JPH09131186A - 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents
組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法Info
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- JPH09131186A JPH09131186A JP7318591A JP31859195A JPH09131186A JP H09131186 A JPH09131186 A JP H09131186A JP 7318591 A JP7318591 A JP 7318591A JP 31859195 A JP31859195 A JP 31859195A JP H09131186 A JPH09131186 A JP H09131186A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 有機炭酸源やＨ2等の還元物質を必要とする
ことなく、微生物から効率的にＰＨＢを生産する方法お
よび、その方法に用いる藍藻内で安定して存在できる組
換えプラスミドおよび該組換えプラスミド含有形質転換
藍藻シネココッカス種を提供する。 【解決手段】 藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列の下流にアルカリ
ゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする遺
伝子群を組み込んだ組換えプラスミド（ｐＡＥＮ１）、
それを含有する形質転換藍藻シネココッカス種（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５１８９）、および該形質転換藍藻シネココ
ッカス種を培養することによるポリ−β−ヒドロキシ酪
酸の製造方法。
ことなく、微生物から効率的にＰＨＢを生産する方法お
よび、その方法に用いる藍藻内で安定して存在できる組
換えプラスミドおよび該組換えプラスミド含有形質転換
藍藻シネココッカス種を提供する。 【解決手段】 藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列の下流にアルカリ
ゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする遺
伝子群を組み込んだ組換えプラスミド（ｐＡＥＮ１）、
それを含有する形質転換藍藻シネココッカス種（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５１８９）、および該形質転換藍藻シネココ
ッカス種を培養することによるポリ−β−ヒドロキシ酪
酸の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えプラスミ
ド、組換えプラスミド含有形質転換藍藻シネココッカス
種及びポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。
ド、組換えプラスミド含有形質転換藍藻シネココッカス
種及びポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリ−β−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。ＰＨＢを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭５
９−２２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および
特開平１−２２２７８８号の各公報でＰＢＨの製造方法
について開示されている。しかしながら、これらの何れ
の方法の場合も資化性炭素源として有機炭素源を必要と
するという欠点があった。そこで、特殊な微生物を利用
して有機炭素源を必要としないでＰＨＢを製造する方法
も提案されている。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．３，１７０−１７４
（１９９０）によれば、アルカリゲネス・ユウトロファ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を
用いて二酸化炭素を炭素源としてＰＨＢを製造する方法
を提案しているが、ＰＨＢの生産には二酸化炭素と同時
に還元物質であるＨ2が必須である点で不都合であっ
た。
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。ＰＨＢを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭５
９−２２０１９２号、特開昭６４−２７４８３号および
特開平１−２２２７８８号の各公報でＰＢＨの製造方法
について開示されている。しかしながら、これらの何れ
の方法の場合も資化性炭素源として有機炭素源を必要と
するという欠点があった。そこで、特殊な微生物を利用
して有機炭素源を必要としないでＰＨＢを製造する方法
も提案されている。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．３，１７０−１７４
（１９９０）によれば、アルカリゲネス・ユウトロファ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を
用いて二酸化炭素を炭素源としてＰＨＢを製造する方法
を提案しているが、ＰＨＢの生産には二酸化炭素と同時
に還元物質であるＨ2が必須である点で不都合であっ
た。
【０００３】そこで、有機炭素源やＨ2等の還元物質を
必要とすることなく微生物から効率的にＰＨＢを生産さ
せる方法が種々模索された。例えば特開平６−３１５７
６５号では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケ
トチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよ
びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをクローニン
グしたベクターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用
いることで、ＰＨＢ生産能の無い藍藻シネココッカス種
にＰＨＢを生産させることに成功している。しかしなが
らＰＨＢ生産遺伝子群を発現させるためのプロモーター
が藍藻由来のものではなかったため、ＰＨＢの生産能力
がＰＨＢ含有率１％以下と極めて低かった。また藍藻は
細胞内で組換えがおこり易いため、ベクターがプラスミ
ドとして存在せずに細胞内の染色体に取り込まれてしま
うことも種々の点で好ましくなかった。
必要とすることなく微生物から効率的にＰＨＢを生産さ
せる方法が種々模索された。例えば特開平６−３１５７
６５号では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケ
トチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよ
びポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをクローニン
グしたベクターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用
いることで、ＰＨＢ生産能の無い藍藻シネココッカス種
にＰＨＢを生産させることに成功している。しかしなが
らＰＨＢ生産遺伝子群を発現させるためのプロモーター
が藍藻由来のものではなかったため、ＰＨＢの生産能力
がＰＨＢ含有率１％以下と極めて低かった。また藍藻は
細胞内で組換えがおこり易いため、ベクターがプラスミ
ドとして存在せずに細胞内の染色体に取り込まれてしま
うことも種々の点で好ましくなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、有機
炭酸源やＨ2等の還元物質を必要とすることなく、微生
物から効率的にＰＨＢを生産する方法および、その方法
に用いる藍藻内で安定して存在できる組換えプラスミド
および該組換えプラスミド含有形質転換藍藻を提供する
ことを課題とする。
炭酸源やＨ2等の還元物質を必要とすることなく、微生
物から効率的にＰＨＢを生産する方法および、その方法
に用いる藍藻内で安定して存在できる組換えプラスミド
および該組換えプラスミド含有形質転換藍藻を提供する
ことを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、アルカリゲネス・ユウト
ロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ
ｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリ
メラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群を、
藍藻由来のプロモーター活性を有する遺伝子の下流に組
み込むことによって、組換えプラスミドを構築したとこ
ろ、この組換えプラスミドを導入した藍藻シネココッカ
ス種が有機炭素源やＨ2を必要とすることなく、ＰＨＢ
を生産でき、しかもこのＰＨＢ生産能を有するシネココ
ッカス種は細胞内に組換えプラスミドを安定に含有し、
またその培養物からＰＨＢが高い収率で得られることを
見いだして、本発明を完成した。すなわち本発明によれ
ば、藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロ
モーター活性を有する配列番号１で示される配列の下流
にアルカリゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドが提供
される。本発明はまた前記プラスミドがアンピシリンお
よびクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ
１プラスミドである組換えプラスミドにも関する。本発
明によれば、さらに、前記組換えプラスミドを含有し、
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換藍藻
シネココッカス種も提供される。本発明によれば、ま
た、ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８９である前記形質転換藍藻
シネココッカス種が提供される。さらに本発明によれば
前記ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換
藍藻シネココッカス種を培養し、培養物からポリ−β−
ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。
を解決すべく鋭意研究の結果、アルカリゲネス・ユウト
ロファス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣ
ｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリ
メラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群を、
藍藻由来のプロモーター活性を有する遺伝子の下流に組
み込むことによって、組換えプラスミドを構築したとこ
ろ、この組換えプラスミドを導入した藍藻シネココッカ
ス種が有機炭素源やＨ2を必要とすることなく、ＰＨＢ
を生産でき、しかもこのＰＨＢ生産能を有するシネココ
ッカス種は細胞内に組換えプラスミドを安定に含有し、
またその培養物からＰＨＢが高い収率で得られることを
見いだして、本発明を完成した。すなわち本発明によれ
ば、藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロ
モーター活性を有する配列番号１で示される配列の下流
にアルカリゲネス・ユウトロファス起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドが提供
される。本発明はまた前記プラスミドがアンピシリンお
よびクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ
１プラスミドである組換えプラスミドにも関する。本発
明によれば、さらに、前記組換えプラスミドを含有し、
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換藍藻
シネココッカス種も提供される。本発明によれば、ま
た、ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８９である前記形質転換藍藻
シネココッカス種が提供される。さらに本発明によれば
前記ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換
藍藻シネココッカス種を培養し、培養物からポリ−β−
ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の組換えプラスミド、およ
びそれを含有する形質転換藍藻シネココッカス種は例え
ば次のようにして得ることができる。
びそれを含有する形質転換藍藻シネココッカス種は例え
ば次のようにして得ることができる。
【０００７】まず、アルカリゲネス・ユウトロファス起
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群はすでに配列決定されており、調
製法と共にＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖｏｌ．２６４，Ｎ
ｏ．２６，１５２９３−１５２９７および同１５２９８
−１５３０３（１９８９）に記載されている。このβ−
ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、
ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群
をコードする酵素遺伝子群は以下、ＰＨＢ合成遺伝子断
片と呼ぶ。
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群はすでに配列決定されており、調
製法と共にＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖｏｌ．２６４，Ｎ
ｏ．２６，１５２９３−１５２９７および同１５２９８
−１５３０３（１９８９）に記載されている。このβ−
ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、
ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群
をコードする酵素遺伝子群は以下、ＰＨＢ合成遺伝子断
片と呼ぶ。
【０００８】次に、得られたＰＨＢ合成遺伝子断片をプ
ラスミド例えばｐＵＣ１９に導入する。すなわち例え
ば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴなどのような緩衝液
中、ｐＵＣ１９を制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＳｍ
ａＩで処理し、次いアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ処理ｐＵ
Ｃ１９（約２．７Ｋ塩基対）を得る。これとは別にＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴ
Ｔなどのような公知の緩衝液中、ＳｍａＩおよびＥｃｏ
ＲＩを用いて処理し、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製して、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ処理したＰＨＢ
合成遺伝子断片を得る。前記のようにして得られた制限
酵素処理ｐＵＣ１９およびＰＨＢ合成遺伝子断片を１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰなどのよう
な公知の緩衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、ｐＵＣ
１９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プ
ラスミドを構築し、これをｐＡＥ１００と名付ける。
ラスミド例えばｐＵＣ１９に導入する。すなわち例え
ば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０
ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴなどのような緩衝液
中、ｐＵＣ１９を制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＳｍ
ａＩで処理し、次いアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ処理ｐＵ
Ｃ１９（約２．７Ｋ塩基対）を得る。これとは別にＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴ
Ｔなどのような公知の緩衝液中、ＳｍａＩおよびＥｃｏ
ＲＩを用いて処理し、さらに例えばフェノール抽出によ
り精製して、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ処理したＰＨＢ
合成遺伝子断片を得る。前記のようにして得られた制限
酵素処理ｐＵＣ１９およびＰＨＢ合成遺伝子断片を１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰなどのよう
な公知の緩衝液中Ｔ４リガーゼを用いて連結し、ｐＵＣ
１９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プ
ラスミドを構築し、これをｐＡＥ１００と名付ける。
【０００９】次に、ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターｐＡＥＮ１を構築する。このとき使用できるプ
ラスミドとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有
する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣＡＮ８にプ
ラスミドｐＫＫ２３２−８のクロラムフェニコール耐性
遺伝子、および配列番号１に示す藍藻由来のプロモータ
ー活性を有する遺伝子を組み込んだｐＫＥ４−９があげ
られる。前記ｐＥＣＡＮ８の製法は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２７，２５３−２
５６（１９８５）に記載されている。ｐＡＥ１００から
ＰＨＢ合成遺伝子断片を切り出すには、例えば１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄIIIを用いて、ｐＡＥ１００を３７℃で１時間反応さ
せ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。この
ようにして得られた遺伝子断片のうち約５，２００塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰなどのような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製ＰＨＢ合成遺伝子断片が得られる。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターｐＡＥＮ１を構築する。このとき使用できるプ
ラスミドとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有
する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣＡＮ８にプ
ラスミドｐＫＫ２３２−８のクロラムフェニコール耐性
遺伝子、および配列番号１に示す藍藻由来のプロモータ
ー活性を有する遺伝子を組み込んだｐＫＥ４−９があげ
られる。前記ｐＥＣＡＮ８の製法は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２７，２５３−２
５６（１９８５）に記載されている。ｐＡＥ１００から
ＰＨＢ合成遺伝子断片を切り出すには、例えば１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄIIIを用いて、ｐＡＥ１００を３７℃で１時間反応さ
せ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。この
ようにして得られた遺伝子断片のうち約５，２００塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，
０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，
０．１ｍＭｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰなどのような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製ＰＨＢ合成遺伝子断片が得られる。
【００１０】ｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導
入するには、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，
１００ｍＭ ＮａＣｌなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばＳａｌＩを用いて、ｐＫＥ４−９を３７℃で
１時間反応させ、次いで例えば３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸
（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸
マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰなど
のような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７
℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、ＰＨＢ合成遺伝子断片との結合に
使用する。
入するには、例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，
１００ｍＭ ＮａＣｌなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばＳａｌＩを用いて、ｐＫＥ４−９を３７℃で
１時間反応させ、次いで例えば３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸
（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸
マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰなど
のような緩衝液中、Ｔ４ポリメラーゼを用いて通常３７
℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、ＰＨＢ合成遺伝子断片との結合に
使用する。
【００１１】こうして得られたＳａｌＩ処理ｐＫＥ４−
９とＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝
液中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ
中でＰＨＢ合成遺伝子断片とｐＫＥ４−９をＴ４リガー
ゼを用いて通常１６℃で１時間処理すればよい。このよ
うにしてｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入し
た組換えプラスミドをｐＡＥＮ１と名付け、その構成を
図１に示す。
９とＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝
液中、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ
中でＰＨＢ合成遺伝子断片とｐＫＥ４−９をＴ４リガー
ゼを用いて通常１６℃で１時間処理すればよい。このよ
うにしてｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入し
た組換えプラスミドをｐＡＥＮ１と名付け、その構成を
図１に示す。
【００１２】次にｐＡＥＮ１を用いてシネココッカス種
を形質転換する。まずシネココッカス種の細胞を例えば
表１に示すＢＧ−１１培地や表２に示すＭＤＭ培地のよ
うな培地中で所定量となるまで培養する。
を形質転換する。まずシネココッカス種の細胞を例えば
表１に示すＢＧ−１１培地や表２に示すＭＤＭ培地のよ
うな培地中で所定量となるまで培養する。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】次にＰａｃｋｅｒ及びＡ．Ｎ．Ｃｌａｚｅ
ｒ編集のＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮ
Ｃ．１９８８）に記載された方法等に従い、ｐＡＥＮ１
を用いて該藍藻を自然形質転換する。このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種形質転換藍藻は、ｐＡＥＮ１
−１と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成７年９月１９日に寄託した（受託番号＝ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１８９）。
ｒ編集のＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮ
Ｃ．１９８８）に記載された方法等に従い、ｐＡＥＮ１
を用いて該藍藻を自然形質転換する。このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種形質転換藍藻は、ｐＡＥＮ１
−１と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成７年９月１９日に寄託した（受託番号＝ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１８９）。
【００１６】次に、得られた形質転換藍藻にＰＨＢを生
産させる。例えば形質転換藍藻を、上記ＢＧ−１１培地
のような培地にアンピシリン、クロラムフェニコールを
添加し、通常、通気撹拌培養を行う。アンピシリンは最
終濃度０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｇ
／ｍｌとなるよう添加し、クロラムフェニコールは最終
濃度１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍ
ｌとなるよう添加する。一般に培養温度は２０〜６０
℃、好ましくは２５〜５５℃、培養液のｐＨは６〜１
１、好ましくは７〜９が望ましい。また、光強度は１０
００〜３０００Ｌｕｘが好ましい。次に、所定量まで培
養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の方
法により分離する。分離した藍藻菌体を栄養源を制限し
た培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリウム
を除いた培地にて培養を行い、藍藻菌体にＰＨＢを生成
蓄積させ、このＰＨＢをＧ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２９−３７（１９７８））に
従い培養菌体細胞から採取する。ＰＨＢの含有率は乾燥
菌体重量当たり２％であり、従来１％以下だったのに比
較して格段に向上している。この藍藻はＰＨＢ合成遺伝
子群をプラスミド中に安定に保持している。
産させる。例えば形質転換藍藻を、上記ＢＧ−１１培地
のような培地にアンピシリン、クロラムフェニコールを
添加し、通常、通気撹拌培養を行う。アンピシリンは最
終濃度０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｇ
／ｍｌとなるよう添加し、クロラムフェニコールは最終
濃度１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍ
ｌとなるよう添加する。一般に培養温度は２０〜６０
℃、好ましくは２５〜５５℃、培養液のｐＨは６〜１
１、好ましくは７〜９が望ましい。また、光強度は１０
００〜３０００Ｌｕｘが好ましい。次に、所定量まで培
養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の方
法により分離する。分離した藍藻菌体を栄養源を制限し
た培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリウム
を除いた培地にて培養を行い、藍藻菌体にＰＨＢを生成
蓄積させ、このＰＨＢをＧ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２９−３７（１９７８））に
従い培養菌体細胞から採取する。ＰＨＢの含有率は乾燥
菌体重量当たり２％であり、従来１％以下だったのに比
較して格段に向上している。この藍藻はＰＨＢ合成遺伝
子群をプラスミド中に安定に保持している。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００１８】実施例 まず、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする構造遺伝子群断片（ＰＨＢ合成遺伝子断片）を
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，
１５２９３−１５２９７（１９８９）およびＴｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，１５２９８
−１５３０３（１９８９）に記載されている方法で調製
した。一方、得られたＰＨＢ合成遺伝子断片をプラスミ
ドに導入するため、プラスミドｐＵＣ１９ １００μｇ
（宝酒造株式会社製）を用意し、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ中、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩそ
れぞれ５００ユニットずつ用いて、３７℃で１時間反応
させ、次いでアルカリホスファターゼ２ユニットを用い
て３７℃で１時間脱リン酸化反応を行い、さらにフェノ
ール抽出により精製した。
ｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）起源のβ−ケトチオ
ラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリ
ヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコ
ードする構造遺伝子群断片（ＰＨＢ合成遺伝子断片）を
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，
１５２９３−１５２９７（１９８９）およびＴｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．２６，１５２９８
−１５３０３（１９８９）に記載されている方法で調製
した。一方、得られたＰＨＢ合成遺伝子断片をプラスミ
ドに導入するため、プラスミドｐＵＣ１９ １００μｇ
（宝酒造株式会社製）を用意し、緩衝液１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ中、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩそ
れぞれ５００ユニットずつ用いて、３７℃で１時間反応
させ、次いでアルカリホスファターゼ２ユニットを用い
て３７℃で１時間脱リン酸化反応を行い、さらにフェノ
ール抽出により精製した。
【００１９】このようにして制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＳｍａＩ処理したｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基対）と、
ＰＨＢ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＢ合成遺伝
子断片２００μｇを緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ
中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５００ユニッ
トずつ用いて、３７℃で１時間反応させ、さらにフェノ
ール抽出により精製した。その後、緩衝液１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中で、上記処理したＰ
ＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと上記処理したｐＵＣ１
９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガーゼを用い
て１６℃で約１時間処理した。このようにしてｐＵＣ１
９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プラ
スミドをｐＡＥ１００と名付けた。
ＳｍａＩ処理したｐＵＣ１９（約２．７Ｋ塩基対）と、
ＰＨＢ合成遺伝子とを連結するために、ＰＨＢ合成遺伝
子断片２００μｇを緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ
中、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩをそれぞれ５００ユニッ
トずつ用いて、３７℃で１時間反応させ、さらにフェノ
ール抽出により精製した。その後、緩衝液１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ2，
１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ中で、上記処理したＰ
ＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと上記処理したｐＵＣ１
９ ５０ｎｇに対して５ユニットのＴ４リガーゼを用い
て１６℃で約１時間処理した。このようにしてｐＵＣ１
９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入した約８Ｋ塩基対プラ
スミドをｐＡＥ１００と名付けた。
【００２０】次に、ｐＡＥ１００からＰＨＢ合成遺伝子
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するため、プラスミドｐＫＥ４−９を１
００μｇ用意した。ｐＫＥ４−９は、アンピシリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣ
ＡＮ８にプラスミドｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列番号１で示される
遺伝子を組み込んだものである。ｐＡＥ１００からＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を切り出すため、緩衝液１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ中、制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIをそれぞれ５００ユニ
ットずつ用いて、ｐＡＥ１００の２００μｇを３７℃で
１時間反応させ、フェノール抽出により精製した。次
に、得られた遺伝子断片のうち約５，２００塩基の大き
さのものを選択し、これをさらに緩衝液３ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ
ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧ
ＴＰ中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３
７℃で５分間処理し、次いでフェノール抽出することに
より精製ＰＨＢ合成遺伝子断片を得た。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するため、プラスミドｐＫＥ４−９を１
００μｇ用意した。ｐＫＥ４−９は、アンピシリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターｐＥＣ
ＡＮ８にプラスミドｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列番号１で示される
遺伝子を組み込んだものである。ｐＡＥ１００からＰＨ
Ｂ合成遺伝子断片を切り出すため、緩衝液１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ中、制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIをそれぞれ５００ユニ
ットずつ用いて、ｐＡＥ１００の２００μｇを３７℃で
１時間反応させ、フェノール抽出により精製した。次
に、得られた遺伝子断片のうち約５，２００塩基の大き
さのものを選択し、これをさらに緩衝液３ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−酢酸（ｐＨ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０
ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ
ｄＣＴＰ，０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧ
ＴＰ中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて３
７℃で５分間処理し、次いでフェノール抽出することに
より精製ＰＨＢ合成遺伝子断片を得た。
【００２１】ｐＫＥ４−９にＰＨＢ合成遺伝子断片を導
入するため、緩衝液５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１
００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中、制限酵素ＳａｌＩを５０
０ユニット用いて、ｐＫＥ４−９の２００μｇを３７℃
で１時間反応させ、次いで３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐ
Ｈ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、０．５ｍＭＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，
０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰの緩衝液
中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて通常３
７℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼ２
ユニットを用いて３７℃で１時間脱リン酸化反応を行っ
た後、フェノール抽出により精製した。その後、前記Ｓ
ａｌＩ処理したｐＫＥ４−９とＰＨＢ合成遺伝子断片を
連結するため緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１
ｍＭ ＡＴＰ中でＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと前
記処理したｐＫＥ４−９の５０ｎｇに対して５ユニット
のＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１時間処理した。こ
のようにしてｐＫＥ４−９のＳａｌＩサイトにＰＨＢ合
成遺伝子断片を導入した１４．００ｋｂ塩基対のプラス
ミドを得、これをｐＡＥＮ１と名付けた。その構成を図
１に示す。
入するため、緩衝液５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１
００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中、制限酵素ＳａｌＩを５０
０ユニット用いて、ｐＫＥ４−９の２００μｇを３７℃
で１時間反応させ、次いで３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐ
Ｈ７．９），６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、０．５ｍＭＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ，０．１ｍＭ ｄＡＴＰ，０．１ｍＭ ｄＣＴＰ，
０．１ｍＭ ｄＴＴＰ，０．１ｍＭ ｄＧＴＰの緩衝液
中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを用いて通常３
７℃で５分間処理し、さらにアルカリホスファターゼ２
ユニットを用いて３７℃で１時間脱リン酸化反応を行っ
た後、フェノール抽出により精製した。その後、前記Ｓ
ａｌＩ処理したｐＫＥ４−９とＰＨＢ合成遺伝子断片を
連結するため緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＤＴＴ，１
ｍＭ ＡＴＰ中でＰＨＢ合成遺伝子断片１００ｎｇと前
記処理したｐＫＥ４−９の５０ｎｇに対して５ユニット
のＴ４リガーゼを用いて１６℃で約１時間処理した。こ
のようにしてｐＫＥ４−９のＳａｌＩサイトにＰＨＢ合
成遺伝子断片を導入した１４．００ｋｂ塩基対のプラス
ミドを得、これをｐＡＥＮ１と名付けた。その構成を図
１に示す。
【００２２】次にｐＡＥＮ１を用いて形質転換藍藻を得
るため、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）をＢＧ−１
１培地４０ｍｌにて２，０００Ｌｕｘ、３０℃にてＯＤ
660＝０．２の値になるまで培養し、ｐＡＥＮ１ ２０
μｇを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、ＰａｃｋｅｒおよびＡ．Ｎ．Ｃｌａｚｅｒ編集のＭ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１
６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９８
８）に記載されている方法を用いた、このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種ＰＣＣ７９４２の形質転換藍
藻は、ｐＡＥＮ１−１と命名し、工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番
号＝ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８９）。
るため、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２（Ｓｙｎｅｃ
ｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）をＢＧ−１
１培地４０ｍｌにて２，０００Ｌｕｘ、３０℃にてＯＤ
660＝０．２の値になるまで培養し、ｐＡＥＮ１ ２０
μｇを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、ＰａｃｋｅｒおよびＡ．Ｎ．Ｃｌａｚｅｒ編集のＭ
ｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１
６７（ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．１９８
８）に記載されている方法を用いた、このｐＡＥＮ１を
保有するシネココッカス種ＰＣＣ７９４２の形質転換藍
藻は、ｐＡＥＮ１−１と命名し、工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成７年９月１９日に寄託した（受託番
号＝ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８９）。
【００２３】次に、ｐＡＥＮ１−１をアンピシリン２ｍ
ｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍｌを
含むＢＧ−１１培地２００ｍｌに植菌し、２，０００Ｌ
ｕｘ、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物を
３０℃、１５８０Ｇ、１０分間の条件で遠心し、培養液
から藍藻菌体を分離した。分離した藍藻菌体をＢＧ−１
１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、
２，０００Ｌｕｘ、３０℃で、さらに１４日間培養を行
った。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢ蓄積率は乾燥菌体
重量当たり２％であった。菌体からのＰＨＢの採取は
Ｇ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２
９−３７（１９７８））に従って実施した。ＰＨＢの定
量は、ガスクロマトグラフにて下記のように行った。す
なわち、凍結乾燥した菌体４０ｍｇをスクリューキャッ
プ付き１０ｍｌ試験管に入れ、クロロホルム２ｍｌと、
３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液２ｍｌを加え、栓をして
１００℃で３．５時間反応させた。反応終了後、水１ｍ
ｌを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離
した下層のクロロホルム層を取り出し、このクロロホル
ム層をガスクロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪
酸メチルのピークの面積からＰＨＢ量を計算して求め
た。
ｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０ｍｇ／ｍｌを
含むＢＧ−１１培地２００ｍｌに植菌し、２，０００Ｌ
ｕｘ、３０℃にて１４日間培養を行った。この培養物を
３０℃、１５８０Ｇ、１０分間の条件で遠心し、培養液
から藍藻菌体を分離した。分離した藍藻菌体をＢＧ−１
１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁させ、
２，０００Ｌｕｘ、３０℃で、さらに１４日間培養を行
った。培養後の藍藻菌体によるＰＨＢ蓄積率は乾燥菌体
重量当たり２％であった。菌体からのＰＨＢの採取は
Ｇ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，２
９−３７（１９７８））に従って実施した。ＰＨＢの定
量は、ガスクロマトグラフにて下記のように行った。す
なわち、凍結乾燥した菌体４０ｍｇをスクリューキャッ
プ付き１０ｍｌ試験管に入れ、クロロホルム２ｍｌと、
３ｗｔ％硫酸−メタノール溶液２ｍｌを加え、栓をして
１００℃で３．５時間反応させた。反応終了後、水１ｍ
ｌを加えて激しく１０分間振とうした後に、２層に分離
した下層のクロロホルム層を取り出し、このクロロホル
ム層をガスクロマトグラフィーにかけて、ヒドロキシ酪
酸メチルのピークの面積からＰＨＢ量を計算して求め
た。
【００２４】比較例１ シネココッカス種ＰＣＣ７９４２をＢＧ−１１培地２０
０ｍｌに植菌し、２，０００Ｌｕｘ、３０℃にて１４日
間培養を行った。この培養物を３０℃、１５８０Ｇ、１
０分間の条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離し
た。分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた培地にて懸濁させ、２，０００Ｌｕｘ、３
０℃で、さらに１４日間培養を行った。培養後の藍藻菌
体によるＰＨＢ蓄積量を定量したが、ＰＨＢの蓄積は認
められなかった（乾燥菌体重量当たり０．００１％未
満）。ＰＨＢの定量は、実施例１と同様にして行った。
０ｍｌに植菌し、２，０００Ｌｕｘ、３０℃にて１４日
間培養を行った。この培養物を３０℃、１５８０Ｇ、１
０分間の条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離し
た。分離した藍藻菌体をＢＧ−１１培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた培地にて懸濁させ、２，０００Ｌｕｘ、３
０℃で、さらに１４日間培養を行った。培養後の藍藻菌
体によるＰＨＢ蓄積量を定量したが、ＰＨＢの蓄積は認
められなかった（乾燥菌体重量当たり０．００１％未
満）。ＰＨＢの定量は、実施例１と同様にして行った。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、無機物のみを炭素源と
し、有機炭素源もしくはＨ2等の還元物質を必要とする
ことなく、安定にプラスミドを保持できる微生物から効
率的にＰＨＢを生産することが可能となった。
し、有機炭素源もしくはＨ2等の還元物質を必要とする
ことなく、安定にプラスミドを保持できる微生物から効
率的にＰＨＢを生産することが可能となった。
【００２６】
【００２７】配列番号１： 配列の長さ：２６２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ） 起源： 生物名：藍藻 株名 ：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７９４２ 配列の特徴：プロモーター活性 配列： GCCAACCCAC TCCAGTGGCT TAGACCAGTT GCGACTCTGG CTGCCCTGCC CCTATACTTG 60 AGCGTCTGCT GAGATGACAA CGCTGGAGGA TACGGCCATT CGCGAAACGC TCGCCCTGAC 120 GGTTAGTTTG CGAGGAACCG TAGAAGTCAG GGACGATTAC CAATTGTTCC GGCTTACGGG 180 TCAGCTCGAT GCCTTCTCGG AGCCGACCTT CCGCAAGGTT CTTGGCAAGA GCCTAGAAGA 240 TGGGCCAAAA CATGCTATTC TA 262
【図１】組換えプラスミドｐＡＥＮ１の構成を示す概略
図である。
図である。
ＰＵＨ２４：藍藻由来の遺伝子で、藍藻中で複製する為
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：配列番号１で示されるプロモーター ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ：大腸菌で複製する為に必要な領域
に必要な領域 Ｎｏ．９ ：配列番号１で示されるプロモーター ｐｈｂ Ｃ：ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 ｐｈｂ Ａ：β−ケトチオラーゼ遺伝子 ｐｈｂ ｂ：アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子 ＯＲＩ：大腸菌で複製する為に必要な領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 浅田 泰男 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 常盤 豊 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 三宅 正人 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 藍藻での複製に必要な領域を持ち、藍藻
由来のプロモーター活性を有する配列番号１で示される
配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファス起源のβ
−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ
およびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからなる
酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラス
ミド。 - 【請求項２】 前記プラスミドがアンピシリンおよびク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＡＥＮ１プラ
スミドである請求項１記載の組換えプラスミド。 - 【請求項３】 請求項１記載の組換えプラスミドを含有
し、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有する形質転換
藍藻シネココッカス種。 - 【請求項４】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８９である請求項
３記載の形質転換藍藻シネココッカス種。 - 【請求項５】 請求項３記載のポリ−β−ヒドロキシ酪
酸生産能を有する形質転換藍藻シネココッカス種を培養
し、培養物からポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取するこ
とを特徴とするポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7318591A JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7318591A JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09131186A true JPH09131186A (ja) | 1997-05-20 |
| JP2777597B2 JP2777597B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=18100855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7318591A Expired - Lifetime JP2777597B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 組換えプラスミド、それを含有する形質転換藍藻およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2777597B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999036547A1 (en) * | 1998-01-19 | 1999-07-22 | Lg Chemical Ltd. | POLYHYDROCYALKANOATE BIOSYNTHESIS-RELATED GENES DERIVED FROM $i(ALCALIGENES LATUS) |
-
1995
- 1995-11-13 JP JP7318591A patent/JP2777597B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999036547A1 (en) * | 1998-01-19 | 1999-07-22 | Lg Chemical Ltd. | POLYHYDROCYALKANOATE BIOSYNTHESIS-RELATED GENES DERIVED FROM $i(ALCALIGENES LATUS) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2777597B2 (ja) | 1998-07-16 |
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