JPH09121859A - ヒト抗体遺伝子を含む新規プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物宿主細胞中でヒトモノクローナル抗体を
発現しうるプラスミドを提供すること。 【解決手段】 ＳＶ４０初期プロモーターと、その下流
側に位置するヒトモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖部
分もしくはその一部分のアミノ酸配列をコードする構造
遺伝子と、該構造遺伝子の下流側に位置するＳＶ−４０
初期スプライシング ポリＡ付加部位とを含有すること
を特徴とする、哺乳動物宿主細胞中でモノクローナル抗
体の重鎖又は軽鎖部分もしくはその一部分のアミノ酸配
列を発現しうるプラスミド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、たとえば、ヒトの
疾患の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生
化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学
分野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫
グロブリンの遺伝子を含むプラスミドに関する。更に詳
しくは、本発明は、ヒト子宮癌患者のＢ細胞とヒトリン
パ芽球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ
Ｈ１１が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ンの重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むプラスミドに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞融合あるいは細胞の不死化によるモ
ノクローナル抗体作製の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどを使って得られてきた。そのなか
でも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍
抗原の解析などの基礎研究への利用のほかに、血清診
断、標識化抗体による腫瘍の画像診断等に利用されはじ
め、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウス等の
異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与す
ることは投与抗体にたいする免疫反応を惹起し、その結
果、副作用並びに抗体の治療または予防効果の低下を引
き起こす。以上の点から、ヒトの癌の予防、治療、体内
診断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を考え
ると、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しかし、
ヒト型のモノクローナル抗体は、その作製が困難である
ことから、現在のところほとんど実用化されるに至って
いない。

【０００３】このような状況の中で本発明者の一人は、
特開昭５８−２０１９９４公報（特公平０１−５９８７
８号公報）、特開昭５９−１３５８９８号公報および特
開昭５９−１３７４９７号公報に詳しく開示されている
ごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体を産生する細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
（ＡＴＣＣ Ｎｏ.ＨＢ８３０７）を樹立した。この細
胞株が産生する抗体（ＣＬＮ−ＩｇＧと命名）は、抗体
クラスがＩｇＧ、アイソタイプがγ１型およびκ型であ
り、免疫組織学的に癌細胞の表面に存在する癌抗原に結
合し、なおかつ癌細胞の増殖を抑制する効果を持つとい
う興味ある知見が得られている。現在、該モノクローナ
ル抗体の全アミノ酸配列およびＤＮＡ塩基配列が明らか
になっている。

【０００４】

【発明が解決使用とする課題】このような技術背景の中
で、以下に述べる如き解決すべき課題がある。

【０００５】１） モノクローナル抗体産生細胞株は、
一般に継代と共にその抗体産性能の低下することが知ら
れている。また一般的に言って、ヒトハイブリドーマは
マウスのそれに比較して抗体の産生量が低い。ヒトモノ
クローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の抗
体が必要であり、この問題の解決は必須である。

【０００６】２） 現在の免疫学の知見によれば、モノ
クローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の
作用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅さ
せる機構が知られている。更にまた、補体あるいはＫ−
細胞やマクロファージ等の助けをかりて癌細胞の増殖を
抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力でなく、それゆえ更に抗体の抗癌活性を上昇させ
る試みが必要である。

【０００７】以上のような課題の解決手段、すなわち抗
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の上昇を具体化する一
つの手段として遺伝子操作による方法がある。例えば、
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングした後、
動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入し、抗
体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によって解
決することが考えられ、また、２）の問題の場合、抗体
遺伝子を人為的に換えることによって、抗体の種々の機
能、たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを
抗体分子もしくはその断片に付加することによってより
抗癌活性の高い分子をデザインすることが考えられる。

【０００８】これらの目的を達成するためには、抗体遺
伝子を組み込んだプラスミドを作製し、さらにこのプラ
スミドを動物細胞などに導入して、抗体を発現させるこ
とが重要である。

【０００９】本発明の主たる目的は、ヒトモノクローナ
ル抗体の軽鎖または重鎖の遺伝子を組み込んだプラスミ
ドを作製し、これらのプラスミドを動物細胞に導入する
ことによって該抗体を発現することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ＳＶ４
０初期プロモーターと、その下流側に位置するヒトモノ
クローナル抗体の重鎖又は軽鎖部分もしくはその一部分
のアミノ酸配列をコードする構造遺伝子（以下、抗体遺
伝子という）と、該構造遺伝子（抗体遺伝子）の下流側
に位置するＳＶ−４０初期スプライシング ポリＡ付加
部位とを含有することを特徴とする、哺乳動物宿主細胞
中でモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖部分もしくはそ
の一部分のアミノ酸配列を発現しうるプラスミドが提供
される。以下、本発明のプラスミドの作製及びその動物
細胞内での発現についてさらに詳細に説明する。

【００１１】本発明のプラスミドは、例えば、ＳＶ４０
のプロモーターとターミネーターを含む発現プラスミド
の該プロモーターとターミネーターの間に抗体遺伝子を
挿入することにより作製することができる。

【００１２】本発明のプラスミドを構築するのに必要な
「ＳＶ４０初期プロモーター」及び「ＳＶ−４０初期ス
プライシング ポリＡ付加部位」は例えば次のようにし
て取得することができる。

【００１３】すなわち、ＳＶ４０初期プロモーター及び
／又はＳＶ−４０初期スプライシング ポリＡ付加部位
を含むプラスミド等、例えば、ｐＳＶ２ｂｓｒ、ｐＳＶ
２ｎｅｏ、ｐＭＳＧなどを制限酵素等により断片化し電
気泳動などによりそれらの断片を分離した後、目的の断
片を含むゲルを切り出し、例えば電気溶出法によりゲル
片から断片を回収する。回収した断片を、例えば、フェ
ノール処理、エタノール沈澱等により精製する。このよ
うにして得られる精製プロモーター及び／又はターミネ
ーター断片を、ベクター例えばプラスミドベクターに標
準的な手法を用いてプロモーターの下流にターミネータ
ーが位置するようにクローニングすることによって、Ｓ
Ｖ４０のプロモーターとターミネーターを含む発現プラ
スミドを作製することができる。

【００１４】また、必要に応じて、この発現プラスミド
に、標準的な手法を用いて、ＳＶ４０初期プロモーター
をもう一つその下流にＳＶ４０初期スプライシングポリ
Ａ付加部位が位置するようにクローニングすることによ
って、同時に２種類の遺伝子を発現するプラスミドを作
製することができる。

【００１５】一方、上記発現プラスミドに挿入して発現
させうる抗体遺伝子としては、特に制限はなく、任意の
ヒトモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖部分もしくはそ
の一部分（例えば超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤ
Ｒ３など）のアミノ酸配列をコードする構造遺伝子を用
いることができる。また、抗体遺伝子はｃＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、合成ＤＮＡであることができるが、一般にｃＤＮＡ
が好適である。かかる抗体遺伝子の具体例としては、例
えば、ＣＬＮ−ＩｇＧモノクローナル抗体の重鎖又は軽
鎖をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成ＤＮＡ等が挙
げられる。これらの抗体遺伝子はそれを含むプラスミド
等から標準的方法により分離することができる。

【００１６】このようにして得られる抗体遺伝子は、標
準的な手法を用いて前述の発現プラスミドのＳＶ４０初
期プロモーターとＳＶ４０初期スプライシング ポリＡ
付加部位との間に挿入しサブクローニングすることによ
り、本発明のプラスミドを作製することができる。

【００１７】また、前述のＳＶ４０初期プロモーターと
ＳＶ４０初期スプライシングポリＡ付加部位を２つづつ
もつプラスミドの一方のプロモーターとターミネーター
の間に重鎖部位を、そしてもう一方の間に軽鎖部分を挿
入しサブクローニングすることにより、重鎖と軽鎖を同
時に発現するプラスミドを作製することができる。

【００１８】本発明のプラスミドは、前述したＳＶ４０
初期プロモーター、抗体遺伝子及びＳＶ４０初期スプラ
イシングポリＡ付加部位のみから実質的に構成されてい
てもよいが、必要によりさらに、抗体の発現を上昇させ
る目的でエンハンサーや遺伝子増幅配列、例えばＤＨＦ
Ｒ遺伝子等を導入してもよい。

【００１９】以上の如くして作製される本発明のプラス
ミドは、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯ
Ｓ細胞、Ｍ１２細胞、Ｌ細胞、ＷＩＬ２細胞等を形質転
換することにより、抗体遺伝子がコードするヒトモノク
ローナル抗体の重鎖又は軽鎖部又もしくはその一部分の
アミノ酸配列（以下、便宜上これを抗体という）を発現
させることができる。

【００２０】本発明のプラスミドによる動物宿主細胞の
形質転換は、それ自体既知の任意の形質転換方法によっ
て行なうことができる。例えば、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈澱法、リポフェクションによ
り、活性を持った抗体の発現を可能にする適当な宿主細
胞系にトランスフェクションし、トランスフェクション
後、細胞は選択培地中でトランスフェクトされたプラス
ミドを獲得した細胞のみを増殖させる。トランスフェク
ション時に、薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドを抗体遺
伝子を含むものの半分程度にしておけば、薬剤耐性細胞
が抗体遺伝子を含む確率を上昇させることができる。抗
体を発現または分泌するクローンは、例えば、培養上清
中の抗体の存在について、普通のアッセイ技術、例えば
酵素結合免疫吸着法によって同定することができる。形
質転換細胞により分泌される抗体は、普通の技術、例え
ば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーま
たは標準の生化学的手法により精製することができる。

【００２１】また、ヒトモノクローナル抗体の重鎖部分
あるいは軽鎖部分をもつプラスミドで同時に同じ細胞を
形質転換（co-transfection）することにより、もとの
ヒトモノクローナル抗体がもっていた結合活性をもつ抗
体を発現させることができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されないこ
とはいうまでない。

【００２３】実施例１（ベクターの造成） （１） プラスミドｐＢＳＰの作製 Ａ） Bluescript II ＳＫ⁺のＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII
消化、アルカリフォスファターゼ処理 Bluescript II ＳＫ⁺（Stratagene社）ＤＮＡ溶液２０
μｌ（１０μｇ）に１０×Ｍ buffer（１００ｍＭ Tris
-ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）２０μｌ、Ｈｉｎｄ
III（宝酒造（株））５μｌ（８０units）及び滅菌水１
５５μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートした。
反応後、この溶液に１０×Ｌ buffer（１００ｍＭ Tris
-ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＣｌ）２０μｌ、５Ｍ Ｎ
ａＣｌ０.６μｌ、ＨｉｎｃII（宝酒造（株））５μｌ
（８０units）及び滅菌水１７５μｌを加え、さらに３
７℃で２時間インキュベートした。

【００２４】反応後、フェノール−クロロホルム処理、
エタノール沈澱することによりＤＮＡを精製、回収し
た。０.９％アガロース電気泳動により、切断されたプ
ラスミドを分離し、その切断されたプラスミドをゲルか
ら電気的に溶出した後、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱することによりＤＮＡを精製、回収
した。この沈澱を１００μｌの０.１Ｍ Tris-ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）に溶解し、１０μｌのアルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造（株））溶液を加え、６５℃、２時間
インキュベートした。反応後、フェノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈澱することによりＤＮＡを精製、
回収した。

【００２５】Ｂ） ｐＳＶ２ｂｓｒからのプロモーター
部分の単離 ｐＳＶ２ｂｓｒＤＮＡ（科研製薬（株））溶液２０μｇ
（１０μｇ）に１０×Ｍ buffer ２０μｌ、ＰｖｕII
（宝酒造（株））５μｌ（４０units）、ＨｉｎｄIII５
μｌ（４０units）及び滅菌水１５０μｌを加え、３７
℃で２時間インキュベートした、反応後、この溶液をフ
ェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱すること
により精製、回収した。２.０％アガロースゲル電気泳
動によりＳＶ４０ early promoter を含む３４２ｂｐの
断片を分離し、このＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出
した後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈
澱することにより精製、回収した。

【００２６】Ｃ） Bluescript II ＳＫ⁺（ＨｉｎｃII
−ＨｉｎｄIII消化）とプロモーター部分の連結 Bluesc
ript II ＳＫ⁺（ＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIII）ＤＮＡ溶液
１μｌ（０.２μｇ）、ＳＶ４０ early promoter 部位
ＤＮＡ断片溶液１μｌ（０.２μｇ）、１０×ligation
buffer（６６０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、６６
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＤＴＴ）１μｌ、１０ｍ
Ｍ ＡＴＰ １μｌ、ligase（宝酒造（株））１μｌ及び
滅菌水５μｌを加え、１６℃、１５時間インキュベート
した。

【００２７】Ｄ） プラスミドｐＢＳＰのクローニング 上記 ligation 溶液１μｌを５０ｍＭ ＣａＣｌ₂処理し
た E. coli ＪＭ１０９の細胞懸濁液２００μｌに加
え、穏やかに混合した。この混合液を氷水中で３０分間
インキュベートした後さらに４２℃で２分間インキュベ
ートしてＤＮＡを細胞中に取り込ませた。この懸濁液に
１.８ｍｌの２×ＹＴ（トリプトン １６ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ ５ｇ／ｌ、酵母抽出エキス １０ｇ／ｌ）液体培地を
加え、３７℃で１時間の振とう培養後、ＬＢ（トリプト
ン １０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、酵母抽出エキス
５ｇ／ｌ）寒天培地（アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを
含む）にプレートした。得られたいくつかのコロニーか
らプラスミドを調製し、制限酵素地図の解析から目的の
プラスミド、ｐＢＳＰを保持しているコロニーを選択し
た（図１）。このｐＢＳＰを保持している E. coli を
１００ｍｌの２×ＹＴ液体培地で培養し、プラスミドＤ
ＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量に調製した。

【００２８】（２） プラスミドｐＢＳＰＴの作製 Ａ） ｐＢＳＰのＰｓｔI−ＢａｍＨI消化、アルカリフ
ォスファターゼ処理 ｐＢＳＴＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に１０×Ｂａ
ｍＨI buffer（２００ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８.
５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ
ＫＣｌ）２０μｌ、ＢａｍＨI（宝酒造（株））１０μ
ｌ（８０units）及び滅菌水１５０μｌを加え、３７℃
で２時間インキュベートした。反応後、この溶液をフェ
ノール−クロロホルム処理し、エタノール沈澱すること
によりＤＮＡを精製、回収した。０.９％アガロース電
気泳動により切断されたプラスミドを分離し、その切断
されたプラスミドをゲルから電気的に溶出した後、フェ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱することに
より精製した。

【００２９】このようにして精製した切断されたｐＢＳ
ＰＤＮＡ溶液１０μｌ（５μｇ）に１０×Ｈ buffer
（５００ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０００ｍＭ ＮａＣ
ｌ）１０μｌ、Ｐｓｔ １５μｌ（４０units）及び滅菌
水７５μｌを加え、３７℃、２時間インキュベートし
た。反応後、フェノール−クロロホルム処理し、エタノ
ール沈澱することによりＤＮＡを精製、回収した。０.
９％アガロース電気泳動により切断されたプラスミドを
分離し、その切断されたプラスミドをゲルから電気的に
溶出した後、フェノール−クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱することによりＤＮＡを精製、回収した。この沈
澱を１００μｌの０.１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に
溶解し、１０μｌのアルカリフォスファターゼ溶液を加
え、６５℃、２時間インキュベートした。反応後、フェ
ノール−クロロホルム処理し、エタノール沈澱すること
によりＤＮＡを回収した。

【００３０】Ｂ） ｐＭＡＭｎｅｏからＳＶ４０ early
splicing region と polyＡ signal部分の単離 ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech社）ＤＮＡ溶液２０μｌ（１
０μｇ）に１０×ＢａｍＨI buffer ２０μｌ、Ｂａｍ
ＨI１０μｌ（８０units）及び滅菌水１５０μｌを加
え、３７℃で２時間インキュベートした。反応後、フェ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱することに
よりＤＮＡを精製、回収した。このようにして得られた
切断されたｐＭＡＭｎｅｏＤＮＡ溶液１０μｌ（５μ
ｇ）に１０×Ｈ buffer １０μｌ、ＰｓｔＩ ５μｌ
（４０units）及び滅菌水７５μｌを加え、３７℃、２
時間インキュベートした。反応後、フェノール−クロロ
ホルム処理、エタノール沈澱することによりＤＮＡを精
製、回収した。１.５％アガロース電気泳動を行い目的
のＤＮＡ断片（８８６ｂｐ）を分離し、このＤＮＡ断片
をゲルから電気的に溶出した後、フェノール−クロロホ
ルム処理、エタノール沈澱して精製、回収した。

【００３１】Ｃ） ｐＢＳＰ（ＰｓｔI−ＢａｍＨI消
化）とＳＶ４０ early splicing region＋polyＡ signa
l 部分の連結 ｐＢＳＰ（ＰｓｔI−ＢａｍＨI消化）ＤＮＡ溶液１μｌ
（０.２μｇ）、ＳＶ４０ early splicing region＋pol
yＡ signal 部分ＤＮＡ断片溶液１μｌ（０.２μｇ）、
１０×ligation buffer １μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ １μ
ｌ、ligase（宝酒造（株））１μｌ及び滅菌水５μｌを
加え、１６℃、１５時間インキュベートした。

【００３２】Ｄ） プラスミドｐＢＳＰＴのクローニン
グ 上記 ligation 溶液１μｌを５０ｍＭＣａＣｌ₂処理し
た E. coli ＪＭ１０９の細胞懸濁液２００μｌに加
え、穏やかに混合した。この混合液を氷水中で３０分間
インキュベートした後さらに４２℃で２分間インキュベ
ートしてＤＮＡを細胞中に取り込ませた。この懸濁液に
１.８ｍｌの２×ＹＴ液体培地を加え、３７℃で１時間
の振とう培養液、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含む）にプレートした。得られたいくつかのコ
ロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図の解析か
ら目的のプラスミド、ｐＢＳＰＴを保持しているコロニ
ーを選択した（図２）。このｐＢＳＰＴを保持いている
E. coli を１００ｍｌの２×ＹＴ液体培地で培養し、
プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量に調
製した。

【００３３】（３） プラスミドｐＢＳＰＴｂｓｒの作
製 Ａ） ｐＢＳＰＴのＨｉｎｄIII消化、アルカリフォス
ファターゼ処理 ｐＢＳＰＴＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に１０×Ｍ
buffer ２０μｌ、ＨｉｎｄIII １０μｌ（８０unit
s）及び滅菌水１５０μｌを加え、３７℃、２時間イン
キュベートした。反応後、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱することによりＤＮＡを精製、回収
した。この沈澱を１００μｌの０.１Ｍ Tris-ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）に溶解し、１０μｌのアルカリフォスフ
ァターゼを加え、６５℃、１時間インキュベートした。
反応後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈
澱することによってＤＮＡを精製、回収した。

【００３４】Ｂ） ｐＳＶ２ｂｓｒからのプラストサイ
ジンＳ耐性遺伝子の単離 ｐＳＶ２ｂｓｒＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に１０
×Ｍ buffer ２０μｌ、ＨｉｎｄIII １０μｌ（８０un
its）及び滅菌水１５０μｌを加え、３７℃、２時間イ
ンキュベートした。反応後、この溶液をフェノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱することによりＤＮＡ
を精製、回収した。２.０％アガロースゲル電気泳動に
よりプラストサイジンＳ耐性遺伝子（ｂｓｒ）を含み４
８１ｂｐの断片を分離し、このＤＮＡ断片をゲルから電
気的に溶出した後、フェノール−クロロホルム処理、エ
タノール沈澱することによって精製、回収した。

【００３５】Ｃ） ｐＢＳＰＴ（ＨｉｎｄIII消化）と
ｂｓｒ断片の連結 ｐＢＳＰＴ（ＨｉｎｄIII）ＤＮＡ溶液１μｌ（０.２μ
ｇ）、ｂｓｒ部分ＤＮＡ断片溶液１μｌ（０.２μ
ｇ）、１０×ligation buffer １μｌ、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ１μｌ、ligase １μｌ及び滅菌水５μｌを加え、１
６℃、１５時間インキュベートした。

【００３６】Ｄ） プラスミドｐＢＳＰＴｂｓｒのクロ
ーニング 上記 ligation 溶液１μｌを５０ｍＭＣａＣｌ₂処理し
た E. coli ＪＭ１０９の細胞懸濁液２００μｌに加
え、穏やかに混合した。この混合液を氷水中で３０分間
インキュベートした後さらに４２℃で２分間インキュベ
ートしてＤＮＡを細胞中に取り込ませた。この懸濁液に
１.８ｍｌの２×ＹＴ液体培地を加え、３７℃で１時間
の振とう培養後、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含む）にプレートした。得られたいくつかのコ
ロニーからプラスミドを調製し、制限酵素地図の解析か
らクローニングされた断片の方向を確認し、目的のプラ
スミド、ｐＢＳＰＴｂｓｒを保持しているコロニーを選
択した（図３）。このｐＢＳＰＴｂｓｒを保持している
E. coli を１００ｍｌの２×ＹＴ液体培地で培養し、
プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ法により大量に調
製した。

【００３７】（４） プラスミドｐＢＳＰＴＧ、ｐＢＳ
ＰＴＫの作製 Ａ） ｐＢＳＰＴのＥｃｏＲI消化、アルカリフォスフ
ァターゼ処理 ｐＢＳＰＴＤＮＡ溶液２０μｌ（１０μｇ）に１０×Ｈ
buffer ２０μｌ、ＥｃｏＲI １０μｌ（８０units）
及び滅菌水１５０μｌを加え、３７℃、２時間インキュ
ベートした。反応後、フェノール−クロロホルム処理、
エタノール沈澱することによりＤＮＡを精製、回収し
た。この沈澱を１００μｌの０.１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８.０）に溶解し、１０μｌのアルカリフォスファタ
ーゼを加え、６５℃、２時間インキュベートした。反応
後、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱す
ることによってＤＮＡを精製、回収した。

【００３８】Ｂ） ｐＧ６１１、ｐＫ４１３からのγ
鎖、κ鎖ｃＤＮＡ断片の単離 ｐＧ６１１ＤＮＡ溶液あるいはｐＫ４１３ＤＮＡ溶液２
０μｌ（１０μｇ）に１０×Ｈ buffer ２０μｌ、Ｅｃ
ｏＲI １０μｌ（８０units）及び滅菌水１５０μｌを
加え、３７℃、２時間インキュベートした。反応後、フ
ェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱すること
により、ＤＮＡを回収した。１.２％アガロース電気泳
動を行い、目的のＤＮＡ断片（γ鎖は１６２４ｂｐ、κ
鎖は９４７ｂｐ）を分離し、このＤＮＡ断片をゲルか
ら、電気的に溶出し、フェノール−クロロホルム処理、
エタノール沈澱することにより精製、回収した。

【００３９】Ｃ） ｐＢＳＰＴ（ＥｃｏＲI消化）とＣ
ＬＮＨ１１γ鎖あるいはκ鎖ｃＤＮＡ断片との連結 ｐＢＳＰＴ（ＥｃｏＲI）ＤＮＡ溶液１μｌ（０.２μ
ｇ）、γ鎖ｃＤＮＡ断片溶液あるいはκ鎖ｃＤＮＡ断片
１μｌ（０.２μｇ）、１０×ligation buffer１μｌ、
１０ｍＭ ＡＴＰ １μｌ、ligase １μｌ及び滅菌水５
μｌを加え、１６℃、１５時間インキュベートした。

【００４０】Ｄ） プラスミドｐＢＳＰＴＧ、ｐＢＳＰ
ＴＫのクローニング ligation溶液１μｌを５０ｍＭＣａＣｌ₂処理した E. c
oli ＪＭ１０９の細胞懸濁液２００μｌに加え、穏やか
に混合した。この混合液を氷水中で３０分間インキュベ
ートした後さらに４２℃で２分間インキュベートしてＤ
ＮＡを細胞中に取り込ませた。この懸濁液に１.８ｍｌ
の２×ＹＴ液体培地を加え、３７℃で１時間の振とう培
養後、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
む）にプレートした。それぞれの ligation 溶液で形質
転換して得られたいくつかのコロニーからプラスミドを
調製し、制限酵素地図の解析からクローニングされた断
片の方向を確認し、目的のプラスミド、ｐＢＳＰＴＧあ
るいはｐＢＳＰＴＫを保持しているコロニーを選択した
（図４、図５）。このｐＢＳＰＴＧあるいはｐＢＳＰＴ
Ｋを保持している E. coli を１００ｍｌの２×ＹＴ液
体培地で培養し、プラスミドＤＮＡをＳＤＳ−アルカリ
法により大量に調製した。

【００４１】実施例２（重鎖あるいは軽鎖抗体遺伝子発
現組換え体の取得） （１） プラスミドｐＢＳＰＴＫ及びｐＢＳＰＴｂｓｒ
あるいはｐＢＳＰＴＧ及びｐＢＳＰＴｂｓｒによるＣＨ
Ｏ細胞の形質転換） 前項で得られたプラスミドｐＢＳＰＴＫ及びｐＢＳＰＴ
ｂｓｒあるいはｐＢＳＰＴＧ及びｐＢＳＰＴｂｓｒをリ
ポフェクションによってＣＨＯ細胞に導入した。すなわ
ち、ＣＨＯ細胞４×１０⁴を５ｍｌのＤＦ（ＤＭＥＭ
６.７２ｇ／ｌ、ＨａｍＦ１２ ５.３２ｇ／ｌ、ＮａＨ
ＣＯ₃ ２.２２ｇ／ｌ）＋１０％ＦＢＳを含む６０ｍｍ
のプレートに培養し、３日後３ｍｌのＤＦ培地で細胞を
洗い、ＦＢＳを除去した。次に、ｐＢＳＰＴＫ５μｇ及
びｐＢＳＰＴｂｓｒ２.５μｇあるいはｐＢＳＰＴＧ５
μｇおよびｐＢＳＰＴｂｓｒ２.５μｇを１５μｌの滅
菌水に懸濁したＤＮＡ溶液とリポフェクチン（ベセスダ
リサーチ社）１５μｌを混合してＤＮＡ／リポフェクチ
ン複合体を作った。上記の細胞にＤＮＡ／リポフェクチ
ン複合体を滴下し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で細胞を
培養し、２４時間後に培地を５ｍｌの１０μｇ／ｍｌの
ブラストサイジンＳ（ＢＳ）を含むＤＦ＋１０％ＦＢＳ
と交換し、さらに２４時間後に細胞を回収し、ＤＦ＋１
０％ＦＢＳ＋ＢＳ１０μｇ／ｍｌに細胞を懸濁し、クロ
ーニングプレート（グライナー社）で培養した。３日毎
に培養液の交換を行い形質転換細胞を選択的に増殖さ
せ、約１×１０^-4の割合で形質転換細胞を得た。

【００４２】（２） 形質転換細胞培養上清の重鎖ある
いは軽鎖量の測定 ヤギ抗ヒトγ鎖抗体（Antibodies Incorporated）溶液
あるいはヤギ抗ヒトκ鎖抗血清（Kent Laboratories）
をＰＢＳ（Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １.１５ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄
０.２ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８.０ｇ／ｌ ＫＣｌ ０.２ｇ／
ｌ）により適当な濃度に希釈した溶液をマイクロプレー
トに１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、３０分イン
キュベートすることによって抗体を固相に吸着させた。
マイクロプレートから抗体溶液を除去した後、ゼラチン
バッファー（１０ｍＭ ＰＢＳ、０.３％ゼラチン）で３
回洗浄し、マイクロプレートの未吸着部分をブロッキン
グするために、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を１ウェルあ
たり２００μｌ加えた。次に、各培養上清をＰＢＳで希
釈したものを１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、１
時間インキュベートした後、試料を除去し、ゼラチンバ
ッファーで３回洗浄し、ヤギＰＡ標識抗ヒトＩｇＧ抗体
（ＣＡＰＰＥＬ社）をＰＢＳにより適当な濃度に希釈し
た溶液を１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、３０分
インキュベートした。ゼラチンバッファーで３回洗浄し
た後、１ウェルあたり５０μｌのＯＰＤＡ溶液（クエン
酸バッファー１ｍｌあたりＯＰＤＡを０.６ｍｇ含み使
用直前にＨ₂Ｏ₂を０.２μｌ／ｍｌの割合で加えたも
の）を加えて、３７℃、１０〜２０分インキュベート
し、５ＮＨ₂ＳＯ₄を５０μｌ加え、反応を停止させ、Ｏ
Ｄ₄₉₂をマイクロプレートリーダー（コロナ社）を用い
て測定した。

【００４３】ＥＬＩＳＡの結果を図６および図７に示
す。

【００４４】実施例３（抗体遺伝子発現組換え体の取
得） （１） プラスミドｐＢＳＰＴＫ、ｐＢＳＰＴＧ及びｐ
ＢＳＰＴｂｓｒによるＣＨＯ細胞の形質転換） 前項で得られたプラスミドｐＢＳＰＴＫ、ｐＢＳＰＴＧ
及びｐＢＳＰＴｂｓｒをリポフェクションによってＣＨ
Ｏ細胞に導入した。すなわち、ＣＨＯ細胞４×１０⁴を
５ｍｌのＤＦ（ＤＭＥＭ ６.７２ｇ／ｌ、ＨａｍＦ１２
５.３２ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ₃ ２.２２ｇ／ｌ）＋１０
％ＦＢＳを含む６０ｍｍのプレートに培養し、３日後３
ｍｌのＤＦ培地で細胞を洗い、ＦＢＳを除去した。次
に、ｐＢＳＰＴＫ５μｇ、ｐＢＳＰＴＧ５μｇ、ｐＢＳ
ＰＴｂｓｒ２.５μｇを１５μｌの滅菌水に懸濁したＤ
ＮＡ溶液とリポフェクチン（ベセスダリサーチ社）１５
μｌを混合してＤＮＡ／リポフェクチン複合体を作っ
た。上記の細胞にＤＮＡ／リポフェクチン複合体を滴下
し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で細胞を培養し、２４時
間後に培地を５ｍｌの１０μｇ／ｍｌのブラストサイジ
ンＳ（ＢＳ）を含むＤＦ＋１０％ＦＢＳと交換し、さら
に２４時間後に細胞を回収し、ＤＦ＋１０％ＦＢＳ＋Ｂ
Ｓ１０μｇ／ｍｌに細胞を懸濁し、クローニングプレー
ト（グライナー社）で培養した。３日毎に培養液の交換
を行い形質転換細胞を選択的に増殖させ、約１×１０^-4
の割合で形質転換細胞を得た。

【００４５】（２） 形質転換細胞培養上清の抗体量の
測定 ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）溶液あるいは
ＣＬＮＩｇＧの抗インディオタイプ抗体を含むマウスの
腹水をＰＢＳ（Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １.１５ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄
０.２ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８.０ｇ／ｌ ＫＣｌ ０.２ｇ／
ｌ）により適当な濃度に希釈した溶液をマイクロプレー
トに１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、３０分イン
キュベートすることによって抗体を固相に吸着させた。
マイクロプレートから抗体溶液を除去した後、ゼラチン
バッファー（１０ｍＭ ＰＢＳ、０.３％ゼラチン）で３
回洗浄し、マイクロプレートの未吸着部分をブロッキン
グするために、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を１ウェルあ
たり２００μｌ加えた。次に、各培養上清をＰＢＳで希
釈したものを１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、１
時間インキュベートした後、試料を除去し、ゼラチンバ
ッファーで３回洗浄し、ヤギＰＡ標識抗ヒトＩｇＧ抗体
（ＣＡＰＰＥＬ社）をＰＢＳにより適当な濃度に希釈し
た溶液を１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃、３０分
インキュベートした。ゼラチンバッファーで３回洗浄し
た後、１ウェルあたり５０μｌのＯＰＤＡ溶液（クエン
酸バッファー１ｍｌあたりＯＰＤＡを０.６ｍｇ含み使
用直前にＨ₂Ｏ₂を０.２μｌ／ｍｌの割合で加えたも
の）を加えて、３７℃、１０〜２０分インキュベート
し、５ＮＨ₂ＳＯ₄を５０μｌ加え、反応を停止させ、Ｏ
Ｄ₄₉₂をマイクロプレートリーダー（コロナ社）を用い
て測定した。

【００４６】濃度既知のＣＬＮＩｇＧを標準にして抗体
産生量を算出したＥＬＩＳＡの結果の一部を以下に示
す。

【００４７】

【表１】

【００４８】（３） 培養上清中の抗体の電気泳動によ
る確認 形質転換細胞培養上清中に含まれるヒト抗体の特異的濃
縮を目的として、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（ＤＹＮＡＬ社）
を利用した。すなわち、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体とビーズ
を０.０５Ｍ Ｈ₃ＢＯ₃（ｐＨ９.５）溶液中で、２０μ
ｇ抗体／ｍｇビーズの割合で混合し、室温で振とうしな
がら２４時間インキュベートすることによってビーズの
表面に抗体を結合させた。次に、ビーズをＰＢＳ＋０.
１％ＢＳＡ溶液中で４℃で振とうしながら２４時間イン
キュベートした。このようにして得られた抗体結合ビー
ズ５μｌと培養上清１００μｌを混合して培養上清中の
抗体をビーズに結合させ、ビーズを磁石により回収する
ことによってヒト抗体を特異的に濃縮した。回収したビ
ーズを５μｌの５×電気泳動サンプルバッファー（２５
０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ６.８）、０.５％ ＢＰＢ、
５０％ glycerol）に懸濁し、１００℃、３分処理した
後、この内の３μｌをＳＤＳ電気泳動した（図８）。

【００４９】実施例４（抗体産生細胞株の大量培養と抗
体の精製） ローラーボトルにＣＨＯｂｓｒクローンと６００ｍｌの
ＤＦ＋１％ＦＢＳ＋１μｇ／ｍｌＢＳを加えて培養し、
抗体量を測定しながら適当な時期に培養上清を回収し、
上清６００ｍｌに対して硫安を２８３.２ｇ（７０％飽
和）を加えた後、遠心によって沈澱物を集めた。この沈
澱をＰＢＳに溶解した後、リン酸バッファー（ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄ ２.５７ｇ／ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １.４７ｇ／ｌ）に
対して透析を行った。透析後のサンプルを遠心して不溶
物を取り除き、上清からＭａｂ ＴｒａｐII（ファルマ
シア社）を使い、抗体を精製した。カラムの溶出画分の
抗体の精製度をＳＤＳ電気泳動によって確認した（図
９）。

【００５０】実施例５（精製抗体のウェスタンブロッテ
ィング） 前記で得られた抗体を還元条件下でＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動し、イモビロン（ミリポア社）にセミド
ライブロッター（イワキ社）を使いタンパク質をブロッ
ティング後、フィルターを５％スキムミルクを含むＰＢ
Ｓ−０.１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）溶液に入
れ、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。
この後、フィルターをＰＢＳ−Ｔ溶液を交換して軽く２
回、振とうしながら１５分１回、５分２回洗浄した。次
に、フィルターをヤギ抗ヒトγ鎖抗体（Antibodies Inc
orporated）あるいはヤギ抗ヒトκ鎖抗血清（Kent Labo
ratories）をＰＢＳ−Ｔ溶液で適当な濃度に希釈した溶
液に入れ室温で１時間反応させ、前記と同様に洗った
後、ウサギＰＡ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Kent Laborator
ies）をＰＢＳ−Ｔ溶液で適当な濃度に希釈した溶液に
入れ、室温で振とうしながら１時間インキュベートし
た。前記と同様に洗った後、ＥＣＬ検出システム（アマ
シャム社）でγ鎖あるいはκ鎖を検出した（図１０
（Ａ）、（Ｂ））。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢＳＰの構築を表す。

【図２】プラスミドｐＢＳＰＴの構築を表す。

【図３】プラスミドｐＢＳＰＴｂｓｒの構築を表す。

【図４】プラスミドｐＢＳＰＴＧの構築を表す。

【図５】プラスミドｐＢＳＰＴＫの構築を表す。

【図６】ｐＢＳＰＴＫ及びｐＢＳＰＴｂｓｒによる形質
転換細胞培養上清のＥＬＩＳＡの結果。

【図７】ｐＢＳＰＴＧ及びｐＢＳＰＴｂｓｒによる形質
転換細胞培養上清のＥＬＩＳＡの結果。

【図８】形質転換細胞培養上清中のビーズに結合した蛋
白のＳＤＳ電気泳動による解析を表す。上の数字はレー
ン数を表す。レーン１は、ＣＬＮＩｇＧ抗体（無処理）
を、レーン２は、ビーズのみを、レーン３は、ＣＬＮＩ
ｇＧ抗体を、レーン４は培地のみを、レーン５は培地＋
ＣＬＮＩｇＧを、レーン６は、ＣＨＯ細胞の培養上清
を、レーン７は、クローンＮｏ.２の培養上清を、レー
ン８はクローンＮｏ.４の培養上清を、レーン９はクロ
ーンＮｏ.１５の培養上清を表す。

【図９】カラムにより精製された抗体のＳＤＳ電気泳動
による解析を表す。上の数字は、レーン数を表す。レー
ン１は、マーカーを、レーン２は、ＣＬＮＩｇＧを、レ
ーン３は、クローンＮｏ.２を、レーン４は、クローン
Ｎｏ.４を、レーン５は、クローンＮｏ.１５を表す。

【図１０】組み替え抗体のウェスタンブロッティングに
よる解析を表す。上の数字はレーン数を表す。レーン１
は、ＣＬＮＩｇＧを、レーン２は、クローンＮｏ.２
を、レーン３は、クローンＮｏ.４を、レーン４は、ク
ローンＮｏ.１５を表す。（Ａ）は、抗ヒトγ鎖抗体、
（Ｂ）は、抗ヒトκ鎖抗血清を表す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＶ４０初期プロモーターと、その下流
   側に位置するヒトモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖部
   分もしくはその一部分のアミノ酸配列をコードする構造
   遺伝子と、該構造遺伝子の下流側に位置するＳＶ−４０
   初期スプライシング ポリＡ付加部位とを含有すること
   を特徴とする、哺乳動物宿主細胞中でモノクローナル抗
   体の重鎖又は軽鎖部分もしくはその一部分のアミノ酸配
   列を発現しうるプラスミド。
2. 【請求項２】 該構造遺伝子がｃＤＮＡである請求項１
   のプラスミド。
3. 【請求項３】 プラスミドｐＢＳＰＴＫ。
4. 【請求項４】 プラスミドｐＢＳＰＴＧ。