基の相対的
位置は、オルト、メタ、パラ若しくはいかなる比率であ
れその３つの型の混合とすることが出来る。結合された
蛍光基は、ポリマーと化学的に結合でき且つジオキセタ
ン生成物の励起状態と対比してシングレットの電子的励
起状態のための低いエネルギーを有するいかなる蛍光剤
とすることも出来る。蛍光基は、ジオキセタンの化学ル
ミネッセンス効率を、光の形のエネルギー受容体として
作用することにより高め、光の形で励起エネルギーを放
出する。本発明を実施する上で有用な蛍光剤の例には、
もっともこれらの何れにも制限されるものではないが、
蛍光染料、並びに、多環式の芳香族化合物、ビフェニ
ル、ターフェニル、スチルベンゼン、複素芳香族及び多
環式複素芳香族化合物を含む芳香族、例えば、アクリジ
ン、クマリン、フタロシアニン、フラン、オキサゾー
ル、ベンゾチアゾール、キノリン、キサンテン、フルオ
レセイン、及びフルオレセイン誘導体、例えばアミドフ
ルオレセイン、エオシン、及びエオシン誘導体、ローダ
ミン、及びレソルフィンが含まれる。

【００５７】更に、本発明は、イオン的若しくは疎水的
な相互作用によりホスホニウム塩と化学的に結合若しく
は組み合わされ得る蛍光化合物へエネルギーを移行させ
ることにより化学ルミネッセンスをさらに増感する方法
に関する。本発明を実施する上で有用な蛍光剤の例に
は、もっともこれらの何れにも制限されるものではない
が、いかなるものであれ蛍光染料；並びに、多環式の芳
香族化合物、ビフェニル、ターフェニル、スチルベンゼ
ン、複素芳香族及び多環式複素芳香族化合物を含む芳香
族、例えば、アクリジン、クマリン、フタロシアニン、
フラン、オキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、
キサンテン、フルオレセイン、及びフルオレセイン誘導
体、例えばアミドフルオレセイン、エオシン、及びエオ
シン誘導体、ローダミン、及びレソルフィンが含まれ
る。

【００５８】更に、本発明は、ポリビニルホスホニウム
塩増感剤の存在下で、酸、塩基、塩、酵素、無機及び有
機触媒、及び電子ドナーから選択される活性化剤によっ
て刺激される安定な１，２−ジオキセタンからの化学ル
ミネッセンスを検出する改良された方法に関する。本発
明は、また、酸、塩基、塩、酵素、無機及び有機触媒、
及び電子ドナーから選択される活性化剤を、ポリビニル
ホスホニウム塩増感剤によって検出するための改良され
た方法に関する。

【００５９】更に、本発明は、免疫検査例えばエリサ
（ＥＬＩＳＡ）中において酵素を検出し、且つ、酵素に
結合される核酸、抗体、抗原を検出するための方法及び
組成物に関する。放出される光の検出は発光計、Ｘ線フ
ィルム、若しくはカメラ及び光学フィルムを使用して容
易に行うことができる。

【００６０】ポリビニルホスホニウム塩の陰イオンは、
好ましくは、塩化物である。別の陰イオンには、アジ化
合物、臭化物、沃化物、弗化物、流化物、窒化物、及び
カルボン酸塩が含まれ、これら全ては、好ましくは水溶
性で非干渉的（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）であ
る。これらは、直接に若しくはイオン交換により製造し
得る。

【００６１】別のポリビニルホスホニウムは、例えば以
下の化学式：

【００６２】

【化１４】

【００６３】のものがあり、また、スチレン若しくはジ
ビニルベンゼンを有する共重合体がある。

【００６４】

【化１５】

【００６５】

【実施例】

（１）ポリビニルホスホニウム塩増感剤の合成全てのポリマーは、下記の一般的な反応により製造し
た：

【００６６】

【化１６】

【００６７】ポリビニルベンジルトリメチルホスホニウ
ムクロライド（（ポリマーＴＭ）（反復単位の分子量２
２８．７ｇ／ｍｏｌ）：１００ｇのポリ（ビニルベンジ
ルクロライド）（モノマー−ポリマーラボラトリーズ
（Ｍｏｎｏｍｅｒ−ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ），Ｔｒｅｖｏｓｅ，ＰＡ））を、無水ＤＭＦ
（約５０ｍＬ）に溶解した。ポリマーを完全に溶解後、
トルエン（アルドリッヒＡｌｄｒｉｃｈ製，ミルウォー
キー，ＷＩ）中の１Ｍのトリメチルホスファイン１９．
７ｍＬ（０．０１９７ｍｏｌ，出発ポリマーの反復単位
の等量の３倍）を、溶液に加えた。反応容器を次に窒素
でパージした。反応混合物を次に４日間攪拌し続けた。
この間で、ポリマー生成物は沈殿した。僅かに黄色がか
った白色の固体ポリマーを、次に濾過で除き、１リット
ル程度のトルエンで洗浄した。完全に空気乾燥した後、
１．４１ｇの少し灰色がかった白色の固体が得られた。
（完全に置換したとすると収率９４．１％）。Ｄ₂Ｏ中
でのＮＭＲによるこのポリマーの特性は以下の通りであ
った：¹ ＨＮＭＲδ＝７．０及び６．６（４Ｈ），３．６
（１．７Ｈ），１．７（１１．８Ｈ）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７，４１，３１，７（タ
ブレット）；³¹ ＰＮＭＲδ＝２７−２５．５

【００６８】ビニルベンジルトリメチルホスホニウムク
ロライド、ビニルベンジルフルオレセイン（ポリマーＴ
Ｍ／Ｆ）の共重合体。（反復単位の分子量＝２２８．７
０ｇ／ｍｏｌ）；１．００ｇのポリビニルベンジルクロ
ライド）（モノマー−ポリマーラボラトリーズ）を、
無水ＤＭＦ中に溶解させた。ポリマーが完全に溶解した
後に、染料含有量約７０％の水溶性のフルオレセイン１
０ｍｇ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））、及びトル
エン（アルドリッチ）中の１Ｍのトリフェニルホスフィ
ン１９．７ｍＬ（０．０１９７ｍｏｌ、出発ポリマーの
反復単位の等量の３倍）を、溶液に加えた。反応容器を
次に窒素でパージした。反応混合物を次に４日間攪拌し
続けた。この間で、ポリマー生成物は析出した。蛍光色
で黄色の固体ポリマーを、次に濾過し、１リットル程度
のトルエンで洗浄した。蛍光色で黄色のポリマー固体
（１．３９ｇ、完全に置換されたと仮定すると収率９
２．８％）を完全に空気乾燥した後分離した。Ｄ₂Ｏ中
でのＮＭＲによるこのポリマーの特性は以下の通りであ
った。¹ ＨＮＭＲδ＝７．０及び６．６（４Ｈ）、３．６
（１．９Ｈ）及び１．７（１０．９Ｈ）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７、４１、３１、７（タ
ブレット）；³¹ ＰＮＭＲδ＝２７−２５．５

【００６９】ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウ
ムクロライド（ポリマーＴＢ）。（反復単位の分子量＝
３５４．９４ｇ／ｍｏｌ）；２．００ｇのポリ（ビニル
ベンジルクロライド）（モノマー−ポリマーＬａｂｏｒ
ａｔｒｉｅｓ製）を、無水ＤＭＦ（約１００ｍＬ）中に
溶解させた。ポリマーが完全に溶解した後に、１５ｍＬ
（０．０６０２ｍｏｌ、出発ポリマーの反復単位の等量
の４．６倍）のトリブチルホスフィン（アルドリッチ）
を溶液に加えた（ＴＢポリマーを製造するにはトリブチ
ルホスフィンの等量の３倍のみが必要である）。反応容
器を次にアルゴンでパージした。４日間攪拌し続けた
後、沈殿物は何等生成しなかったが、反応を停止し終了
した。反応混合物を大きなエルレンマイヤーフラスコに
入れ、攪拌中の混合物に、全てのポリマーが沈殿し始め
るまでトルエンを加えた。上層液をデカントで除き、更
にトルエンを加えた。全体で約０．５〜１Ｌのトルエン
を使用した。混合物を攪拌し、細かい粉になるまで手で
固体を粉砕した。ポリマーの細かい粒子を濾過し、約１
Ｌのトルエンで洗浄した。ポリマー生成物を空気乾燥す
ると、４．４１ｇ（完全な置換を仮定すると収率９４．
８％）の僅かに黄色がかった白色の固体が生成した（ポ
リビニルベンジルクロライド（アルドリッチ）を出発材
料として使用する引続きのバッチでは高度の白色の生成
物が得られた。）。Ｄ₂Ｏ中でのＮＭＲによるこのポリ
マーの特性は以下の通りであった。¹ ＨＮＭＲδ−７．２及び６．５（４Ｈ）、３．６
（１．８Ｈ）、及び２．０、１．３及び０．８（２９．
５）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７、２４−２２．５、１
９−１７、及び１３−１２．５；³¹ ＰＮＭＲδ−３３．３２

【００７０】ビニルベンジルトリブチルホスホニウムク
ロライド、ビニルベンジルフルオレセイン（ポリマーＴ
Ｂ／Ｆ）との共重合体（反復単位の分子量＝３５４．９
４ｇ／ｍｏｌ）：２．００ｇのポリ（ビニルベンジルク
ロライド）（モノマー−ポリマーラボラトリーズ製）
を、無水ＤＭＦ（約１２５ｍＬ）に溶解させた。ポリマ
ーが完全に溶解した後に、染料含有量約７０％（アルド
リッチ）の水溶性のフルオレセイン２０．１ｍｇ、及び
１５ｍＬのトリブチルホスフイン（０．０６０ｍｏｌ、
出発ポリマーの反復単位の等量の３倍；アルドリッチ）
を、溶液に加えた。反応容器を次にアルゴンでパージし
た。析出物は何等形成されなかったが、４日間攪拌後、
反応を停止し、操作を終了した。オレンジ色の反応混合
物を大きなエルレンマイヤーフラスコに入れ、８００ｍ
Ｌのトルエンを加え、その結果オレンジ色の析出物が生
成した。得られた懸濁液を１時間攪拌し続け、析出物を
濾過し、別の８００ｍＬのトルエンで洗浄した。数時間
の空気乾燥の後、３．８８ｇの蛍光の黄色の固体が得ら
れた（完全な置換を仮定すると収率８３．４％）。Ｄ ₂
Ｏ中でのＮＭＲによるこのポリマーの特性は以下のとお
りであった。¹ ＨＮＭＲδ＝７．２及び６．５（４Ｈ）、３．６
（１．８Ｈ）、及び２．０、１．３及び０．８（３１．
７）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７、２４−２２．５、１
９−１７、及び１３−１２．５；³¹ ＰＮＭＲδ＝３３．５−３２

【００７１】ビニルベンジルトリブチルホスホニウムク
ロライド、ビニルベンジル−ローズベンガル（Ｒｏｓｅ
Ｂｅｎｇａｌ）（ポリマーＴＢ／ＲＢ）との共重合体
（反復単位の分子量＝３５４．９４ｇ／ｍｏｌ）：１．
００ｇのポリ（ビニルベンジルクロライド）（アルドリ
ッチ）を、約５０ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶解させた。ポ
リマーが完全に溶解した後に、５０．１ｍｇのローズベ
ンガル、二ナトリウム塩（アルドリッチ）を溶液に加え
た。反応容器を次に窒素でパージした。別に５０ｍＬの
ＴＨＦをシリンジを介して加えて、大部分のローズベン
ガルを溶解させた。次に、トリブチルホスフィン５ｍＬ
（０．０２０ｍｏｌ、出発ポリマーの反復単位の等量の
３倍）をシリンジにより加えた。反応混合物を窒素でパ
ージし攪拌を続けた。７日間の攪拌後、反応を停止し、
操作を終了した。次に、無色となったＴＨＦ溶液を、Ｔ
ＨＦから析出し反応容器の壁を被覆している赤い固体か
ら分離して容器から出した。ポリマーを次にＴＨＦで数
回洗浄し、真空（ｖａｃｕｏ）乾燥してガラス状の赤い
固体を得た。この時点で、ポリマーは、ポリマーとジオ
キセタン１の溶液が、ｐＨ９．６の緩衝液中のアルカリ
性のホスファターゼにより刺激されたとき、水中で強い
赤色の蛍光を示し、赤い化学ルミネッセンスを発生した
（ローズベンガルは水中では蛍光を示さない）。ポリマ
ーをジクロロメタンに溶解し、次に溶媒を真空で除去し
た（最初はロートバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）で、次に加
熱高真空下で）。ポリマーの¹ＨＮＭＲスペクトル
は、ＴＨＦがまだ存在することを示し、従って、痕跡程
度のＴＨＦが¹ＨＮＭＲスペクトルにより観察される
に過ぎなくなるまで試料を更に乾燥させた。ＴＢ／ＲＢ
の１６８ｇ産出量が得られた（完全な置換を仮定すると
収率７２．４％）。ポリマーは、次にＤ₂Ｏ中でＮＭＲ
により以下のように特性を決定した。¹ ＨＮＭＲδ＝７．２及び６．５（４Ｈ）、及び２．
０、１．４及び０．８（２９．３Ｈ）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７、２４−２２．５、１
９−１７、及び１３−１２．５；³¹ ＰＮＭＲδ＝３３−３２

【００７２】ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニ
ウムクロライド（ポリマーＴＯ）。（反復単位の分子量
＝５２３．２５ｇ／ｍｏｌ）：２．００ｇのポリ（ビニ
ルベンジルクロライド）（モノマー−ポリマーラボラト
リーズ）を、アルゴン雰囲気で約５０ｍＬの無水ＤＭＦ
に溶解させた。ポリマーが完全に溶解した後に、１５．
９ｇ（０．０４２９ｍｏｌ、出発ポリマーの反復単位の
等量の３．３倍）のトリ−（ｎ−オクチル）−ホスフィ
ンをシリンジで加えた。溶液を次にアルゴン下で攪拌し
た。６日間攪拌した後、反応を停止し終了させた。反応
混合物を大きなエルレンマイヤフラスコに注ぎ、約１Ｌ
のトルエンを加えた。これは何の効果もなかった。そこ
で、約１００ｍＬの溶媒を除く全てを真空で除去した。
ポリマーを沈殿させている得られた溶液に次に約１Ｌの
ヘキサンを加えた。次にポリマーを濾過して分離した
が、空気乾燥後もホスフィンの臭いがした。従って、ポ
リマーを再びＴＨＦに再溶解させ、ヘキサンにより沈殿
させた。完全な空気乾燥の後、３７８ｇ（完全な置換を
仮定すると収率５５．１％）の僅かに黄色がかった白色
の固体を得た。ポリマーのＤ₂Ｏ中のＮＭＲ特性は以下
のとおりであった：¹ ＨＮＭＲδ＝７．１及び６．４（４Ｈ）、４．４
（１．６Ｈ）、及び２．３、１．３及び０．８（３９．
５Ｈ）；³¹ ＰＮＭＲδ＝３２．５−３１．５

【００７３】ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニ
ウムクロライド、ポリビニルベンジルトリブチルホスホ
ニウムクロライド（ポリマー３ＴＢ／ＴＯ）との共重合
体。ポリ（ビニルベンジルクロライド）（アルドリッ
チ、２．０１ｇ）を、１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ
た。ポリマーが完全に溶解した後に、１．２３ｇ（０．
００３３２ｍｏｌ、出発ポリマーの反復単位の等量の
０．２５倍）のトリ−ｎ−オクチルホスフィンを溶液に
加えた。次に反応容器をアルゴンにより置換（ｆｌｕｓ
ｈ）し、攪拌を続けた。２日間攪拌した後、９．５ｍＬ
のトリブチルホスフィン（０．０３８ｍｏｌ、出発ポリ
マーの反復単位の等量の２．９倍）を反応混合物にシリ
ンジで加えた。更に２日間の攪拌の後、反応を停止し終
了させた。反応混合物を大きなエルレンマイヤフラスコ
に入れ、約１Ｌのトルエンを加えた。一旦、ポリマーを
トルエン中の細かい粒子の懸濁物とした後、これを濾過
し、約５００ｍＬのトルエンで洗浄した。完全な空気乾
燥の後、４．３１ｇ（完全な置換及びトリオクチルホス
フィンの完全な消費を仮定すると収率８２．８％）の白
色の固体が得られた。このポリマーのＤ₂Ｏ中でのＮＭ
Ｒ特性は以下のようであった：¹ ＨＮＭＲδ＝７．２及び６．５（４Ｈ）、３．６
（１．５Ｈ）、及び２．０、１．４及び０．８（４３．
１Ｈ）；¹³ ＣＮＭＲδ＝１３０−１２７、２４−２２．５、１
９−１７、１３−１２．５；同様な方法を使用してＴＯ及びＴＢを混合した他のポリ
マーを合成した。

【００７４】（２）化学ルミネッセンス速度（Ｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ）及び量子収率の測定化学ルミネッセンスの強度及びレート（ｒａｔｅ）測定
を、ターナーデザイン（ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎ
ｓ）（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、形式ＴＤ−２０ｅ
発光計又はラビシステムルミノスカン（Ｌａｂｙｓｙｓ
ｔｅｍｓＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ）発光計（ヘルシン
キ、フィンランド）の何れかを使用して行った。ターナ
ー発光計で分析される試料の温度制御は、装置に接続し
た循環水浴で行った。ターナー発光計による光強度の量
的測定は、中性密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルタにより
検出器の１０⁴のリニア範囲を越えて行われた。データ
の採集は、アップルマッキントッシュコンピュータＳＥ
／３０により、ルミソフト（Ｌｕｍｉｓｏｆｔ^TM）デー
タ圧縮プログラム（ルミンゲン（Ｌｕｍｉｎｇｅｎ），
Ｉｎｃ，デトロイト，ＭＩ）を使用して調節した。

【００７５】（３）化学ルミネッセンス及び蛍光スペク
トル添付の図面は、以下の通りである。図１は、本発明の増
感剤を用い酵素によって刺激された１，２−ジオキセタ
ンの化学ルミネッセンススペクトルと市販の試薬ＬＵＭ
Ｉ−ＰＨＯＳ^R４８０を用いたスペクトルとの比較を示
すグラフである。このグラフは、アルカリ性ホスファタ
ーゼで刺激されるジオキセタン１（０．３３ｍＭ）の分
解で、（ａ）Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R４８０中のもの、及
び（ｂ）、０．５ｍｇ／ｍＬのＴＢを含有するｐＨ９．
６で０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノ
ール緩衝液中のものを示している。スペクトルｂの最大
放出の波長は４７０ｎｍである。Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R
４８０は、ｐＨが９．６で０．７５Ｍの２−メチル−２
−アミノ−１−プロパノール緩衝液と１．１ｍＭのＣＡ
ＴＢとを含む。

【００７６】図２は、本発明の増感剤の存在下でのアル
カリ性の水溶液中のメチル３−ヒドロキシベンゾエート
の蛍光スペクトルと市販の試薬ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ^R４
８０存在下の同じもののスペクトルとを比較して示すグ
ラフである。このグラフは、メチル３−ヒドロキシベン
ゾエートを、（Ａ）ｐＨ９．６で１．１ｍｇＣＡＴＢ
（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R４８０に見られるもの）を含む
０．７５Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノー
ル緩衝液中のもの、（Ｂ）ｐＨ９．６で０．５ｍｇ／ｍ
ＬＴＢを含む０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１
−プロパノール緩衝液中のもの、（Ｃ）ｐＨ９．６で
０．５ｍｇ／ｍＬ１８ＴＢ／ＴＯを含む０．２Ｍの２
−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液中のも
の、を夫々含んでいる。ＣＡＴＢを含有する２２１緩衝
液中のメチル３−ヒドロキシベンゾエートの蛍光は、緩
衝液の濃度を０．７５Ｍから０．２Ｍに変動させても影
響されなかった。

【００７７】図３は、アルカリ性のホスファターゼで刺
激される１，２−ジオキセタンの増感剤濃度の関数とし
ての光強度を示すグラフである。このグラフは、ｐＨが
９．６で０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂と、１．０〜０．０
１ｍｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度の３ＴＢ／ＴＯとを含
有する０．２Ｍの２２１緩衝液中におけるＬｕｍｉｇｅ
ｎ^RＰＰＤの０．３３ｍＭ溶液１００μＬからの強度を
示している。化学ルミネッセンス反応は、５．５×１０
^-18ｍｏｌの牛の腸のアルカリ性のホスファターゼを３
７℃で添加することによって開始された。

【００７８】図４は、バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒ
ｏｕｎｄ）に対する光強度を、アルカリ性のホスファタ
ーゼによって刺激される１，２−ジオキセタンとの関係
で示したグラフである。このグラフは、化学ルミネッセ
ンス強度（Ｓ）と試薬バックグラウンド（Ｂ）との比
を、ｐＨが９．６で０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有す
る０．２Ｍの２２１緩衝液中でのアルカリ性のホスファ
ターゼによる３７℃でのＬｕｍｉｇｅｎ^RＰＰＤの化学
ルミネッセンス分解における３ＴＢ／ＴＯの最適の濃度
の関数として示している。数値は３通りの結果の平均と
して示されている。最適の信号／バックグラウンドは、
０．５Ｍｇ／ｍＬの増感剤濃度で得られた。

【００７９】図５は、光強度と酵素濃度との関係を、対
数−対数グラフで示すもので、アルカリ性ホスファター
ゼの０．００５ａｍｏｌｅが検出される旨が示されてい
る。グラフは、ｐＨが９．６で０．８８ｍＭのＭｇＣｌ
₂と、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の３ＴＢ／ＴＯとを含有す
る０．２Ｍの２２１緩衝液中におけるＬｕｍｉｇｅｎ ^R
ＰＰＤの３７℃での化学ルミネッセンス分解における最
大化学ルミネッセンス強度がアルカリ性ホスファターゼ
の量に依存することを示している。光強度は、５×１０
^-17ｍｏｌ〜５×１０^-21ｍｏｌの範囲の酵素量と直線
的な関係にある。検出限界（０．００５ａｍｏｌのアル
カリ性ホスファターゼ）は、増感剤を使用しないアルカ
リ性ホスファターゼの検出限界よりも２０００倍小さ
い。最大の化学ルミネッセンス強度を得るための時間
は、この範囲の酵素量に依存しない。

【００８０】図６及び７は、５ａｔｔａｍｏｌのアルカ
リ性ホスファターゼにおける種々の増感剤及び増感剤な
しの効果を示す光強度と時間との関係のグラフである。
図６のグラフは、アルカリ性ホスファターゼの化学ルミ
ネッセンス検査における信号／バックグラウンド比の比
較を示している。ｐＨが９．６で、５．５×１０^-18ｍ
ｏｌの牛の腸のアルカリ性ホスファターゼを添加するこ
とにより３７℃で刺激される、０．２Ｍの２２１緩衝液
中に種々の増感剤及びＬｕｍｉｇｅｎ^RＰＰＤを含有す
る１００μＬの溶液からの化学ルミネッセンス強度。比
較のために以下のものを含む：高分子量アンモニウム塩
（ＢＤＭＱ）を有する溶液、増感剤及び市販の試薬Ｌｕ
ｍｉ−Ｐｈｏｓ^R５３０を有しない溶液。図７のグラフ
は、ｐＨが９．６で、５．５×１０^-18ｍｏｌの牛の腸
のアルカリ性ホスファターゼを添加することにより３７
℃で刺激される２−メチル−２−アミノ−１−プロパノ
ール（２２１）緩衝液中に、本発明の増感剤とジオキセ
タン１とを含有する１００μＬの溶液からの化学ルミネ
ッセンス強度の比較を示している。更に比較のために以
下を含む：高分子アンモニウム塩（ＢＤＭＱ）を有する
溶液、並びに、増感剤及び市販の試薬Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏ
ｓ^R５３０を有しない溶液。

【００８１】図８Ｃ及び８Ｄは、増感剤の存在下でアル
カリ性ホスファターゼにより刺激された１，２−ジオキ
セタンを使用して人のトランスフェリンの化学ルミネッ
センス分解を検出したウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎｂｌｏｔ）分析の結果を示している。試薬Ｃ（図
８Ｃ）及び試薬Ｄ（図８Ｄ）を利用してウェスタンブロ
ットした人のトランスフェリンを示している。各スロッ
トに詰められた人のトランスフェリンは、（１）１００
０ｐｇ、（２）２００ｐｇ、（３）５０ｐｇ、（４）２
０ｐｇ、及び（５）５ｐｇである。ブロット（ｂｌｏ
ｔ）は、コダックＸ−ＯＭＡＴＡＲフィルムに、夫々
の検出試薬による３０分間の培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏ
ｎ）後に、３０秒間露出した。スロット１及び２のかす
かな帯域は、検出試薬Ａ及びＢを使用して観察できた。

【００８２】化学ルミネッセンス及び蛍光スペクトル
を、１ｃｍ水晶セル（ｃｕｖｅｔｔｅ）を有するフルオ
ロログ（Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ）ＩＩ蛍光計（スペック
（Ｓｐｅｘ）Ｉｎｄ，エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ），Ｎ
Ｊ）を使用して測定した。全ての測定は、室温で行っ
た。０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び０．１％の増感剤Ｔ
Ｂを含有するＬｕｍｉｇｅｎ^RＰＰＤの２ｍＬ溶液をセ
ル内に入れ、アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｉｏｚｙｍ
ｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，サンジェゴ，ＣＡ）の
溶液５μＬを注入して化学ルミネッセンスを開始した。
スペクトルは、光強度が一定のレベルに達したとき走査
（ｓｃａｎ）した。図１は、これらの条件の下で得られ
た化学ルミネッセンススペクトルと、界面活性剤ＣＡＴ
Ｂ（ＬｕｍｉｇｅｎＩｎｃ，デトロイト，ＭＩ）を含
有する同じジオキセタンの市販の処方Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏ
ｓ^R４８０を用いたものとの比較を示している。

【００８３】アルカリ性緩衝液中におけるジオキセタ
ン、メチル３−ヒドロキシベンゾエートの反応生成物の
蛍光スペクトルは、蛍光がポリビニルホスホニウム塩の
存在下で大きく増加することを示している。エステルの
分解生成物の蛍光量子収量の最も大きな増加は、トリブ
チル−及びトリオクチルホスホニウム基を有するポリマ
ー３ＴＢ／ＴＯの存在下で起る（図２）。蛍光スペクト
ルが化学ルミネッセンススペクトルに比較して青の方に
シフトすることが観察される。（図１）。

【００８４】（４）酵素検査における最適な増感剤濃度
の決定９６−ウェルマイクロプレート（ｗｅｌｌｍｉｃｒｏｐ
ｌａｔｅ）の内の３つのウェル（ｗｅｌｌ）の夫々に、
ｐＨが９．６で、０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び種々の
濃度の増感剤３ＴＢ／ＴＯを１．０〜０．０１ｍｇ／ｍ
Ｌの範囲で有する、０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ
−１−プロパノール（２２１）緩衝液中にある０．３３
ｍＭのジオキセタン１の溶液１００μＬを加えた。プレ
ートは、３７℃で温置（ｉｎｃｕｂａｔｅ）され、５．
５×１０^-18ｍｏｌの牛の腸のアルカリ性ホスファター
ゼの添加によって化学ルミネッセンス放出が開始され
た。発光はルミノスカン（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ）発光
計で２時間測定された。示された最大発光強度値は、酵
素を有しない適当なブランク溶液からの発光で修正され
た３通りの結果の平均である（図３）。光強度は、この
範囲で単調に増加しているが、最適の信号／バックグラ
ウンドは、増感剤濃度０．５ｍｇ／ｍＬで得られた（図
４）。

【００８５】（５）Ｌｕｍｉｇｅｎ^RＰＰＤ＋増感剤に
よるアルカリ性ホスファターゼの検出の直線性９６−ウェルマイクロプレートの６つのウェルの夫々
に、ｐＨが９．６で、０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び
０．５ｍｇ／ｍＬの増感剤３ＴＢ／ＴＯを有する、０．
２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２
２１）緩衝液中の０．３３ｍＭのジオキセタン１の溶液
１００μＬを加えた。プレートは、３７℃の温度で温置
され、化学ルミネッセンス放出が、牛の腸のアルカリ性
ホスファターゼを１．１×１０^-17〜１．１×１０^-21
ｍｏｌ／μＬの範囲で含有する５μＬの希釈液の添加に
よって開始された。図５は０．００５ａｍｏｌのアルカ
リ性ホスファターゼが検出できることを示している。こ
れは、増感剤なしの同じ系に比較して２０００倍だけ検
出限界を低く出来ることを表す（データは示されていな
い）。最大化学ルミネッセンス強度に達する時間は、こ
の範囲では酵素の量に依存しない。

【００８６】（６）化学ルミネッセンス強度−速度デー
タの比較本発明の増感剤の利点は、本発明の増感剤とジオキセタ
ン１を、ｐＨが９．６で、５．５×１０^-18ｍｏｌの牛
の腸のアルカリ性ホスファターゼの添加により刺激され
る２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２
１）緩衝液中に含有する溶液１００μＬからの化学ルミ
ネッセンス強度の比較により、図６及び図７に示されて
いる。

【００８７】０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の増感剤を添加す
ることは、増感剤を有しない同じ溶液若しくはこの分野
で従来知られている増感剤を含有する溶液と比較する
と、化学ルミネッセンス強度を実質的に増加させる。信
号／バックグラウンド比及び、幾らかの場合には、最大
光強度への立ち上がり速度（ｒａｔｅ）に対する修正
が、増感剤の濃度の変化により容易に達成できることが
理解できる。

【００８８】（７）ジオキセタン５の化学刺激分解の増
感表１は、室温において、０．５ｍｇ／ｍＬの増感剤を有
する０．０５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを
添加することにより刺激されるとき、ジオキセタン５
（２−プロパノール中の１００ｍｇ／ｍＬ溶液１０μ
Ｌ）の分解により発生する化学ルミネッセンスの最大強
度を比較している。発光は最大１時間ターナーＴＤ−２
０ｅ発光計により測定された。増感ファクターは、いか
なる増感剤をも有しないときに得られる値との比であ
る。示された値は、適当なブランク溶液からの発光で修
正された３通りの結果の平均である。半減期（ｔ_1/2）
は、発光信号が初期値から１／２に減衰するのに必要な
時間である。

【００８９】

【化１７】

【００９０】

【表１】表１ジオキセタン５の水酸化ナトリウム刺激による化学ルミネッセンスの増感増感剤ｔ１／２全光増感（分） (Rel. 光ユニット) ファクター TB/TO¹ 8.5 2.84E+06 852.85 TO² 12.7 2.82E+06 846.85 1.8TB/TO³ 7.2 2.02E+06 606.61 3TB/TO⁴ 4.7 1.28E+06 384.38 Lumi-Phos ^TM530⁵ 16.7 1.23E+06 369.37 TB/F⁶ 4.7 3.06E+05 91.89 TB⁷ 5.2 1.98E+05 59.46 TB/RB⁸ 6.3 1.01E+05 30.33 BDMQ⁹ 3.3 4.27E+04 12.83 TM/F¹⁰ 3.2 3.84E+04 11.53 Lumi-Phos ^TM480¹¹ 13.8 1.13E+04 3.39 TM¹² 3.7 1.01E+04 3.03 TMQ¹³ 3.5 7.45E+03 2.24 なし 2.2 3.33E+03 1.00

【００９１】１．ポリビニルベンジルトリアルキルホス
ホニウムクロライド、５０％トリオクチル、５０％トリ
ブチル。２．ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロ
ライド。３．ポリビニルベンジルトリアルキルホスホニウムクロ
ライド、３５％トリオクチル、６５％トリブチル。４．ポリビニルベンジルトリアルキルホスホニウムクロ
ライド、２５％トリオクチル、７５％トリブチル。５．ＬｕｍｉｇｅｎＩｎｃ．（デトロイト、ＭＩ）製
の市販製品Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R５３０中に含有された
ＣＡＴＢ及びＮ−テトラデカノイルアミノフルオレセイ
ン。６．共有結合のフルオレセインを含有するポリビニルベ
ンジルトリブチルホスホニウムクロライド。７．ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロラ
イド。８．共有結合で結合されたローズベンガルを含有するポ
リビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロライド。９．ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウム
クロライド。英国特許出願第８９１１３６２７．７号参
照。この材料はＴＢと同様な手順を使用して調製され
た。１０．共有結合で結合されたフルオレセインを含有する
ポリビニルベンジルトリメチルホスホニウムクロライ
ド。１１．ＬｕｍｉｇｅｎＩｎｃ．（デトロイト、ＭＩ）
製の市販製品Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R４８０中に含有する
ＣＡＴＢ。１２．ポリビニルベンジルトリメチルホスホニウムクロ
ライド。１３．ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロ
ライド。英国特許出願第８９１１３６２７．７号。この
材料はＴＢと同様な手順を使用して調製された。

【００９２】（８）酵素で刺激されたジオキセタン１の
分解の増感表２は、５ａｍｏｌのアルカリ性ホスファターゼの水溶
液を添加することによって３７℃で刺激される、０．２
Ｍの２２１緩衝液（ｐＨが９．６）中のジオキセタン、
０．８８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び０．５ｍｇ／ｍＬの増感
剤を有する０．３ｍＭのジオキセタン溶液１００μＬの
分解により発生する化学ルミネッセンスの最大強度を比
較している。発光はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ^TM発光計で２
時間測定し、最大光強度を記録した。示した値は、３通
りの結果の平均値である。バックグラウンド強度は、酵
素の不存在下での光レベルである。Ｉ_1/2値は、最大光
強度の１／２に達するに必要な時間である。Ｉ_BGの値
は、酵素の不存在下での光強度である。項（Ｓ−Ｂ）／
Ｓは修正された最大光強度とバックグラウンド光強度と
の比である。本発明のポリマーは、アダマンチル基が５
−クロロのような基を含有するヘテロ原子で置換された
ジオキセタンに関してホスフェート置換ジオキセタンの
化学ルミネッセンスを増感するために使用することも出
来る。

【００９３】

【表２】表２アルカリ性ホスファターゼによるジオキセタン１の刺激による化学ルネミネッセンスの増感増感剤Ｉ_1/2時間（分）Ｉ_max(S) Ｉ_BG(B) (S-B)/B 1.8TB/TO 24 1600 0.69 2320 3TB/TO 12 613 0.30 2060 TB/TO 28 155 0.24 660 Lumi-Phos 530 16 190 2.47 75 TB/F 7 32 0.16 203 TB 7 23 0.13 170 BDMQ 5 6.2 0.12 53 なし 3 1.1 0.12 8

【００９４】（９）ウェスタンブロッティングによるプ
ロティンの化学ルミネッセンス検出への増感剤の応用ウェスタンブロッティング技術による化学ルミネッセン
ス検出への本発明の組成物の増感剤の利点が、以下の例
で示される。ナイロンのような膜上のＤＮＡ検出のため
に同様な増感が観察される。ウェスタンブロット−市販の化学ルミネッセンスのアル
カリ性ホスファターゼ検出試薬との比較

【００９５】試薬兎の蟻−羊ＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ共役結合
をＣａｐｐｅｌＰｒｏｄｕｃｔ（ダーハムＤｕｒｈａ
ｍ），ＮＣ）から得た。人のトランスフェリン及び分留
された羊の蟻−人トランスフェリン血清をシグマケミカ
ル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）Ｃｏ（セントルイ
ス，ＭＯ）から購入した。ＩｇＧ試料を、１０，０００
ｇで２分間遠心分離し、上層を免疫学的反応に使用し
た。イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐトランスフ
ァー膜をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｃｏｒｐ．
（ベッドフォード、ＭＡ）から得た。コダックＸ−ＯＭ
ＡＴ−ＡＲ及びＯＭＣ（ロチェスター、ＮＹ）フイルム
を検査手順で使用した。

【００９６】ナトリウムドデシル硫酸塩−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び免疫ブロ
ット分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（英
国ラエムリ、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン），２２７，６８
０（１９７０年）に記載された緩衝系を利用して行っ
た。堆積ゲルは、アクリルアミド４．３８％：ビスアク
リルアミド０．１２％であった。分離ゲルは、アクリル
アミド６．８１％、ビスアクリルアミド０．１９％であ
った。電気泳動に引続き、ゲルを２０ｍＭのトリス（Ｔ
ｒｉｓ）、１５３ｍＭのグリシン及び２０％（Ｖ／ｖ）
メタノールを含有する移動緩衝液と７〜８分平衡させ
た。ゲルを、移動膜のシート及びクロマトグラフィー紙
３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ）のシートとの間で挟み、移動
ユニット（バイオ−ラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド、Ｃ
Ａ）の中に置いた。ゲルの中のプロティンを、５０乃至
６０分間４℃、１００Ｖ定電圧で、電気溶出（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｅ）した。膜を、次に１晩中４℃でｐＨ
が７．４（ＴＢＳ）の５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝
塩内に置いた。この期間の後、膜をＴＢＳで１５分間洗
浄した。

【００９７】膜を、１％の非脂肪の粉ミルク（ＮＦＭ）
を含有するｐＨが７．４の５０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ
緩衝塩中の０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で、１時間室
温で処理した。ブロックされた膜は、７５分間室温で、
１％ＮＦＭを含有するＴ−ＴＢＳを使用する１次抗体
（羊の蟻−人トランスフェリンＩｇＧ留分の１：５００
倍希釈）で培養した。膜を次に１０分間づつＴ−ＴＢＳ
で濯ぎと洗浄を３回室温で行った。洗浄した膜を、１時
間室温で、１％ＮＦＭを含有するＴ−ＴＢＳを使用する
２次抗体（兎の蟻−羊ＩｇＧアルカリ性共役ホスファタ
ーゼの１：５０００倍希釈）で培養した。膜を、各１０
分間のＴ−ＴＢＳでの濯ぎ及び洗浄を行い、引続き、１
０分間ＴＢＳでの洗浄を行った。洗浄した膜を４つの検
出試薬（Ａ−Ｄ）の１つに５分間浸漬し、透明フィルム
のシートの間に置いた。Ｘ線フィルムを、１０分〜３０
秒間膜に露出し、現像した。

【００９８】Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ^R５３０（Ａ）、ＢＤ
ＭＱ（Ｂ）を含有する別の試薬及び本発明の増感剤を使
用する２つの別の試薬（Ｃ，Ｄ）を利用した、ウェスタ
ンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）された人トラ
ンスフェリンの化学ルミネッセンス検出を、２つの異な
るＸ線フィルムにより行なった。検出試薬溶液の組成物
は以下の通りである：

【００９９】

【表３】ＡＢＣＤ〔ジオキセタン１〕 0.33mM 0.66mM 0.66mM 0.66mM 緩衝液 221,0.75M 221,0.2M 221,0.2M 221,0.2M ｐＨ 9.6 10.1 10.1 10.1 〔Mg²⁺〕 0.88mM 0 0.88mM 0.88mM 〔NaN₃〕 0 0.1% 0 0 増感剤 CTAB,1.1mM BDMQ,0.1% TB/F,0.1% TB,0.1% F1-S,37μM Ｆ１−Ｓ＝テトラデカノイルアミノフルオレセインＢＤＭＱ＝ポリ（ビニルベンジル）ジメチルアンモニウムクロライド

【０１００】ウェスタンブロットのためのこれら検出系
の感度を決定するために、トランスフェリンのモデル系
がポリぺプチド帯域を公知の量だけ供給するために利用
された。利用されるトランスフェリン標準は、試薬Ｃ
（図８Ｃ）及び試薬Ｄ（図８Ｄ）を利用するＯＭＣＸ
線フィルムに２０秒間露出された後に、５ｐｇ／ｓｌｏ
ｔという低い値迄を検出可能であった。しかし、２０秒
間の露出の間、１ナノグラム及び５ナノグラムのトラン
スフェリンを表すほんの僅かな帯域が、試薬Ａ及びＢが
検出に使用されたときに観察された。７秒間を越える露
出時間が、試薬Ａ及びＢでのトランスフェリンの５ｐｇ
／ｓｌｏｔを検出するのに必要であった。５ｐｇ／ｓｌ
ｏｔのトランスフェリンを検出するための信号とバック
グラウンドの比は、露出時間は大きく異なるものの、４
つの系で同様であった。本発明の増感剤を使用する試薬
Ｃ及びＤで処理された膜は、試薬Ａ及びＢで処理された
膜よりも１５倍速い時間で、同等の信号ラベルをＸ線フ
ィルム上で達成した。

【０１０１】試薬Ｃ及びＤのスピードの利点は、通常使
用されるＸ−ＯＭＡＴ、ＡＲＸ線フィルムが検出に利用
されるときに、もっとはっきりする。同様な信号レベル
のためには、試薬Ａ及びＢは極めて長い露出時間を必要
とする。

【０１０２】（１０）水でない混合溶媒溶液中での増感塩基で刺激されるジオキセタン５組成物からの化学ルミ
ネッセンスは、唯一つの溶媒が水ではない溶液中におけ
る本発明の高分子ホスホニウム塩によっても増感され
る。メタノール中の０．０５ＭのＫＯＨ１００μＬによ
る、ターナー発光計中の水／メタノール若しくはメタノ
ール中の１０μｇ／ｍＬのジオキセタン溶液１００μＬ
の刺激は、０．２５ｍｇ／ｍＬのポリマー３ＴＢ／ＴＯ
の存在下で増感される化学ルミネッセンスを発生した。

【０１０３】

【表４】表３アルコール及びアルコール／水溶媒中のジオキセタン５ポリマー３ＴＢ／ＴＯによる塩基刺激からの化学ルミネッセンスの増感５０％水／５０％メタノール１００％メタノール増感剤なし増感剤あり増感剤なし増感剤ありＩ_max ２３０３０００５７８０２３６２７００５８７０２５０２５３０６０７９平均２３９２７４３５８７６増感１1.６ 1.３

【０１０４】（１１）ガラクトシド保護のジオキセタン
の酵素による刺激分解の増感表４は、ガラクトシド保護ジオキセタンＬｕｍｉｇｅｎ
^RＧＰＤの酵素分解と引続きの塩基刺激とにより発生す
る化学ルミネッセンス全強度を比較している。試料は、
０．１ＭのＯホスファターゼ緩衝液、ｐＨ７．５、０．
８８ｍＭのＭｇＣｌ₂中のガラクトシド保護ジオキセタ
ンＬｕｍｉｇｅｎ^RＧＰＤの１００μｇ／ｍＬの溶液１
００μＬを、水中で５μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダー
ゼ−ストレプタビジン溶液により培養することにより調
製された。化学ルミネッセンスは、３７℃において、
０．５ｍｇ／ｍＬの増感剤を含有する０．０５ＭのＮａ
ＯＨ１００μＬを添加することにより刺激された。化学
ルミネッセンスは、３０分間ターナー発光計で測定され
全光強度が記録された。バックグラウンド強度は、酵素
なしで培養された同一の試料の光強度の和である。Ｉ_BC
の値は、酵素なしでの光強度を表している。項（Ｓ−
Ｂ）／Ｂは、修正された最大光強度と、バックグラウン
ド強度との比である。

【０１０５】

【表５】表４Ｌｕｍｉｇｅｎ^RＧＰＤのβガラクトシダーゼ刺激からの化学ルネミネッセンスの増感増感剤Ｉ_max（Ｓ）Ｉ_BG（Ｂ）（Ｓ−Ｂ）／Ｂ３TB／TO 1.05e＋07 4.43e＋04 235 なし 1.49e＋05 1.06e＋03 140

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の増感剤を用い酵素によって刺激された
１，２−ジオキセタンの化学ルミネッセンススペクトル
と市販の試薬ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ^R４８０を用いたスペ
クトルとを示すグラフである。

【図２】本発明の増感剤の存在下でのアルカリ性の水溶
液中のメチル３−ヒドロキシベンゾエートの蛍光スペク
トルと市販の試薬ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ^R４８０存在下の
同じもののスペクトルとを比較して示すグラフである。

【図３】ホスファターゼで刺激されるアルカリ性の１，
２−ジオキセタンの増感剤濃度の関数としての光強度を
示すグラフである。

【図４】バックグラウンドに対する光強度を、ホスファ
ターゼによって刺激されるアルカリ性の１，２−ジオキ
セタンとの関係で示したグラフである。

【図５】光強度と酵素濃度との関係を示す対数−対数グ
ラフである。

【図６】種々の増感剤の効果を、増感剤を有しない場合
と共に、５ａｔｔａｍｏｌのアルカリ性ホスファターゼ
における光強度と時間との関係として示すグラフであ
る。

【図７】種々の増感剤の効果を、増感剤を有しない場合
と共に、５ａｔｔａｍｏｌのアルカリ性ホスファターゼ
における光強度と時間との関係を示すグラフである。

【図８】増感剤の存在下でアルカリ性のホスファターゼ
により刺激される１，２−ジオキセタンを使用して人の
トランスフェリンの化学ルミネッセンスを検出したウェ
スタンブロット分析の結果を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリＡホスフィンとポリビニルポリマー
とを反応させて調製されるポリビニルリンク（Ｌｉｎ
ｋ）トリＡホスホニウム基を含有するポリマーを含み、
前記リンクは１〜２０個の炭素原子を含み前記ポリマー
とホスホニウムカチオンとを結合する鎖基であり、前記
Ａは１〜２０個の炭素原子を含有するアルキル及び夫々
が１〜２０個の炭素原子を含有するアルキル及びアラル
キル基からなる群から選択されるポリマー。
【請求項２】前記ホスホニウム基がホスホニウムクロ
ライドである請求項１記載のポリマー。
【請求項３】前記リンクがベンジルである請求項１記
載のポリマー。
【請求項４】前記リンク（Ｌｉｎｋ）トリＡホスホニ
ウム基がベンジルトリメチルホスホニウムクロライドで
ある請求項１記載のポリマー。
【請求項５】前記リンク（Ｌｉｎｋ）トリＡホスホニ
ウム基がベンジルトリブチルホスホニウムクロライドで
ある請求項１記載のポリマー。
【請求項６】前記リンク（Ｌｉｎｋ）トリＡホスホニ
ウム基がベンジルトリオクチルホスホニウムクロライド
である請求項１記載のポリマー。
【請求項７】前記ポリマーがトリＡの混合物を含有す
るポリマーであり、Ａは夫々、１〜２０個の炭素原子を
含有するアルキル及びアラルキルからなる群から選択さ
れる請求項１記載のポリマー。
【請求項８】前記トリＡの混合物がトリブチル及びト
リオクチルを含有する請求項７記載のポリマー。
【請求項９】前記ポリマーがポリ（ビニルベンジルト
リアルキルホスホニウムクロライド）であり、該アルキ
ルは７５モル％のトリブチル及び２５モル％のトリオク
チルである請求項８記載のポリマー。