JPH09131186A - 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents
組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法Info
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Abstract
ことなく、微生物から効率的にPHBを生産する方法お
よび、その方法に用いる藍藻内で安定して存在できる組
換えプラスミドおよび該組換えプラスミド含有形質転換
藍藻シネココッカス種を提供する。 【解決手段】 藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列の下流にアルカリ
ゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルCoAレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする遺
伝子群を組み込んだ組換えプラスミド(pAEN1)、
それを含有する形質転換藍藻シネココッカス種(FER
M P−15189)、および該形質転換藍藻シネココ
ッカス種を培養することによるポリ−β−ヒドロキシ酪
酸の製造方法。
Description
ド、組換えプラスミド含有形質転換藍藻シネココッカス
種及びポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。PHBを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭5
9−220192号、特開昭64−27483号および
特開平1−222788号の各公報でPBHの製造方法
について開示されている。しかしながら、これらの何れ
の方法の場合も資化性炭素源として有機炭素源を必要と
するという欠点があった。そこで、特殊な微生物を利用
して有機炭素源を必要としないでPHBを製造する方法
も提案されている。例えば、Journal of F
ermentation and Bioengine
ering Vol.69,No.3,170−174
(1990)によれば、アルカリゲネス・ユウトロファ
ス(Alcaligenes eutrophus)を
用いて二酸化炭素を炭素源としてPHBを製造する方法
を提案しているが、PHBの生産には二酸化炭素と同時
に還元物質であるH2が必須である点で不都合であっ
た。
必要とすることなく微生物から効率的にPHBを生産さ
せる方法が種々模索された。例えば特開平6−3157
65号では、アルカリゲネス・ユウトロファス(Alc
aligenes eutrophus)起源のβ−ケ
トチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼおよ
びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをクローニン
グしたベクターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用
いることで、PHB生産能の無い藍藻シネココッカス種
にPHBを生産させることに成功している。しかしなが
らPHB生産遺伝子群を発現させるためのプロモーター
が藍藻由来のものではなかったため、PHBの生産能力
がPHB含有率1%以下と極めて低かった。また藍藻は
細胞内で組換えがおこり易いため、ベクターがプラスミ
ドとして存在せずに細胞内の染色体に取り込まれてしま
うことも種々の点で好ましくなかった。
炭酸源やH2等の還元物質を必要とすることなく、微生
物から効率的にPHBを生産する方法および、その方法
に用いる藍藻内で安定して存在できる組換えプラスミド
および該組換えプラスミド含有形質転換藍藻を提供する
ことを課題とする。
を解決すべく鋭意研究の結果、アルカリゲネス・ユウト
ロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルC
oAレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリ
メラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群を、
藍藻由来のプロモーター活性を有する遺伝子の下流に組
み込むことによって、組換えプラスミドを構築したとこ
ろ、この組換えプラスミドを導入した藍藻シネココッカ
ス種が有機炭素源やH2を必要とすることなく、PHB
を生産でき、しかもこのPHB生産能を有するシネココ
ッカス種は細胞内に組換えプラスミドを安定に含有し、
またその培養物からPHBが高い収率で得られることを
見いだして、本発明を完成した。すなわち本発明によれ
ば、藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロ
モーター活性を有する配列番号1で示される配列の下流
にアルカリゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドが提供
される。本発明はまた前記プラスミドがアンピシリンお
よびクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpAEN
1プラスミドである組換えプラスミドにも関する。本発
明によれば、さらに、前記組換えプラスミドを含有し、
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換藍藻
シネココッカス種も提供される。本発明によれば、ま
た、FERM P−15189である前記形質転換藍藻
シネココッカス種が提供される。さらに本発明によれば
前記ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換
藍藻シネココッカス種を培養し、培養物からポリ−β−
ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。
びそれを含有する形質転換藍藻シネココッカス種は例え
ば次のようにして得ることができる。
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群はすでに配列決定されており、調
製法と共にThe Journal of Biolo
gical Chemistry.Vol.264,N
o.26,15293−15297および同15298
−15303(1989)に記載されている。このβ−
ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ、
ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群
をコードする酵素遺伝子群は以下、PHB合成遺伝子断
片と呼ぶ。
ラスミド例えばpUC19に導入する。すなわち例え
ば、10mM Tris−HCl(pH7.5),10
mMMgCl2,1mM DTTなどのような緩衝液
中、pUC19を制限酵素、例えばEcoRI及びSm
aIで処理し、次いアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製し、制限酵素EcoRIおよびSmaI処理pU
C19(約2.7K塩基対)を得る。これとは別にPH
B合成遺伝子断片を例えば10mM Tris−HCl
(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DT
Tなどのような公知の緩衝液中、SmaIおよびEco
RIを用いて処理し、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製して、SmaIおよびEcoRI処理したPHB
合成遺伝子断片を得る。前記のようにして得られた制限
酵素処理pUC19およびPHB合成遺伝子断片を10
mM Tris−HCl(pH7.5),10mM M
gCl2,1mM DTT,1mM ATPなどのよう
な公知の緩衝液中T4リガーゼを用いて連結し、pUC
19にPHB合成遺伝子断片を導入した約8K塩基対プ
ラスミドを構築し、これをpAE100と名付ける。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターpAEN1を構築する。このとき使用できるプ
ラスミドとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有
する藍藻と大腸菌のシャトルベクターpECAN8にプ
ラスミドpKK232−8のクロラムフェニコール耐性
遺伝子、および配列番号1に示す藍藻由来のプロモータ
ー活性を有する遺伝子を組み込んだpKE4−9があげ
られる。前記pECAN8の製法は、FEMS Mic
robiol.Lett.,Vol.27,253−2
56(1985)に記載されている。pAE100から
PHB合成遺伝子断片を切り出すには、例えば10mM
Tris−HCl(pH7.5),10mM MgC
l2,1mM DTT,50mM NaClなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばEcoRIおよびHin
dIIIを用いて、pAE100を37℃で1時間反応さ
せ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。この
ようにして得られた遺伝子断片のうち約5,200塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば3mM
Tris−酢酸(pH7.9),66mM酢酸カリウ
ム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,
0.1mg/ml BSA,0.1mM dATP,
0.1mMdCTP,0.1mM dTTP,0.1m
M dGTPなどのような緩衝液中、T4ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製PHB合成遺伝子断片が得られる。
入するには、例えば、50mM Tris−HCl(p
H7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,
100mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばSalIを用いて、pKE4−9を37℃で
1時間反応させ、次いで例えば3mM Tris−酢酸
(pH7.9),66mM酢酸カリウム、10mM酢酸
マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/ml
BSA,0.1mM dATP,0.1mMdCT
P,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPなど
のような緩衝液中、T4ポリメラーゼを用いて通常37
℃で5分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、PHB合成遺伝子断片との結合に
使用する。
9とPHB合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝
液中、10mM Tris−HCl(pH7.5),1
0mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP
中でPHB合成遺伝子断片とpKE4−9をT4リガー
ゼを用いて通常16℃で1時間処理すればよい。このよ
うにしてpKE4−9にPHB合成遺伝子断片を導入し
た組換えプラスミドをpAEN1と名付け、その構成を
図1に示す。
を形質転換する。まずシネココッカス種の細胞を例えば
表1に示すBG−11培地や表2に示すMDM培地のよ
うな培地中で所定量となるまで培養する。
r編集のMethod in Enzymology
Vol.167(ACADEMIC PRESS,IN
C.1988)に記載された方法等に従い、pAEN1
を用いて該藍藻を自然形質転換する。このpAEN1を
保有するシネココッカス種形質転換藍藻は、pAEN1
−1と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成7年9月19日に寄託した(受託番号=FERM P
−15189)。
産させる。例えば形質転換藍藻を、上記BG−11培地
のような培地にアンピシリン、クロラムフェニコールを
添加し、通常、通気撹拌培養を行う。アンピシリンは最
終濃度0.1〜20mg/ml、好ましくは1〜5mg
/mlとなるよう添加し、クロラムフェニコールは最終
濃度1〜50mg/ml、好ましくは5〜20mg/m
lとなるよう添加する。一般に培養温度は20〜60
℃、好ましくは25〜55℃、培養液のpHは6〜1
1、好ましくは7〜9が望ましい。また、光強度は10
00〜3000Luxが好ましい。次に、所定量まで培
養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の方
法により分離する。分離した藍藻菌体を栄養源を制限し
た培養液、例えば、BG−11培地から硝酸ナトリウム
を除いた培地にて培養を行い、藍藻菌体にPHBを生成
蓄積させ、このPHBをG.Brauneggらの方法
(European Journal of Appl
ied Microbiology and Biot
echnology 6,29−37(1978))に
従い培養菌体細胞から採取する。PHBの含有率は乾燥
菌体重量当たり2%であり、従来1%以下だったのに比
較して格段に向上している。この藍藻はPHB合成遺伝
子群をプラスミド中に安定に保持している。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
genes eutrophus)起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする構造遺伝子群断片(PHB合成遺伝子断片)を
The Journal of Biological
Chemistry,Vol.264,No.26,
15293−15297(1989)およびThe J
ournal of Biological Chem
istry,Vol.264,No.26,15298
−15303(1989)に記載されている方法で調製
した。一方、得られたPHB合成遺伝子断片をプラスミ
ドに導入するため、プラスミドpUC19 100μg
(宝酒造株式会社製)を用意し、緩衝液10mM Tr
is−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,
1mM DTT中、制限酵素EcoRI及びSmaIそ
れぞれ500ユニットずつ用いて、37℃で1時間反応
させ、次いでアルカリホスファターゼ2ユニットを用い
て37℃で1時間脱リン酸化反応を行い、さらにフェノ
ール抽出により精製した。
SmaI処理したpUC19(約2.7K塩基対)と、
PHB合成遺伝子とを連結するために、PHB合成遺伝
子断片200μgを緩衝液10mM Tris−HCl
(pH7.5),10mMMgCl2,1mM DTT
中、SmaIおよびEcoRIをそれぞれ500ユニッ
トずつ用いて、37℃で1時間反応させ、さらにフェノ
ール抽出により精製した。その後、緩衝液10mM T
ris−HCl(pH7.5),10mMMgCl2,
1mM DTT,1mM ATP中で、上記処理したP
HB合成遺伝子断片100ngと上記処理したpUC1
9 50ngに対して5ユニットのT4リガーゼを用い
て16℃で約1時間処理した。このようにしてpUC1
9にPHB合成遺伝子断片を導入した約8K塩基対プラ
スミドをpAE100と名付けた。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するため、プラスミドpKE4−9を1
00μg用意した。pKE4−9は、アンピシリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターpEC
AN8にプラスミドpKK232−8(Pharmac
ia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列番号1で示される
遺伝子を組み込んだものである。pAE100からPH
B合成遺伝子断片を切り出すため、緩衝液10mM T
ris−HCl(pH7.5),10mM MgC
l2,1mM DTT,50mM NaCl中、制限酵
素EcoRIおよびHindIIIをそれぞれ500ユニ
ットずつ用いて、pAE100の200μgを37℃で
1時間反応させ、フェノール抽出により精製した。次
に、得られた遺伝子断片のうち約5,200塩基の大き
さのものを選択し、これをさらに緩衝液3mM Tri
s−酢酸(pH7.9),66mM酢酸カリウム、10
mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1m
g/ml BSA,0.1mM dATP,0.1mM
dCTP,0.1mM dTTP,0.1mM dG
TP中、200ユニットのT4ポリメラーゼを用いて3
7℃で5分間処理し、次いでフェノール抽出することに
より精製PHB合成遺伝子断片を得た。
入するため、緩衝液50mM Tris−HCl(pH
7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1
00mM NaCl緩衝液中、制限酵素SalIを50
0ユニット用いて、pKE4−9の200μgを37℃
で1時間反応させ、次いで3mM Tris−酢酸(p
H7.9),66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグ
ネシウム、0.5mMDTT,0.1mg/ml BS
A,0.1mM dATP,0.1mM dCTP,
0.1mM dTTP,0.1mM dGTPの緩衝液
中、200ユニットのT4ポリメラーゼを用いて通常3
7℃で5分間処理し、さらにアルカリホスファターゼ2
ユニットを用いて37℃で1時間脱リン酸化反応を行っ
た後、フェノール抽出により精製した。その後、前記S
alI処理したpKE4−9とPHB合成遺伝子断片を
連結するため緩衝液10mM Tris−HCl(pH
7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,1
mM ATP中でPHB合成遺伝子断片100ngと前
記処理したpKE4−9の50ngに対して5ユニット
のT4リガーゼを用いて16℃で約1時間処理した。こ
のようにしてpKE4−9のSalIサイトにPHB合
成遺伝子断片を導入した14.00kb塩基対のプラス
ミドを得、これをpAEN1と名付けた。その構成を図
1に示す。
るため、シネココッカス種PCC7942(Synec
hococcus sp.PCC7942)をBG−1
1培地40mlにて2,000Lux、30℃にてOD
660=0.2の値になるまで培養し、pAEN1 20
μgを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、PackerおよびA.N.Clazer編集のM
ethod in Enzymology Vol.1
67(ACADEMIC PRESS,INC.198
8)に記載されている方法を用いた、このpAEN1を
保有するシネココッカス種PCC7942の形質転換藍
藻は、pAEN1−1と命名し、工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成7年9月19日に寄託した(受託番
号=FERM P−15189)。
g/mlおよびクロラムフェニコール10mg/mlを
含むBG−11培地200mlに植菌し、2,000L
ux、30℃にて14日間培養を行った。この培養物を
30℃、1580G、10分間の条件で遠心し、培養液
から藍藻菌体を分離した。分離した藍藻菌体をBG−1
1培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、
2,000Lux、30℃で、さらに14日間培養を行
った。培養後の藍藻菌体によるPHB蓄積率は乾燥菌体
重量当たり2%であった。菌体からのPHBの採取は
G.Brauneggらの方法(EuropeanJo
urnal of Applied Microbio
logy andBiotechnology 6,2
9−37(1978))に従って実施した。PHBの定
量は、ガスクロマトグラフにて下記のように行った。す
なわち、凍結乾燥した菌体40mgをスクリューキャッ
プ付き10ml試験管に入れ、クロロホルム2mlと、
3wt%硫酸−メタノール溶液2mlを加え、栓をして
100℃で3.5時間反応させた。反応終了後、水1m
lを加えて激しく10分間振とうした後に、2層に分離
した下層のクロロホルム層を取り出し、このクロロホル
ム層をガスクロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪
酸メチルのピークの面積からPHB量を計算して求め
た。
0mlに植菌し、2,000Lux、30℃にて14日
間培養を行った。この培養物を30℃、1580G、1
0分間の条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離し
た。分離した藍藻菌体をBG−11培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた培地にて懸濁させ、2,000Lux、3
0℃で、さらに14日間培養を行った。培養後の藍藻菌
体によるPHB蓄積量を定量したが、PHBの蓄積は認
められなかった(乾燥菌体重量当たり0.001%未
満)。PHBの定量は、実施例1と同様にして行った。
し、有機炭素源もしくはH2等の還元物質を必要とする
ことなく、安定にプラスミドを保持できる微生物から効
率的にPHBを生産することが可能となった。
図である。
に必要な領域 No.9 :配列番号1で示されるプロモーター phb C:ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 phb A:β−ケトチオラーゼ遺伝子 phb b:アセトアセチルCoAレダクターゼ遺伝子 CAT:クロラムフェニコール耐性遺伝子 Amp:アンピシリン耐性遺伝子 ORI:大腸菌で複製する為に必要な領域
Claims (5)
- 【請求項1】 藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列番号1で示される
配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファス起源のβ
−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼ
およびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる
酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラス
ミド。 - 【請求項2】 前記プラスミドがアンピシリンおよびク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpAEN1プラ
スミドである請求項1記載の組換えプラスミド。 - 【請求項3】 請求項1記載の組換えプラスミドを含有
し、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換
藍藻シネココッカス種。 - 【請求項4】 FERM P−15189である請求項
3記載の形質転換藍藻シネココッカス種。 - 【請求項5】 請求項3記載のポリ−β−ヒドロキシ酪
酸生産能を有する形質転換藍藻シネココッカス種を培養
し、培養物からポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取するこ
とを特徴とするポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7318591A JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7318591A JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09131186A true JPH09131186A (ja) | 1997-05-20 |
JP2777597B2 JP2777597B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=18100855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7318591A Expired - Lifetime JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2777597B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999036547A1 (en) * | 1998-01-19 | 1999-07-22 | Lg Chemical Ltd. | POLYHYDROCYALKANOATE BIOSYNTHESIS-RELATED GENES DERIVED FROM $i(ALCALIGENES LATUS) |
-
1995
- 1995-11-13 JP JP7318591A patent/JP2777597B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999036547A1 (en) * | 1998-01-19 | 1999-07-22 | Lg Chemical Ltd. | POLYHYDROCYALKANOATE BIOSYNTHESIS-RELATED GENES DERIVED FROM $i(ALCALIGENES LATUS) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2777597B2 (ja) | 1998-07-16 |
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