JPH08505767A

JPH08505767A - ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＨｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ▲Ｉ▼、▲ＩＩ▼、および▲ＩＩＩ▼の精製、組成、および特異性

Info

Publication number: JPH08505767A
Application number: JP6513425A
Authority: JP
Inventors: サシセックハラン，ラムナス; エル．ロース，ダニエル; エル．クーニー，チャールズ; ジェイ．リンハート，ロバート; エス．ランジャー，ロバート
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1993-11-30
Publication date: 1996-06-25
Also published as: PT670892E; CA2150263C; USRE41328E1; DE69333834D1; DE69333834T2; DK0670892T3; EP0670892A4; JP2005278651A; ES2243924T3; EP0670892A1; USRE41461E1; CA2150263A1; JP2004135684A; ATE298366T1; US5569600A; WO1994012618A1; US5389539A; EP0670892B1

Abstract

(57)【要約】 F．heparinum由来の３種のヘパリンリアーゼすべてを同時に精製して、明らかに均質にする単一の、再現性のあるスキームが、本明細書で記述される。このヘパリンリアーゼの速度論的性質が示され、そしてこれらの活性および安定性を最適化する条件も示される。この３種のヘパリンリアーゼに対するモノクローナル抗体もまた、記載され、そしてこれらは、これらのヘパリナーゼの検出、単離、および特徴づけのために有用である

Description

【発明の詳細な説明】 Flavobacterium Heparinum由来のヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの精製、組成、および特異性発明の背景本発明は、一般にFlavobacterium Heparinum由来のヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの精製と特徴づけならびにそれらに対する抗体に関する。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、ヘキスロン酸に結合した直鎖状の多糖類であるD-グルコサミン（1→4）により特徴づけられたグルコサミノグリカンのクラスを代表する（Linhardt，R.J．（1991）Chem．Ind．2，45-50；Casu，B．（1985 ）Adv．Carbohydr．Chem．Biochem．43，51-134）。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、炭水化物複合体であって哺乳類の細胞外マトリックスで重要な機能の役割を果たす。これらの多糖類は、正常な状態下での発生または病理学上の状態下で創傷治癒および腫瘍の転移のどちらかの間に起こる組織レベルの事象を調節および制御する。ヘパリンおよびヘパラン硫酸配列についての現状の知識は、それらの生合成の研究に依存している（Linhardt，R.J.，Wang，H.M.，Loganathan，D.，およびBa e，J.H．（1992）Biol．Chem．267，2380-2387；Lindahl U.，Feingold，D.，およびRoden，L．（1986）Trends Biochem．Sci．11，221-225；Jaco bson，I.，およびLindahl，U．（1980）J．Biol．Chem．255，5094-5100；Linda hl，U.，およびKjellen，L．（1987）in The Biology of Extracellular Matrix Proteoglycans（Wight，T.N.，およびMecham R.，編）pp.59-104，Academic Pr ess，New York）。最近の研究（Linhardt，R.J.，Rice，K.G.，Kim，Y.S.，Lohs e，D.L.，Wang，H.M.およびLoganathan，D．（1988）Biochem．J．254，781-787 ；Linhardt，R.J.，Turnbull，J.E.，Wang，H.M.，Loganathan，D.およびGallag her，J.T．（1990）Biochemistry 29，2611-2617）は、これらの多糖類複合体をオリゴ糖に分解する酵素法の適用に焦点が絞られている。次に、オリゴ糖は構造的に特徴づけられ得る（Linhardtら、（1992）Biol．Chem．267，2380-2387；Li nhardtら、（1988）Biochem．J．254，781-787；Loganathan，D.，Wang，H.M.， Mallis，L.M.，およびLinhardt，R.J．（1990）Biochemistry29，4362-4368）。ヘパリンおよびヘパラン硫酸を分解する酵素法は、非常に特異的であり、オリゴ糖産物を与える穏やかな状態を必要とする。そして、オリゴ糖産物が由来するグリコサミノグリカンに良く似ている。ヘパリンおよびヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを分解する２つのタイプの酵素は、脱離機構で作用する原核生物起源の多糖類リアーゼ（Linhardt，R.J.，Galliher，P.M.，およびCooney，C.L．（1 986）Appl．Biochem Biotech．12，135-176）、および加水分解機構で作用する真核生物起源のグルクロニダーゼ（加水分解酵素）である。原核生物のヘパリンおよびヘパラン硫酸の分解は、Flavobacterium heparinum 由来の酵素を用いて主に研究されてきた（Linker，A.およびHovingh，P．（1965 ）J．Biol．Chem．240，3724-3728；Linker，A.，およびHovingh，P．（1970）J ．Biol．Chem．245，6170-6175）；Dietrich，C.P.，Silva，M.E.，およびMiche lacci，Y.M．（1973）J．Biol．Chem．249，6408-6415；Silva，M.E.，Dietrich ，C.P.，およびNader，H.B．（1976）Biochem．Biophys．Acta 437，129-141）。この細菌性分解は、３つ（あるいはそれ以上）のエリミナーゼ（ellminase）作用を伴い開始する。これらのヘパリンリアーゼは、それらの非還元末端に△_4, ₅ 不飽和ウロン酸残基を有するオリゴ糖を生産する。これらのエリミナーゼは、おそらくヘパリンおよびヘパラン硫酸を二糖類に一斉に変化する作用をする。ヘパリンリアーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸中の主なグルコシド結合を特異的に切断する能力を有する酵素の一般的なクラスである。３種のヘパリンリアーゼが、ヘパリン利用微生物である、Flavobacterium heparinum中で同定されたがこの微生物はまた、エキソグリクロニダーゼ、スルホエステラーゼ、およびスルフアミダーゼを生産し、リアーゼにより生じたオリゴ糖産物にさらに作用する。（Yang，V.C.，Linhardt，R.J.，Berstein，H.，Cooney，C.L.，およびLang er，R．（1985）J．Biol．Chem．260，1849-1857；Galliher，P.M.，Linhardt， R.J.，Conway，L.J.，Langer，R.，およびCooney，C.L．（1982）Eur．J．Appl ．Microbiol．Biotechnol．1 5，252-257）。これらのリアーゼは、ヘパリンリアーゼＩ（ヘパリナーゼ、EC 4 .2.2.7）、ヘパリンリアーゼII（ヘパリナーゼII、EC番号なし）およびヘパリンリアーゼIII（ヘパリチナーゼ、EC 4.2.2.8）として命名された。これらの酵素の特異性は、完全には知られていないので、部分精製酵素をヘパリン、ヘパラン硫酸および構造的に特徴づけられたヘパリンオリゴ糖に用いた研究によって、酵素切断を受けやすい結合が理解された（Linhardtら、（1990），Lohse（1992），Rice，K.G.，およびLinhardt，R.J．（1989）Carbohydr．Res．190，219-233 ）。３つの精製したヘパリンリアーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を切断する能力が異なる：ヘパリンリアーゼＩは、ヘパリンを主に切断し、ヘパリンリアーゼIIIは、ヘパラン硫酸を特異的に切断し、そしてヘパリンリアーゼIIは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に等しく作用する（Linhardtら、1986；Linhar dtら、1990）。いくつかのBacteroides種（Saylers，A.A.，Vercellotti，J.R.，West，S.E.H .，およびWilkins，T.D．（1977）Appl．Environ．Microbiol．33，319-322；Na kamura，T.，Shibata，Y.，およびFujimura，S．（1988）J．Clin．Microbiol． 25，1070-1071）もまた、ヘパリナーゼを生産する。しかし、これらの酵素は良く特徴づけられていない。ヘパリナーゼはまた、同定されていない土壌細菌から見かけ上均質になるまで精製された（Bohmer，L.H.，Pitout，M.J.，Steyn，P.L .，およびVisser，L．（1990）J．Biol．Chem．265，13609-13617）。この酵素は、分子量（94,000）、pI（9.2）、アミノ酸組成、および反応速度特性（Ｋ_m 3.4μMおよびＶ_max．36.8μmol/min、最適pH 7.6）という点でFlavobacteri um heparinumから単離した酵素と異なる。 Yoshida，K.，Miyazono，H.，Tawada，A.，Kikuchi，H.，Morikawa，K.，およびTokuyasu，K．（1989）10th Annual Symposium of Glycoconjugates，Jerusal emに記載されたように、その他の３つのヘパリンリアーゼ、特にFlavobacterium 種Hp206から精製したヘパリンリアーゼは、64,000、100,000、および72,000の分子量を有し、ヘパリンリアーゼＩ〜IIIと異なる。 F．heparinumのヘパリンリアーゼは、最も広範囲で使用され、そして最も良く研究されている（Lindhardt，（1986））。LinkerおよびHovingh（1970）は、これらのリアーゼ活性を最初に分離し、粗リアーゼ画分をヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）およびヘパリチナーゼ（ヘパリンリアーゼIII）に分画した。両方の活性は、50〜100倍まで精製されたが、しかし、これらの酵素の物理的な特徴づけは、行われなかった。 Dietrichおよび共同研究者（Dietrichら、1973）；Silvaら、（1976）；Silva ，M.E.，およびDietrich，C.P．（1974）Biochem．Biophys．Res．Commun．56， 965-972；Michelacci，Y.M.，およびDietrich，C.P．（1974）Biochem．Biophys ．Res．Commun．56，973-980）ならびにOtotaniおよびYosizawa（Ototani，N.，およびYosizawa，Z．（1978）J．Biochem．（東京）84，1 005-1008；Ototani，N.，およびYosizawa，Z．（1979）Carbohydr．Res．70，29 5-306；Ototani，N.，Kikiuchi，M.およびYosizawa，Z.，（1981）Carbohydr．R es．88，29.1-303；Ototani，N.およびYosizawa，Z．（1981）Proceedings of t he 6th International Symposium on Glycoconjugates，pp．411-412，9月20〜2 5日、東京、Japan Scientific Press，東京）は、F．heparinumから３種類のリアーゼ（１種類のヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）および２種類のヘパリチナーゼ）を単離した。ヘパリナーゼは、ヘパリンに作用し、主に三硫酸化二糖類を生じる（Dietrich，C.P.およびNader，H.B．（1974）Biochem．Biophys．Acta 343，34-44；Dietrich，C.P.，Nader，H.B.，Britto，L.R.，およびSilva，M.E ．（1971）Biochem．Biophys．Acta 237，430-441）；Nader，H.B.，Porcinatto ，M.A.，Tersariol，I.L.S.，Pinhal，M.S.，OliVeira，F.W.，Moraes，C.T.，およびDietrich，C.P．（1990）J．Biol．Chem．265，16807-16813）。精製された２つのヘパリチナーゼ（ヘパリチナーゼＩおよびIIと呼ばれていた。これらの酵素の物理的な特性は示されていなかったが、おそらくヘパリンリアーゼIIおよびIIIに対応するであろう）を精製し、そしてヘパリンおよびヘパラン硫酸に対する基質特異性を特徴づけた。ヘパリチナーゼＩは、N-アセチル化およびN-スルフェート化ヘパラン硫酸の両方を分解し、一方ヘパリチナーゼIIはN-スルフエート化ヘパラン硫酸を主に分解した。 McLeanおよび共同研究者は、部分精製ヘパリナーゼIIの特異性を記載した（Moffat，C.F.，McLean，M.W.，Long，W.F.，およびWilliamson ，F.B．（1991）Eur．J．Biochem．197，449-459；McLean，M.W.，Long，W.F.，およびWilliamson，F.B．（1985）Proceedings of the 8th International Symp osium on Glycoconjugates，pp．73-74，9月，Houston，Paeger Publishers，Ne w York；McLean，M.W.，Bruce，J.S.，Long，W.F.，およびWilliamson，F.B．（ 1954）Eur．J．Biochem．145，607-615）。ヘパリナーゼIIに対する均質性の証拠または物理的な特性が示されなかったが、種々のポリマー性基質に対する広い特異性（Moffatら、（1991））は、ヘパリンリアーゼIIとして酵素を同定する（ Lindhardtら、（1990）；McLeanら、（1985）。 Lindhardtら、（1984）Appl．Biochem．Biotech．9，41-55）は、SDS-PAGE上で単独のバンドのヘパリナーゼ（ヘパリンリアーゼＩ）の精製を報告した。ヘパリン-セファロース上でのヘパリンリアーゼＩのアフィニティー精製は失敗したが、カラムマトリックスの分解によるものであろう。詳細な特徴づけの研究およびアミノ酸配列の分析のために十分な量の純粋なヘパリンリアーゼＩは、Yangら（1985）によって最初に調製された。ヘパリンリアーゼＩを用いて、ヘパリンリアーゼＩのアフィニティー精製をするための、ウサギのポリクローナル抗体の調製を行った。しかし、酵素を溶出するための過度の厳しい条件により、活性が相当損失した（Lindhardt，（1985））。Yang，V.C.，Bernstein，H.，Cooney，C. L.，およびLanger， R．（1987）Appl．Biochem．Biotech．16，35-50））もまた、ヘパリンリアーゼＩの調製方法を記載している。 Seikagaku Co.は、最近口頭でヘパリンリアーゼＩ〜IIIに対応する市販の酵素の分子量が、それぞれ43,000、84,000、および70,000であることを報告した（Yo sida，K．（1991）International Symposium on Heparin and Related Polysacc harides，9月1〜6日、Uppsala，Sweden）。これらの報告は、本明細書に記載の分子量とほぼ一致するが、しかしそれらの精製または特徴づけの方法の詳細は、公開されていなかった。ヘパリンリアーゼは、プロテオグリカン混合液中にヘパリンの存在を確認するため［（Kanwar，Y.S.，およびFarquhar，M.G．（1979）glomerular basememt m embrane中のヘパリン硫酸の存在。Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 76，1303-1307 ）］、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を分解して生じたオリゴ糖構造の特徴づけるために［（Lindhardt，R.J.，Loganathan，D．Al-Hakim，A.，Wang，H.-M.，Wal enga，J.M.，Hoppensteadt，D.，およびFareed，J．（1990）低分子量ヘパリンのオリゴ糖マッッピング：構造および活性の相違。J．Med．Chem．33，1639-164 5；Lindhardt，R.J.，Rice，K.G.，Kim，Y.S.，Lohse，D．L.，Wang，H.M.，およびLoganathan，D．（1988）.ヘパリンの主なオリゴ糖成分の地図作製および定量。Biochem．J．254，781-787；Merchant，Z.M.，Kim，Y.S.，Rice，K.G.，およびLindhardt，R.J．（1985）ヘパリン由来の四糖類の構造。Biochem．J．229 ，369-377；Turnbull，J.E.，およびGallagher，J. T．（1988）ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動およびナイロンメンブランへのエレクトロトランスファーによるヘパラン硫酸のオリゴ糖マッピング。Bioche m．J．251，597-608）］、抗凝血物および補体阻害活性を有する低分子量のヘパリン調製物を生産するために［（L1ndhardt，R.J.，Grant，A.，Cooney，C.L.，およびLanger，R．（1982）細菌のヘパリナーゼを用いて調製したヘパリンフラグメントの特異な抗凝血物活性。J．Biol．Chem．257，7310-7313； Lindhardt ，R.J.，およびLoganathan，D．（1990a）．ヘパリン、ヘパリノイドおよびヘパリンオリゴ糖：構造および生物学的活性。C.G．Gebelein（編），Biomimetic Po lymers （pp．135-173）．New York： Pleum Press； Sharath，M.D.，Merchant ，Z.M.，Kim，Y.S，Rice，K.G.，Lindhardt，R.J.，およびWeiler，J.M．（1985 ）小さなヘパリンフラグメントは、補体増幅経路を制御する。Immunopharmacolo gy 9，73-80）］、および循環からヘパリンを取り除く（Langerら、1982）ために用いられた。ヘパリン分解酵素は、細胞外マトリックスでヘパリン様分子の役割を理解するため、または異なった組織微環境で特異性の高い方法で細胞外マトリックスを調節および変化するために使用するのに優れた道具である。しかし、ヘパリンリアーゼを利用する研究は、Flavobacterium Heparinumからの酵素精製、特に３つの酵素をそれぞれを分離することに関する困難性により阻害される（ Lindhardtら、1985）。特に、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方を切断するヘパリンリアーゼIIの能力が、ヘパリンを切断するヘパリンリアーゼＩとヘパラン硫酸を切断するヘパリンリアーゼIIIとからの区別を困難にする。これら３つ全てのヘパリン/ヘパラン硫酸リアーゼは、広く使用されているが、ヘパリンリアーゼＩを除いてヘパリナーゼIIおよびヘパリナーゼIIIの純度、または物理的および反応速度論的な特徴に関する情報がない。純粋なヘパリンリアーゼがないことによって、基質特異性のあいまいさが残る。これは、調製物中に他のリアーゼが混入していること、および最適な触媒条件および基質特異性が不明であることに起因し、構造および活性の研究のためにヘパリンおよびヘパラン硫酸を特異的に分解してオリゴ糖にする試薬、ならびに医療への研究のために使用する試薬としてのこれらの酵素の使用の障害となっている。それゆえ、本発明の目的はヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼIIおよびヘパリナーゼIIIを精製し、そして特徴づける方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は精製および特徴づけしたヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼIIおよびヘパリナーゼIIIを提供することにある。本発明のさらなる目的は精製したパリナーゼIIおよびヘパリナーゼIIIの最適使用条件とペプチドマップを提供することにある。本発明の別の目的は３種のヘパリナーゼのアミノ酸組成を提供することである。本発明の別の目的は、ヘパリナーゼの精製および特徴づけに使用され得るヘパリナーゼＩ、IIおよびIIIに対する抗体を提供することにある。発明の要旨 F．heparinumからの３つの全てのヘパリンリアーゼを同時に、明らかに均質で、混入するリアーゼがないように精製する単一の再現可能な手法を、本明細書中で開示する。ヘパリンリアーゼＩ（ヘパリナーゼ、EC 4.2.2.7）、ヘパリンリアーゼII（EC番号なし）、およびヘパリンリアーゼIII（ヘパリチナーゼ、EC 4.2. 2.8）は、分子量（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による）および等電点（等電点電気泳動による）がそれぞれM_r42,800、pI 9.1-9.2 ，M_r70,800、pI 9.9-10.1を有す。それらのアミノ酸分析およびペプチドマップは、これらのタンパク質はそれぞれ、異なった遺伝子産物であるが非常に関連していることを例証した。ヘパリンリアーゼの反応速度論的特性が決定され、活性および安定性の最適条件も同様に決定された。 Flavobacterium HeparinumからのヘパリナーゼIIの精製と特徴づけが記載される。ミカエリスーメンテン（Michelis-Menton）定数は以下の通りである：ヘパリンリアーゼII（ヘパリンに対して）、Ｖ（max）=15.04、Ｋ_m=9.23μM（0.129m g/ml）:ヘパリンリアーゼII（ヘパラン硫酸に対して）、Ｖ（max）=46.95、Ｋ_m= 43.43μM（0.869mg/ml）。9〜11のpH勾配を用いてアガロースIEFから計算されたリアーゼのおおよそのpIは、8.9付近である。ヘパリンリアーゼIIの（ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対する）最適温度は、35℃である。温度が上昇すれば活性は、さらに高くなるが、安定性が大きく減少する。リアーゼ活性の最適pH：（ヘパリンに対して）、pH=7.3および（ヘパラン硫酸に対して）、pH=6.9。 Flavobacterium HeparinumからのヘパリナーゼIII（EC 4.2.2.8）の精製と特徴づけが記載される。ミカエリスーメンテン定数は、Ｖ（max）=277.01、Ｋ_m=10 9.97μM（0.780mg/ml）。9〜11のpH勾配を用いてアガロースIEFから計算されたリアーゼのおおよそのpIは、9.2であった。ヘパリンリアーゼIII活性の最適温度は、35℃である。酵素の活性は、温度が上昇すればさらに高くなるが、安定性が大きく減少する。ヘパリンリアーゼIIIの最適pHは、pH=7.6である。ヘパリナーゼIIIは、ヘパラン硫酸バックボーンのヘキソサミンーグルクロン酸結合に基質特異性がある。酵素は、モノマー性タンパク質であり、ヘパリナーゼＩおよびII とサイズと活性の点で大きく異なる。ヘパリナーゼIIIを用いて、細胞外マトリックスでヘパリン様鎖を放出することが可能であり、配列決定およびヘパリンに基づく細胞応答を引き出すことができる。塩の影響は、ヘパリナーゼIIまたはヘパリナーゼIIIのどちらにも観察されなかった。４つの異なった塩を用いて、イオンの影響ではなくて塩の影響であることを試験し確かめた。３つのヘパリナーゼに対するモノクローナル抗体の調製および使用の方法もまた記載される。抗体は、個々にそしてグループとしてヘパリナーゼの単離、検出および特徴づけに、そして基質特異性、酵素阻害、および活性部位マッピングを含む研究に役立つ。図面の簡単な説明図１はヘパリンリアーゼのHA-HPLC分画のグラフである。タンパク質（A₂₈₀）は、実線である。ヘパリンに対する活性（単位/ml）（黒丸）およびヘパラン硫酸に対する活性（単位/mｌ）（黒四角）は、集めたピークの部分を示すためにクロスハッチングで示された。図２は、ヘパリンリアーゼのMono-S FPLC分画である：a、ヘパリンリアーゼＩ、およびb、ヘパリンリアーゼIII。矢印は、塩グラジエント溶出の開始を示し、そしクロスハッチングは、集めたピークの部分を示す。図３は、ヘパリンリアーゼのGPC-HPLC分画である：a、ヘパリンリアーゼＩ；b 、ヘパリンリアーII；c、ヘパリンリアーゼIII；およびd、サイログロブリン（ウシ、670,000）、ガンマグロブリン（158,000）、オボアルブミン（44,000）、ミオグロビン（ウマ、17,000）およびシアノコバラミン（1350）からなる分子量標準（M_r）。クロスハッチングは、集めたピークの部分を示す。図４は、還元条件下における12％の不連続ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PA GEである。ヘパリンリアーゼＩ（レーンａ）、ヘパリンリアーゼII（レーンｂ）、ヘパリンリアーゼIII（レーンｃ）、および分子量標準（レーンｄ）を２μgずつ。kDaでの分子量標準を右に示す。図５。パネルＡ：M2-A9を用いたSDS-PAGEゲルのウエスタンブロット。（a）ヘパリンリアーゼＩ；（b）ヘパリンリアーゼII；（c）ヘパリンリアーゼIII；（d ）Flavobacterium heparinum細胞のホモジネート。矢印は、目的のバンドを示す。この分析は、ヘパリンリアーゼの存在（精製されているか、またはホモジナイズした細胞物質に存在するかのどちらかてある）を検出するMAbの能力を例証する。パネルＢ：精製したヘパリンリアーゼのSDS-PAGE分析。（a）ヘパリンリアーゼＩ；（b）ヘパリンリアーゼII；（c）ヘパリンリアーゼIII；（d）分子量マーカー。矢印は、目的のバンドを示す。図６は、ヘパリナーゼIIおよびIIIのトリプシン消化マップである。パネルＡはヘパリナーゼIIであり、そしてパネルＢはヘパリナーゼIIIである。発明の詳細な説明Ｉ。ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの精製および特徴づけ F．heparinum由来の３種のヘパリンリアーゼすべてを同時に精製して、明らかに均質（homogeneity）にする単一の、再現性のあるスキームが、本明細書で記述される。実験操作材料酵素アッセイおよび吸光度測定は、ShimadzuのUV 160分光光度計にFisher Sci entific Isotamp model 9100冷却循環水浴（refrigerated circulating water b ath）を接続して測定した。発酵は、Applikonの２リットルの撹拌タンク発酵器中で行った。遠心分離は、Du PontのGSAローターを用いてSorval RC-5冷却遠心分離で行った。HPLCは、LDC Milton-Roy Constametric IIIGポンプ、Rheodyne 7 125インジエクター、Jule直線グラジエント形成装置（Linear Gradient Former ）、および280nmフィルターを有するISCO UA-5型吸光度モニターを使用して行った。1×5cmガードカラムと直列に接続したヒドロキシルアパタイトHPLCカラム（ 1×30cm）はRegisから入手し、Mono-S FPLCカラムはPharmacia LKB Biotechnolo gy Inc.から入手し、Ｃ₁₈カラムはVydacから入手し、そしてBio-SilゲルパーミエーションHPLCカラムはBio-Radから入手した。キャピラリーゾーン電気泳動システムおよびシリカキャピラリーはDionexから入手した。Mini-Protein II電気泳動チャンバー、1405型水平電気泳動セル、および1420B型電源はBio-Radから入手した。チューブゲル電気泳動装置はE-C Apparatus Corp.から入手した。プレキャストアガロースIEFゲルはIso-labsから入手し、そして既染色分子量マーカーおよびRapid Coomassie^TM染料はDiversified Biotechから入手した。Bio-Gel HTヒドロキシルアパタイトはBio-radから入手し、そしてQAE-セファデックスはS igmaから入手した。圧力濾過ユニット、および25mmおよび43mmのPM-10フィルターはAmiconから入手した。ヘパリン（ブタ粘膜ナトリウム塩）はCelsusから入手し、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥはSeikagakuから入手した。ウシ血清アルブミン、ラクトース、プロタミン（遊離塩基）、ブロモフェノールブルー、ナフトールレッド、シトクロムｃ（ウシ心臓型VA）、ヒアルロン酸、CAPS、ビス−Tris、HEPES、TES、ジチオトレイトール、M0PS、メルカプトエタノール、ヨードアセトアミド、およびトリプシンはsigmaから入手した。タンパク質アッセイのためのクーマシー試薬はBio-Radから入手した。試薬に使用したすべての水は脱イオン化し、ガラス中で蒸留した。アッセイ分光光度計は、特定のリアーゼをアッセイする最適温度に調節した。400μgの基質を含む50mMリン酸ナトリウムバッファー（ヘパリンリアーゼＩのための塩化ナトリウム100mMを含む）を700μlの石英マイクロキュベットで熱平衡化した。所定量のリアーゼを加え、最終容量を400μlとし、そしてこのキュベットを穏やかに撹拌した。このマイクロキュベットを、すぐに分光光度計に戻し、そして23 2nmにおける吸光度を３分にわたってで10秒間隔で測定した。生成物の吸光係数3 800Ｍ^-1を用いて、吸光度／単位時間の変化から活性を測定した。次に、１分間当たりに生成した生成物のマイクロモルをキュベット中のタンパク質のミリグラムで割って、比活性を算出した。ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチン硫酸の分子量として用いたのは、それぞれ14,000、20,000、および25,000である（Rice，K.G.，およびLi nhardt，R.J.（1989）Carbohydr．Res．190，219-233）。タンパク質濃度はBrad fordアッセイ（Bradford，M.M.（1976）Anal．Biochem．72，248-254）によって、ウシ血清アルブミン標準曲線に基づき測定した。発酵および酵素の回収 F.heparinum（Payza，A.N.，およびKorn，E.D.（1956）Nature177，88-89）（ ATCC 13,125）を−70℃で、ジメチルスルホキシド（Me₂SO）を含有する定義された培地中に保存した（Zimmermann，J.J.，Oddie，K.，Langer，R.，およびCoone y，C.L.（1991）Appl．Biochem．Biotech．30，137-148）。この微生物を、２リットルの撹拌タンク発酵器中で、ヘパリンを唯一の炭素源として、Galliher，P. M.，Cooney，C.L.，Langer，R.S.，およびLinhardt，R.J.（1981）Appl．Enviro n．Microbiol.41，360-365の方法によって定義された培地中で増殖させた。５リットルの発酵ブロスから、４℃で15分間、12,000×gの遠心分離によって、80gの湿細胞ペレットが得られた。このペレットを、pH7.0で４℃の10mMリン酸ナトリウムバッファー500ml中に懸濁した。細胞懸濁液（１回に20ml）を50mlのステンレススチールカップに入れ、そして冷却しながら10分間、100ワットで、40％パルスモードで超音波処理した。破壊された細胞を４℃で30分間、12,500×ｇで遠心分離して、そしてペレットを捨てた。超音波処理および遠心分離によって得られた上清500mlはタンパク質16.3mg/mlを含んでいた。プロタミンを含まない塩基（2.0g）を10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）20ml中に溶解し、そして上清500ml中に撹拌しながら滴下した。10,0 00×ｇ、４℃で20分間の遠心分離によって沈澱したDNAを除去し、そして上清510 mlを得た。 F.heparinum由来のヘパリンリアーゼの精製バッチのヒドロキシルアパタイト吸着および脱離 15.6mg/mlのタンパク質を含有する上清510mlを凍結せずに直接使用し、250ml のポリプロピレン製遠心分離容器４個に等量づつ分けて、氷浴中に置いた。乾燥ヒドロキシルアパタイト（HA）（20g）を各容器に加え、穏やかに撹拌し、1000 ×ｇ、４℃で２分間の遠心分離によって軽く凝縮し、そして上清をこのHAマトリックスからデカントした。次いでHA結合タンパク質を、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム濃度を上昇させたバッファー中に再懸濁させ、そして遠心分離によって再び凝縮した。上清をマトリックスから再びデカントし、そして酵素活性およびタンパク質濃度についてアッセイした。HAマトリックスを洗浄するために使用したバッファーは、pH6.8の10mMリン酸ナトリウムバッファーと、500mM塩化ナトリウムを含むpH6.8の250mMリン酸ナトリウムバッファーとを４℃において、 6:0、5:1、4:2、3:3、2:4、および0:6（v/v）比で混合することによって調製した。タンパク質上清溶液を分子量カットオフが14,000 の透析チューブに入れ、４℃で終夜、pH7.0の50mMのリン酸ナトリウムバッファーに対して透析した。 QAE-セファデックスクロマトグラフィーバッチHAによって精製されたリアーゼ活性を、凍結せずに、ただちに使用した。エチル４級アンモニウム（QAE）−セファデックスクロマトグラフィー工程は４℃で行った。ヘパリンに対する活性が89％を超え、そしてヘパラン硫酸に対する活性が88％を超えるHA精製画分３バッチ（4:2、3:3、および2:4）（総容量1.5 リットル）を合わせて（1.81mg/mlタンパク質、およびヘパリンに対して1.72単位/mlおよびヘパラン硫酸に対して2.16単位/ml）、そして600mLのQAE-セファデックスを含む３本のカラム（2.5×20cm）に等量かけた。このQAE-セファデックスカラムはあらかじめ、50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0、４℃）で平衡化しておいた。次に、各カラムを１カラム容量の50mMリン酸バッファー（pH7. 0、４℃）で洗浄した。相互作用することなくカラムを通過した、リアーゼ活性を含む画分を集め、そして合わせた。次に、この2.6リットルの溶出液を、43mm のPM-10膜（カットオフ分子量10,000）を使用し、Amicon圧力濾過によって、60p si、４℃で、63ml（タンパク質8.23mg/mlを含有する）まで濃縮した。ヒドロキシルアパタイトHPLC QAE-セファデックス精製し、そして濃縮した溶液63mlを5mlのアリコート１２個に分け、そして必要になるまで−70℃で保存した。5mlの試料１個（タンパク質43mg）を冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして5mlループを使用してHA のHPLCカラムにインジェクトした。このHA=HPLCカラムは50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で平衡化しておいた。試料をロードした後、カラムを50mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）を用いて、0.5ml/分で20分間洗浄した。カラムを溶出するために、50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）から、750mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）までの直線グラジエント60mlを使用した。溶出は280nmで連続的にモニターした。グラジエントが完了した後、1M塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム）（pH7.0）5.0 mlでカラムを洗浄し、強く結合したタンパク質を除去し、そして次に50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で再平衡化した。この分画工程を、残りの11個のアリコートについて繰り返した。12画分それぞれからのヘパリンリアーゼＩ、ヘパリンリアーゼII、およびヘパリンリアーゼIIIに対応する画分をプールし、5 0mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）20容量に対して12時間、４℃で透析し、そしてPM-10膜を装備したAmicon圧力濾過を使用して、60psi、４℃で濃縮した。この３種のリアーゼ調製物を各々1mlのアリコートに分け、そして−70℃で凍結した。ヘパリンリアーゼＩおよびIIIのMono−S FPLC HA-HPLCから単離された、濃縮されたヘパリンリアーゼＩ調製物およびヘパリンリアーゼIII調製物を−70℃の冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、そして50m Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で平衡化したMono-S FPLC HR 5/5カチオン交換カラムにかけた。1.75mgのタンパク質を含有する、各リアーゼ調製物の一部（350μl）をインジェクトし、そして50mMリン酸ナトリウムバッファー（H7.0 ）によって、1ml/分で５分間、カラムを洗浄し、相互作用しないタンパク質を溶出した。50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）から500mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）までの直線グラジエントを使用し、そして溶出を280nmでモニターした。活性なヘパリンリアーゼＩ画分およびヘパリンリアーゼIII画分を４℃で、200mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）に対して12時間、透析し、そしてPM-10膜（カットオフ分子量10,000）を用いたAmico n圧力濾過を使用して濃縮した。ゲルパーミエーションHPLC Mono-S FPLCから得られたヘパリンリアーゼＩおよびIII調製物、およびHA-HPL Cから得られたヘパリンリアーゼII調製物を、200mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で平衡化しておいたBio-Silゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC）HPLCカラム（１×25cm）にかけた。各リアーゼをインジェクトし（ヘパリンリアーゼＩおよびIIIの場合、タンパク質800μgを含有する試料250μl；ヘパリンリアーゼIIの場合タンパク質1.5mgを含有する試料200μl）、流速１ml/分で溶出し、そして280nmにおける吸光度を測定した。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIについて、この分離を５回繰り返した。活性画分を一緒にプールし、そしてリアーゼ活性およびタンパク質濃度をアッセイした。各ヘパリンリアーゼを50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7. 0）に対して透析し、60psi、４℃で、25mmのPM-10膜（分子量カットオフ10,000 ）によって圧力濾過することにより濃縮し、そしてさらに10μlのアリコートに分けて、−70℃で保存した。３種のヘパリンリアーゼの特徴づけ電気泳動による純度の評価 Laemmli，U.K.（1970）nature 227,680-685に記載された操作を少し変えて、３種のヘパリンリアーゼについて非連続的なSDS-PAGEを行った（図４）。ゲルを 12％（w/v）トリクロロ酢酸で固定し、脱イオン蒸留水ですすぎ、そしてRapid C oomassie染料溶液によって染色し、そして脱色した。あらかじめ成形したアガロースゲル（85×100mm）上で、IEFゲル電気泳動を行った。２つの電極芯を1Mリン酸（アノライト）および1M水酸化ナトリウム（カソライト）で濡らした。５ワットで５分間、次いで10ワットで１時間、電圧が1200 Ｖで一定になるまで、電気泳動した。このゲルを、15％トリクロロ酢酸水溶液でただちに固定し、ブロットし、そして水ですすぎ、終夜乾燥し、クーマシーG-25 0で染色し、そして脱色した。連続的な酸−尿素ゲル電気泳動を10％ポリアクリルアミドチューブゲル中で行った（Panyim，S.，およびChalkley，R．（1969）Arch．Biochem．Biophys．130 ，337-346）。ヘパリンリアーゼＩ〜III試料（10μg）を、グリセロールおよびナフトールレッドを追跡染料（tracking dye）として含有する酸−尿素バッファー中で調製した。2.5mA/チューブゲルの定常電流で電気泳動した。100μgのシトクロムｃ標準（茶色のバンド）がチューブの底に来るまで、タンパク質をカソードに向かって約２時間泳動させた。染色および脱色は、SDS-PAGEで記載したのと同様に行った。３種のヘパリンリアーゼに対するキャピラリーゾーン電気泳動はDionexキャピラリー電気泳動システムを用いて、375μm×70cmキャピラリーで、既に刊行されているタンパク質分析方法（Lauer，H.H.，およびMcManigill，D．（1986）Anal ．Chem．58，166-170）によって、10mM塩化カリウムを含有する20mMのCAPS（pH1 1.0）中で、20kVで、室温で行い、そして検出は280nmの吸光度で行った。各々2. 74、2.07、および2.45mg/mlのヘパリンリアーゼＩ〜III試料（20nl）をそれぞれ分析した。逆相HPLC 逆相（RP）HPLC（HP-1090 Hewitt Packard，CA）はVydac Ｃ₁₈カラムを用いた（Sasisekharan，R．（1991）博士論文、Flavobacterium heparinumからのヘパリナーゼのクローニングおよび生化学的特徴づけ、Harvard University）。精製された各酵素１nmolを RP-HPLCカラムにインジェクトし、そして0.1〜１のTFA、H₂Oの０〜80％アセトニトリルのグラジエントで、120分間溶出した。これらの溶出プロファイルを210nm および280nmでモニターした。酵素のピークを単離してアミノ酸の組成分析を行い、そしてペプチドマッピングのためにトリプシンで消化した。トリプシンによるペプチドマッピング RP-HPLC精製された各酵素１ナノモルを、400mM炭酸アンモニウムおよび5mMジチオトレイトールを含有する8M尿素50μl中、50℃で変性した（Sasisekharan，R ．（1991）博士論文）。室温まで冷却した後、このタンパク質を、10mMヨードアセトアミドで、15分間、暗所でアルキル化した。全反応容量は200μlであった。各リアーゼ溶液にトリプシン（４％、w/w）を添加し、そしてこのタンパク質を3 7℃で24時間、消化した。タンパク質分解は、65℃で２分間加熱することによって停止させた。各消化により形成されたペプチドは完全に可溶であり、そしてこれをRP-HPLCカラムにインジェクトし、そして０〜80％アセトニトリルのグラジエントで120分間、溶出した。トリプシンによる（tryptic）ペプチドマップを28 0nmでモニターした。アミノ酸の組成分析およびＮ末端分析アミノ酸の組成分析をマサチューセッツ工科大学のバイオポリマー研究所（Ma ssachusetts Institute of TechnologyのBiopolymers Laboratories）において、Applied Biosystems 420/130型Derivatizer/Amino Acid Analyzerで、フェニルイソチオシアネートによるプレカラム誘導体化化学反応を用いて行った。試料の気相加水分解をWaters Pico Tag Hydrolysis workstationを用いて行った。プレカラム誘導体化において、遊離のアミノ酸がフェニルイソチオシアネートと結合し、フェニルチオカルバミルアミノ酸を形成し、これは逆相カラムから溶出されると254nmで検出される。加水分解は、6N塩酸、0.1％フェノールを用いて、15 5℃で１時間、または100℃で22時間のいずれかで行った。タンパク質が完全に加水分解され、アミノ酸残基の分解が最小であることを確実にするために、36時間または48時間の加水分解時間もまた、試験した。Ｎ−末端分析は１nmolのヘパリンリアーゼＩ〜IIIで行った。活性に対するpHの影響コハク酸（4.0〜6.5）、ビス−トリスプロパン（BTP）-HCl（6.5〜9.0）、および、Tris-HClおよびリン酸ナトリウムの両方（6.0〜7.5）を用いて、各リアーゼに対して最適な活性のpHを得た。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIアッセイ溶液を、精製されたリアーゼの試料10μl（タンパク質濃度２〜３mg/ml）をリン酸ナトリウムバッファー（50mM、pH7.0）で希釈することによって作成し、そしてアッセイのために必要になるまで氷上に置いた。次に、各リアーゼの活性（Ｉはヘパリンに対して作用、IIはヘパリンとヘパラン硫酸の両方に対して作用、そしてIIIはヘパラン硫酸に対して作用）を異なるpH値において求めた。最適活性のためのバッファーの選択各ヘパリンリアーゼに対して最適な活性を与えるバッファーは、先の実験で算出された最適pHの近傍での緩衝能についてバッファーをテストすることによって選択した。これらのバッファーは：Tris-HCl、リン酸ナトリウム、HEPES、MOPS 、TES、およびBTP-HClである。各バッファーは50mMで調製し、そしてそのpHは塩酸または水酸化ナトリウムで、ヘパリンに作用するヘパリンリアーゼIIについては6.9、ヘパリンリアーゼＩについては7.15、ヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼIIについては7.3、およびヘパリンリアーゼIIIについては7.6に調製した。ヘパリンリアーゼアッセイ溶液は、酵素を、上記の適切なpHに調節した50mM リン酸ナトリウムバッファー中で希釈することによって作成した。ヘパリンリアーゼ活性を、各バッファーについて求めた。各バッファーの添加直後およびそれに続く24時間、37℃のインキュベーションの後の両方で、活性をアッセイした。活性に対する２価金属および添加する塩の影響 BTP-HClバッファー（50mM）を、10mM塩化カルシウム、10μM または１mMの塩化銅（II）、10μMまたは１mMの塩化水銀（II）、および１mM塩化亜鉛（II）のいずれかを含有するように調製した。各溶液を、リアーゼをテストするための最適pHに調節し、そしてヘパリンリアーゼの活性を、２価金属の存在下または非存在下で測定した。最適活性のための塩濃度を研究した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、および、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムを用いて、イオン強度と特定のイオンの影響（specific ion affects）とを区別した。添加する塩の濃度は50mMリン酸ナトリウムバッファー中０から500ｍＭまでの間で変化させて調製し、その後、pHを各酵素の最適値に調節し、そしてヘパリンリアーゼ活性を測定した。最適活性のための温度最適活性のための温度を、各ヘパリンリアーゼについて、それらの最適pHにおいて、リン酸ナトリウムバッファー（ヘパリンリアーゼＩアッセイバッファーは 100mMの塩化ナトリウムを含有する）中で、15℃から55℃の間５°づつ温度上昇させて求めた。温度は温度調節分光光度計中で調節し、そして10分間、平衡化してからアッセイを開始した。温度安定性の最適値リアーゼアッセイのストック溶液を適切なバッファー中で調製し、そして以下の温度で水浴中に置いた：ヘパリンリアーゼＩは30℃、ヘパリンリアーゼIIは35℃、そしてヘパリンリアーゼIIIは35℃ および40℃。種々の時間間隔（１〜22時間）をおいて、アリコートを一部取り出して、残存する酵素活性を測定した。速度定数の決定上記の最適化された条件を用いて、ミカエリスーメンテン定数を求めた。トータルのポリマー分解の最終吸光度を20で割って、反応が５％完了したことを表す値を求めた。精製されたリアーゼ調製物を希釈して、トータルのポリマー分解の５％が、わずか３分間のアッセイの終わりには達成されるようにした。各リアーゼおよびその基質についての特定のモル濃度における反応速度を、Perella,F.W. （（1988）Anal．Biochem．174，437-447）のEZ-FIT双曲線カーブフィッティングプログラムを用いて速度論的に分析した。基質溶液は、50mg/mlヘパリンおよび40mg/mlのヘパラン硫酸ストック溶液から調製した。これらの定数は、ヘパリンリアーゼＩについては、30℃で、100mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.15）で、そしてヘパリンリアーゼIIについては35℃ で、ヘパリン対してはpH7.3の50mMリン酸ナトリウムバッファーで、そしてヘパラン硫酸に対してはpH6.9の50mMリン酸ナトリウムバッファーで、そしてヘパリンリアーゼIIIについては35℃で50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.6）で求めた。複合多糖類に対するヘパリンリアーゼの活性各ヘパリンリアーゼを、複合多糖類溶液（1mg/ml）に、最適化されたアッセイ条件下て添加し、反応を232nmで30分間モニターした。使用した精製されたリアーゼの量は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸基質を30分以内に完全に分解するのに充分であった。各多糖類の分解の初期速度を測定し、次いで、この反応を24時間続け、そして多糖類の分解の最終レベルを、232nmにおける最終吸光度を測定し、そして活性パーセントで表現することによって評価した。ヘパリンリアーゼの安定性凍結解凍および凍結乾燥に対するヘパリンリアーゼの安定性を、２種の賦形剤、すなわち2mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）、および0.5wt%のラクトースを用いて研究した。各リアーゼを、50mMリン酸ナトリウムバッファー、2mg/mlのBS Aを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファー、または0.5％のラクトースを含有する50mMリン酸ナトリウムバッファーのいずれかに、濃度１〜３単位/mlで溶解した。これらのリアーゼ溶液を３つの等量のアリコートに分け、そして各々のうち１つを、凍結解凍、凍結乾燥、または対照として氷浴中に保持のいずれかで保存した。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIの活性を賦形剤の存在下または非存在下で、以下の後に求めた：1）４℃で短期間貯蔵；2）−70℃で凍結し、そして解凍；および3）−70℃で凍結し、凍結乾燥し、そして等量の冷水で再構成。結果超音波処理による、最適化されたF.heparinumの細胞溶解は、遊離した酵素が失活しない40％パルスモードを用いて100ワットで10分間で達成された。プロタミンによる沈澱によって、全活性および比活性の両方を42倍増加し、タンパク質濃度は減少しなかった。これはヘパリンリアーゼを競争的に阻害し得る多価アニオン性核酸の除去によるものと思われる。バッチのHA精製工程は、タンパク質濃度、およびヘパリン／ヘパラン硫酸代謝に関連する他の夾雑物の活性を大幅に減少させるが、３種のヘパリンリアーゼ活性を分離しない。QAE-セファデックスを使用して混入した酸性タンパク質を除去する。HA-HPLCは、３種のリアーゼ活性を分離する。図１に示すように、塩化ナトリウムの直線グラジエントを用いて、ヘパリンリアーゼＩ〜IIIを、それぞれ塩化ナトリウムが330mM、555mM、および4 35mMのところで溶出させる。コンドロイチン／デルマタン硫酸リアーゼもまたこの細菌中に見いだされるが、これらはグラジエントの最後、ヘパリンリアーゼII のすぐ後でHA-HPLCカラムから溶出される。この手法によって、タンパク質濃度を低減しながら全ヘパリンリアーゼ活性が良好に回収される。図２に示すように、ヘパリンリアーゼＩおよびIIIを、カチオン交換FPLCによって、さらに精製した。ヘパリンリアーゼＩは、活性を良好に保持しながら回収され、そしてタンパク質濃度は大幅に減少した。ヘパリンリアーゼIIIの比活性は、Mono-S FP LCを使用しても改良されず、全活性の実質的な減少が示された。しかし、SDS-PA GE分析によって、この工程の後、ヘパリンリアーゼIIIの純度の向上が明らかになった。ヘパリンリアーゼIIはMono-S FPLCによって精製されなかった。なぜならカラムと結合しないからである。図３に示すように、最終精製工程において、ヘパリンリアーゼＩ〜IIIはGPCを用いて分画された。 GPCの後、各ヘパリンリアーゼ調製物は、均質であることが、SDS-PAGE、酸− 尿素PAGE、IEF、キャピラリーゾーン電気泳動、および逆相HPLCによって示された。SDS-PAGEによるヘパリンリアーゼＩ〜IIIの推定分子量は、それぞれ42,800 、84,100、および70,800であった。３種のヘパリンリアーゼについてこの精製スキームを用いて得られた結果を、表Ｉにまとめる。ヘパリンリアーゼＩは、細胞ホモジネートに比べて3400倍精製された。このスキームは、質量基準の全収率0.03％、全活性回収率を基準とした収率10.8％を与え、そして比活性130単位/mgであった。ヘパリンリアーゼIIは細胞ホモジネートに対して5200倍精製され、質量基準の収率は0.02％であった。この酵素は、ヘパリンに対して比活性19単位/mgを有し、全活性回収率1.02％であった。この酵素調製物はまた、ヘパラン硫酸に対して、比活性36.5単位/mgを有し、全活性回収率1.54％であった。ヘパリンリアーゼIIIは細胞ホモジネートに対して5100倍精製され、質量基準の収率0.02％であり、全活性基準の収率2.74％であり、そして比活性63.5単位 /mgであった。ヘパリンリアーゼ純度および物理的性質の特徴づけ３種のヘパリンリアーゼの物理的、速度論的、および安定性の性質を研究した。非連続SDS-PAGE（Laemmli，U.K.（1970））によって、この３種のヘパリンリアーゼが明らかに均質であることが例証された。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIの分子量は、それぞれ42,800、84,100、および70,800と推定された。β−メルカプトエタノールを用いない非還元SDS-PAGEは、同様のバンドパターンを明らかにし、これはサブユニットが存在しないことを示唆する。３種のヘパリンリアーゼの等電点を求め、そしてその純度を評価するために、IEFを使用した。種々のpHグラジエント（pH３〜10、７〜10、および8.5〜10.5）を用いたIEFは、３種のリアーゼについての正確なpI値を与えなかった。３種のリアーゼがそれぞれ、カソードに非常に近い位置に移動したからである。次に、pHグラジエントが９〜11のアガロースゲルを用い、シトクロムｃ標準（pI＝10.25）のバンドの下の３つのタンパク質をフォーカシングした。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIについて測定されたpI 値は、それぞれ、9.1〜9.2、8.9〜9.1、そして9.9〜10.1であった。panyim，s. ，およびChalkley，R.（1969）の方法を用いたチューブゲル中での尿素−酢酸PA GEによって、３種のヘパリンリアーゼの均質性が確認された。各ヘパリンリアーゼのキャピラリーゾーンエレクトロフェログラム（electropherograms）（Lauer ，H.H.，およびMcManigill，D.（1986））は、単一の対称なピークを与える。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIは、それぞれ、移動時間12. 7分、12.4分、および13.4分であった。 RP-HPLCを使用して３種のヘパリンリアーゼを脱塩し、アミノ酸組成分析およびペプチドマッピングのためのトリプシン消化に供した。（Sasisekharan，R．（1991）博士論文）。興味深いことに、各クロマトグラムは、異性体の存在を示唆する非常に近接した二重のピークを示し、これはおそらく翻訳後修飾によるものであろう。ヘパリンリアーゼＩ、II、およびIIIの異性休についてのアミノ酸分析は同一であった。異性休は、親水性がわずかに異なり、これはおそらく、グリコシル化またはホスホリル化のようなある種の翻訳後修飾によるものと思われる。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIの主要な異性体は、RP-HPLCにおいてそれそれ保持時間38.5分、44.3分、および42.7分であった。各ヘパリンリアーゼに対応する主要なRP-HPLCピークを、トリプシンで徹底的に処理して、ペプチドフラグメントを調製した。これらのペプチドフラグメントを、再び、RP-HPLCを用いて分析した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、各リアーゼのペプチドマップは、いくつかの共通なペプチドフラグメントが観察されるとはいえ、明らかに異なる。３種のヘパリンリアーゼのアミノ酸分析を表11に示す。Ｎ−末端アミノ酸は修飾され、それゆえ、３種のリアーゼすベてについてのアミノ酸配列決定によって検出され得ない。このアミノ酸組成物およびペプチドマッピングは、ヘパリンリアーゼＩ〜III は異なる遺伝子産物であり、そしてヘパリンリアーゼＩおよびIIIは、単に、より大きなヘパリンリアーゼIIから翻訳後処理によって生成されたものではないことを示す。このリアーゼはすべて、このリアーゼの高い等電点に寄与し得る多量のリシンを含む。ヘパリンリアーゼＩのアミノ酸組成を用いたコンピューターモデル化によって等電位点の計算値9.33が与えられ、これは等電点フォーカシングを用いて得られた実験値と一致した。ヘパリナーゼII（84,000ダルトン）については727アミノ酸と仮定され、そしてヘパリナーゼIII（70,000ダルトン）については636アミノ酸と仮定される。Cys およびTrpは報告されない。ヘパリンリアーゼについての最適な触媒活性の特徴づけ３種のヘパリンリアーゼの各々についての最適な反応条件を、一連の実験によって求めた。最初に試験したパラメータは最適pHであった。ヘパリンリアーゼＩおよびIIについてはヘパリン濃度2.5mg/ml、およびヘパリンリアーゼIIおよびII Iについてはヘパラン硫酸濃度1.0mg/mlが、刊行されている値（14、26）および予備実験に基づいて十分であることが示された。反応温度37℃は、最初に、文献に報告されている値の平均値として選択した（Linhardt，R.J.，Turnbull，J.E. ，Wang，H.M.，Loganathan，D.，およびGallagher，J.T.（1990）；Silva，M.E. ，Dietrich，C.P.，およびNader，H.B．（1976）；Yang，V.C.，Linhardt，R.J. ，Berstein，H.，Cooney，C.L.，およびLanger，R．（1985））。この温度は、その後、各リアーゼについての最適値が決定した後で修正した。決定したpH最適値は、リアーゼＩについてヘパリンに対して7.15であり、リアーゼIIについてヘパリンに対して7.3、およびヘパラン硫酸に対して6.9であり、そしてリアーゼIIIについてヘパラン硫酸に対して7.6であった。各ヘパリンリアーゼについて最適な活性を与えるバッファーは、各々、研究する酵素および基質のための最適pHに調節した、６種の異なるバッファーを用いて選択した。ヘパリンリアーゼＩは、Tris-HClおよびBTP-HCl中で同様の初期反応速度を示し、リン酸ナトリウム中で中程度の活性を示し、そしてMOPS、TES、およびHEPES中で低い活性を示した。各バッファー中で37℃で24時間インキュベートしたところ、活性は初期値の１〜20％にまで低下した。MOPS、 TES、およびHEPES中でインキュベートしたヘパリンリアーゼＩは、活性のほとんどを保持した。ヘパリンに対するヘパリンリアーゼII活性は、６種のバッファーすべてにおいて、きわだって同様であった。しかし、ヘパラン硫酸に対して作用する場合、ヘパリンリアーゼIIはまた、MOPS、 TES、およびHEPES中における活性が顕著に低下することを示した。各バッファー中でインキュベートした後、MO PS、TES、およびHEPESは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対して、ヘパリンリアーゼII活性を最も保護することが分かった（30〜70％の活性を保持）。ヘパリンリアーゼIIIは、研究した６種のバッファー中において、ほんのわずかの活性の違いを示した。MOPSおよびHEPESは、インキュベーションの後、ヘパリンリアーゼIIIの活性を保護した（15〜30％の活性を保持）。ヘパリンリアーゼの初期反応速度に対するカルシウム、銅（II）、水銀（II）、および亜鉛（II）イオンの影響を、先行文献（Silva，M.E.，Dietrich，C.P. ，およびNader，H.B．（1976）；Hovingh，P.，およびLinker，A．（1970））に基づいて検討した。これらのイオンとの適合性のためBPT-HClバッファー（50mM ）を選択した。最適活性のためのイオン強度（０〜500mM）を、各ヘパリンリアーゼについて、50mMリン酸ナトリウムバッファー中でその最適pHで検討した。塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、および酢酸カリウムは、同じイオン強度において共通した活性を与えた。ヘパリンリアーゼＩは、塩濃度の増加に応じて活性の増加を示し、100mMで最適な活性を示した。ヘパリンリアーゼIIおよびIIIは各々、添加した塩の濃度が増加するにつれて活性の低下を示す。400mMの塩において、ヘパリンリアーゼＩ〜IIIの活性は、ほぽ完全に阻害された。ヘパリンリアーゼについての最適活性の温度は、50mMリン酸ナトリウムバッファー中で、その最適pH（ヘパリンリアーゼＩは100mM塩化ナトリウムを含む）で、15℃と55℃との間の温度を用いて、決定した。最大活性の温度はヘパリンリアーゼＩについて35℃であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用するヘパリンリアーゼIIについて40℃であり、そしてヘパリンリアーゼIIIについては45 ℃であった。ヘパリンリアーゼについての温度安定性最適値は、熱失活が、速度定数を求めることを目的とする実験に影響しないことを確実にするために、確立した。ヘパリンリアーゼＩおよびIII（タンパク質濃度650ng/ml）は活性の指数関数的な減少を示した。ヘパリンリアーゼＩは30℃、５時間でその活性の80％を失った。ヘパリンリアーゼIIIは、35℃および40℃、3.5時間および0.5時間で、それぞれ、その活性の80％を失った。ヘパリンリアーゼII（タンパク質濃度１〜２μg/ml）は、より活性の低下が緩慢であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に対して、35℃、25時間で、その活性の70％を保持していた。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIに対する、他のすべての実験において、30、35、および35℃をそれぞれ使用し、酵素の安定性を維持しながら、高い活性を保持した。ヘパリンリアーゼは、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸に対して0. 5％未満の活性を示し、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｄ、およびＥに対する活性を示さなかった。ヒアルロニダーゼ活性、グルクロニダーゼ活性は観察されず、そして0.5％未満のスルファターゼ活性が観察された。３種のヘパリンリアーゼの特異性を、それらの多糖類基質を用いて試験した。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の分解の初期速度、および最終レベルを測定した。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIは、それぞれ、平均してヘパリンポリマーの７、14、および１部位に作用し、そしてヘパラン硫酸ポリマーの５、25、および20部位に作用した。ヘパリンリアーゼIIは、ヘパラン硫酸に対し、ヘパリンに対して観察される初期速度の1.7倍の速度で作用した。オリゴ糖産物が、強いアニオン交換H PLCおよびグラジエントPAGE（Linhardt，R.J.，Turnbull,J.E.，Wang，H.M．Log anathan，D.，およびGallagher，J.T．（1990））によって分析されるオリゴ糖マップを、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して作用する各ヘパリンリアーゼについて調製した（Lohse，D.L．（1992）博士論文、Flavobacterium Heparinumのヘパリンリアーゼ、The University of Iowa）。これらのデータは、図５に示すヘパリンリアーゼＩ〜IIIについての特異性と一致する。ヘパリンリアーゼについてのミカエリス−メンテン定数の決定ミカエリス−メンテン定数は、最適反応条件を用いて、10％未満が消費される各基質濃度における反応速度を計算するために設計された実験によって求めた（表III）。ヘパリンリアーゼの安定性ヘパリンリアーゼの最適な貯蔵条件の研究が必要であった。なぜならこれらの酵素の不安定性を例示する文献が多いからである。賦形剤の非存在下において、１回の凍結−解凍および凍結−乾燥の後、４℃で貯蔵されたヘパリンリアーゼＩは、それぞれ、50、45、および25％の活性を保持していた。2.0mg/mlのBSAの添加によって貯蔵安定性が向上し、その結果85％を超える活性が保持され、同様に、５％のラクトースの添加によって活性が40〜80％保持された。ヘパリンリアーゼIIは、すべての貯蔵条件下で75％を超える活性を保持し、そしてBSAまたはラクトースの添加によって、追加される安定性はわずかであった。ヘパリンリアーゼIIIは凍結−解凍および凍結乾燥に対して、非常に不安定である。ヘパリンリアーゼIIIは、40℃での短期間の保存ではその活性のほとんどを保持するが、凍結−解凍または凍結−乾燥では70〜80％を失う。BSAの存在によって活性は20〜2 5％回復するが、ラクトースを添加するとヘパリンリアーゼIIIは不安定となる。ヘパリンリアーゼＩについて算出された最適pHは7.15であった。この値は、Ya ngら（1985）によって、そしてLinkerおよび共同研究者（HovinghおよびLinker ，（1965および1970））によって報告されたpH6.5よりも高かった。両グループとも、そのリアーゼ調製物を６時間までの時間を用いてアッセイし、ここでは熱不安定性がファクターとなり得る。本研究で用いた最大時間は、わずか３分間であった。ヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼIIのpH最適値は6.9 であった。ヘパリンリアーゼIIIについてのpH最適値は7.6であった。HovinghおよびLinker、ならびにDietrichおよびその共同研究者は、この酵素についてのpH 最適値は6.0と7.0との間であることを報告した。再度述べるが、両グループによって使用されたアッセイ時間間隔は６時間までであり、熱不安定性はこれらの値の間の差異の原因となり得る。ヘパリンリアーゼＩの活性は、１mM亜鉛によってわずかに減少し、そして10μ Mおよび１mMの水銀および１mMの銅によって顕著に減少した。10mMのカルシウムは活性を30％増加させた。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用するヘパリンリアーゼIIの、２価の金属イオンの存在下における活性は、10μMの銅の場合を除いて、すべてのテストされた金属によって阻害されることが示された。カルシウムでさえ、ヘパリンリアーゼII活性を劇的に減少させる結果となった。ヘパリンリアーゼIIIはカルシウムによって活性化され（20％）、銅および水銀（両者とも10μM）によって影響をうけず、そして亜鉛、水銀、および銅（すべて１m M）によって阻害された。一般に２価金属イオンの添加は、ヘパリンリアーゼの活性を低下させた。ヘパリンリアーゼＩの最適活性は、イオン強度100mMにおいて観察された。ヘパリンリアーゼIIおよびIII活性は塩濃度が増加するにつれ、減少した。表IIIに、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に作用するヘパリンリアーゼＩ〜IIIについての見かけのミカエリス−メンテン定数をまとめた。ヘパリンリアーゼＩについての見かけのＫ_m値が0.3〜42μMの範囲であること、およびＶ_maxが19.7μmo l/分/mgタンパク質であることが報告されている（Riceら、（1989）；Yangら、（1985）；Lindhardt，（1984））。ヘパリン硫酸に作用する精製されたヘパリンリアーゼIIIの見かけのＫ_mが5.7μMであり、そしてＶ_maxが3.57×10^-3μmol/ 分であることが報告されている（RiceおよびLindhardt，（1989））。ヘパリンリアーゼＩおよびIIはヘパリンおよびヘパラン硫酸の両方に作用し、他方ヘパリンリアーゼIIIはヘパラン硫酸のみに作用する。３種の酵素すべてがエンド型で作用する。しかし、ポリマー内のすべての切断可能な部位が等しく作用されやすいわけではない（Cohen,D.M.およびLidhardt，R.J.（1990）Biopolym ers 30，733-741）。これらのポリマー性基質内の、各酵素で切断される主要な（primary）結合はオリゴ糖マッピング実験から推定された。ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対するヘパリンリアーゼＩ〜IIIの特異性はそれらの部分的に精製された、工業的に調製された対応物について、先に報告された特異性と同一である。同等の部位を有するオリゴ糖基質（すなわち、四糖類および六糖類）は基質となりにくい。四糖類基質に作用するヘパリンリアーゼＩおよびIIIについて測定されたＶ_max／Ｋ_mは、ポリマー基質について測定されたＶ_max／Ｋ_mのわずか0. 01〜１％である。ヘパリンリアーゼＩ〜IIIのデルマタンおよびコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅに対する作用もまた研究した。これらの基質は、硫酸エステル化（sulfation）の位置および度合い、およびそのウロン酸のキラリティーが異なる。これらの酵素が、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸に対してわずかに活性であることは、ヘパリンリアーゼに混入物があるか、あるいはこれらの基質が少量のヘパリンまたはヘパラン硫酸を含有していることを示唆した。この２つの可能性を区別するために、反応を長時間にわたって追跡した。最初は、すべての活性が観察され、その後、基質は、新鮮な酵素の繰り返し添加に対して安定になった。このことにより、観察されるわずかな活性は、基質が混入した（コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫酸中に約１％のヘパリン／ヘパラン硫酸が混入）ことに起因するものであり、酵素が混入したことによるものではないことが確認された。ヘパリンリアーゼはいずれも、ヒアルロン酸に対する活性を示さなかった。ヘパリンリアーゼがこれら他のグリコサミノグリカンに対して作用しないということは、ヘパリン／ヘパラン硫酸に対するその特異性、およびリアーゼ活性の混入がないことの両方を、明白に示している。精製されたリアーゼには、グルクロニダーゼ活性（Warnick，C.T.，およびLinker，A．（1972）Biochemistry 11，568-572 ）は観察されず、そして0.5％未満のスルファターゼ活性（McLean，M.W.，Bruce ，J.S.，Long，W.F.，およびWilliamson，F.B．（1954）Eur.J.Biochem．145，6 07-615）が検出された。 II．ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼII、およびヘパリナーゼIIIに対するモノクローナル抗体の調製ヘパリンリアーゼＩをマウスに注射し、そしてそのＢリンパ球を使用して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成した。３種の各ヘパリンリアーゼに対するモノクローナル抗体（mAb）の特異性を試験した。材料および方法抗体産生のためのヘパリンリアーゼの調製上記のように、ヘパリンリアーゼＩ、II、およびIIIをFlavobacterium hepari numから単離し、そして均質に精製した。ヘパリンリアーゼ濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキット（Richmond，CA，U.S.A.）を使用して測定した。モノクローナル抗体の調製６つのモノクローナル抗体（mAb）を調製した。簡単に述べると、精製されたヘパリンリアーゼＩを、70日間にわたって３回、マウスに注射した。マウスの脾臓を取り出し、そして脾臓細胞混合物からリンパ球を単離した。このリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを生成した。このハイブリドーマを培養し、そしてヘパリンリアーゼＩに対する抗体の産生についてスクリーニングした。ヘパリンリアーゼＩに対するmAbを産生することが見いだされた６つのハイブリドーマをM-1A、M2-B7、M2-A9、M-32、M-33、およびM-34と命名した。mAb溶液のタンパク質濃度を、Pierce（Rockford,IL,U.S.A.）のBCAタンパク質アッセイ試薬を使用して、測定した。各モノクローナル抗体の濃度を表IVに示す。イムノアッセイ操作のためのバッファーニトロセルロース膜、ヤギ抗マウスIgG（H＋L）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合体、トリス｛ヒドトキシメチル｝アミノメタン（Tris）、ゼラチン、Tween-20、およびHRP発色試薬（Color Development Reagent）（４-クロロ- １-ナフトール）は、Bio-Rad（Richmond,CA,U.S.A）から購入した。Tris緩衝生理食塩水（TBS）は、塩化ナトリウム500mMを含有する20mMTris（pH7.5）であった。ブロッキング溶液はTBS中に3.0％ゼラチンを含んでいた。TBSで希釈したTwe en-20洗浄溶液（TTBS）は、TBS中に0.05％のTween-20を含んでいた。抗体バッファーはTBS中に１％のゼラチンを含んでいた。HRP発色溶液は、使用の直前に、HR P発色試薬60mgを０℃のメタノール100mL中に、0.015％H₂O₂のTBS溶液とともに混合することによって作成した。モノクローナル抗体を用いたヘパリンリアーゼのイムノアッセイドットブロッティングイムノアッセイ法を、Bio-Radイムノブロットアッセイプロトコル（Bio-Rad，Richmond，CA，U.S.A.）で推奨された方法で、行った。簡単に述べると、ニトロセルロース膜を２×３cmの小片にカットし、そしてこの膜上に１×１cmの四角形を、軟らかい鉛筆を用いて描いた。この膜をTBS中に15 分間浸漬し、そして濾紙上で15分間、風乾した。種々の濃度のヘパリンリアーゼ（TBS中１μL）を各四角形の中央に置き、そしてこの膜を15分間風乾し、次に、この膜をブロッキング溶液中に１時間浸漬し、残りの疎水性部分を被覆した。これをTTBS中で４回洗浄し（２回すばやくすすぎ、次に５分間の撹拌を２回）、次に、0.2％（v/v）mAbを含む抗体バッファー溶液中に終夜浸漬し、次に、この膜をTTBSで４回洗浄し、そしてヤギ抗マウスHRP溶液（抗体バッファー中0.1％）に加え、４時間、穏やかに撹拌した。この膜をTTBSで４回洗浄し、次に、TBSで２回洗浄した。HRP発色溶液をこの膜に添加し、そして紫色のバンドが明確に可視化したとき、膜を蒸留水中に置いて発色を停止した。次にこの膜を濾紙上で15分間乾燥し、そしてアルミニウム箔で覆って光から保護した。電気泳動材料電気泳動は、Bio-Rad（Richmond，Ca，U.S.A.）のMini-Protean II電気泳動セルを使用して行った。アクリルアミドおよびN,N'-メチレンビスアクリルアミドは、International Biotechnologies Inc．（New Haven，CT，U.S.A.）から入手したものか、あるいは調製した40％アクリルアミド溶液（37.5（アクリルアミド）：１（N,N'-メチレンビスアクリルアミド）（Fischer Scientific，Fairlawn ，NJ．U.S.A.））である。トリス｛ヒドロキシメチル｝アミノメタン（Tris）は Bio-Rad（Richmond，CA，U.S.A.）から入手した。N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）はBoehinger Mannheim Biochemicals（Indianapolis，IN ，U.S.A.）から入手した。過硫酸アンモニウム（APS）および氷酢酸は、Mallinc krodt Inc．（Pads，KY，U.S.A.）から入手した。尿素およびグリセロールはFis her Scientific（Fair Lawn，NJ，U.S.A.）から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）はBDH Chemicals Ltd.（Poole，England）から入手した。ナフトールレッドはSigma Chemical Co．（St． Loius，MO，U.S.A.）から入手した。２-β-メルカプトエタノールはEM Science （Gibbstown，NJ，U.S.A.）から入手した。ブロモフェノールブルーはMCB Manuf acturing Chemists，Inc．（Cincinnati，OH，U.S.A.）から入手した。分子量標準およびRapid Coomassie染料はDiversified Biotech（Newton Centre，MA，S.S .A.）から入手した。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）ヘパリンリアーゼＩ、II、IIIおよびFlavobacterium heparinum細胞ホモジネートを上記のように、SDS-PAGEを用いて分析した。上記のように、蒸留水4.35mL 、1.5MTris（pH8.8）2.5mL、および市販の、37.5（アクリルアミド）：１（N,N' -メチレンビスアクリルアミド）調製溶液（Fischer Scientific，Fairlawn，NJ ，U.S.A.）3.0mLを混合して、分離ゲル（12％アクリルアミド、10％SDS）を調製した。この溶液を真空下で少なくとも15分間、脱気した。次に、APS50μL（10％）およびTEMED５μLをモニター溶液に添加して、重合を開始した。このゲル溶液を、0.75mmのスペーサーで隔てられた２枚のガラス板の間にすばやく流し込み、 γ−ブタノールで飽和した蒸留水で重層し、25℃で60分間、重合させた。蒸留水6.4mL、0.5M Tris（pH6.8）2.5mL、アクリルアミド/ビス溶液（Fischer Scientific）1.0mL、APS（10％）50μL、およびTEMED10μLを混合して、スタッキングゲルを調製した。分離ゲルからγ−ブタノール壁を除去し、このゲルを蒸留水ですすぎ、そしてスタッキングゲル溶液を、分離ゲルの上に注意深く加えた。ウエル形成用電気泳動コームを、重合の前にスタッキングゲルに挿入した。スタッキングゲルを60分間重合させ、そしてウエル形成用コームを、試料をロードする直前に、取り外した。試料バッファーは、蒸留水4.0mL、0.5MTris（pH6.8）1.0mL、グリセロール0.8 mL、SDS（10％）1.6mL、２-β-メルカプトエタノール0.4mL、およびブロモフェノールブルー（0.05％w/v）0.2mLを混合することによって調製した。電気泳動のための試料および分子量標準マーカーを、スタッキングゲル中の先の工程で形成したウエル中にロードする直前に、試料バッファーで１：４に希釈し、そして10 0℃で４分間加熱した。泳動バッファー（0.125MTris、1.0Mグリシン、0.5％SDS 、pH8.3）を、スタッキングゲル上に注意深く重層し、そして200Ｖの一定電圧で、ブロモフェノールブルーマーカーが、ゲルの底から0.3cm以内に移動するまで（典型的には約４５分）、電気泳動を行った。電気泳動に続いて、このゲルを、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファー（electro-transfer）するか、あるいはRapid Coomassie染料で45分間染色して、次に7.5％メタノール/５％酢酸溶液で脱色した。尿素／酢酸PAGE いくつかの実験においては、尿素／酢酸PAGEシステム（panyim，S.,およびCha lkley，R.（1969）「ヒストンの高分解能アクリルアミドゲル電気泳動」Arch．Biochem．Blophys．130，337-346）を、SDS- PAGEのかわりに使用して、ウェスタンブロットにおいてmAbがヘパリンリアーゼを検出する能力に対するSDSの影響を比較した。尿素／酢酸PAGEの調製に使用するストック溶液は、60％アクリルアミド溶液を、アクリルアミド60g、およびN,N '-メチレンビスアクリルアミド0.4gを蒸留水100mLに溶解することによって、調製した。43.2％酢酸／TEMEDストック溶液を、酢酸43.2mL、TEMED4.0mL、および蒸留水52.8mLを混合することによって、調製した。APS/尿素を、APS５Mgを10M尿素25mL中に溶解することによって調製した。尿素／酢酸PAGEを、60％アクリルアミド溶液4.0mL、43.2％酢酸／TEMED3.0ml 、および蒸留水2.0mLを混合することによって、形成した。この溶液およびAPS／尿素溶液を、15分間脱気した。APS／尿素15mLをアクリルアミドモノマーに添加し、混合し、そして２枚の0.75mmスペーサーで隔てられた２枚のガラス板の間に注意深く流し入れた。ウエル形成用電気泳動コームを、このゲルの上に挿入し、そしてゲルを60分間重合させた。ヘパリンリアーゼを尿素／酢酸試料バッファーで１：４に希釈した。この試料バッファーは、酢酸520μL、グリセロール1.0ml、ナフトールレッド1.0mg、および尿素6.0gを、蒸留水（最終容量を10mLにする）中で混合することによって調製した。ウエル形成用コームを取り外し、そしてウエル中に試料をロードし、そして泳動バッファー（0.9M酢酸）で重層した。一定電流20mAで３時間（ゲルのプレフォーカシング）、そして次に10mAで、ナフトールレッドがゲルの底から約0.3cmまで移動するまで（約３時間）、電気泳動を行った。アクリルアミドゲルからニトロセルロース膜へのヘパリンリアーゼのエレクトロトランスファー半乾燥トランスブロッティング（transblotting）を、Hoefer Scientific Ins truments（San Francisco，CA，U.S.A.）のSemiPhor Transfer Unit（Te-70）を使用しておこなった。SDS-PAGEまたは尿素／酢酸PAGEからニトロセルロース膜へのヘパリンリアーゼのエレクトロトランスファーは、Al-Hakim，A.，およびLinh ardt，R.J．（1990）「半乾燥エレクトロトランスファーによる、ポリアクリルアミドゲルからの酸性オリゴ糖の単離および回収」Electrophoresis 11，23-28 に記載された半乾燥トランスブロッティング法を用いて行ったが、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）を転写バッファーとして使用したことが異なる。転写は、８Ｖ、40分間で完了した。モノクローナル抗体を用いたヘパリンリアーゼのウェスタンブロット検出ニトロセルロース膜上のヘパリナーゼを、ドットブロッティングイムノアッセイ操作に関する上記記載と同じようにウェスタンブロッティング法を用いて検出した。モノクローナル抗体の検出に対するSDSの影響 mAb M-32およびM-33によるヘパリンリアーゼの免疫検出に対するSDSおよび２- β-メルカプトエタノールの影響について試験した。ヘパリンリアーゼＩおよびI Iのドットブロッティングイムノアッセイは、ヘパリンリアーゼを、SDSおよび／または２-β-メルカプトエタノールを含有する溶液中に、SDS-PAGE分析で使用したのと同じ割合で、ニトロセルロース膜上にブロッティングする前に溶解したこと以外は、前述と同様に行った。結果６種の各mAbの、３種のヘパリンリアーゼに対する反応性を試験した。種々の量の３種の各ヘパリンリアーゼをニトロセルロース膜上にスポットし、そして抗ヘパリンリアーゼmAbを用いて検出した、次いで、ヤギ抗マウスIGG-HRPおよびこの免疫結合体の発色剤を添加した。表Ｖに、イムノアッセイ操作で検出された各ヘパリンリアーゼの最低濃度をまとめる。表Ｖからわかるように、mAbは、３種のヘパリンリアーゼの免疫検出に対して広範囲の感受性を有する。例えば、M2-A 9およびM2-B7は、10pgほどの少量のヘパリンリアーゼIIを検出し得、他方M-32、 M-33、およびM-34は、ヘパリンリアーゼIIIを検出するためには１μgのヘパリンリアーゼIIIの存在を必要とする。各データは、mAbが、ヘパリンリアーゼＩおよびIIが、Flavobacterium hepari num細胞ホモジネート中のような２種一緒に存在する場合の、この２種の識別のために使用し得ることを示す。特にM-32は、ヘパリンリアーゼＩを、ヘパリンリアーゼIIより10倍低いレベルで検出し得る。反対に、M2-A9およびM2-B7はヘパリンリアーゼIIを、ヘパリンリアーゼＩの10倍低いレベルで検出し得る。M-33、M- 34およびM-1Aは、ヘパリンリアーゼＩとIIとの間の識別のためには使用し得ない。さらに、６種のmAbはすべてヘパリンリアーゼＩおよびIIを、ヘパリンリアーゼIIIより低いレベルで検出し得、従って、ヘパリンリアーゼIIIとヘパリンリアーゼＩまたはIIとの間の識別が可能となる。ヘパリンリアーゼＩとIIとの間の識別は重要である。なぜなら両方の酵素とも、ヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して作用し、従って、その基質特異性に基づく識別が容易でないからである。ヘパリンリアーゼのウェスタンブロット分析３種のヘパリンリアーゼおよびFlavobacterium heparinum細胞ホモジネート試料をSDS-PAGEとそれに続くウェスタンブロット免疫検出によって分析した（図５ａに示す）。図５ｂは、クーマシーブルーと分子量マーカーで染色された３種のヘパリンリアーゼの典型的なSDS-PAGEゲルを含む。mAbがヘパリンリアーゼを検出する能力を、３種のヘパリンリアーゼおよびFlavobacterium heparinum細胞ホモジネートを６つのSDS-PAGEゲルを通して泳動し、次いでこのゲルの内容物をウェスタンブロット免疫検出によって試験した。ヘパリンリアーゼＩ（18ng）、ヘパリンリアーゼII（570ng）、ヘパリンリアーゼIII（1.63μg）、および細胞ホモジネート（87ng）を、各ゲルにロードした。M-34、M1-A、M2-A9、およびM2-B7 を含むニトロセルロース膜上での検出のために用いた発色時間は、それぞれ20、 10、15および40分間であった。４種のmAb（M-34、M-1A、M2-A9、およびM2-B7）が、精製されたヘパリンリアーゼＩ、II、およびIIIと、Flavobacterium hepari num細胞ホモジネート中に存在するヘパリンリアーゼを検出することができた。２種のmAb（M-32およびM-33）は、精製されたヘパリンリアーゼまたは細胞タンパク質のいずれをも、ウェスタンブロットで検出できなかった。 M-32およびM-33がヘパリンリアーゼを免疫検出する能力を破壊する原因となる、SDS-PAGEシステムの試薬を決定した。M-32およびM-33を使用したヘパリンリアーゼのドットブロッティングイムノアッセイを用いて、SDS-PAGEシステムの各成分を評価した。ヘパリンリアーゼＩおよびIIを、SDSおよび／または２-β-メルカプトエタノールの存在下または非存在下において、ニトロセルロース膜上にブロットし、そしてドットブロッティングイムノアッセイ法を用いて試験した。mA bは、SDSが存在するとリアーゼを検出できず、これは、SDSが、ウェスタンブロッティング操作の間のこれらの２種のmAbの感受性を低下させる原因となることを例証する。この実験は、M-32およびM-33が、リアーゼ上のエピトープを認識しなければならないことを示唆する。このエピトープは、３種すべてのヘパリンリアーゼに存在する折り畳み構造のような二次コンホメーション（これはSDS変性によって破壊される）を必要とする。 SDSが、M-32およびM-33のヘパリンリアーゼに対する反応性を低下させることの原因となることをさらに例証するために、３種のヘパリンリアーゼおよびFlav obacterium heparinum細胞ホモジネートを、M-32およびM-33を用いた尿素／酢酸 PAGEとそれに続くウェスタンブロッティング免疫検出を用いて分析し、システム中のリアーゼを検出した。検出感度は顕著に低下した。ヘパリンリアーゼＩ（2.7μg）、ヘパリンリアーゼII（3.4μg）。ヘパリンリアーゼIII（4.7μg）、および細胞ホモジネート（7.7μg）が検出可能であった。従って、SDSが、Mab（M-32およびM-33）のヘパリンリアーゼに対する反応性を低下させる、主要な原因である。PAGEとそれに続くウェスタンブロッティング免疫検出で分析した場合、６種のMAbすべてが、３種のヘパリンリアーゼすべてを、精製された形態または天然形態のいずれにおいても検出し得る。６種のMAbのうち少なくとも１種が、単一のヘパリンリアーゼを特異的に検出し、細胞ホモジネートのようなヘパリンリアーゼの複合混合物中におけるそのリアーゼの検出を可能とすることが予期された。ドットブロッティングおよびウェスタン分析によって、mAbのすべてが、３種のリアーゼすべてを検出し得ることが明らかとなった。この観察は、これらの３種のヘパリンリアーゼが、６つの共通するエピトープを有しているので、顕著に類似した構造であることを示唆する。これらの３種の酵素のペプチドマッピングは、多数の共通ペプチドフラグメントを示し、そしてこれらが、３種のヘパリンリアーゼ内の高度に免疫原性の領域に位置し得ることを示唆する。ドットブロッティング分析における、個々のmAb の各リアーゼに対する感受性は大幅に変化し、従って、ドットブロッティング分析が３種のリアーゼ間の識別のために使用し得る可能性を与える。 PAGE（SDSまたは尿素／酢酸）の使用は、ドットブロッティング操作に比べてより多くのタンパク質を必要とし、そしてmAbの、各リアーゼに対する感受性は、ドットブロッティング分析で示された感受性とは異なる。これはおそらく、PAGEおよび転写工程の間に二次構造が変化することに起因する。従って、mAbを使用したヘパリンリアーゼの検出は、本明細書中で記載されるドットブロッティング法を用いることによって、最も効果的に行われる。さらに、６種すべてのmAbが、Flavobacterium heparinum細胞ホモジネート中に存在する３種すべてのリアーゼを検出可能であり、従って、これらのmAbを使用して、細胞ホモジネート中のヘパリンリアーゼの存在を迅速に示し得る可能性が与えられる。リアーゼ精製に便利なように、これらのmAbは、最初に固定化され、そしてヘパリンリアーゼに対するこれらの結合活性が評価される。抗体を固定化するための方法および材料は市販されており、そして当業者に公知である。要約すれば、本明細書に記載された結果は、mAbがヘパリンリアーゼＩ、II、およびIIIを、その精製状態において、またはホモジナイズしたFlavobacterium 細胞の溶液中に一緒に存在する場合のいずれかで、検出し得ることを示す。これらのmAbはまた、リアーゼのドットブロッティング分析にも使用し得、３種の各リアーゼについてのそれらの感受性の違いに基づいて、３種のリアーゼを識別する。精製されたヘパリナーゼの修飾および改変、それらの精製法、およびそれらに対するモノクローナル抗体は、上記の詳細な説明から当業者に自明である。これらの修飾および改変は、添付の請求項の範囲内であることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者サシセックハラン，ラムナスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02174，アーリントン，リッジストリート 118 (72)発明者ロース，ダニエルエル. アメリカ合衆国テキサス 77801，ブライアン，ナンバー 5204，オールドカレッジロード 4441 (72)発明者クーニー，チャールズエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックリン，チェストナットプレイス 35 (72)発明者リンハート，ロバートジェイ. アメリカ合衆国アイオワ 52240，アイオワシティー，プラムストリート 1422 (72)発明者ランジャー，ロバートエス. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02158，ニュートン，ランバードストリート 77

Claims

【特許請求の範囲】１．精製されたヘパリナーゼIIであって、Heparinum flavobacterium中に存在し、ヘパリナーゼII活性以外のリアーゼ活性がなく、分子量84,100であり、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を切断し、そして最適pHが8.9〜9.1である、ヘパリナーゼII。２．精製されたヘパリナーゼIIIであって、Heparinum flavobacterium中で発現され、ヘパリナーゼIII活性以外のリアーゼ活性がなく、分子量70,800であり、ヘパラン硫酸を切断し、そして最適pHが9.9〜10.1である、ヘパリナーゼIII。３．ヘパリン硫酸を切断しない、請求項２に記載のヘパリナーゼIII。４．アルブミンで安定化される、請求項２に記載のヘパリナーゼIII。５．Heparinum flavobacteriumの生物学的に純粋な培養物からヘパリナーゼＩ、II、およびIIIを精製する方法であって、Flavobacterium heparinumの生物学的に純粋な培養物中のFlavobacterium heparinum細胞を溶解する工程、該細胞溶解物から細胞残渣および核酸を除去する工程、ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIをヒドロキシルアパタイトへ吸着させる工程、非ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIタンパク質をQAE樹脂へ吸着させる工程、該QAE樹脂に結合しない該ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIを回収する工程、ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIを、HPLCによって、ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離する工程、該ヒドロキシルアパタイトカラム上で分離された該ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIを回収する工程、分離された該ヘパリナーゼをカチオン交換FPLCによって精製する工程、該カチオン交換FPLCによって分離された該ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIを回収する工程、分離された該ヘパリナーゼをゲルパーミエーションHPLCによって精製する工程、およびゲルパーミエーションHPLCによって分離された該ヘパリナーゼＩ、II、および IIIを回収する工程を包含する方法。６．前記核酸がプロタミンによる沈澱によって除去される、請求項５に記載の方法。７．前記ヘパリナーゼが、ヒドロキシルアパタイトカラム上で塩グラジエントによる溶出によって分離される、請求項５に記載の方法。８．前記ヘパリナーゼが、塩濃度を増加させるグラジエントによってカチオン交換カラムから溶出される、請求項５に記載の方法。９．前記ヘパリナーゼが、グラジエントまたは塩濃度の増加によってカチオン交換カラムから溶出される、請求項５に記載の方法。１０．Heparinum flavobacterium由来のヘパリナーゼＩ、II、およびIIIに対して異なる親和性で交差反応するモノクローナル抗体。１１．前記抗体が、ヘパリナーゼＩで免疫されたマウスからの白血球とマウス骨髄腫細胞との融合物によって産生され、次いで、次いでヘパリナーゼＩ、II、およびIIIの３種すべてに対する反応性によってスクリーニングされる、請求項１０に記載の抗体。１２．ヘパリナーゼを検出する方法であって、ヘパリナーゼ活性を有する試料を、Heparinum flavobacterium由来のヘパリナーゼＩ、II、およびIIIに対して異なる親和性で交差反応する抗体と反応させる工程、および該反応の程度を決定する工程を包含する方法。１３．前記試料がHeparinum flavobacterium由来である、請求項１２に記載の方法。１４．前記試料中のヘパリナーゼを単離し、そして１種を超える抗体と反応させて、ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIとの構造類似性を決定する、請求項１２に記載の方法。１５．前記抗体と前記ヘパリナーゼとの反応性がイムノブロッティングによって決定される、請求項１２に記載の方法。１６．ヘパリンおよびヘパリン硫酸を切断する方法であって、該ヘパリンまたはヘパリン硫酸を、Heparinum flavobac teriumに由来し、いかなるリアーゼも混入していない、ヘパリナーゼＩ、II、およびIIIからなる群から選択される精製されたヘパリナーゼと反応させる工程を包含する方法。１７．前記ヘパリンが細胞外マトリックスである、請求項１６に記載の方法。