JPH08508973A - 骨形成を刺激するための低分子量ヒアルロン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分子量が、約20,000から約60,000ダルトンの範囲である、骨誘導活性を有するヒアルロン酸フラクションを提供する。またこれらのフラクション及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物、及びこれらの医薬組成物を用いて種々の型の骨の病気を治療する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 骨形成を刺激するための低分子量ヒアルロン酸の製法発明の背景 発明の分野 本発明は骨誘導薬としてのヒアルロン酸の種々のフラクションの使用に関し、 すなわち、骨形成細胞の成長及び分化を剌激する能力のある薬及び従って、新し い骨の原料自身の形成を剌激する能力のある薬に関する。活性の型は哺乳動物の 起源の細胞に関係する。関連分野の説明 細胞外基質、すなわち組織体積の本質的な部分、を含む高分子の複雑なネット ワークは細胞外のスペースを大きく満たしている。多くの組織、そのような結合 性組織においては、それは、通常かなり豊富であり、完全に全周囲において細胞 を取り囲んでいる。細胞外基質は組織の挙動の多くのプロセスの調節にかなり重 要であり、それ故、その組織の物理的性質が決定されている。細胞外基質の状態 及び構成の変化が、生合成プロセス及び組織の成長に深く影響することが証明さ れてきた。 グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）は最も豊富な非繊維性の細胞外の高分子で あり、全ての結合性組織内に偏在している。高分子量の陰イオンのグリコ共役体 のこの群は軟らかく、無機物を含んだ関連組織に存在する。それらは、細胞外基 質の「非コラーゲン性タンパク質」（ＮＣＰ）、又は「プロテオグリカン」と呼 ばれる高分子から実質上構成されている。これらの用語は第一には、例えばコラ ーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンのような繊維性タンパク質の 群とそれらの分子を区別する；第二には、それらは普通には、タンパク質に共役 結合して発見されることが示されている。 プロテオグリカンの生化学的特性は、主に軟組織に関しては、熱心な研究の対 象であった。一方、骨及び膠着物はそれらのプロテオグリカン含量が関係する限 りにおいて事実上無視されてきた。実際、歯槽の骨のプロテオグリカンを記載す る唯一のレポートが存在するのみである（R.J.Waddingtonら、Connective Tissu e Res .,1988:17,171）。 ＧＡＧｓは長い、非分枝の多糖類鎖で、二糖単位の繰り返しから成る。糖残基 、それらの結合、及び硫酸基の数及び位置の型によってＧＡＧｓは４つの主な群 に分けられる：１）ヒアルロン酸、２）コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸 、３）ヘパラン硫酸及びヘパリン、及び４）ケラチン硫酸。ＧＡＧｓ（おおよそ ヒアルロン酸を除いては）は組織内に自由な状態で存在することは希であること に注目することが重要である。それらは通常、タンパク質に共有結合している。 ヒアルロン酸をは除いては、ＧＡＧｓは硫酸基を含み、この硫酸基はカルボキ シ基と共に、生理学的条件下において、高い負の電化を有する分子を形成してい る。 ヒアルロン酸（ＨＡ）、またヒアルロナン又はヒアルロネートと呼ばれる、は 、数千の糖残基を持つ。それは硫酸化されていない二糖単位の規則的な配列から なる、かなり単純な分子である。 ＨＡは形態発生及び組織修復の間中、細胞移動を促進することができると考え られている。それは成人動物のすべての組織及び流体に種々の量で発見され、特 に初期の胚に豊富である。その単純さのために、ＨＡはグリコサミノグリカンの 最も初期の進化型を代表するであろう。一方ではＨＡの生成及び間葉細胞の動き の間には相互関係が存在し、他方ではＨＡ分布と細胞分化との間には相互関係が 存在する（B.Toolら、Proc.Nat.Acadd.Sci.,USA,1972:69,1384）。傷が癒される 過程は、多くの器官の胚成長の間に起こる初期の出来事と共通する側面をいくつ か有しており、ＨＡは両方の過程において重要な役割を果している（S.H.Barond es編集、Neuronal Recoginition, PlenumPress，New York，pp.275-329における B.P.Tool(1976)）。ＨＡ及び細胞の癒着の間の相互関係が、ＨＡレセプターに関 して発見された（Go1dsteinら、Cell,1989:56,1063;I.Stamenkovicら、Cell,198 9:56,1057）。 上記の結合性組織に対するＨＡの特徴の大部分は、骨においてもまた発見され る。非コラーゲン性タンパク質が局所的石灰化メカニズムに影響を与える可能性 が、しばらく前に評定された（H.Iwataら、Clin.Orthop.,Rel.Res.1973:90、236 ;Bourne,G.H.編集:The Biochemistry and Physiology of Bone, New York，Acad emic Press，1976:1-59におけるM.R.Urist,）。ＨＡ及び骨形成の間の相互関係 は多数存在する： １．ＨＡは骨の形態発生の間中、細胞外基質の顕著な成分である（B.Toolら、Develop．Biol. ,1971:26,28;H.Iwataら、Clin.Orthop.,Rel.Res.1973:90,236） ２．間葉細胞が軟骨へ変遷する間中、ＨＡが、かなりの量、存在する（O.Wieb kinら、FEBSLett.,1973:37,42;C/H.Handleyら、Biochem．Biophys．Acta, 1976: 444,69）； ３．傷の癒される過程及び骨組織成長の間中、それの相互関係に関して（S.H. Barondes編集、Neuronal Recoginition, Plenum Press，New York，pp.275-329 におけるB.P.Tool(1976)）、ＨＡは一種の「プライマー」と考えられる。 ＨＡは歯周病の治療に有用であることが長く知られていた（Minerva Stomatol .17:140,1968; Riv．Ital.，Stomatolog.20:1540,1965）。これらの場合におい ては、良く明確にされた出来事の配列があるように思われる： 最初に、細胞があまり供給されていない空間においてＨＡに富んだ基質が置か れる； 第２に、細胞移動が刺激され、ＨＡ基質は、近接した組織からの細胞移動によ って浸入される；及び 最後に、細胞外基質内部の細胞がヒアルロニダーゼ（ＨＡを減らす）、硫酸化 されたグリコサミニグリカン及びコラーゲンを分泌し、基質が再度模型とされる ようになる間、ＨＡの役割を変わる。 上記の３つの成長システムの各々において、ＨＡ基質が最初に合成され、次に 減生される。従って、細胞の仲介する出来事の複雑なひと続きが進行される前に は、その破壊が以後に起こる、細胞中に僅かに存在する、この変遷性ＨＡ基質が 必要とされるらしい。 種々の型の細胞表面上にＨＡが結合する部位が、かなりの数、存在することも 報告されている、例えば、内皮細胞及び繊維芽細胞において（S.Erikssonら、Ex p．Cell Res. 1983:144,223;R.H.Rajaら、J．Cell．Biol.;1985:101,426a;C.B.Un derhillら、Cell Biol.1979:82,475）。従って、ＨＡは特異的に細胞表面及び細 胞外基質の分子との両方と相互作用を行うことができる。 ＨＡの骨誘導を含む化学的及び物理化学的特徴はまだ明確にされていない。ヒ アルロン酸の生物学的活性が、異なる分子量及び粘度の明確なフラクションと度 々関係づけることができることが知られている。本発明の要約 従って、本発明の目的は、それが骨誘導活性を発揮するために存在する細胞起 源以外の起源から抽出及び精製されたヒアルロン酸の異なるフラクションを提供 することである。生の材料から出発すると、実質上、純粋なヒアルロン酸のフラ クションを、分子量は約２０から約６０Ｋダルトンの範囲内で、粘度は約1.2dl/ gから約2.8dl/gの範囲内で、及びタンパク質含量は約0.5％（重量／重量）以下 にて、得ることができる。 もう１つの本発明の目的は、骨誘導活性を有するヒアルロン酸フラクション及 び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供することである。上記医薬組 成物は、ミクロスフェア、膜、フィルム、不織組織、チューブ、神経チャンネル 、スポンジ、粉末又は顆粒の形態を採ることができ、上記ヒアルロン酸フラクシ ョンを0.1％から99％重量、より好ましくは上記ヒアルロン酸フラクションを10 ％から90％重量、最も好ましくは上記ヒアルロン酸フラクションを20％から80％ 重量、含むことができる。 本発明のさらなる目的は、ヒトの及び獣医学の薬において有用な、骨の機能を 維持する方法、骨の機能損失を防止する方法、外傷性の状態において骨の機能を 回復する方法、遅い段階における急性の病的な状態及び慢性の退化的病的な状態 を含む慢性の又は急性の病的な状態において骨の機能を回復する方法、及び骨の 老化に起因する病的な状態を治療する方法を提供することである。これらの方法 は、必要としているヒト又は動物に、骨誘導活性を持つヒアルロン酸フラクショ ン及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を、効果量、投与することからな る。 上記医薬組成物は、非経口投与、皮内投与、局所投与及びその場所への投与を 含む群から選択される経路によって投与することができる。局所的投与は骨の欠 失部位におけるジエンジバル内投与（intragengival）を含む。 本発明の応用のさらなる範囲は、以下に提供される詳しい記載及び図面により 明らかにされるであろう。しかし、本発明の精神及び範囲内において種々の変形 及び修飾が、この詳しい記載から本分野の当業者には明らかにされるので、その 詳しい記載及び具体的実施例は、本発明の好ましい具体例を示し、単に例示の手 段として与えられたものであることが理解されねばならない。図面の簡単な説明 本発明の上記の及び他の目的、特徴及び効果が、添付された図面と結合された 以下の詳しい説明からより良く理解され、全ての図面は単に例示のために提供さ れ、本発明を限定しない、図中： 図１は本明細書中に記載されたヒアルロン酸の低分子量フラクションを生成す るために取り得る種々の方法を示している。 図２はインビトロ系における骨誘導活性を示し、骨コロニー領域を用いた測定 による、分子量30及び40Ｋダルトンを有するヒアルロン酸フラクションの濃度0. 5、1.0及び2.0mg/mlにおける活性を示している。 図３はインビトロ系における骨誘導活性を示し、骨コロニー数を用いた測定に よる、分子量30及び40Ｋダルトンを有するヒアルロン酸フラクションの濃度0.5 、1.0及び2.0mg/mlにおける活性を示している。 本発明の詳しい説明 以下の詳しい説明は、本分野の当業者が本発明を実行することを助けるために 提供される。それでも、本明細書において討論された具体例の修飾及び変形は、 本分野の当業者によって、本発明の発見の精神又は範囲から、はずれないで作ら れるものであるから、以下の詳しい説明は本発明を不当に制限するものであって はならない。 本明細書にて引用した参考文献の各々の内容は、完全に参考として挿入されて いる。材料及び方法 ヒアラスチン（Ｈyalastine）からの低分子量ヒアルロン酸フラクションの調製 実施例１ 炎症性の活性のないヒアラスチン及びヒアレクチン（Hyalectin）フラクション の混合物を得る方法： めんどりのとさか、新鮮か又は冷凍のもの（3000g）を肉ミンチ機でミンチに して、次に注意深く機械のホモジナイザーでホモジナイズする。得られたペース トを、AISI 316ステンレススチールの容器又はガラス容器に、無水アセトン10体 積と共に入れる。次に全内容物を６時間、50g/分の速さで撹拌し、分離するため に12時間放置し、その後アセトンをサイホンで吸って除き、捨てる。 この抽出工程を、捨てられたアセトンが正しい湿気レベルに達するまで繰り返 す［カール−フィッシャー（Karl-Fischer）法］。 次に得られた物質を遠心分離し、適切な温度にて５−８時間真空乾燥する。こ の過程において、めんどりのとさかから、乾燥粉末が約500-600g得られる。 次にその乾燥粉末300gに対して、パパイン（0.2g）を用い、システイン塩酸が 適当量存在するリン酸バッファーを用いたバッファー化された水性溶媒を通す、 酵素消化工程を行う。この混合物を次に60-65℃の一定温度にて60g/分にて、24 時間撹拌する。全体を25℃まで冷却し、セリート（Celite）(R)を60g加え、さら に１時間撹拌を続ける。 得られた混合物を、清澄な液体が得られるまで濾過する。次にこの清澄な液体 を、30,000の制限で分子を除く膜を用いた、分子限外濾過を行い、膜上に分子量 30,000以上の分子を保持する。元の体積の５から６が限外濾過され、そして同時 に生成物に連続して蒸留水が加えられる。蒸留水の添加物は懸濁し、生成物は、 その元の体積の３分の１が残るまで限外濾過される。 残渣溶液は塩化ナトリウムを加えて0.1Ｍにして、温度を50℃にする。生成物 を60g/分にて撹拌している間に、塩化セチルピリジニウムを45g加える。セリー ト(R)を50g加えた後、この混合物を60分間撹拌する。撹拌下において生成物の 温度を25℃に下げて、形成した沈殿を遠心分離により集める。このように得られ た沈殿を、塩化セチルピリジニウムを0.05％含む0.01Ｍ塩化ナトリウム溶液（５ リットル）内に懸濁する。それを50℃においてさらに60分間撹拌する。温度を25 ℃に下げて、沈殿を遠心分離する。 その後、洗浄プロセスを３回繰り返し、塩化セチルピリジニウムを0.05％含む 0.05Ｍ塩化ナトリウム溶液が３リットル入った容器に最後に沈殿を集める。これ を60g/分にて60分間撹拌し、25℃の一定温度にて２時間維持する。脂質の上清を 遠心分離によって除去する。 その方法をこのように、塩化セチルピリジニウムを0.05％含む0.1Ｍ塩化ナト リウム溶液を用いて数回繰り返す。混合物を遠心分離し、上清を除去する。塩化 セチルピリジニウムを0.05％含む0.30Ｍ塩化ナトリウム溶液に沈殿を拡散する（ 31）。混合物を撹拌し、沈殿及び清澄な液体の両方を集める。さらに３回、各々 同じ水溶液を0.5リットル用いて、沈殿に対して抽出を繰り返す。 最後に、残渣の沈殿を除去し、清澄な液体を単一の容器内で一体化する。液体 の温度を、撹拌しながら、50℃に上げる。次に液体を塩化ナトリウムを用いて、 0.23Ｍにする。塩化セチルピリジニウムを１ｇ加え、12時間撹拌を続ける。混合 物を25℃に冷却し、次に、最初にセリート(R)パックを通過させ、次にフィルタ ー（１μ）を通過させ、濾過する。 次に、得られた混合物を、30,000の制限で分子を除去する膜を通過させる分子 限外濾過をさらに行い、元の３体積に0.33Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えて限外濾 過する。塩化ナトリウム溶液の添加物は懸濁し、液体の体積を元の体積の４分の １に減らす。 このように濃縮された溶液を、撹拌（60g/分）下、25℃の温度にてエタノール （95％）を３体積用いて、沈殿させる。沈殿を遠心分離により集めて、上清を捨 てる。沈殿を0.1Ｍ塩化ナトリウム溶液１リットル中に拡散し、95％エタノール を３体積用いて、沈殿操作を繰り返す。 沈殿を集めて、最初は75％エタノールで（３回）、次に無水エタノールで（３ 回）及び第３に、無水アセトンで（３回）洗浄する。 このように得られた生成物（ヒアラスチン＋ヒアレクチン フラクション）は 平均分子量が25,000及び35,000の間である。 ヒアルロン酸の収率は元の新鮮な組織の0.6％に等しい。 実施例２ 実施例１に記載の方法により得られた混合物からヒアラスチン フラクションを 得る方法 実施例１に記載の方法で得られた混合物を発熱物質不含の蒸留水に、生成物10 mgに対して水１mlの比率で溶解する。このように得られた溶液を200,000の制限 で分子を排除する膜を通す分子限外濾過を、濃度技術を用い、膜上に水を追加し ないで行なう。200,000の制限で排除する膜を通す限外濾工程の間中、200,000以 上の分子量の分子は通過せず、それに反して、より小さい分子は水と共に膜を通 過する。濾過工程の間、膜上の区画に水を加えない、従って、この区画の体積は 減少し、それと共に分子量200,000以上の分子の濃度は増加する。次に膜上の体 積が最初の体積の10％に減少するまで限外濾過する。発熱物質不含の２回蒸留し た水を２体積加え、この溶液を再度、体積が３分の１に減少するまで限外濾過す る。この操作をもう２回繰り返す。 膜を通した溶液を塩化ナトリウムを用いて1.0Ｍにして、次に95％エタノール を４体積用いて、沈殿させる。沈殿を75％エタノールを用いて３回洗浄し、次に 真空乾燥する。 このように得られた生成物（ヒアラスチン フラクション）は50,000及び100, 000の間の平均分子量を有している。 ヒアルロン酸の収率は元の新鮮な組織の0.4％に等しい。 本発明の低分子量ヒアルロン酸フラクションは、図１に示されるようにヒアラ スチン フラクションから調製された。単離された間葉細胞の培養方法 妊娠第12日目−第13日目のスイスウエブスター（Swiss Webster）マウスをネ ムビタールナトリウム塩（sodium nembutal）0.4mlを非経口投与することにより 麻酔した。胎児を無菌状態で除去した。頭の上皮を除去し、円頂冠を持ち上げ て脳を露出した。側頭部の、前頭部の、頭頂部の、及び後頭部の間葉の部分を除 去し、直ちにＢＧＪｂ培地に入れた。各々のマウスからの組織を別々に、カルシ ウム及びマグネシウム不含の無菌のハンクのバランス化された生理食塩水（HBSS ）12ml、生のコラーゲン10mg及びデキストロース50μgが入った無菌のペトリ皿 内に入れた。このペトリ皿を回転するプラットホームに置き、37℃にて90分間、 破砕することにより、組織を溶解した。このように分散させた組織を、遠心分離 のために、無菌の円錐形の50ml試験管へ移した。遠心分離後、上清を除去し、残 ったペレットを、ゲンタマイシン50μg/ml及び加熱−不活性化した胎児の子牛血 清（ウイルスがないことが確認された）10％を用いて豊富化したＢＧＪｂ溶媒中 に再懸濁した。この工程を３回繰り返し、コラーゲナーゼの完全な除去を確実に する。最後の再懸濁の後、一部分を細胞数の測定のために、血球計算器へ移す。 血球計算器の２つのチャンバーから得られた値が、その２つのチャンバーの平均 の２乗根以上異なる場合には、カウントを繰り返す。次に細胞懸濁物を、４×10⁵ 細胞／mlの濃度が得られるまで、希釈又は濃縮する。各々が２×10⁶細胞を含む ５mlの部分を、無菌の、60-mmペトリ皿に入れ、37℃、湿度100％、圧縮空気95％ 及び二酸化炭素５％の大気中にて貯蔵した。これらの細胞はMarvaso及びBernard によって記載された様に、多数の骨のコロニーに成長する（J.S.Koら、Am.J.Ana t .1981:161,415）。顕微鏡法 骨の培養がインジツ系において固定され、その後ペトリ皿からゴムのへらを用 いて、無傷で除去され、低速度の遠心分離によって、穏やかに詰められる。この ように処理された細胞培養を区分することによって、相互の関係を含む、培養の 多くの領域を見ることができ、従って、各々のペトリ皿における組織学的表現の 全体にわたる印象を得ることができる。固定後、全ての組織を、一連のアルコー ル群を通過させることにより、脱水し、キシレンによって浄化し、パラフィン内 に埋め込む。各々の骨コロニーにより覆われた領域を、位相差顕微鏡（35ｘ）に 接続したデジタル分析装置によって測定する。5-6ミクロンの区画が物質の全長 に沿って取られ、半連続法において取り付けられる。結合したカルシウムの検出 のためのVon Kossa試薬を用いて処理すると、１５の各々の列の３つの連続的な 区画が、トルイジンブルー、H.及びEを用いた、又はニュートラルレッドで、同 じオーダーで染色された。与えられた組織の全ての区画が試験され、最も代表的 な顕微鏡の視野が写真撮影された。 コントロールの頭骨、単離された間葉細胞ペレット及び細胞培養物質は、上記 の様に集められ固定されるが、細胞培養をペトリ皿から除去せず、インジツ系に て固定する違いがある。次に、全ての組織をｐＨ7.4において0.1Ｍカルボン酸ナ トリウム塩における１％四酸化オスミウムにおいて、１時間ポスト−フィックス ド（post-fixed）し、アルコール及びプロピレン オキシド又はメタクリル酸ヒ ドロキシプロピルにおいて脱水し、エポン（Epon）812内に埋め込む。そのブロ ックを、ポーター−ブルーム（Porter-blum）MT-１超ミクロ切除器の上のガラス の刃を用いて切る。光学顕微鏡のために、プラスチック物質の半−薄い（semi-t hin）、１ミクロンの区画が、水性トルイジンブルーを用いて固定され、一方、 他の薄い区画は、酢酸ウラニル及びくえん酸鉛を用いて固定され、全ての超微細 構造の分析のために使用される。電子顕微鏡法はシーメンズ1Aエルモスコップ（ Siemens 1A Elmoskop）を用いて80KVにて行った。細胞培養内部において、骨の コロニーの細胞集合を表す凝集のみを試験する。最後に各々のペトリ皿から任意 に、３つの凝集を選び、指定の時に埋め込む。実施例３ 異なる分子量を有するＨＡの異なる量を、前に記載の様に準備した培養された 骨コロニーに加えた。 粉末状のＨＡのサンプルは、ヒアルロン酸の異なる分子量フラクションを表し た：２×10⁴;４×10⁴;６×10⁴;16×10⁴;55×10⁴;88×10⁴;及び13×10⁵。 ＨＡサンプルの特徴を、ＡからＧとして定義し、表１に示す。 種々のＨＡサンプルを用いて、３つの異なる濃度：0.5,1.0及び2.0mg/mlにお ける間葉細胞を処理した。全てのサンプルを、試験ごとに全部で８つのペトリ皿 に適用し、統計的に意味のあるデータを産出した。ＨＡを含む培養培地（ＢＧＪ ｂ）を最初にＨＡ不含培地に48時間後に取り替え、次に24時間ごとにその後は得 られる組織が固定される10日まで取り替えた。 写真顕微鏡の結果は、サンプルＡ，Ｂ及びＣにおける最大の骨誘導活性を示し た。 図２及び図３は、培養された骨コロニーにおけるコロニー面積及びコロニー数 の各々に対する、分子量30及び40Ｋダルトンを有するＨＡフラクションの影響を 示す。 図２に示されるように、分子量30Ｋダルトンを有するＨＡフラクション（左パ ネル）は１mg/mlの濃度において、骨コロニー面積成長を刺激する活性が最大で あった。分子量40Ｋダルトンを有するＨＡフラクション（右パネル）は、２mg/m lの濃度において活性が最大であった。両方の場合において、コロニーの大きさ 及びＨＡ用量の間の関係はおおよそ直線的であった。 図３に示されるように、分子量30及び40Ｋダルトンを有するＨＡフラクション の両方は、２mg/mlにおいて、コロニー形成を刺激する活性が最大であった。両 方のＨＡフラクションを用いた処理は、未処理のコントロールと比較すると、培 養内の骨コロニーの数の顕著な増加をもたらした。この増加は、用量の増加とお およそ直線関係にあり、分子量30ＫダルトンＨＡフラクションにおいてより顕著 であった。 このように本発明が記載されたので、同じものが種々の方法で修飾され得るこ とが明白である。このような修飾は、本発明の精神及び範囲から相違すると考え られるべきではなく、本分野の当業者にとって明らかな修飾のいかなるものも、 以下の特許請求の範囲内に入ると考えられるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨誘導活性を有するヒアルロン酸フラクション。 ２．フラクションの分子量が、約20,000から約60,000ダルトンの範囲である特 許請求の範囲第１項に記載のヒアルロン酸フラクション。 ３．フラクションの分子量が、３０Ｋダルトン又は４０Ｋダルトンである特許 請求の範囲第２項に記載のヒアルロン酸フラクション。 ４．フラクションの粘度が、約１．２ｄｌ／ｇから約２．８ｄｌ／ｇの範囲で ある特許請求の範囲第１項に記載のヒアルロン酸フラクション。 ５．フラクションの粘度が１．３ｄｌ／ｇである特許請求の範囲第４項に記載 のヒアルロン酸フラクション。 ６．フラクションのタンパク質含量が約０．５％以下である特許請求の範囲第 １項に記載のヒアルロン酸フラクション。 ７．特許請求の範囲第１−６項のいずれかに記載のヒアルロン酸フラクション 及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。 ８．ミクロスフェア、膜、フィルム、不織組織、チューブ、スポンジ、粉末及 び顆粒から成る群から選択される形態である特許請求の範囲第７項に記載の医薬 組成物。 ９．ヒト又は動物対象における骨機能を維持する方法であって、特許請求の範 囲第７項に記載の医薬組成物を、骨機能を維持する効果が生じる量、該ヒト又は 動物に投与することを特徴とする方法。 １０．ヒト又は動物における骨機能の損失を防ぐ方法であって、特許請求の範 囲第７項に記載の医薬組成物を、骨機能の損失を防ぐ効果が生じる量、該ヒト又 は動物に投与することを特徴とする方法。 １１．ヒト又は動物における外傷性状態下での骨機能を回復する方法であって 、特許請求の範囲第７項に記載の医薬組成物を、骨機能を回復する効果が生じる 量、外傷性のヒト又は動物に投与することを特徴とする方法。 １２．ヒト又は動物における急性又は慢性病的状態下での骨機能を回復する方 法であって、特許請求の範囲第７項に記載の医薬組成物を、骨機能を回復する効 果が生じる量、該ヒト又は動物に投与することを特徴とする方法。 １３．急性の病的状態が遅い段階であることを特徴とする特許請求の範囲第１ ２項に記載の方法。 １４．慢性の病的状態が慢性の退化的病的状態であることを特徴とする特許請 求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．ヒト又は動物における骨の老化に起因する病的状態を治療する方法であ って、特許請求の範囲第７項に記載の医薬組成物を、骨の老化に起因する病的状 態の治療効果が生じる量、該ヒト又は動物に投与することを特徴とする方法。 １６．非経口投与、皮内投与、局所投与及びその場所への投与から成る群から 選択される経路によって、医薬組成物を投与することを特徴とする特許請求の範 囲第１０項から第１６項のいずれかに記載の方法。 １７．局所投与がジエンジバル内（ｉｎｔｒａｇｅｎｇｉｖａｌ）への適用に より行われることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の方法。