JPH0853477A - ２−アミノ−４−メチルホスフィノブタンアミド誘導体の酵素切断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】式（Ｉ）および（ＩＩ） 〔Ｒ₁ は枝分かれしていないまたは枝分かれした（Ｃ₁
〜Ｃ₂₀）−アルキルなど、Ｒ₂ はホルミル、枝分かれし
ていないまたは枝分かれした（Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀）−アルキル
カルボニルなど〕で表されるＤ−およびＬ−ＰＴＣ誘導
体の混合物を水媒体または水−有機媒体中で加水分解活
性酵素で処理して、ＰＴＣ誘導体を酵素により分離す
る。 【効果】Ｌ−ホスフィノトリシンの効果的な酵素合成が
可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】Ｌ−２−アミノ−４−メチルホス
フィニルブタン酸──以下Ｌ−ホスフィノトリシンまた
はＬ−ＰＴＣと称す──またはその塩基または酸との塩
は、ドイツ連邦共和国特許出願公開第２９３９２６９号
明細書に記載されているように、化学的に容易に入手で
きるラセミ化合物、すなわち２−アミノ−４−メチルホ
スフィニルブタン酸の活性成分である。ドイツ連邦共和
国特許出願公開第２７１７４４０号明細書に記載されて
いる試験は、Ｌ−ホスフィノトリシンが、多様な雑草に
対する顕著な除草活性を有することを示す。このため、
Ｌ形を経済的方法によって容易に入手できる、使用に適
した方法を開発する必要があった。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】文献
から公知の微生物源の抗生物質であるＬ−ＰＴＣ−アラ
ニル−アラニンを、酸加水分解することによって（特開
昭４８−８５５３号公報）または酵素分解することによ
って（特開昭４９−３１８９０号公報）Ｌ−ＰＴＣを得
ることができることが既に開示されている。

【０００３】さらに、化学的に合成された、ラセミＰＴ
Ｃ前駆体の酵素分割に基づく方法が知られている。ドイ
ツ連邦共和国特許出願公開第２９３９２６９号明細書に
は、Ｎ−アシル−ＰＴＣ、特にＮ−アセチル−ＰＴＣ
を、シュードモナス属、ストレプトマイセス属またはア
スペルギルス属の特に培養した微生物菌株から得ること
ができるアシラーゼを用いて切断することが記載されて
いる。

【０００４】ヨーロッパ特許出願第０３８２１１３号明
細書には、ラセミ２−アシルアミノ−４−（アルコキシ
−メチルホスフィニル）ブタンカルボン酸エステルを、
エステラーゼにより、また２−アシルアミノ−４−（ア
ルコキシ−メチルホスフィニル）−ブタン酸エステルお
よび−ブタンアミドを、アシラーゼにより、酵素切断す
る種々の方法が記載されている。

【０００５】式１：

【０００６】

【化２】

【０００７】および

【０００８】

【化３】

【０００９】国際公開第８９１０９６９号パンフレット
には、特にアリール置換されたラセミアミノニトリルを
先ずアシネトバクター・カルコアチエンス(Acinetobact
er calcoatiens)(ＤＳＭ３８７５）培養株と共にインキ
ュベーションすることによって対応するＤ，Ｌ−アミノ
酸アミドに変換しそしてこの生成物を別の工程でＬ−ア
ミノ酸アミダーゼ、例えばアルスロバクターＡＴＣＣ３
１６５２によって切断してＬ−アミノ酸を得、その際残
ったＤ−アミノ酸アミドを同時にアミドラセマーゼによ
ってラセミ化する方法が記載されている（式２）。

【００１０】式２：

【００１１】

【化４】

【００１２】Ｒ＝例えば−ＣＨ₂ Ｃ₆ Ｈ₅ ； Ｅ₁ ^* ＝アミノニトリル加水分解酵素 Ｅ₂ ^* ＝Ｌ−アミノ酸アミドアミダーゼ Ｅ₃ ^* ＝Ｄ−アミノ酸アミドラセマーゼ たとえこれら全ての合成工程が連続してまたは同時に行
なわれ得るとしても、この方法は、部分方法の複雑さの
ために、３つの異なる酵素を用いてＬ−アミノ酸の工業
的規模での生産を実現するためにはあまり有望でない。

【００１３】リン含有基を有するアミノ酸を切断できる
ことは示唆されていない。これはおそらく、Ｐ（Ｖ）−
含有化合物、特に式Ｒ' Ｒ''Ｐ（Ｏ）ＯＲ''' で表され
る誘導体が、その立体配置のために酵素加水分解された
カルボン酸エステルの遷移状態に似ていて(M. Dixon,
E. Webb, Enzymes, e. 版, Longmans, Green & Co LTD,
London 1964, pp.346-352)、従って、失活効果を有し
得るためであろう。

【００１４】J. Org. Chem. 53, 1826 (1988) にはさら
に、ミクロバクテリウム・ネサウラム(Microbacterium
nesaurum)(ＡＴＣＣ２５７２５）を用いてラセミα−ア
ルキル化アミノ酸アミドを酵素分離する方法が記載され
ているが、その際得られるエナンチオマー過剰は普通の
程度でしかない。

【００１５】ヨーロッパ特許出願公開第１９３１１３号
明細書には、ラセミα−アミノ酸アミド、例えば、Ｄ，
Ｌ−フェニルアラニンアミドを微生物、例えばシュード
モナスによって加水分解してＬ−アミノ酸とすることが
記載されている。残るＤ−アミノ酸アミドは強塩基、例
えばＮａＯＨによってラセミ化されそしてこの方法に再
循環される。この特許明細書にも、リン含有アミノ酸誘
導体の使用に関する示唆はない。

【００１６】最後に、Bull. Chem. Soc. Japan 61, 359
9 (1988)には、Ｌ−２−アセトアミド−４−（メチルホ
スフィニル）−ブタンアミドまたはＬ−２−アセトアミ
ド−４−（エトキシメチルホスフィニル）ブタンアミド
を酵素グルタミナーゼによって加水分解してＬ−２−ア
セトアミド−４−（メチルホスフィニル）ブタン酸およ
びＬ−２−アセトアミド−４−（エトキシメチルホスフ
ィニル）ブタン酸とすることが記載されている。しか
し、これらのアミダーゼ反応は問題のＬ−立体配置ホス
フィノトリシンアミド誘導体を用いてしか明確に行なわ
れず、従ってＬ−ホスフィノトリシンを安価なラセミ前
駆体から経済的に合成する経路を提供しない。

【００１７】上記先行技術に基づいて、Ｌ−ホスフィノ
トリシンが、ホスフィン酸部分上で修飾されている容易
に入手できるホスフィノトリシンアミドを用いて酵素に
より効果的に合成され得ることは予期され得なかった。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、式（Ｉ）およ
び（ＩＩ）

【００１９】

【化５】

【００２０】〔式中Ｒ₁ は枝分かれしていないまたは枝
分かれした（Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀）−アルキル──これは置換さ
れていないか、あるいは１個またはそれ以上のハロゲン
基、例えばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素によって置
換されているか、あるいは（Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ）−アルコキシ
によって一置換または多置換されている──であるか、
または（Ｃ₃ 〜Ｃ₈ ）−シクロアルキル──これは（Ｃ
₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキル、（Ｃ ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシお
よびハロゲンからなる群から選択される１個またはそれ
以上の基によって置換されていることができる──であ
るか、または（Ｃ₃ 〜Ｃ₁₀）−アルケニル、（Ｃ₃ 〜Ｃ
₁₀）−アルキニルまたはベンジルであり、そしてＲ₂ は
ホルミル、枝分かれしていないまたは枝分かれした（Ｃ
₁ 〜Ｃ₂₀）−アルキルカルボニル──これは置換されて
いないかまたはアルキル部分でヒドロキシル、ハロゲ
ン、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシ、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−ア
ルキルチオおよびフェニル｛これは（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）−ア
ルキル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）−アルコキシ、ハロゲン、ニト
ロおよびＣＦ₃ からなる群から選択される３個までの基
によって置換されていることができる｝からなる群から
選択される１個またはそれ以上の基によって置換されて
いる──であるか、またはベンゾイルまたは、（Ｃ₁〜
Ｃ₁₂）−アルキル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）−アルコキシ、ハロ
ゲン、ニトロおよびＣＦ₃ からなる群から選択される１
〜３個の基によって置換されているベンゾイルであ
る。〕で表されるＤ−およびＬ−ＰＴＣ誘導体の混合物
を水媒体または水−有機媒体中で加水分解活性酵素で処
理し、その際、選択的活性のＬ−アミノ酸−切断酵素ま
たは微生物が使用される、ＰＴＣ誘導体の酵素分離方法
を提供する。

【００２１】式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるラセミ
アミノ酸アミド誘導体またはＬ−形が豊化されたアミノ
酸アミド誘導体を使用することができる。残るＤ−ホス
フィノトリシンアミド誘導体は、例えば塩基の作用によ
ってラセミ化され、この方法に再循環され得る。

【００２２】反応は、Ｄ−アミノ酸アミドラセマーゼの
存在下に行なうこともでき、その結果純粋なＬ−ホスフ
ィノトリシン誘導体が最後に得られる。Ｒ₁ が枝分かれ
していないまたは枝分かれした（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキ
ルまたは、ハロゲン、例えばフッ素、塩素によってもし
くは（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシによって置換されてい
る（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルであるか、または（Ｃ₅ 〜
Ｃ₆ ）−シクロアルキルであり、そしてＲ₂ が水素、ホ
ルミル、枝分かれしていないまたは枝分かれした（Ｃ₁
〜Ｃ₁₀）−アルキルカルボニル──これは置換されてい
ないかまたはアルキル部分がヒドロキシル、ハロゲン、
（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシ、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキ
ルチオ、フェニルまたは、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキル、
（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシおよびハロゲンからなる群
から選択される１〜３個の基によって置換されているフ
ェニルによって置換されている──であるか、またはベ
ンゾイルまたは、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ −アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ −
アルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される１
〜３個の基によって置換されているベンゾイルである上
記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるＤ−およびＬ−Ｐ
ＴＣ誘導体の混合物を用いることを包含する本発明によ
る方法が特に重要である。

【００２３】Ｒ₁ が枝分かれしていないまたは枝分かれ
した（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルであり、そしてＲ₂ が水
素、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルカルボニル──これはフ
ェニルによってまたは一置換〜三置換されているフェニ
ル｛その１〜３個の置換基は（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキ
ル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシおよびハロゲンから選
択される｝によって置換されている──、好ましくはフ
ェナセチルであるか、またはベンゾイルである上記式
（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるＤ−およびＬ−ＰＴＣ
誘導体の混合物を用いることを包含する本発明による方
法が好ましい。

【００２４】（Ｃ₁ 〜Ｃ₆ ）−アルキルは、特に、メチ
ル、エチル、１−プロピルまたは２−プロピル、ｎ−、
ｉ−、ｔ−または２−ブチル、３−メチル−ブト−２−
イル、ｎ−、ｉ−、ｔ−、２−または３−フェニル、ｎ
−ヘキシルあるいはヘキシル立体異性体である。Ｃ₁ 〜
Ｃ₆ −アルコキシは、特に、（Ｃ₁ 〜Ｃ₆ −アルキル）
−オキシであり、その際アルキル基は上記意味を有す
る。

【００２５】より詳細に定義するとは言えないが、ハロ
ゲンは基フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、好ましくは
フッ素および塩素、特に塩素である。本発明による切断
は、Ｒ₁ およびＲ₂ が上で定義された通りである式
（Ｉ）おおよび（ＩＩ）で表されるＤ，Ｌ−ＰＴＣ誘導
体のＮ−アシル切断により行なわれ得る。

【００２６】式（Ｉ）で表されるアミノ酸アミド誘導体
のこのアミダーゼ開裂により、式（ＩＩＩ）

【００２７】

【化６】

【００２８】で表される対応するホスフィンエステル保
護Ｌ−ホスフィノトリシンが得られ、これはそれ自体公
知の方法で、公知の経路によって、例えば未反応のＤ−
ＰＴＣ誘導体を酸性範囲のｐＨで切断された酸から抽出
により除去することによって、式ＩＶで表される未反応
のアミドから単離され得、この方法においてＬ−ＰＴＣ
誘導体は水溶液中にアンモニウム塩の形で残り次いで水
溶液を乾燥するまで蒸発することによって単離され得
る。さらに、特に、晶出、蒸発またはクロマトグラフィ
ーによる分離が可能である。

【００２９】式（ＩＩ）で表されるこれらのＮ−アシル
−アミノ酸誘導体のアミダーゼ切断によって、式Ｖで表
される対応するホスフィンエステル保護Ｌ−Ｎ−アシル
ホスフィノトリシンが式ＶＩで表される未反応のＤ−Ｎ
−アシルアミノ酸との混合物の形で得られる。

【００３０】

【化７】

【００３１】酵素的に加水分解されたＬ−ＰＴＣ誘導体
Ｖは、慣用の方法でまたは根本において知られている方
法で、例えば晶出、蒸発、カラムまたはイオン交換クロ
マトグラフィーによって、特に未反応のＤ−ＰＴＣ誘導
体を水相（ｐＨは好ましくは９〜１１、特に９．５〜１
０．５）から適当な有機溶剤を用いて、好ましくは０〜
１０℃の減ぜられた温度で素早く抽出することによっ
て、首尾よく単離され得、その際アミド切断から生じる
Ｌ−ＰＴＣ誘導体はカルボン酸塩の形で水相中に残る。

【００３２】Ｄ−誘導体を分離した後、Ｌ−ＰＴＣ誘導
体を慣用の方法と同様に、例えば２０℃〜溶液の沸点ま
での温度で希鉱酸水を用いて、化学加水分解し、その際
反応時間は１〜２４時間である。適当な鉱酸は、例え
ば、ハロゲン化水素酸または硫酸、特に希〜濃塩酸であ
る。

【００３３】しかし、有機酸もまたそれぞれの場合に非
常に適している。化学全加水分解により、Ｌ−ＰＴＣだ
けでなくアシル基Ｒ₂ に対応するカルボン酸も生じ、そ
の際このカルボン酸を酸性水溶液から蒸発によってまた
は適当な有機溶剤での抽出によって除去できる。

【００３４】残るＤ−ＰＴＣ誘導体は、酵素加水分解の
副産物から抽出方法、蒸留、晶出またはクロマトグラフ
ィーによって精製され得そして再度Ｄ，Ｌ−混合物の形
で、場合によりラセミ化後、例えば熱でまたは塩基、例
えばアルコール性溶液中のアルコラートの作用によっ
て、酵素加水分解される。一般に、このような塩基を用
いたラセミ化は特に穏やかな方法である。

【００３５】上記酵素は遊離形で、あるいは慣用の方法
または専門家に知られている方法で固定化した後に使用
され得る。問題の基質は溶液または懸濁液の形で水媒体
中で使用される。０．１％〜飽和溶液（その際この方法
は懸濁状態で行なわれる）までの濃度が可能である。水
に溶解しない有機溶剤の添加下での２相混合物中での方
法と同様に、水溶性溶剤、例えばメタノールの添加も、
それぞれの場合に同様に行い得る。

【００３６】一般に、酵素切断の際の反応温度は１０〜
６０℃、好ましくは２０〜４０℃である。例えば、本方
法は、バッチ式でまたはカラム方法として連続的に行な
われ得る。

【００３７】酵素加水分解は好ましくは５〜１２のｐＨ
で、特にｐＨ６〜１０で行なわれ、その際本方法はそれ
ぞれの場合にカルボン酸エステルまたはカルボキサミド
の非特異的な加水分解を抑えるようにｐＨ５〜７で行な
うこともできる。

【００３８】反応の過程は例えばＨＰＬＣによって基質
の減量を監視することによって監視され得る。それぞれ
の場合において、特にカルボン酸エステルが切断される
時に、反応の過程は他の簡単な方法によって、例えばｐ
Ｈが一定になるまで配量しなければならない塩基の量を
監視することによっても監視され得る。

【００３９】酵素切断生成物中のＬ−化合物含有率は、
化合物をアルカリ性または酸性加水分解してＬ−ＰＴＣ
とし、次いで誘導体化した後に、根本において知られて
いる方法で(D. Asward, Analytical Biochemistry 137,
405-409 (1984))、ＨＰＬＣを用いて、測定され得る。

【００４０】式ＩＩで表される出発原料は公知であるか
またはそれ自体公知の方法によって製造され得る（ヨー
ロッパ特許出願第０３８２１１４号参照）。式Ｉで表さ
れる出発材料は、これまで知られておらず、それ故本特
許出願の主題でもある。この化合物の合成は実験部で例
によって記載されている。

【００４１】場合により誘導体化されているＰＴＣ誘導
体中の術語ＤまたはＬは、カルボキル基に対してα位に
あって場合により保護されているアミノ基に連結してい
る炭素原子上の立体配置を示している。一般に、これら
のＤ−またはＬ−ＰＴＣ誘導体は、Ｒ₁ 保護ＰＴＣ誘導
体中のリン原子上の付加的なキラル中心のために、純粋
なエナンチオマーではなくジアステレオマー混合物であ
る。

【００４２】驚くべきことに、酵素切断には実質的に上
記α−炭素原子上の立体配置だけが重要であることが明
らかとなった。基Ｒ₁ の加水分解後、リン原子上のキラ
ル中心は、ＯＨとＯの間の素早いプロトン交換のために
実質的に失われる。

【００４３】Ｄ，Ｌ−ＰＴＣ誘導体の分割のためのまた
Ｌ−ＰＴＣの製造のための本発明による方法は、基質／
生成物混合物の効率的な分離の際に生じる塩が少量であ
ることによって特徴づけられる。酵素分離後に得られる
Ｄ−ＰＴＣ誘導体が望まれない場合には、それは容易に
かつ穏和な条件下で、場合により事前に単離せずにラセ
ミ化され得、従って酵素分離に再使用され得る。

【００４４】本発明による方法は好ましくはアミダーゼ
を合成する微生物を用いて行なわれ得る。このような微
生物の例は、エンテロバクター・エロゲネス（ＤＳＭ９
１６４）、クレブシエラ・オキシトカ（ＤＳＭ９１６
２）、クレブシエラ・トレビサニイ（ＤＳＭ９１６
３）、コリネバクテリウム・アクアチカム(Colynebacte
riumaquaticum（ＤＳＭ９１７１）、ロドコッカス・ル
ブロペンティンクタス（ＡＴＣＣ２１９３０）、ロドコ
ッカス・ロドクラウス（ＡＴＣＣ３３２７８）、アルス
ロバクターｓｐ．（ＡＴＣＣ３１６５２）およびコリネ
バクテリウムｓｐ．（ＡＴＣＣ３１６６２）である。

【００４５】

【発明の効果】本発明によりエステルが保護されたＰ−
Ｏ酸官能基を持ったＰＴＣ誘導体を使用する時、特別な
予期されない利点は、ＰＴＣ誘導体のエナンチオ選択的
切断に市販のアミダーゼさえ使用できることである。一
般に、ホスフィン酸エステルによる加水分解活性の阻
害、またはホスフィン酸エステルの加水分解の副反応さ
え、本方法において観察されず、このことは驚くべきこ
とである。この酵素アミド切断において、エステルの形
でホスフィン酸を保護することは、変換率に正の効果を
及ぼすかまたは、それぞれの場合に、まず第一に酵素に
より基質を受容させる。

【００４６】

【実施例】

Ａ）出発原料 例Ａ１ Ｄ，Ｌ−２−アミノ−４−（１−ブトキシ−（メチル）
ホスフィニル）ブタンアミド（式Ｉ：Ｒ₁ ＝ｎ−Ｃ₄ Ｈ
₉ ） ａ）Ｄ，Ｌ−２−アミノ−４−（１−ブトキシ−（メチ
ル）ホスフィノイル）ブタノニトリル（米国特許第５，
０５１，５２５号またはヨーロッパ特許出願第０３８２
１１４号と同様に製造） ５２．２５ｇ（０．２００モル）のＤ，Ｌ−２−アセト
キシ−４−（１−ブトキシ−（メチル）ホスフィノイ
ル）ブチロニトリルを３０℃で６０ｍｌのアンモニア溶
液（２５％）に２時間にわたって添加する。

【００４７】次いで反応混合物をジクロロメタンを用い
て抽出し、そして抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させそ
してロータリーエバポレーター中で蒸発させる。これに
よって、３２．１ｇ（理論量の７３．５％）の帯黄色の
油状物が得られ、これは精製することなく次の合成工程
に使用される。

【００４８】ｂ）Ｄ，Ｌ−２−アミノ−４−（１−ブト
キシ−（メチル）ホスフィノイル）ブタンアミド １６．１４ｇのＤ，Ｌ−２−アミノ−４−（１−ブトキ
シ−（メチル）ホスフィノイル）−ブタノニトリル
（０．０７５モル）を室温で１００ｍｌのギ酸中で６０
ｇのＨＣｌガスで飽和させる。２時間後、反応混合物を
濃縮し、残留物を水に溶解させ、そして混合物を飽和重
炭酸ナトリウム溶液を用いてｐＨ８にする。次いでこの
溶液を２回ジクロロメタンを用いて洗浄し、次いで水相
をロータリーエバポレーター中で蒸発させ、そして繰り
返しメタノールを用いて煮詰める。メタノール抽出物を
濃縮した後、残った油状物をシリカゲル上でメタノール
／ジクロロメタン（３：７）中でクロマトグラフィーで
分離する。

【００４９】これによって１４．７ｇ（理論量の８３．
１％）のＤ，Ｌ−２−アミノ−４−（１−ブトキシメチ
ル）ホスフィノイル）ブタンアミドが無色の油状物の形
で得られる。

【００５０】¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：０．９４
（ｔ，Ｊ＝Ｈｚ，３Ｈ）；１．４８（ｄ，Ｊ＝１４Ｈ
ｚ，３Ｈ），１．３２〜１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．６
４（ｍ，２Ｈ），１．８〜２．１（ｎ，４Ｈ）と重複；
２．５（ｓ，ＮＨ₂ ）；３．５２（ｔ，Ｊ＝．．Ｈ
ｚ）、３．９６（ｍ，２Ｈ）；６．３８（ｓ，１Ｈ）；
７．４２（ｇ，１Ｈ）。²¹ｐ ＮＭＲ（Ｄ₂ ．．）：６
２．４（ｓ）ｐｐｍ。

【００５１】生物学的例 物質：Ｄ，Ｌ−２−アミノ−４−（メチル）（ｎ−ブト
キシ）ホスフィノイルブタンアミド＝ＰＰＴ−ＡＭ Ｄ，Ｌ−Ｎ−アセチル−４−（メチル）（ｎ−ブトキ
シ）ホスフィノイル−２−アミノブタンアミド＝ＰＰＴ
−Ａｃ 例１：土壌中でのＰＰＴ−ＡＭおよびＰＰＴ−Ａｃの分
解 種々の源（砂を含んだ、堤防砂利、森林地帯腐食土、牧
草地、庭腐食土、ローム）からの土壌の１０ｇ試料を乾
燥させ、スクリーニングしそして１．２ｍｌの２つの試
験物質の中の１つの１００ｍＭ溶液，ｐＨ＝７．０で処
理した。バッチを暗がりで室温で１４日間インキュベー
ションした。

【００５２】分解挙動を分析するために、０．５ｇの試
料を１、２、４、６、８、１２および１４日後に採取し
て６０℃で２×０．５ｍｌの水を用いて２×３０分間抽
出した。合わせた上清をアミノ酸分析計中でニンヒドリ
ンポストカラム誘導体化（Biotronic LC5001)(ＰＰＴ−
ＡＭの場合）でまたはＨＰＬＣ（カラム：Aminex HPX-8
7H／溶離液：０．０１ Ｈ₂ ＳＯ₄ 、１０％のアセトニ
トリル、または０．１％のトリフルオロアセテート、１
０％のアセトニトリル／溶離：無勾配検出：それぞれ１
９５ｎｍおよび２１０ｎｍ１）（ＰＰＴ−Ａｃの場合）
によって試験した。

【００５３】無菌土壌上での対照実験を行なった（２０
０℃で４時間のインキュベーション）。両方の試験物質
が微生物活性土壌中で、約１〜２日の半減期で分解され
ることが明らかになった。それぞれの場合において、１
つの代謝生成物が出発材料に対してほぼ等モル比で蓄積
する。しかし、試験化合物のさらなる分解は２週間の実
験時間中で見出されなかった。無菌土壌中で上記両アミ
ドの変換は検出され得なかった。

【００５４】例２：ＰＰＴ−ＡＭまたはＰＰＴ−Ａｃを
唯一の窒素源として用いた土壌微生物の増菌培養株(enr
ichment cultures) 例１に記載した土壌の１ｇのバッチを１０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ＝７．０
で、室温で抽出し、そして上清を次の培地中への接種に
使用した。

【００５５】 グルコース ０．２％ スクシネート ５ｍＭ グリセロール １０ｍＭ ＮＨ₄ Ｃｌ １ｇ／ｌ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ，ｐＨ＝７．２ ２．５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ ０．０６ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．０１ｇ／ｌ 微量元素溶液 １ｍｌ／ｌ ＰＰＴ−ＡＭまたはＰＰＴ−Ａｃ １０ｍＭ 微量元素溶液： ＦｅＳＯ₄ ×７Ｈ₂ Ｏ １ｇ／ｌ ＭｎＳＯ₄ ×Ｈ₂ Ｏ ０．２２ｇ／ｌ Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１ｇ／ｌ Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ×２Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ／ｌ ＺｎＳＯ₄ ×７Ｈ₂ Ｏ ０．１８ｇ／ｌ ＣｕＳＯ₄ ×５Ｈ₂ Ｏ ０．１６ｇ／ｌ ＣｏＣｌ₂ ×６Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ／ｌ １Ｎ ＨＣｌ １ｍｌ／ｌ これらの培養株の２ｍｌのバッチを２８℃で２００ｒｐ
ｍで２〜３日間インキュベートしそして、増殖が起こっ
た後、窒素源ＮＨ₄ Ｃｌを段階的に減らしながら（１ｇ
／ｌ ---> ０．５ ---> ０．１ｇ／ｌ ---> ０ｇ／ｌ）
さらに継代した。これにより、いくつかの増菌培養株が
得られ、これらは、唯一の窒素源として、それぞれＰＰ
Ｔ−ＡＭおよびＰＰＴ−Ａｃを用いて増殖することが可
能である。

【００５６】純粋な培養株を得るために、単コロニー
を、適当な寒天培地上にプレーティングした後に増菌培
養株から単離し、次いでこれらの単コロニーを液体培地
中で増殖させ再度寒天プレート上に画線して純度を評価
した。得られた純粋な培養株は次のように同定された： −唯一の窒素源としてＰＰＴ−ＡＭおよびＰＰＴ−Ａｃ
の利用： エンテロバクター・エロゲネス（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳ
Ｍ９１６４） −唯一の窒素源としてＰＰＴ−Ａｃの利用： クレブシエラ・オキシトカ（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９
１６２） クブシエラ・トレビサニイ（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９
１６３） コリネバクテリウム・アクアチカム（ＤＳＭ寄託番号：
ＤＳＭ９１７１） 例３：唯一の窒素源としてＰＰＴ−ＡＭまたはＰＰＴ−
Ａｃの利用に関する他の微生物のスクリーニング 例２に記載した手順を使って、菌株コレクションからの
一連の微生物を、唯一の窒素源として上記両アミドの利
用についてスクリーニングした。次の菌株が、基質とし
て専らＰＰＴ−ＡＭを利用できることが見出された： ロドコッカス・ルブロペルティンクタス，ＡＴＣＣ２１
９３０ ロドコッカス・ロドクラウス，ＡＴＣＣ３３２７８ アルスロバクターｓｐ．，ＡＴＣＣ３１６５２ コリネバクテリウムｓｐ．，ＡＴＣＣ３１６６２ 例４：分解反応の性質：例２および例３に記載した菌株
の１０ｍｌの培養株を例２の最小培地中で唯一の窒素源
として関連のアミド基質を用いて２８℃で２００ｒｐｍ
で２〜３日間増殖した。細胞が対数増殖の後期に達した
時に、細胞を遠心分離しそして培養上清をアミノ酸分析
計で（ＰＰＴ−ＡＭ培養株の場合）またはＨＰＬＣによ
って（ＰＰＴ−Ａｃ培養株の場合）例１に概説したよう
に分析した。

【００５７】両方のアミド基質で、代謝生成物の形成が
観察され、それは未反応出発化合物に対してほぼ等モル
比である（図１および２参照）。培地中の炭素源の過剰
にもかかわず、ラセミアミドＰＰＴ−ＡＭおよびＰＰＴ
−Ａｃのさらなる反応は観察されず、このことは分解反
応が立体選択的であることを示唆した。さらに、アンモ
ニアの豊富化が培地上清中で検出され（図１参照）、そ
の際アンモニアは、アミダーゼ反応における生産物とし
て形成された。

【００５８】例５：ＰＰＴ−Ａｃ代謝生成物の同定、お
よびエナンチオマー比の測定： 例４（ＰＰＴ−Ａｃ）からの培養上清を、凍結乾燥によ
って１０倍に濃縮した。それぞれ約１０ｍｇの代謝生成
物および未反応の出発化合物をこれらの溶液から次のよ
うに単離した： −ＰＰＴ−Ａｃおよび代謝生成物Ｍ：調製に関するＨＰ
ＬＣ，条件は例１を参照、溶離：０．１％のトリフルオ
ロアセテート、１０％のアセトニトリル、検出：２１０
ｎｍ。

【００５９】単離した物質は凍結乾燥によって濃縮し次
いで質量分析によって分析した。これによって代謝生成
物の分子構造を決定した。この物質は： −Ｍ＝Ｎ−アセチル−４−（メチル）（ｎ−ブトキシ）
ホスフィノイル−２−アミノブタン酸と同定された。

【００６０】エナンチオマー純度を調べるために、代謝
生成物および未反応のアミドをＨＣｌで加水分解して遊
離ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）とした。得られるＰＰ
Ｔ試料のエナンチオマー比を、キラルＨＰＬＣによる誘
導体化後に測定した（D. Aswad, Analytical Biochemis
try, 137, 405-409, 1984)。

【００６１】結果を菌株エンテロバクター・エロゲネス
（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９１６４）についてここに示
す。 −代謝生成物：Ｌ−ＰＰＴ ９５．７％ Ｄ−ＰＰＴ ４．３％ −未反応のＰＰＴ−ＡＭ：Ｌ−ＰＰＴ ３．３％ Ｄ−ＰＰＴ ９６．７％ 本明細書中に記載した他の菌株についても同等の結果が
得られた。

【００６２】これらの試験から、見出された反応型が、
使用したラセミアミドを立体選択的に加水分解して対応
するＬ−カルボン酸とし、これはＬ−特異的アミダーゼ
によって触媒されることがわかった。

【００６３】例６：バイオ形質転換(biotransformatio
n) によるＰＰＴ−Ａｃのエナンチオ選択的アミド切
断： クレブシエラ・オキシトカ（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９
１６２）をエレンマイエルフラスコ中で例２の培地１０
０ｍｌ中で２８℃で２００ｒｐｍで２日間唯一の窒素源
として１０ｍＭのＰＰＴ−Ａｃを用いて培養した。次い
で細胞を５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、５０ｍｌ
の１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩
衝液，ｐＨ７．０中で１回洗浄し、そして同一の緩衝液
中に、３０ｍｇ／ｍｌのＤ，Ｌ−ＰＰＴ−Ａｃを用いて
ｃ＝５０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。

【００６４】バイオ形質転換バッチ（全容積１２ｍｌ）
をエレンマイヤーフラスコ中で２８℃で２００ｒｐｍで
１５時間インキュベーションし、次いで反応上清をＨＰ
ＬＣで分析した（例１参照）。

【００６５】Ｎ−アセチル−４−（メチル）（ｎ−ブト
キシ）ホスフィノイル−２−アミノブタン酸の含量は１
４．５ｍｇ／ｍｌであった。形成される生成物のエナン
チオマー純度は、図５に示された図に対応していた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 唯一の窒素源として１０ｍＭのＰＰＴ−ＡＭ
を含む最小培地中で増殖したエンテロバクター・エロゲ
ネス（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９１６４）の培養上清の
アミノ酸プロフィール（例２参照）。試料は、アミノ酸
分析計，モデルBiotronic LC5001で、ニンヒドリンポス
トカラム誘導体化を用いて分析した。図は、関連ピーク
の保持時間（単位：分）を示している。 ５１．２８７分＝２−アミノ−４−（メチル）（ｎ−ブ
トキシ）−ホスフィノイルブタン酸 ９１．２５４分＝アンモニア １０７．６９１分＝ＰＰＴ−ＡＭ 他のピークは、測定装置の内部ピークである。

【図２】 唯一の窒素源として１０ｍＭのＰＰＴ−Ａｃ
を含む最小培地中で増殖したエンテロバクター・エロゲ
ネス（ＤＳＭ寄託番号：ＤＳＭ９１６４）の培養上清の
ＨＰＬＣプロフィール（例２参照）。試料は、Aminex H
PX-87Hカラム、０．１％のトリフルオロアセテート、１
０％のアセトニトリルでの無勾配溶離、検出：２１０ｎ
ｍを用いて分析した。Ｍ２＝Ｎ−アセチル−４−（メチ
ル）（ｎ−ブトキシ）−ホスフィノイル−２−アミノブ
タン酸。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）および（ＩＩ） 【化１】 〔式中Ｒ₁ は枝分かれしていないまたは枝分かれした
   （Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀）−アルキル──これは置換されていない
   か、あるいは１個またはそれ以上のハロゲン基、例えば
   フッ素、塩素、臭素またはヨウ素によって置換されてい
   るか、あるいは（Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ）−アルコキシによって一
   置換または多置換されている──であるか、または（Ｃ
   ₃ 〜Ｃ₈ ）−シクロアルキル──これは（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）
   −アルキル、（Ｃ ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシおよびハロゲ
   ンからなる群から選択される１個またはそれ以上の基に
   よって置換されていることができる──であるか、また
   は（Ｃ₃ 〜Ｃ₁₀）−アルケニル、（Ｃ₃ 〜Ｃ₁₀）−アル
   キニルまたはベンジルであり、そしてＲ₂ はホルミル、
   枝分かれしていないまたは枝分かれした（Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀）
   −アルキルカルボニル──これは置換されていないかま
   たはアルキル部分でヒドロキシル、ハロゲン、（Ｃ₁ 〜
   Ｃ₄ ）−アルコキシ、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキルチオお
   よびフェニル｛これは（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）−アルキル、（Ｃ
   ₁ 〜Ｃ₁₂）−アルコキシ、ハロゲン、ニトロおよびＣＦ
   ₃ からなる群から選択される３個までの基によって置換
   されていることができる｝からなる群から選択される１
   個またはそれ以上の基によって置換されている──であ
   るか、またはベンゾイルまたは、（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）−アル
   キル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂）−アルコキシ、ハロゲン、ニトロ
   およびＣＦ₃ からなる群から選択される１〜３個の基に
   よって置換されているベンゾイルである。〕で表される
   Ｄ−およびＬ−ＰＴＣ誘導体の混合物を水媒体または水
   −有機媒体中で加水分解活性酵素で処理することを特徴
   とする、ＰＴＣ誘導体の酵素分離方法。
2. 【請求項２】 選択的に作用するＬ−アミノ酸アミド−
   切断酵素またはこの酵素を合成する微生物が使用され
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 エンテロバクター・エロゲネス（ＤＳＭ
   ９１６４）、クレブシエラ・オキシトカ（ＤＳＭ９１６
   ２）、クレブシエラ・トレビサニイ（ＤＳＭ９１６
   ３）、コリネバクテリウム・アクアチカム(Colynebacte
   rium aquaticum)(ＤＳＭ９１７１）、ロドコッカス・ル
   ブロペンティンクタス（ＡＴＣＣ２１９３０）、ロドコ
   ッカス・ロドクラウス（ＡＴＣＣ３３２７８）、アルス
   ロバクターｓｐ．（ＡＴＣＣ３１６５２）およびコリネ
   バクテリウムｓｐ．（ＡＴＣＣ３１６６２）からなる群
   から選択される少なくとも１種の微生物が使用される、
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 式（Ｉ）または（ＩＩ）で表されるラセ
   ミアミノ酸アミド誘導体、またはＬ形が富化されたアミ
   ノ酸アミド誘導体が使用される、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 反応が、Ｄ−アミノ酸アミドラセマーゼ
   の存在下に行なわれる、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｒ₁ が枝分かれしていないまたは枝分か
   れした（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルまたは、ハロゲン、例
   えばフッ素、塩素によってもしくは（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−ア
   ルコキシによって置換されている（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アル
   キルであるか、または（Ｃ₅ 〜Ｃ₆ ）−シクロアルキル
   であり、そしてＲ₂ が水素、ホルミル、枝分かれしてい
   ないまたは枝分かれした（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルカル
   ボニル──これは置換されていないかまたはアルキル部
   分がヒドロキシル、ハロゲン、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコ
   キシ、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキルチオ、フェニルまた
   は、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アル
   コキシおよびハロゲンからなる群から選択される１〜３
   個の基によって置換されているフェニルによって置換さ
   れている──であるか、またはベンゾイルまたは、Ｃ₁
   〜Ｃ₄ −アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ −アルコキシおよびハロ
   ゲンからなる群から選択される１〜３個の基によって置
   換されているベンゾイルである、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 Ｒ₁ が枝分かれしていないまたは枝分か
   れした（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルであり、そしてＲ₂ が
   水素、（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀）−アルキルカルボニル──これは
   フェニルによってまたは一置換〜三置換されているフェ
   ニル｛その１〜３個の置換基は（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルキ
   ル、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）−アルコキシおよびハロゲンから選
   択される｝によって置換されている──、好ましくはフ
   ェナセチルであるか、またはベンゾイルである、請求項
   １記載の方法。
8. 【請求項８】 （Ｃ₁ 〜Ｃ₆ ）−アルキルが、メチル、
   エチル、１−プロピルまたは２−プロピル、ｎ−、ｉ
   −、ｔ−または２−ブチル、３−メチル−ブト−２−イ
   ル、ｎ−、ｉ−、ｔ−、２−または３−ペンチル、ｎ−
   ヘキシルあるいは立体異性ヘキシル基である、請求項１
   記載の方法。
9. 【請求項９】 ハロゲンが、フッ素、塩素、臭素または
   ヨウ素、好ましくはフッ素または塩素、特に塩素であ
   る、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の式（ＩＩ）で表される
    化合物。