ES2243924T3 - Purificacion, composicion y especificidad de heparinasa i, ii y iii de heparinum flavobacterium. - Google Patents
Purificacion, composicion y especificidad de heparinasa i, ii y iii de heparinum flavobacterium.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN ESQUEMA SIMPLE Y REPRODUCIBLE PARA PURIFICAR SIMULTANEAMENTE LAS TRES LIASAS DE HEPARINA A PARTIR DE F. HEPARINUM A HOMOGENEIDAD APARENTE. LAS PROPIEDADES CINETICAS DE LAS LIASAS DE HEPARINA HAN SIDO DETERMINADAS Y ASI COMO LAS CONDICIONES PARA OPTIMIZAR SU ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD. TAMBIEN SE DESCRIBEN ANTICUERPOS MONOCLONALES A LAS TRES HEPARINASAS QUE SON UTILES PARA DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE LAS HEPARINASAS.
Description
Purificación, composición y especificidad de la
heparinasa I, II y III de Heparinum Flavobacterium.
Esta invención se refiere generalmente a la
purificación y caracterización de la heparinasa I,II y III de la
Flavobacterium heparinum y anticuerpos de la misma.
La heparina y el sulfato de heparana representan
una clase de glucosaminoglucanas caracterizadas por un polisacárido
lineal de D-glucosamina (1-4)
enlazado al ácido hexurónico (Linhardt, R.J (1991) Chem. Ind. 2,
45-50; Casu, B. (1985) Adv. Carbohydr. Chem Biochem.
43. 51-134). La heparina y el sulfato de heparana
son carbohidratos complejos que representan un importante papel
funcional en la matriz extracelular de los mamíferos. Estos
polisacáridos modulan y regulan los cambios que se producen a nivel
tisular o bien durante el desarrollo en condiciones normales o en
relación con la curación y con metástasis tumorales en condiciones
patológicas.
Gran parte de los actuales conocimientos sobre la
secuencia de la heparina y de la heparana se basa en estudios de su
biosíntesis (Linhardt, R.J, Wang, HM, Loganathan, D y Bae, J.H
81992), Biol. Chem. 267, 2380-2387; Lindahl, U,
Feingold, D y Roden, L. (1986) Trends Biochem Sci 11,
221-225; Jacobson, I. y Lindahl U. (1980) J. Biol.
Chem. 255, 5094-5100; Lindahl, U y Kjllen, L (1987)
en The Biology of Extracellular Matrix Proteoglycans (Wight, T. N y
Mecham R., eds págs. 59-104, Academic Press, Nueva
York). Recientes esfuerzos (Linhardt, R. J, Rice, K. G., Kim, Y.S.
Lohse, D.L, Wang, H.M. y Loganathan, D. (1988) Bio) Biochem. J. 254,
781-787; Linhardt, R.J., Wng, H.M. Loganathan, D. y
Gallagher, J.T. (1990) Biochemistry 29, 2611-2617)
se han enfocado sobre la aplicación de métodos enzimáticos para
despolimerizar estos complejos polisacáridos en oligosacáridos que
puedan ser caracterizados estructuralmente (linhardt y col. (1992)
Biol. Chem. 267, 2380-2387; Linhardt y col. (1988)
Biochem. J. 254, 781-787; Loganathan, D., Wang,
H.M., Mallis, L.M. y Linhardt, R.J. (1990) Biochemistry 29,
4362-4368).
Los métodos enzimáticos para la despolimerización
de la heparina y del sulfato de heparana son muy específicos y
requieren unas condiciones ideales que produzcan unos productos
polisacáridos que se parezcan rigurosamente a aquellos de los que se
derivan. Dos tipos de enzimas que degraden las glucosaminoglicanas
de la heparina y del sulfato de heparana son las liasas de
polisacáridos procedentes de fuentes procarióticas que actúan a
través de un mecanismo eliminador (Lonhardt, R.J, Galliher, P.M. y
Cooney, C.L. (1986) Appl. Biochem Biotech. 12,
135-176), y las glicuronidasas (hidrolasas)
derivadas de fuentes eurocarióticas que actúan a través de un
mecanismo hidrolítico.
La degradación procariota de la heparina y del
sulfato de heparana ha sido estudiada especialmente utilizando
enzimas derivadas de "Flavobacterium heparinum" (Linker,
A. y Hovingh, P, (1965) J. Biol. Chem. 240,
3724-3728; Linker, A, y Hovingh, P (1970) J. Biol.
Chem. 245, 6170-6175); Dietrich, C.P., Silva, M.E.
y Michelacci, Y.M. (1973) J. Biol. Chem. 249
6408-6414; Silva, M.E. Dietrich C.P. y Nader, H.B.
(1976) Biochm. Biophys. Acta 437 129-141). Esta
degradación bacteriana se inicia con la acción de tres (o
posiblemente más) eliminasas. Estas liasas de heparina producen
oligosacáridos con \Delta_{4,5}-insaturados de
residuos de ácido urónico en sus términos no reductores. Estas
liminasas actúan probablemente en combinación para convertir la
heparina y el sulfato de heparana en disacáridos.
Las liasas de heparina son una clase general de
enzimas que son capaces de disociar específicamente los principales
enlaces glucosídicos en heparina y sulfato de heparana. Tres liasas
de heparina han sido identificadas en Flavobacterium
heparinum, un organismo que utiliza la heparina para producir
exoglucuronidasas, sulfoesterasas y sulfamidasas que siguen actuando
sobre los productos oligosacáridos generados por la liasa (Yang,
V.C, Linhardt, R.J. Berstein, H, Cooney, C.L y Langer, R. (1985).
Chem. 260, 1849-1857; Galliher, P.M., Linhardt,
R.J., Convay, L.J. Lnger, R., y Cooney, C.L. (1982) Eur. J. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 15, 252-257). Estas liasas
son denominadas liasa I de heparina (heparinasa, EC 4.2.2.7), liasa
II de heparina (Heparinasa II, sin número EC) y liasa III de
heparina (heparitinasa EC 4.2.2.8). Aunque las especificidades de
estas enzimas no son completamente conocidas, los estudios
realizados empleando enzimas parcialmente depuradas con heparina,
sulfato de heparana y oligosacáridos de heparina estructuralmente
caracterizados han llevado a conocer los enlaces susceptibles a la
disociación enzimática (Linhardt y col, (1990), Lohse (1992), Rice,
K.G. y Linhardt, R.J. (1969) Carbohydrt. Res. 190
(219-233). Estas tres liasas de heparina depuradas
difieren en cuanto a su capacidad de disociación de la heparina y
del sulfato de heparana: la liasa de heparina I, disocia
principalmente heparina, la liasa de heparina III disocia
específicamente sulfato de heparana y la liasa de heparina II actúa
de la misma manera sobre la heparina y el sulfato de heparana
(Linhardt y col., 1986; Linhardt y col. 1990).
Varios Bacteroides sp. (Saylers, A. A.,
Vercellotti, J.R., West, S.E.H. y Wilkins, T.D. (1977) Apl. Environ.
Microbiol. 33, 319.322; Nkamura, T. Shibata, Y, y Fujimura, S.
(1988) J. Clin. Microbiol. 25, 1070-1071), producen
también heparinasas; pero estas enzimas no están bien
caracterizadas. Una heparinasa ha sido purificada con aparente
homogeneidad a partir de una bacteria de suelo no identificada
(Bonner, L.H, Pitout, M.J, Steyn, P.L y Visser, L. (1990) J. Biol.
Chem. 265, 13609-13617). Esta enzima se diferencia
de las aisladas a partir de la Flavobacterium heparinum en su
peso molecular (95,000), \mul (9,2), composición de amino-ácido y
propiedades cinéticas (Km de 3.4 \muM y Vmax de 36.8
\mumol/min., pH óptimo de 7.6).
Otras tres liasas de heparina especialmente
purificadas a partir de Flavobacterium so. Hp206 tienen unos pesos
moleculares de 64,000, 100,000 y 72,000 según informan Yoshida, K,
Miyazono, H, Tawada, A., Kikuchi, H. Morikawa, K y Tokuyasu,
K(1989) 10th Annual Symposium of Glycoconjugates, Jerusalén,
diferentes de las liasas de heparina I-III.
Las liasas de heparina de F. heparinum son
las que se emplean en mayor escala y han sido mejor estudiadas
(Lindhardt, (1986). Linker y Hovingh (1970) fueron los primeros en
separar estas actividades de la liasa, fraccionando una fracción de
liasa cruda en una heparinasa (kiasa de heparina I) y en
heparitinasa (liasa de heparina III). Ambas actividades se
purificaron 50-100 veces; pero no se llevó a a cabo
caracterización física alguna de estas enzimas.
Dietrich y colaboradores (Dietrich y col., 1973);
Silva y col., (1976); Silva, M.E. y Dietrich, C.P (1974) Biochem
Biophys, Res Commun, 56, 965-972; Michelacci, Y.M y
Dietrich, C.P. (1974) Biochem, Biophys. Res Commun 56,
973-980 y Ototani y Yosizava (Ototani, N.; y
Yosizava, Z(1978), J. Biochem (Tokio) 84,
1005-1008; Ototani, N y Yosizava,
Z(1979)Carbohydr. Res 70, 295-306;
Ototani, N-Kikiuchi, M y Yosizava, Z(1081)
Carbodydr. Res. 88, 29.1-303; Ototani, N. y
Yosizava, Z. (1981) Proceedings of the 6th International Symposium
on Glycoconjugates, páginas 411-412, septiembre
20-25, Tokio, Japan Sccientific Prewss, Tokio)
aislaron tres liasas, una heparinasa (liasa de heparina I) y dos
heparitinasas a partir de F. heparinum. La heparinasa actúa
sobre la heparina para producir principalmente disacáridos
trisulfatados (Doetrich, C.P y Nader, H.B (1974) Biochem. Biophys.
Acta, 34-44; Dietrich, C.F., Nader H.B., Britto,
L.R. y Silva M.E. (1971) Biochem Biophys, Acta 237,
430-441) Nader, H.B.; Porcionatto, M.A. Tersariol,
I.L.S, Pinhal, M.S. Oliveira, F.W. Moraes, C.T. y Dietrich,
C.P.(1990), J. Biol. Chem. 265, 16807-16813)
purificaron dos heparitinasas (denominadas heparitinasa I y II,
posiblemente correspondientes a liasas de heparina II y III, aunque
no se indicaron las propiedades físicas de estas enzimas) y
caracterizaron su especificidad de sustrato hacia la heparina y el
sulfato de heparana. La heparitinasa I degradó el sulfato de
heparana N-acetilado y N-sulfatado
mientras que la heparitinasa II degradó principalmente sulfato de
heparana N-sulfatado.
McLean y colaboradores. describen la
especificidad de un heparinasa II parcialmente purificada (Moffat,
C.F., McLean, M.W, Long, W.F y Williamson, F.B. (1991) Eur. J.
Biochem, 197, 449-459; McLean, M.W., Long, W.F. y
Williamson, F.B. (1985) en Proceedings of the 8th International
Symposium on Glycoconjugates, págs. 73-74,
setiembre, Houston Paeger Publishers, Nueva York; McLean, M.W.
Bruce, J.S., Long W.F. y Williamson F.B. 1954) Eur.
J-Biochem.145 (607-615). Aunque no
se señalan evidencias de homogeneidad o propiedades físicas de la
heparinasa II, la amplia especificidad sobre diversos sustratos
poliméricos (Moffat y col., (1991) identifica la enzima como liasa
II de heparina (Lindhardt y col. (1990); McLean y col., (1985).
Linhardt y col. (1984)
Appl-Biochem. Biotec. 9 41-55)
informan sobre la depuración de la heparinasa (liasa de heparina I)
a una simple banda en SDS-PAGE. La purificación por
afinidad de la liasa de heparina I falló en la sefarosa de heparina,
al parecer a causa de la degradación de la matriz de columna. En
primer lugar se prepararon cantidades suficientes de liasa de
heparina I para realizar estudios detallados de caracterización y
análisis de aminoácidos por Yang y col. (1985). La liasa de heparina
I se empleó para preparar cuerpos policlonales en conejos para
conocer la purificación por afinidad; pero eran necesarias una
condiciones excesivamente rigurosas para eluir la enzima, lo que
suponía una pérdida sustancial de actividad (Lindhardt, (1985).
Yang, V.V, Bernstein, H, Cooney, C.L. y Manger, R.(1987) Appl.
Biochem, Biotech, 16, 35-50) describen también un
procedimiento para preparar liasa de heparina I.
Sikagaku Co., ha informado recientemente de
palabra que los pesos moleculares de sus enzimas comerciales
correspondientes a las liasas I-III de heparona eran
43,000, 84.000 y 70,000 respectivamente (Yoshida K. (1991)
International Symposium on Heparin y Related Polysaaccharides,
setiembre 1-6, Uppsala, Suecia). Estos informes
están rigurosamente de acuerdo con los pesos moleculares indicados;
pero no se han dado a conocer detalles de su depuración o de los
métodos de caracterización.
Se han utilizado liasas de heparina para
determinar la presencia de heparina en mezclas de proteoglicanos
(Kanwar, Y.S. y Farquhar, M.G. (1979) Presencia de sulfato de
heparina en la membrana de base glomerular. Proc. Natl. Acad. Sci,
EE,UU 76(1303-1307), para despolimerizar
heparina y sulfato de heparana para caracterizar la estructura de
los oligosacáridos resultantes (Linhardt, R.J, Loganathan, D
Al-Hakim, A. Wang, H-M, Walenga,
J.M. Hoppensteadt D. y Fareed, J (1990), configuración de
oligosacáridos de bajo peso molecular; estructura y diferencias de
actividad, J. Med, Chem 33, 1639-1645;Linhardt, R.J.
Rice, K.G, Kim Y.S., Lohse, D.L., Wang H.M y Loganathan, D.(1988).
Configuración y cuantificación de los principales componentes
oligosacáridos de la heparina. Biochm. J. 154,
781-787; Merchant, Z.M. Kim. Y.S; Rice K.G. y
Linhardt, R.J. (1985). Estructura de tetrasacáridos derivados de la
heparina, Biochem. J.229, 369-377; Turnbull, J.E. y
Gallagher, J.T. (1988) Configuración de oligosacáridos de sulfato de
heparana por electroforesis de gel de gradiente de poliacrilamida y
electrotransferencia a membrana de nilón. Biochem. J.251,
597-608, para producir preparados de heparina de
bajo peso molecular con actividades de anticoagulante e inhibidoras
complementarias (Linhardt, R.J., Grant, A., Coopey, C.L y Langer R,
(1982) Actividad diferencial anticoagulante de fragmentos de
heparina preparados utilizando heparinasa microbial. J. biol.
Chem. 257, 7310-7313; Linhardt R.J. y Loganathan, D
(1990a). Heparina, heparinoides y oligosacáridos de heparina;
estructura y actividad biológica. En C.G. Gabelein (Ed.) Polímeros
biomiméticos (pags. 135-173) Nueva York; Plenum
Press; Ghaarath, M.D, Merchant, Z.M., Kim, Y.S., Rice K.G.,
Linhardt, R.J- y Weiler, J.M. (1985) Pequeñas fracciones de
heparina regulan el recorrido amplificador del complemento
Immunopharmacology 9, 73-80) y forma de eliminar la
heparina de la circulación (Langer y col. 1982). Las enzimas
despolimerizantes de la heparina constituyen unas excelentes
herramientas para comprender el papel de las moléculas tipo heparina
en la matriz extracelular o para utilizar en diferentes
microambientes tisulares para modular y alterar la matriz
extracelular de una manera muy específica. Ello no obstante, los
estudios sobre el empleo de liasas de heparina se han visto
obstaculizados por dificultades para la depuración de enzimas de
Flavobacterium heparinum, especialmente en lo que se refiere
a la separación de las tres enzimas entre sí (linhardt y col. 1985).
Específicamente, la capacidad de la liasa de heparina II para
disociar heparina y sulfato de heparana hace difícil la distinción
con respecto a la liasa de heparina I que disocia heparina y la
liasa de heparina II que disocia sulfato de heparana.
Aun cuando se emplean profusamente las tres
liasas de heparina y de sulfato de heparana, con excepción de la
liasa de heparina I, no existe información sobre la pureza de las
características físicas y cinéticas de las heparinasas II y III. La
ausencia de liasas de heparina puras da lugar a ambigüedades con
respecto a la especificidad del sustrato. Esto se debe a la
contaminación de otras liasas del preparado y a la falta de
conocimientos sobre las condiciones catalíticas óptimas y la
especificidad del sustrato en relación con el empleo de estas
enzimas como reactivos para la despolimerización específica de la
heparina y del sulfato de heparana en oligosacáridos para estudios
estructurales y de actividad y para su empleo en estudios
clínicos.
Por consiguiente, uno de los objetos de la
presente invención es el de proporcionar un procedimiento para
purificar y caracterizar las heparinasa I, II y III. Otra finalidad
es la de suministrar heparinasas caracterizadas I, II y III.
Otra finalidad es la de proporcionar las
condiciones para un empleo óptimo y para trazar un mapa de péptidos
de las heparinasas II y III.
Otro objeto más de la presente invención es el de
proporcionar las composiciones de aminoácidos de las tres
heparinasas, así como de suministrar anticuerpos para las
heparinasas I, II y III que pueden utilizarse para la purificación y
caracterización de heparinasas.
Se da a conocer un procedimiento sencillo y
reproducible para depurar simultáneamente las tres liasas de
heparina de "F. heparinum" para homogenizarlas y
liberarlas de contaminantes. La liasa de heparina I (heparinasa, EC
4.2.2.7), la liasa de heparina II (sin número EC) y la liasa de
heparina III (heparitinasa, EC 4.2.2.6) tienen unos pesos
moleculares (por electroforesis de gel de
sulfato-poliacrilamida de dodecilo sódico, así como
puntos isoeléctricos (por enfoque isoeléctrico) de M,42,800, pl
9.1-9.2, M,70,800, pl 9.9-10.1,
respectivamente. Sus análisis de aminoácidos y mapas de péptidos
demuestran que aunque estas proteínas son diferentes, los productos
de genes están íntimamente relacionados. Se han determinado las
propiedades cinéticas de las liasas de heparina, así como las
condiciones para optimizar su actividad y su estabilidad.
Se describen la depuración y caracterización de
la heparinasa II del "Flavobacterium Heparinum". Las
constantes de Michelis-Menton son: Liasa de heparina
II (con heparina), V(max)=15.04, Km=9.23 \muM (0,129
mh/ml); liasa de heparina II (con sulfato de heparana),
V(max)=46,95, Km=43,43 \muM (0,869 mg/ml). El pl aproximado
de la liasa calculada de agarosa IEF utilizando un gradiente pH de
9-11 es de aprox. 8.9. La temperatura óptima de la
liasa de heparina I (ambas con heparina y sulfato de heparana) es de
35ºC. La actividad es mayor a temperaturas más elevadas; pero la
estabilidad se reduce considerablemente. El pH óptimo para la
actividad de la liasa: (con heparina), pH=7.3 y (con sulfato de
heparana), pH=6.9.
Se describe la depuración y caracterización de la
heparinasa III (EC 4.2.2.8) de la Flavobacterium Heparinum.
Las constantes de Michelis-Menton son
V(max)=277.01, Km=109,97 \mum (0,780 mg/ml). El pl
aproximado de la liasa se ha calculado a partir de agarosa IEF
utilizando un gradiante de pH de 9-11 y comprobando
que era 9.2. La temperatura óptima para la liasa de heparina III es
de 35ºC. La actividad es superior a temperaturas más elevadas para
la enzima; pero la estabilidad se reduce considerablemente. El pH
óptimo para la liasa de heparina III es pH=7.6. La especificidad del
sustrato de la heparinasa III es para las afinidades de la
hexosamina-ácido glucurónico la base d sulfato de heparana. La
enzima es una proteína monomérica, muy diferente de las heparinasas
I y II en tamaño y actividad. Es posible emplear heparinasa III para
desprender cadenas del tipo de la heparina en la matriz
extracelular para secuenciar y educir una respuesta celular a base
de heparina.
No se han observado efectos salinos para las
heparinasas II o III, utilizándose cuatro sales diferentes para
confirmar que se ensayaron efectos salinos y no efectos iónicos.
También se describen procedimientos para la
preparación y empleo de anticuerpos monoclonales para las tres
heparinasas. Los anticuerpos están indicados para el aislamiento,
detección y caracterización de heparinasas, individualmente y en
grupo, así como en estudios que comprenden la especificidad del
sustrato, inhibición de enzimas y representación activa.
La fig. 1 es un gráfico de l fracción
HA-HPLC de liasas de heparina. La
proteína(A280) es el trazo grueso. La actividad (unidad/ml)
respecto a la heparina (círculos enteros) y la actividad (unidad/ml)
respecto al sulfato de heparana (Cuadrados enteros) se indican con
rayado cruzado para indicar la parte de los picos recogida.
La fig. 2 es un mono-S FPLC
fraccionamiento de liasas de heparina: a, liasa de harina I y b,
liasa de heparina III. La flecha indica el comienzo de la elución
del gradiente salino y el rayado en cruz, la parte de los picos
recogida.
La fig. 3 es un fraccionamiento
GPC-HPLC de liasas de heparina:a, liasa de heparina
I; b, liasa de heparina II; c, liasa de heparina III y d, tipos de
peso molecular (Mr) formados por tiroglobulina (bovina, 670.000),
gamma globulina (158,000), ovalbumina (44,000), mioglobina (caballo,
17,000) y cianocobalamina (1350). El rayado en cruz indica la parte
de los picos que se recogió.
La fig. 4 es un SDS-PAGE en un
gel de poliacrilamida discontinua al 12% en condiciones de
reducción. Dos \mug en cada una de las liasa de heparina I ( vía
a), liasa de heparina II (vía b), liasa de heparina III (vía c) y
peso molecular (vía d) son típicos. A la derecha figura la masa de
los tipos de peso molecular en kDa.
Fig. 5. Panel A: Mancha occidental de gel
SDS-PAGE utilizando M2-M9. a) liasa
de heparina I; b) liasa de heparina II; c) liasa de heparina III; d)
homogenado celular de Flavobacterium heparinum. Las flechas
indican las zonas de interés. Esta análisis demuestra la capacidad
de este MAb para detectar la presencia de liasas de heparina
depuradas o presentes en material celular homogenizado.
Panel B: Análisis SDS-PAGE de
liasas de heparina depuradas. a) liasa de heparina I; b) liasa de
heparina II; c) liasa de heparina III; d) marcadores de peso
molecular. Las flechas indican las franjas de interés.
La fig. 6 es una representación del extracto
tríptico de las heparinasas II y III. El panel A es la heparinasa
II y el panel B, I heparinasa III.
Se describe un esquema sencillo y reproducible de
la depuración simultánea de las tres liasas de heparina de F.
heparinum de homogeneidad aparente.
Se realizaron ensayos de enzimas y mediciones de
absorbancia en un espectrofotómetro UV 160 de Shimdzu conectado a
un baño de agua en circulación refrigerada de Fisher Scientific
Isotamp modelo 9100 y se realizaron fermentaciones en un
fermentador de depósito agitado de dos litros de Applikon. Luego, se
centrifugó en una centrífuga refrigerada Sorval RC-5
en un rotor GSA de Du Pont. El HPLC se efectuó utilizando una bomba
LDC Milton-Roy Constametric IIIG, un inyector
Rheodyne 7125, un formador de gradiente lineal de julios y un
monitor de absorbancia ISCO modelo UA-5 con filtro
280-nm
La columna HPLC de hidroxilapatita 1 x 30 cm se
conectó en serie con una columna protectora de 1 x 5 cm de Regis, la
columna Mono-S FPLC era de Pharmacia LKB
Biotechnology Inc., la columna C18 era de Vydac y la columna HPLC de
permeación de gel Bio-Sil era de
Bio-Rad. El sistema de electroforesis de zona
capilar y los capilares de sílice eran de Dionex. La cámara de
electroforesis Mini-Protein II, un modelo 1405 de
célula de electroforesis horizontal y un modelo 1420B de fuente de
energía eran de Bio-Rad. El equipo de electroforesis
de gel tubular era de E-C Apparatus Corp. Los geles
IEF de agarosa prefundidos eran de Iso-labs y los
marcadores de peso molecular pre-manchados y el
tinte Rapid Coomassie TM eran de Diversssified Biotech. La
hidroxilapatita Bio-Gel HT era de
Bio-Rad y el QAE-Sephadex era de
Sigma. Las unidades de filtrado a presión y los filtros de 25- y 43
mm PM-10 eran de Amicon. La heparina (sal sódica
mucosa porcina) era de Celsus, el sulfato de heparana, el sulfato de
dermatana y el sulfato de condroitina A, C, D y E era de Seikagaku.
La albúmina sérica bovina, la lactosa, la protamina (base libre), el
azul de bromofenol, el rojo de naftol, el citocromo c (corazón de
bovino tipo VA), el ácido hialurónico, CAPS,
bis-Tris, HEPES, TES, ditiotreitol, MOPS,
mercaptoetanol, iodoacetamida y tripsina eran de Sigma. El
reactivo Coomassie para el ensayo de proteína era de
Bio-Rad. Todo el agua utilizada en los reactivos se
desionizó y destiló en cristal.
El espectrofotómetro se ajustó a la temperatura
óptima de la liasa que se estaba ensayando. Se equilibró
térmicamente una micro-cubeta de cuarzo de 700
\mul que contenía 400 \mug de sustrato en reductor de 50 mM de
fosfato sódico (conteniendo 100 mM de cloruro sódico para liasa de
heparina I); se añadió una cantidad medida de liasa, situando el
volumen final en 400 \mul y se mezcló con suavidad la cubeta. A
continuación, se pasó inmediatamente la micro-cubeta
al espectrofotómetro y se midió el cambio de absorbancia a 232 nm a
intervalos de 10 segundos durante 3 minutos. Luego, se midió la
actividad a partir del cambio de absorbancia/unidad de tiempo
utilizando un coeficiente de extinción de 3800 M-1
para los productos. Después, se calculó la actividad específica
dividiendo los micromoles del producto producido por minuto por los
miligramos de proteína existentes en la cubeta. Los pesos
moleculares empleados para la heparina, sulfato de heparana y
sulfatos de condroitina fueron 14,000, 20,000 y 25,000,
respectivamente, Rice, K.G. y Linhardt, R.J. (1989) Carbohydr. Res.
190, 219.233. La concentración de proteína se midió por el ensayo de
Bradford, Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72,
248-254, sobre la base de la curva estándar de
albúmina de suero bovino.
Se almacenó F. heparinum (Payza, A.N. y
Korn, E.D. (1956) Nature 177, 88-89) (ATCC 13, 125)
a -70ºC en un medio concreto que contenía sulfóxido de dimetil
(Me2SO) (Zimmermann, J.J. Oddie, K., Langer, R. y Cooney, C.L.(1991)
Appl. Biochem. Biotech, 30, 137-148). El organismo
se desarrolló en un fermentador agitado de dos litros con heparina
como única fuente de carbono en un medio definido por el método de
Galliher, P.M., Cooney, C.L., Langer, R.S. y Linhardt, R.J (1981)
Appl. Environ. Microbiol. 41 (360-365). A partir de
5 litros de caldo de fermentación, se obtuvo una pastilla húmeda de
80 g. mediante centrifugado durante 15 min. a 12,000 x g a 4ºC. Esta
pastilla se puso en suspensión en 500 ml de reactivo de fosfato
sódico de 10 mM con pH 7.0 y 4ºC. La suspensión celular (20 ml de
una vez) se colocó en un vaso de acero inoxidable y se trató por
refrigeración durante 10 minutos a 10 vatios utilizando un modo
pulsado del 40%. Las células alteradas se centrifugaron a 12,500 x g
durante 30 min. y 4ºC y la pastilla se desechó. Los 500 ml de
sobrenadante, obtenidos por sonificación y centrifugado, contenían
16,3 mg/ml de proteína. La base exenta de proteína (2.0 g) se
disolvió en 20 ml de reactivo de fosfato sódico, pH 7.0 y se
agregaron en gotas agitando a los 500 nl de sobrenadante. Se
centrifugó a 10,000 x g y 4ºC durante 20 minutos, extrayendo el DNA
precipitado y se agregaron 510 ml de sobrenadante.
Los 510 ml de sobrenadante que contienen 15,6
mg/ml de proteína, empleados directamente sin congelar, se dividen
en partes iguales en cuatro recipientes de centrífuga de
polipropileno de 250 ml y se colocan en un baño de hielo. A cada
recipiente se añaden 20 g de hidroxilapatita seca (HA), se agita
suavemente, se compacta ligeramente por centrifugación a 1000 x g
durante 2 minutos a 4ºC y el sobrenadante se decanta y se separa de
la matriz de HA. A continuación, se vuelve a suspender la proteína
ligada a la HA en reactivos con crecientes concentraciones de
fosfato sódico y de cloruro sódico y se vuelve a compactar por
centrifugación. Los sobrenadantes se decantan nuevamente de la
matriz y se vuelven a comprobar la actividad enzimática y la
concentración de proteína. Se preparan los reactivos utilizados para
lavar la matriz de HA mezclando una solución de 10 mM de reactivo de
fosfato sódico de un pH 6.8, con una solución de 250 mM de reactivo
de fosfato sódico de un pH de 6.8 que contenga 500 mM de cloruro
sódico en unas proporciones de 6:0, 5:1, 4:2, 3:3; 2:4 y 0:6 (V/V)
a 4ºC. Las soluciones de sobrenadante de proteína se colocó en tubos
de diálisis con un peso molecular por separado de 14,000 y se
dializa durante una noche a 4ºC con 50 mM de reactivo defosfato
sódico sw pH 7.0.
Se utiliza inmediatamente sin congelar la
actividad de la liasa depurada por lote de HA y se efectúa una fase
de cromatografía (QAE) Sephadex de etil amonio cuaternario a 4ºC. Se
consolidan tres lotes de fracciones de HA purificada (4:2; 3:3 y
2:4), con un volumen total de 1,5 litros, conteniendo más del 89% de
la actividad con respecto a la heparina y 88% de la actividad con
respecto al sulfato de heparana (1,81 mg/ml de proteína y 1.72
unidades/ml con respecto a la heparina y 2.16 unidades/ml con
respecto al sulfato de heparana y se aplican directamente en
porciones iguales a tres columnas (2.5 x 20 cm) que contienen 600 ml
de QAE-Sephadex. Estas columnas de
QAE-Sephadex se han equilibrado previamente con 50
mM de reactivo de fosfato sódico de pH 7.0 a 4ºC. Luego, cada
columna se lava con un volumen por columna de 50 mM de reactivo de
fosfato, pH 7.0, a 4ºC. Después, se recogen y combinan las
fracciones que contienen la actividad de la liasa que han pasado a
través de las columnas sin interacción. Loa 2.6 litros de eluyente
se concentran después a 63 ml (conteniendo 8.23 mg/ml de proteína)
mediante filtrado a presión con Amicon a 413.7x103º Pa(60
psi) y 4ºC utilizando una membrana PM-10 de 43 mm
(peso molecular 10,000).
Los 63 ml de solución
QAE-Sephadex purificada y concentrada se dividen en
doce partes alícuotas de 5 ml y se almacenan a -70ºC hasta que se
necesiten. Se extrae una muestra de 5 ml (43 mg de proteína) del
congelador, se deja descongelar a la temperatura ambiente y,
empleando un espira de 5 ml, se inyecta en una columna
HA-HPLC. A continuación, se equilibra la columna de
HA-HPLC con 50 mM de reactivo de fosfato sódico de
pH 7.0. Después de cargar la muestra, se lava la columna con 50 mM
de reactivo de fosfato sódico de pH 7.0 a 0,5 ml/min, durante 20
minutos. Para eluir la columna se emplea un gradiente lineal de 60
ml de 50 mM de fosfato sódico, pH 7.0, a 50 mM de reactivo de
fosfato sódico que contiene 750 mM de cloruro sódico, pH 7.0. La
elusión se gradúa continuamente a 280 nm y, una vez completo el
gradiente, se lava la columna con 5.0 ml de 50 mM de fosfato sódico
que contiene 1 M de cloruro sódico,de pH 7.0, para eliminar las
proteínas firmemente adheridas y después, se
re-equilibra con el reactivo de 50 mM de fosfato
sódico, de pH 7.0. Esta fase de fraccionamiento se repite con las 11
partes alícuotas restantes. Las fracciones correspondientes a la
liasa de heparina I, liasa de heparina II y liasa de heparina III de
cada uno de los 12 fraccionamientos, se reagrupan, se dializan con
20 volúmenes de reactivo de 50 mM de fosfato sódico, pH 7.0 durante
12 h. a 4ºC y se concentran a 60 psi y 4ºC utilizando el filtrador a
presión Amicon equipado con membranas PM-10. Los
tres preparados de liasa se dividen en partes alícuotas de 1 ml y se
congelan a -70ºC.
Los preparados de liasa I y III de heparina,
aislados de la HA-HPLC, se sacan del congelador de
-70ºC, se deshielan a la temperatura ambiente y se aplican a una
columna de intercambio de cationes Mono-S FPLC HR
5/5 equilibrada con reactivo de fosfato sódico 50 mM, pH 7.0. Una
parte de cada preparado de liasa, conteniendo 350 \mul de proteína
de 1.75 mg, se inyecta y se lava la columna a 1 ml/min durante 5
minutos con reactivo de fosfato sódico 50 mM, pH 7.0, para eluir las
proteínas no interactivas. Se utiliza un gradiente lineal de
reactivo de fosfato sódico de 50 mM, pH 7.0 a 50 mM de fosfato
sódico que contenga 500 mM de cloruro sódico, pH 7.0 y la elución
se gradúa a 280 nm. Las fracciones de liasa I y liasa III de
heparina activas se dializan a 4ºC con 200 mM de reactivo de fosfato
sódico de pH 7.0 durante 12 h. y se concentran utilizando el
filtrador de presión Amicon con una membrana PM-10
(Peso molecular 10,000).
Los preparados de liasa I y III de heparina
obtenidos de la Mono-S FPLC y el preparado de
heparina de liasa II obtenidos a partir de HA-HPLC,
se aplican a una columna HPLC de cromatografía de permeación de gel
Bio-Sil (GPC) (1 x 25 cm) equilibrada con reactivo
de fosfato sódico de 200 mM, pH 7.0. Se inyecta cada liasa (muestras
de 250 \mul conteniendo 800 \mug de proteína para las liasas I
y III; muestras de 200 \mul conteniendo 1.5 mg de proteína para la
liasa II), se eluyen a razón de 1 ml/min y se mide la absorbancia a
280 nm. Esta separación se repite 5 veces para las liasas
I-III. Las fracciones activas se reagrupan
comprobando la actividad de la liasa y la concentración de
proteínas. Cada liasa de heparina se dialisa con 50 mM de reactivo
de fosfato sódico, pH, concentrado a 413.7 x 103 Pa(60 psi) y
4ºC utilizando filtrado por presión con membranas de 25 mm
PM-10 (peso molecular 10,000) y se subdivide en
partes alícuotas de 10 \mul y se almacena a -70ºC.
Se lleva a cabo una SDS-PAGE
discontinua en las tres liasas de heparina utilizando una
modificación de un procedimiento descrito por Laemmli, U,K. (1970)
Nature 227, 680-685 (Fig. 4). Los geles se fijaron
con ácido tricloroacético al 12% (w/v), se aclaró con agua destilada
desionizada y se coloreó con una solución Rapid Coomassie Stain y se
decoloró.
La electroforesis con gel IEF se efectuó con
geles de agarosa prefundidos (85 x 100 mm), humedeciendo dos
torcidas de electrodos con ácido fosfórico 1 M (anolito) e
hidróxido sódico 1 M (catolito).La electroforesis se realizó a 5
vatios durante 5 minutos y después a 10 vatios durante 1 h. hasta
que la tensión fue constante a 1200 v. El gel se fijó inmediatamente
en ácido tricloroacético acuoso al 15%, se tiñó y se aclaró con
agua, se secó durante una noche y se coloreó utilizando Coomassie
G-250 y luego, se decoloró.
Se efectuó una electroforesis de gel de
ácido-urea continua con geles de tubo de
poliacrilamida al 10% (Panyim, S. y Chalkley, R. (1969) Arch.
Biochem. Biophys. 130, 337-346). Se prepararon
muestras de liasa de heparina I-III (10 \mug) en
reactivo de urea-ácido acético que contenía glicerol y naftol rojo
como tinte localizador. La electroforesis se efectuó con una
corriente constante de 2.5 mA/gel de tubo. Las proteínas se enviaron
hacia el cátodo durante 2 h. aprox. hasta que los 100 \mug de
citocromo c estándar (una banda parda) se encontraron en el fondo de
su tubo. El coloreado y decolorado se efectuaron en la forma
descrita para SDS-PAGE.
Para la electroforesis de la zona capilar en las
tres liasas de heparina, se empleó un sistema de electroforesis
capilar Dionex con una capilaridad de 375 \mum x 70 cm por un
método ya conocido para análisis de proteína (Lauer, H.H. y
McManigill, D (1986) Anal. Chem. 58, 166-170 en 20
mM CAPS que contenían 10 mM de cloruro potásico, pH 11.0 a 20 kV a
la temperatura ambiente y la detección se efectuó por absorbancia a
280 nm. Se analizaron muestras de liasa de heparina
I-III (20 nl) que contenía cada una 2.74, 2.07 y
2.45 mg/ml, respectivamente.
El HPLC(HP-1090 Hewitt
Packard, CA) de fase inversa (RP) utiliza una columna vYDAC c18
(sASISEKHARAN, r. (1991), tesis de doctorado, Clonación y
Caracterización Bioquímica de heparinasa de Flavobacterium
heparinum, Universidad de Harvard). Se inyectó un nmol de cada
enzima purificada en la columna RP-HPLC y se eluyó
utilizando un gradiente de 0 a 80% de acetonitrilo en 0.1 a 1 TFA,
H20 durante 120 minutos. Estos perfiles de elución se fijaron a 210
y 280 nm. Los picos de las enzimas se aislaron para análisis de
amino-ácidos para composición y digestión contripsina para
representación de péptidos.
Se desnaturalizó un nanomol de cada una de las
enzimas de RP-HPLC purificada en 50 \mul de 8 M de
urea que contenía 400 mM de carbonato amónico y 5 mM de ditiotreitol
a 50ºC (Sasiskharan, R. (1991), Tesis de doctorado). Después de
enfriar a la temperatura ambiente, se aquilataron las proteínas con
10 mM de acetamida de yodo durante 15 min. en lugar oscuro. El
volumen de reacción total fue de 200 \mul. Luego, se añadió
tripsina (4%, w/w) a cada solución de liasa y las proteínas se
digirieron a 37ºC durante 24 h. La proteolisis se dio por terminada
calentando a 65ºC durante 2 minutos. Los péptidos formado en cada
digestión eran completamente solubles y se inyectaron en la columna
RP-HPLC y se eluyeron empleando un gradiente de 0 a
80% de acetonitrilo durante 120 min. Las representaciones trípticas
de péptidos se realizaron a 280 nm.
El análisis composicional de amino-ácidos se
efectuó en los Laboratorios de Biopolímeros del Instituto de
Tecnología de Massachusetts sobre un modelo de Biosistemas Aplicados
Analizador Derivatizador de Amino-ácidos 420/130 utilizando la
química de derivatización de precolumna de fenilisotiocianato. El
hidroanálisis en fase gaseosa de muestras se llevó a cabo utilizando
un puesto de trabajo de hidrólisis Waters Pico Tag. En la
derivatización de precolumna se acoplaron amino-ácidos libres con
fenilisotiocianato para formar feniltiobarbamil aminoácidos que se
detectaron a 254 nm al ser eluídos desde la columna de fase
invertida. Para la hidrólisis se empleó ácido clorhídrico 6 N, 0,1%
de fenol a 155ºC durante 1 h. o a 100ºC durante 22 h. También se
estudiaron los tiempos de hidrólisis de 36 y 48 h. para garantizar
que la proteína se estaba hidrolizando por completo con una
destrucción mínima de residuos de amino-ácidos. El análisis terminal
N se realizó sobre 1 nmol de liasa de heparina
I-III.
La actividad del pH óptima para cada una de las
liasas se obtuvo emplean ácido succínico (4.0-6,5),
bis-tris propano (BTP-HCl
(6.5-9.0), así como Tris-HCl y
fosfato sódico (6-0-7.5). Las
soluciones experimentales de liasa de heparina I-III
se obtuvieron diluyendo una muestra de 10 \mul de la liasa
purificada (2-3 mg/ml de concentración de proteína)
con 90 \mul de tampón de fosfato sódico a 50 mM, pH 7,0 y
colocándolo en hielo hasta que fuera necesario para el ensayo. Las
actividades de cada liasa (I actuando sobre la heparina, II actuando
sobre heparina y sulfato de heparina y III actuando sobre sulfato de
heparana, se determinaron para diferentes valores de pH.
La solución amortiguadora que proporciona una
actividad óptima par cada liasa de heparina, se eligió ensayando
reactivos experimentales de una capacidad amortiguadora próxima al
pH óptimo calculado en anteriores experimentos. Estos moderadores
eran: Tris-HCl, fosfato sódico, HEPES, MOPS, TES y
BTP-CHl. Cada moderador se preparó a 50 mM y su pH
se ajustó con ácido clorhídrico o hidróxido sódico a 6.9 para la
liasa de heparina II actuando sobre heparina, 7.15 para liasa de
heparina I, 7.3 para liasa de heparina II actuando sobre sulfato de
heparana y 7.6 para liasa de heparina III. La soluciones
experimentales de liasa de heparina se fabricaron diluyendo enzima
en 50 mM de moderador de fosfato sódico ajustado al pH apropiado tal
como se ha descrito. La actividad de la liasa de heparina se
determinó para cada solución tampón. La actividad se comprobó
inmediatamente después de la adición a cada moderador y luego de
incubar durante 24 h. a 37ºC.
El moderador BTP-HCl (50 mM) se
preparó conteniendo o bien 10 mM de cloruro cálcico, 10 \muM o 1
mM de cloruro de cobre (II), 10 \muM y 1 mM de cloruro de mercurio
(II) y 1 mM de cloruro de cinc (II). Cada solución se ajustó al pH
óptimo para la liasa a ensayar y la actividad de las liasas de
heparina se midió en presencia y en ausencia de metales
divalentes.
Se investigó la concentración en sal para una
actividad óptima, utilizando cloruro sódico, cloruro potásico y
acetatos sódico y potásico para diferenciar entre concentración
iónica y efectos iónicos específicos. Las concentraciones de sal
añadidas variaron entre 0 y 500 mM y se prepararon en 50 mM de
moderador de fosfato sódico, después de lo cual se ajustó el pH a
cada óptimo enzimático y se midió la actividad de la liasa de
heparina.
La temperatura para un actividad óptima se
determinó para las liasas de heparina en su pH óptimo en moderador
de fosfato sódico (el moderador experimental de liasa de heparina I
contenía 100 mM de cloruro sódico) en incrementos de 5º a
temperaturas entre 15 y 55ºC. La temperatura se ajustó en un
espectrofotómetro de temperatura regulada y se equilibró durante 10
minutos antes del ensayo.
Se prepararon soluciones experimentales de liasa
con el moderador apropiado y se colocaron en baños de María a las
siguientes temperaturas: liasa I de heparina a 30ºC; liasa II de
heparina a 35ºC y liasa III de heparina a 35 y a 40ºC. Se tomaron
pequeñas partes alícuota a diversos intervalos (1-22
h) para medir la actividad enzimática restante.
Las constantes Michaelis-Menten
se determinaron empleando unas condiciones optimizadas. El valor de
la absorbancia final de la despolimerización total se dividió por 20
para hallar un valor que representa el 5% de la reacción completa.
Los preparados de liasa purificados se diluyeron de forma que el 5%
de la despolimerización total solamente se alcanzara al final de un
ensayo de 3 minutos. Las velocidades de reacción de las
concentraciones molares específicas para cada liasa y sus sustratos
se emplearon para análisis cinéticos utilizando el programa de
curvas hiperbólicas EZ-FIT de Perella, F.W. (1988)
Anal. Biochem. 174, 437-447). Se prepararon
soluciones de sustratos de 50 mg/ml de heparina y 40 mg/ml para
soluciones concentradas de sulfato de heparana. Estas constantes se
determinaron a 30ºC en 50 mM de moderador de fosfato sódico de pH
7.15 conteniendo 100 mM de cloruro sódico para la liasa de heparina
I, 50 mM de amortiguador de fosfato sódico de pH 7.3 para heparina
y pH 6.9 para sulfato de heparana y a 35ºC en 50 mM de amortiguador
de fosfato sódico de pH 7.6 para liasa de heparina III.
Se agrega cada liasa de heparina a una solución
de polisacáridos complejos (1 mg/ml) en condiciones de ensayo
optimizadas y la reacción se mantiene en 232 nm durante 30 min.
La cantidad de liasa purificada fue suficiente
para la completa despolimerización de la heparina o de los sustratos
de sulfato de heparana durante 30 minutos. Se midió el ritmo inicial
de despolimerización de cada polisacárido, se continuó la reacción
durante 24 horas y el nivel final de despolimerización de
polisacárido se evaluó midiendo la absorbancia definitiva a 232 nm
y expresada como actividad en porcentaje.
Se investigan estabilidades de liasas de heparina
con respecto al deshielo y la liofilización utilizando dos
excipientes, albúmina sérica bovina (BSA) y lactosa a 0,5% en peso.
Cada liasa se disolvió en 50 mM de reactivo de fosfato sódico que
contenía 2 mg/ml de BSA o 50 mM de reactivo de fosfato sódico que
contenía 0,5% de lactosa en concentraciones de 1-3
unidades/ml. Después, estas soluciones de liasa se dividieron en 3
partes alícuotas iguales y una de cada una se sometió a deshielo,
liofilización o se retuvo como control en un baño helado. Las
actividades de las liasas de heparina I-III se
determinaron en presencia y ausencia de excipientes luego de: 1)
breve almacenamiento a 4ºC; 2) congelación a -70ºC y deshielo; y 3)
congelación a -70ºC, liofilización y reconstitución con un volumen
igual de agua fría.
Se llevó a cabo una lisis celular optimizada de
F. heparinum por sonicación durante 10 min a 100 vatios,
utilizando un modo de impulsos del 40% sin inactivación de la enzima
liberada. La precipitación de protamina aumenta la actividad total y
específica en 42 veces sin reducir la concentración de proteínas,
eliminando presuntamente los ácidos nucleicos polianiónicos que
pueden inhibir competitivamente las liasas de heparina. Una fase de
purificación de lotes HA reduce considerablemente la concentración
de proteína y otras actividades contaminantes asociadas al
metabolismo de la heparina/sulfato de heparana; pero no separa las
tres actividades de la liasa de heparina. Para eliminar las
proteínas acídicas se utiliza QAE-Sephadex. El
HA-HPLC resuelve las tres actividades de la liasa.
Un gradiente lineal de cloruro sódico se utiliza para eluir liasas
de heparina I-III con 330, 555 y 435 mM de cloruro
sódico, respectivamente, como puede verse en la fig. 1. Las liasas
de condroitina/sulfato de dermatan también presentes en esta
bacteria, se eluyen de la columna HA-HPLC al final
del gradiente inmediatamente después de la liasa de heparina II.
Este procedimiento permite una buena recuperación de la actividad
total de la liasa de heparina, reduciendo la concentración de
proteína. Las liasas I y III de heparina se depuraron más por
intercambio de cationes FPLC, tal como se indica en la fig. 2. La
liasa I de heparina se recupera con una excelente retención de la
actividad y una gran disminución de la concentración de proteína. La
actividad específica de la liasa de heparina III no mejora
utilizando Mono-S FPLC, como lo demuestra la
sustancial reducción de la actividad total; pero el análisis
SDS-PAGE revela una mejora de la pureza de la liasa
de heparina III después de esta fase. La liasa de heparina II no se
depura con Mono-S FPLC porque no se liga a la
columna. En la fase de depuración final, las liasas de heparina
I-III se fraccionan utilizando GPC, tal como se ve
en la fig. 3.
Después de la GPC, cada preparado de liasa de
heparina se comprueba que está homogéneo por
SDS-PAGE, PAGE con ácido-urea, IEF,
electroforesis de zona capilar y fase inversa de HPLC. Los pesos
moleculares calculados por SDS-PAGE de las liasas de
heparina I-III fueron 42,000, 84,100 y 70,800
respectivamente.
Los resultados obtenidos empleando este sistema
de purificación de las tres liasas de heparina se resumen en la
tabla I. La liasa de heparina I se depuró 3400 veces sobre el
homogenato celular. El programa proporcionó un rendimiento general
sobre la base d una masa de 0,03%, un rendimiento sobre la base de
la recuperación total de la actividad del 10.8% y una actividad
específica de 130 unidades/mg. La liasa de heparina II se depuró
5200 veces sobre el homohenato celular con un rendimiento general
basado en una masa de 0,02%. Esta enzima tenia una actividad
específica de 19 unidades/mg respecto a la heparina con una
recuperación total de la actividad del 1.02%. Este preparado
enzimático tenía una actividad específica de 36.5 unidades/mg
respecto al sulfato de heparana y una recuperación total de la
actividad del 1.54%. La liasa de heparina III se depuró 5100 veces
sobre el homogenato celular con un rendimiento basado en la masa de
0,02%, un rendimiento basado en la actividad total de 2.74% y una
actividad específica de 63.5 unidades/mg.
| Fase de depuración | Proteína | Actividad | Unidad/mg | % de actividad |
| Liasa de heparina I Homogenización celular. | 8150 | 66 | 8.12 x 10-3 | |
| Protam Ppt. | 7960 | 2890 | 3.63 x 10-1 | 100 |
| Lote-HA | 2720 | 2580 | 9.50 x 10-1 | 89.4 |
| QAE Sepharose | 519 | 2220 | 4.27 | 76.8 |
| HA-HPLC | 22.6 | 944 | 41.8 | 32.7 |
| Mono-S-FPLC | 7.36 | 877 | 119 | 30.4 |
| . GPC-HPLC | 2.40 | 313 | 130 | 10.8 |
| Liasa de heparina II actuando sobre la Homogenización | ||||
| celular heparina | 8150 | 66 | 8.12 x 10-3 | |
| Protam Ppt. | 7960 | 2890 | 3.63 x 10-1 | 100 |
| Lote-HA | 2720 | 2580 | 9.50 x 10-1 | 89.4 |
| . QAE-Sepharose | 519 | 22220 | 4.27 | 76.8 |
| . HA-HPLC | 19.6 | 109 | 5.53 | 3.8 |
| . GPC-HPLC | 1.55 | 29.4 | 19 | 1.02 |
| Liasa de heparina II actuando sobre sulfato de heparana | ||||
| Homogenización celular | 8150 | 91.5 | 1.13 x 10-2 | |
| Protam Ppt | 7960 | 3680 | 4.63 x 10-1 | 100 |
| )... Lote-HA | 2720 | 2580 | 1.19 | 88.0 |
| QAE-Sepharose | 519 | 2220 | 4.11 | 57.8 |
| HA-HPLC | 19.6 | 275 | 14 | 7.46 |
| GPC-HPLC | 1.55 | 56.5 | 36.5 | 1.54 |
| Liasa de heparina III Homogenización celular | 8150 | 91.5 | 1.13 x 10-2 | |
| Protam Ppt | 7960 | 3860 | 4.63 x 10-3 | 100 |
| . Lote-HA | 2720 | 3420 | 1.19 | 88.0 |
| QAE Sepharose. | 519 | 2130 | 4.11 | 57.8 |
| HA-HPLC | 23.1 | 1010 | 43.6 | 27.4 |
| Mono 5 FPLC | 8.41 | 348 | 41.4 | 9.45 |
| GPC-HPLC. | 1.59 | 101 | 63.5 | 2.74 |
Se investigaron las características físicas,
cinéticas y de estabilidad de las tres liasas de heparina. El
SDS-PAGE (Laemmli, Reino Unido (1970) demuestra que
las tres liasas de heparina eran aparentemente homogéneas. Los pesos
moleculares de la liasas de heparina I,III se estimaron en 42,800,
84,100 y 70,800, respectivamente. El SDS-PAGE no
reductor sin beta-mercaptoetanol reveló los mismos
tipos de segregación, indicando que no había presentes
sub-unidades. El IEF se utilizó para determinar los
puntos isoeléctricos de las tres liasas de heparina y para evaluar
su pureza. El IEF empleando una serie de gradientes de pH (pH
3-10, 7-10 y
8.5-10.5) no proporcionaron valores pl seguros para
las tras liasas toda vez que cada una de ellas emigró a una posición
muy próxima al cátodo. Entonces, se empleó un gel de agarosa con un
gradiente de pH de 9-11, enfocando las tres
proteínas por debajo de la banda de citocromo c estándar (pl=10.25).
Los valores pl medidos para las liasas de heparina
I-III fueron 9.1-9.2,
8.9-9-1 y 9.9-10.1
respectivamente. El PAGE de urea-ácido acético en geles de tubo
utilizando el método de Panyim, S y Chalkley, R (1969) confirmó la
homogeneidad de las tres liasas de heparina. Los electroferogramas
de la electroforesis en zona capilar (Lauer, H.H y McManigill, D
(1986) de cada liasa de heparina proporcionaron un pico simétrico
sencillo. Las liasas de heparina I-III, registraron
unos tiempos de emigración de 12.7, 12,4 y 13.4 min.,
respectivamente. El RP-HPLC se utilizó para desalar
las tres liasas de heparina antes del análisis composicional de
amino-ácidos y de la digestión tríptica para la representación de
péptidos (Sasisekharan, R (1991), tesis doctoral. Resulta
interesante que cada cromatograma refleje un doblete muy cercano que
indica la presencia de isoformas, posiblemente como consecuencia de
la modificación post-translacional. Los análisis de
aminoácidos de las isoformas de liasa de heparina para I, II y III
fueron idénticos. Las isoformas difieren ligeramente en
hidrofilicidad, posiblemente a causa de alguna modificación
post-translacional tal como la glucosilación o
fosforilación. La isoforma principal de las liasas de heparina
I-III presentaron unos tiempos de retención de 38.5,
44.3 y 42.7 min., respectivamente, en RP-HPLC. El
pico principal RP-HPLC correspondiente a cada liasa
de heparina fué tratado exhaustivamente con tripsina para preparar
fragmentos de péptidos, los cuales se volvierona a analizar
empleando RP-HPLC. Según puede verse en las figs. 6A
y 6B, la capa de péptido de cada liasa fué claramente diferente a
pesar de que se observaron algunos fragmentos de péptidos
comunes.
comunes.
Los análisis de amino-ácidos de la tres liasas de
heparina se muestran en la tabla II. El terminal aminoácido N se ha
modificado y, por consiguiente, no puede detectarse por la sucesión
de aminoácidos de las tres liasas. La composición de los
amino-ácidos y la representación de los péptidos demuestra que las
liasas de heparina I-III son productos génicos
diferentes y que las liasas de heparina I y III no se han procesado
solamente post-translacionalmente a partir de la
liasa de heparina principal II.
Todas las liasas contienen una elevada cantidad
de lisina que puede contribuir a sus elevados picos isoeléctrios en
modelado por ordenador utilizando la composición de los amino-ácidos
de la liasa de heparina I, lo que suministra un pico isoeléctrico
calculado de 9.33 en coincidencia con los valores experimentales
obtenidos por enfoque isoeléctrico.
\vskip1.000000\baselineskip
| Amino-ácido | Heparinasa I | Heparinasa II | Heparinasa III |
| ASX | 45 | 91 | 95 |
| GLX | 36 | 62 | 67 |
| SER | 24 | 37 | 38 |
| GLY | 30 | 101 | 50 |
| HIS | 6 | 14 | 13 |
| ARG | 13 | 37 | 35 |
| THR | 20 | 35 | 25 |
| ALA | 26 | 55 | 52 |
| PRO | 20 | 40 | 35 |
| TYR | 27 | 54 | 37 |
| VAL | 18 | 44 | 37 |
| MET | 2 | 15 | 7 |
| ILE | 20 | 31 | 24 |
TABLA II
(continuación)
| Amino-ácido | Heparinasa I | Heparinasa II | Heparinasa III |
| LEU | 17 | 53 | 42 |
| PHE | 17 | 35 | 36 |
| LYS | 47 | 47 | 40 |
Suponiendo 727 amino-ácidos para la heparinasa II
(84.000 daltons) y 636 amino-ácidos para la heparinasa III (70,000
daltons). No se informa sobre Cys y Trp.
Las condiciones de reacción óptimas para cada una
de las tres liasas de heparina se determinó mediante una serie de
experimentos. El primer parámetro examinado fue el pH óptimo. Se
comprobó que una concentración de heparina de 2.5 mg/ml para las
liasas de heparina I y II y una concentración de sulfato de heparana
de 1.0 mg/ml para las m liasas de heparina II y III presentaban una
saturación sobre los valores básicos dados a conocer (14,26) y sobre
los experimentos preliminares. Inicialmente, se eligió una
temperatura de reacción de 37ºC como media de los valores que
figuran en la bibliografía (Linhardt, R.J, Turnbull, J.E., Wang,
H.M, Loganathan, D, y Gallagher, J.T (1990); Silva, M.E., Dietrich,
C.P y Nader, H.B. (1976); Yang, V.C, Linhardt, R.J., Berstein, H,
Cooney, C.L. y Langer, R (1985). La temperatura se modificó
posteriormente después de determinar la óptima para cada liasa.
Los pH óptimos determinados fueron 7.15 para la
heparina de la liasa I, 7.3 para la heparina y 6.9 para el sulfato
de heparina de la liasa II y 7.6 para el sulfato de heparana de la
liasa III.
El reactivo que proporcionó la actividad óptima
para cada liasa de heparina se eligió empleando diferentes reactivos
ajustados cada uno al pH óptimo para la enzima y sustrato a
estudiar. La liasa de heparina I presentó unas velocidades de
reacción iniciales similares en Tris-HCI y
BTP-HCl, una actividad intermedia en fosfato sódico
y un actividad reducida en MOPS, TES, y HEPES. Después de incubar
en cada reactivo a 37ºC durante 24 h., la actividad se redujo a
1-20% de su valor inicial. La liasa de heparina I
incubada en MOPS, TES y HEPES retuvo la máxima actividad. La
actividad de la liasa II de heparina sobre la heparina fue
notoriamente similar en los seis reactivos. En cambio, al actuar
sobre el sulfato de heparana, la liasa de heparina II registró una
marcada reducción de actividad en MOPS, TES y HEPES. Después de
incubar en cada reactivo, se comprobó que MOPS, TES y HEPES
protegían mejor la actividad de la liasa II de heparina
(30-70% de retención de actividad) c con respecto a
la heparina y al sulfato de heparana. La liasa de heparina III
mostró solamente ligeras diferencias en actividad en los seis
reactivos estudiados. MOPS y HEPES protegieron la actividad de la
liasa III de heparina (15-30% de retención de
actividad) después de la incubación.
El efecto de los iones del calcio, del cobre
(II), del mercurio (II) y del cinc (II) sobre las velocidades de
reacción iniciales de la liasa de heparina se investigaron sobre la
base de la literatura existente sobre el tema (Silva, M.E, Dietrich,
C.P y Nader, H.B (1976); Hovingh, P y Linker, A (1970). El reactivo
BPT-HCl (50 mM) fue elegido por su compatibilidad
con estos iones.
La concentración ionica (0-500
mM) para una actividad óptima, se investigó para cr liasa de
heparina en su pH óptimo en 50 mM de reactivo de fosfato sódico. El
cloruro sódico, el cloruro potásico, el acetato sódico y el acetato
potásico proporcionaron unas actividades comprables con la misma
concentración iónica. La liasa de heparina I registró una mayor
actividad en respuesta a concentraciones salinas elevadas, con una
actividad óptima a 100 mM. Las liasas de heparina II y III
mostraron, cada una, una disminución de la actividad al aumentar la
concentración de sal añadida. Con 400 mM de sal, la actividad de las
liasas de heparina I-III desapareció casi por
completo.
La temperatura para una actividad óptima se
determinó para las liasas de heparina en 50 mM de reactivo de
fosfato sódico con su pH óptimo (con liasa I de heparina con
contenido de 100 mM de cloruso sódico) utilizando temperaturas entre
15 y 55ºC. Las temperaturas para una actividad máxima fueron de 35ºC
para la liasa de heparina I, 40ºC para la liasa de heparina II
actuando sobre heparina y sulfato de heparana y 45ºC para liasa de
heparina III. La estabilidad óptima de la temperatura para liasas de
heparina se estableció para garantizar que la inactivación térmica
no influía en los experimentos tendentes a determinar las constantes
cinéticas. Las liasas de heparina I y III (concentración de
proteínas de 650 ng/ml) mostraron una disminución exponencial de la
actividad. La liasa I perdió el 80% d su actividad en 5 h. a 30ºC.
La liasa II perdió el 80% de su actividad en 3.5 h. y 0,5 h a 35ºC y
40ºC, respectivamente. La liasa de heparina II (concentración de
proteína 1-2 \mug/ml) mostró una disminución más
lenta de su actividad, reteniendo el 70% de su actividad en la
heparina y en el sulfato de heparana luego de 25 h. a 35ºC. Todos
los demás estudios sobre las liasas I-III de
heparina emplearon 30, 35 y 35ºC, respectivamente para mantener una
actividad elevada y conservar la estabilidad enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Las liasas de heparina mostraron una actividad
inferior a 0,5% con respecto al sulfato C de condroitina y al
sulfato de dermatán y ninguna actividad con respecto al sulfato de
condroitina A, D y E. No se observó actividad alguna frente a la
hialuronidasa y a la glucuronidasa y una actividad inferior al 0,5%
frente a la sulfatasa.
La especificidad de las tres liasas de heparina
se examinó utilizando sus sustratos de polisacáridos y se midió la
proporción inicial y el nivel final de heparina y la
despolimerización al sulfato de heparana. La liasa de heparina
I-III actuó en una media de 7, 14 y 1 puntos en el
polímero de heparina y en 5, 25 y 20 sitios en el polímero de
sulfato de heparana, respectivamente. La liasa de heparina II actuó
sobre el sulfato de heparana en 1,7 veces la proporción inicial
observada con la heparina. Se prepararon recubrimientos de
oligosacáridos, en los que los productos de los mismos se analizaron
mediante un sólido intercambio de aniones HPLC y de gradiente PAGE
(Linhardt, R.J, Turnbull, J.E., Wang, H.M, Loganathan, D y
Gallagher, J.T. (1990) para cada liasa de heparina que actuara sobre
la heparina y sobre el sulfato de heparana (Lohse, D.L. (1992),
tesis doctoral, Las lisas de heparina de Flavobacterium
heparinum, Universidad de lowa). Estos datos concuerdan con la
especificidad de la liasa de heparina I-III
indicada en la fig. 5.
Las constantes de
Michaelis-Menten se determinaron empleando las
condiciones de reacción óptimas en experimentos previstos para
calculas las velocidades de reacción en cada concentración de
sustratos en donde se había consumido menos del 10% (Tabla III).
Fue necesario estudiar las condiciones para el
almacenamiento óptimo de las liasas de heparina toda vez que la
literatura sobre el tema está repleta de ejemplos de la
inestabilidad de estas enzimas. En caso de ausencia de excipiente,
la liasa de heparina I se almacena a 4ºC después de una
congelación-deshelado sencilla y luego de una
congelación-secado, manteniendo 50, 45 y 25% de su
actividad respectivamente. La adición de 2,0 mg/ml de BSA mejoró la
estabilidad al almacenamiento, dando lugar a una retención de
actividad superior al 85%, como lo logró la adición de lactosa al
5%, que permitió una retención de la actividad del
40-80%. La liasa de heparina II retuvo una actividad
superior al 75% en todas las condiciones de almacenamiento y la
adición de BSA o de lactosa proporcionó una ligera estabilización
adicional. La liasa de heparina III es muy inestable a la
congelación-deshielo y a la liofilización y mantiene
la mayor parte de su actividad durante un breve almacenamiento a
40ºC; pero pierde del 70 al 80% durante la
congelación-deshielo o la congelación por secado. La
presencia de BSA incrementa la actividad recuperada en
20-25%; pero la adición de lactosa desestabiliza la
liasa de heparina III.
| Liasa de heparina | Sustrato | Km appa | Vmax a,b | Kcat/Kmc |
| I | Heparina | 17.8+/-1.50 | 219+/-3.48 | 8.82 |
| II | Heparina | 57.7+/-6.56 | 16.7+/-0.555 | 0.405 |
| II | Sulfato de heparana | 11.2+/-2.18 | 28.6+/-1.26 | 3.57 |
| III | Sulfato de heparana | 29.4+/-3.16 | 141+/-3.88 | 5.59 |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
a) \begin{minipage}[t]{160mm}Los valores de Km y Vmax
aparentes se derivan de las velocidades iniciales obtenidas en ocho
o más concentraciones (3-500 \mu M) de la heparina
o del sulfato de heparana. Las concentraciones proteínicas para
liasas de heparina I-III fueron 80, 994 y 68 ng/ml,
respectivamente. Los errores normales de los valores Km y Vmax
indican la precisión de las proporciones iniciales y concentraciones
correspondientes de heparina o sulfato de heparana con respecto a la
ecuación de Michaelis-Menten descrita en
Materiales y métodos .\end{minipage} \cr b)
\begin{minipage}[t]{160mm}Vmax se expresa como \mu mol/min mg
de proteína\end{minipage} \cr c)
\begin{minipage}[t]{160mm}Kcat/Km se expresa como
(s- \mu M)-1\end{minipage} \cr}
El pH óptimo calculado para la liasa de heparina
I fue 7.15, valor superior al pH de 6.5 citado por Yang y col.
(1985) y por Linker y col. (Hovingh y Linker (1965 y 1970). Ambos
grupos probaron sus preparados de liasa utilizando períodos de hasta
6 h. cuando la inestabilidad térmica pudiera ser un factor.
El período máximo empleado en este estudio fue
solamente de 3 min. El pH óptimo de la liasa de heparina II actuando
sobre el sulfato de heparana fue 6.9. El pH óptimo para la liasa de
heparina III fué 7.6. Hovingh y Linker, así como Dietrich y col.
informan de un pH óptimo entre 6.0 y 7.0 para esta enzima. También
aquí, los intervalos experimentales empleados por ambos grupos
ascendieron hasta 6 h. y la inestabilidad térmica podría ser la
causa de las diferencias entre estos valores.
La actividad de la liasa de heparina I se reduce
ligeramente con 1 mM de cinc y, de forma acusada, con 10 \muM y 1
mM de mercurio y 1 mM de cobre. El calcio a 10 mM aumenta la
actividad en un 30%. La actividad de la liasa de heparina II
actuando sobre la heparina y el sulfato de heparana en presencia de
iones metálicos divalentes muestra inhibición por todos los metales
ensayados excepto para 10 \muM de cobre. Incluso el calcio reduce
espectacularmente la actividad de la liasa de heparina II. La liasa
de heparina III se activa con el calcio (20%), no resulta afectada
por el cobre y el mercurio (ambos con 10 \muM) e inhibida por el
cinc, el mercurio y el cobre (todos con 1 mM). En general, la
adición de iones metálicos divalentes disminuye la actividad de las
liasas de heparina, habiéndose observado una actividad óptima de la
liasa de heparina I con una concentración iónica de 100 mM. Las
liasas de heparina II y III reducen la actividad al aumentar las
concentraciones salinas.
La Tabla III resume las constantes aparentes de
Michaelis-Menten para las liasas de heparina
I-III que actúan sobre la heparina y el sulfato de
heparana. Se informa de unos valores de Km aparentes para la liasa
de heparina I que oscilan entre 0,3 y 42 \muM y una Vmax de 19,7
\mumol/min/mg de proteína (Rice y col., (1989); Yang y col.
(1985); Lindhardt, (1984). También se ha informado de un Km aparente
de 5.7 \muM y Vmax de 3.57 x 10-3 \mumol/min
para una liasa de heparina modificada III actuando sobre sulfato de
heparina (Rice y Linddhardt, (1989).
Las liasas I y II de heparina actúan sobre la
heparina y el sulfato de heparana mientras que las liasa de heparina
III actúa solamente sobre el sulfato de heparana. Ello no obstante,
las tres enzimas actúan endolíticamente y todas las zonas
disociables del interior del polímero puede no ser igualmente
susceptibles (Cohen, D.M y Linhardt, R.J (1990) Biopolymers
30.733-741). Los enlaces primarios dentro de estos
sustratos poliméricos que se disocian por cada enzima se han
deducido de los experimentos de representación de oligosacáridos. La
especificidad de las liasas de heparina puras I-III
hacia la heparina y el sulfato de heparana fueron idénticas a las
indicadas anteriormente para sus contrapartidas parcialmente
purificadas y comercialmente preparadas. Los sustratos de
oligosacáridos (es decir, tetrasacáridos y hexasacáridos) con
ubicaciones equivalentes son malos sustratos. La Vmax/Km observada
para las liasas de heparina I y III actuando sobre sustratos de
tetrasacáridos es únicamente de 0,01 a 1% de la Vmax/Km medida para
los sustratos de polímero.
También se ha estudiado la acción de las liasas
de heparina I-III sobre el dermatan y los ulfatos de
condroitina A-E. Estos sustratos varían de posición
y grado de sulfación, así como de quiralidad de su ácido urónico. La
ligera actividad de estas enzimas con respecto al sulfato de
condroitina C y al sulfato de dermatana parecen indicar que, o bien
las liasas de heparina están contaminadas o que estos sustratos
contienen pequeñas cantidades de heparina o de sulfato de heparana.
Para distinguir entre estas dos posibilidades, la reacción se siguió
durante periodos más largos. La totalidad de la actividad se
observó inicialmente y después, el sustrato se volvió estable con
respecto a cambios repetidos con enzimas recientes. Así, se confirmó
que la ligera actividad observada era el resultado de un sustrato
contaminado (aproximadamente 1% de contaminación por
heparina/sulfato de heparana en sulfato C decondroitina y sulfato de
dermatana) y no una enzima contaminada. Ninguna de las liasas de
heparina mostró actividad sobre ácido hialurónico. La falta de
actuación de las liasas de heparina sobre estas otras
glucosaminoglicanas demuestra claramente su especificidad hacia la
heparina/sulfato de heparana y la falta de actividad de liasa
contaminante. No se observó actividad de glucuronidasa (Warnick,
C.T y Linker, A. (1972) Biochemistry 11, 568-572) y
en las liasas purificadas se observó una actividad inferior a 0,5%
de sulfatasa (McLeanm M.W, Bruce, J.S., Long, W.F y Williamson,
F.B,. (1954) Eur. J. Biochem, 145, 607-615).
Se inyectó Liasa I de heparina a ratones y sus
linfocitos B se utilizaron para formar hibridomas monoclonales
generadores de anticuerpos. Se examinó la especificidad de los
anticuerpos monoclonales (mAdbs) para cada una de las tres liasas de
heparina.
Se aislaron liasas de heparina I, II y III de
Flavobacterium heparinum y se depuraron hasta la homogeneidad
en la forma ya descrita. Las concentraciones de liasa de heparina se
determinaron utilizando un equipo experimental de proteínas
Bio-Rad (Richmond, CA, EE.UU).
Se prepararon seis anticuerpos monoclonales
(mAbs). Resumiendo, se inyectó liasa de heparina I en ratones tres
veces durante un periodo de 70 días. Se extrajeron los bazos de los
ratones y e aislaron los linfocitos de la mezcla de esplenocito. Los
linfocitos se fundieron con célula de mieloma de ratón para producir
hibridomas, los cuales se cultivaron y cribaron para obtener
anticuerpos a la liasa I de heparina. Los seis hibridomas
resultantes para producir mAbs de la liasa I de heparina se
designaron como M-1A, M2-B7,
M2-A9, M-32, M-33 y
M-34. Las concentraciones proteínicas de las
soluciones mAb e determinaron utilizando reactivos experimentales de
proteínas BCA de Pierce (Rockford, IL, EE.UU.).
Las concentraciones de cada anticuerpo monoclonal
se indican en la Tabla IV.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Mab \+ \hskip1,5cm \+ (mg/mL)a\cr M-32 \+
\+ 49\cr M-33 \+ \+ 45\cr M-34 \+
\+ 41\cr M1A \+ \+ 42\cr M2-A9 \+ \+ 44\cr
M2-B7 \+ \+
48\cr}
Las membranas de nutrocelulosa, conjugado de
peroxidasa Horseradish (HRP) de cabra anti-ratón IgG
(H+L), gelatina Tris de aminometano (hidroximetilo (Tris), reactivo
para el desarrollo de color Tween-20 y HRP
(4-cloro-1-naftol,
se adquirieron en Bio-Rand (Richmond, CA, EE.UU). La
salina reactivada Tris (TBS) fué 20 mM de Tris que contenía 500 mM
de cloruro sódico de pH 7.5. La solución de bloqueo fue gelatina al
3.9% en TBS. La solución de lavado Tween-20 diluida
en TBS (TTBS) fué 0,05% de Tween-20 en TBS. El
reactivo anticuerpo fue gelatina al 1% en TBS. La solución para el
desarrollo de color se obtuvo mezclando 60 mg de reactivo para el
desarrollo de color HRP en 100 mL de metanol a 0ºC con 0,015% de
H2O2 en TBS inmediatamente antes de su uso.
Las técnicas de inmuno-ensayo por
entintado se realizaron en la forma recomendada en el Acta de
Ensayos de inmuno-entintado Bio-Rad
(Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU). En pocas palabras,
se cortaron membranas de nitrocelulosa en piezas de 2 x 3 cm y se
trazaron cuadrados de 1x1 cm en las membranas empleando un lápiz
blando. Las membranas se empaparon en TBS durante 15 minutos y se
secaron al aire sobre papel de filtro durante 15 minutos. Se
colocaron varias concentraciones de liasa de heparina (1 \muL en
TBS) en el centro de cada cuadrado y la membrana se secó al aire
durante 15 minutos y después se sumergió la membrana en solución de
bloqueo durante 1 hora para recubrir las zonas hidrofóbicas
remanentes. El conjunto se lavó cuatro veces en TTBS (dos enjuagues
rápidos y después dos agitaciones de 5 minutos), luego se empaparon
durante una noche en una solución de mAb 0,2% (V/V) en reactivo de
anticuerpos y se lavaron las membranas 4 veces con TTBS y se
añadieron a una solución de cabra anti-ratón HRP
(0,1% en reactivo de anticuerpos) durante 4 horas agitando
suavemente. Las membranas se lavaron 4 veces con TTBS y luego, dos
veces con TBS. Después, se agregó a las membranas solución HRP para
el desarrollo de color y cuando quedaron claramente visibles bandas
púrpura, se detuvo el revelado colocando las membranas en agua
destilada. Luego, se secaron las membranas sobre papel de filtro
durante 15 minutos y se cubrieron con lámina de aluminio para
protegerlas de la luz.
La electroforesis se efectuó empleando una pila
Mini-Protean II de electroforesis de
Bio-Rad (Richmond, Ca. EE.UU). La acrilamida y la
bisacrilamida de N-N'-metileno
fueron de International Biotechnologies Inc (New
Haven, CT, EE.UU) o se utilizaron como una solución de acrilamida al 40% formada por 37,5 de acrilamida: 1 N,N' de bisacrilamida de metileno (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, EE.UU). El Tris Amino metano (Tris) de hidroximetilo procedía de Bio-Rad (Richmond, CA, EE.UU). La N, N, N',N'-tetrametiletilenediamina (TEMED) procedía de Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN, EE.UU). El persulfato amónico (APS) y el ácido acético glacial procedían de Mallinckrodt Inc. (Pads, KY, EE.UU.). La urea y el glicerol procedían de Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, EE,UU.). El sulfato de dodecilo sódico (SDS) procedía de BDH ChemicalsmLtd. (Poole, Inglaterra). El rojo de naftol procedía de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), El 2-beta-mercaptoetanol procedía de EM Science (Gibbstown, NJ, EE.UU.). El azul de bromofenol era de MCB Manufacturing Chemists, Inc, Cincinnati, OH, EE.UU.). Las normas sobre pesos moleculares y la piedra coomassie rápida procedían de Diversifiet Biotech (Newton Centre, MA, EE.UU)
Haven, CT, EE.UU) o se utilizaron como una solución de acrilamida al 40% formada por 37,5 de acrilamida: 1 N,N' de bisacrilamida de metileno (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, EE.UU). El Tris Amino metano (Tris) de hidroximetilo procedía de Bio-Rad (Richmond, CA, EE.UU). La N, N, N',N'-tetrametiletilenediamina (TEMED) procedía de Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN, EE.UU). El persulfato amónico (APS) y el ácido acético glacial procedían de Mallinckrodt Inc. (Pads, KY, EE.UU.). La urea y el glicerol procedían de Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, EE,UU.). El sulfato de dodecilo sódico (SDS) procedía de BDH ChemicalsmLtd. (Poole, Inglaterra). El rojo de naftol procedía de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), El 2-beta-mercaptoetanol procedía de EM Science (Gibbstown, NJ, EE.UU.). El azul de bromofenol era de MCB Manufacturing Chemists, Inc, Cincinnati, OH, EE.UU.). Las normas sobre pesos moleculares y la piedra coomassie rápida procedían de Diversifiet Biotech (Newton Centre, MA, EE.UU)
Las liasas de heparina I, II y III y el
homogenado de Flavobcterium heparinum se analizaron
utilizando el SDS-PAGE en la forma antes descrita.
Los geles separadores (12% de acrilamida, 10% SDS) se prepararon
mezclando 4.35 mL de agua destilada, 2.5 mL de 1.5 M Tris de pH 8.8
y 3.0 mL de una solución comercialmente preparada de 37.5 de
acrilamida. 1 N-N'-bisacrilamida de
metileno (Fisher Scccientific, Fairlawn, NJ, EE.UU) en la forma
antes descrita. Esta solución se desgasificó bajo vacío durante 15
minutos por lo menos. A continuación, se añadieron 50 \muL de APS
(10%) y 5 \muL de TEMED a la solución monomérica para iniciar la
polimerización. La solución de gel se vertió rápidamente entre dos
placas de cristal separadas por distanciadores de 0,75 mm,
recubriendo con agua destilada saturada con
gamma-butanol y dejando polimerizar a 25ºC durante
60 minutos. El gel de apilado se preparó mezclando 6.4 mL de agua
destilada, 2.5 mL de 0,5 M Tris de pH 6.8, 1.0 mL de
acrilamida/solución Bis (Fisher Scientific) 50 \muL de APS (10%) y
10 \muL de TEMED-La pared de
gamma-butanol se eliminó del gel separador, éste se
aclaró con agua destilada y la solución de gel de apilado se agregó
cuidadosamente hasta la cima del gel separador. Antes de la
polimerización, se insertó en el gel de apilado un pico conformador
de la electroforesis y se dejó que el gel de apilado polimerizara
durante 60 minutos, retirando el pico conformador inmediatamente
antes de cargar las muestras.
El reactivo de muestra se preparó mezclando 4.0
mL de agua destilada, 1.0 mL de Tris de ph 6.8, 0,8 mL de glicerol,
1,6 mL de SDS (10%), 0,4 ml. de
2-beta-mercaptoetanol y 0,2 mL de
azul de bromofenol (0,05% W/V). Las muestras y los marcadores
estándar del peso molecular para la electroforesis se diluyeron en
una proporción de 1:4 en el reactivo de muestra y se calentaron
durante 4 minutos a 100ºC inmediatamente antes de su carga en los
manantiales formados anteriormente en el gel de apilado. El reactivo
corriente (0,125 M Tris, 1,0 M glicina, 0,5% SDS de pH 8,3) se
superpuso cuidadosamente sobre el gel de apilado y la electroforesis
se efectuó con una tensión constante de 200 V hasta que el marcador
de zul de bromofenol pasó a 0,3 cm de la base del gel (generalmente,
a unos 45 minutos). Después de la electroforesis, los geles o bien
se electro-transfirieron a membranas de
nitrocelulosa o se tiñeron con Rapid Coomassie Stain durante 45
minutos seguido de un desteñido con una solución de 7.5% de
metanol/5% de ácido acético.
En algunos experimentos se empleó un sistema de
PAGE de urea/ácido acético (Panyim, S., y Chalkey, R. (1969) de
electroforesis de histones de gel de acrilamida de alta resolución.
Arch. Biochem. Biophys. 130, 337-346) en lugar de la
SDS-PAGE para comparar los efectos del SDS sobre la
capacidad del mAbs para detectar las liasas de heparina en teñidos
Western. Las soluciones concentradas utilizadas para preparar los
geles de PAGE-urea/ácido acético, se prepararon de
la siguiente manera: Se constituyó una solución al 60% de acrilamida
disolviendo 60 g de acrilamida y 0,4 g N,
N'-bisacrilamida de metileno en 1.00 mL de agua
destilada. Una solución concentrada de 43.2% ácido acético/TEMED se
preparó mezclando 43,2 mL de ácido acético, 4,0 mL TEMED y 52,8 mL
de agua destilada. La APS/urea se preparó disolviendo 5 Mg APS en 25
mL de 1.0 M de urea.
Los geles de PAGE urea/ácido acético se formaron
mezclando 4.0 mL de solución de acrilamida al 60%, 3.0 mL de 43,2%
de ácido acéticco/TEMED y 2.0 mL de agua destilada. Esta solución y
la solución de APS/urea se desgasificaron durante 15 minutos. 15 mL
de la solución APS/urea se añadió a la solución monomérica de
acrilamida, se mezcló y se vertió cuidadosamente entre dos placas de
vidrio separadas por dos distanciadores de 0,75 mn. Se introdujo un
peine de electroforesis generador de fuente en la parte superior del
gel y se dejó polimerizar éste durante 60 minutos.
Las liasas de heparina se diluyeron en una
proporción de 1:4 en reactivo de muestra de urea/ácido acético,
reactivo que se preparó mezclando 520 \muL de ácido acético, 1,0
mL de glicerol, 1,0 mg de rojo de naftol y 6.0 de urea en agua
destilada que se aportó hasta un volumen final de 10 mL. Se retiró
el peine formador de fuente y las muestras se cargaron en las
fuentes y se cubrieron con reactivo corriente (0,9 M de ácido
acético). La electroforesis se realizó con una corriente constante
de 20 mA durante 3 horas (pre-enfoque del gel) y
después, a 10 mA hasta que se retiró el rojo de naftol a unos 0,3 cm
del fondo del gel (aprox. 3 horas).
El trans-teñido semiseco se
realizó utilizando una Unidad Transferidora SemiPhor
(TE-70) de Hoefer Scientific Instruments (San
Francisco, CA, EE.UU). La electro-transferencia de
las liasas de heparina desde la PAGE-SDS o la
PAGE-urea/ácido acético a las membranas de
nitrocelulosa se efectuó utilizando técnicas de
trans-teñido semiseco tales como las descritas por
Al-Hakim, A., y Linhardt, R.J. (1990) Aislamiento y
recuperación de oligosacáridos acídicos de geles de poliacrilamida
mediante electrotransferencia semiseca, "Electrophoresis" 11,
23.28, excepto que se emplearon 50 mM de fosfato sódico pH 6.8 como
reactivo transferidor. La transferencia se efectuó en 40 minutos a 8
V.
Se detectaron heparinasas en membranas de
nitrocelulosa empleando técnicas de sombreado Western exactamente
como se ha descrito ya para los procedimientos de
inmuno-ensayos de sombreado por puntos.
Se examinan los efectos del SDS y del
2-beta-mercaptoetanol sobre la
inmunodetección de las liasas de heparina por mAbs
M-32 y M-33. Los
inmuno-ensayos de sombreado por puntos de liasas de
heparina I y II se efectuaron de la forma antes descrita salvo que
se disolvieron las liasas en soluciones que contenían SDS y/o
2-beta-mercaptoetanol en las mismas
proporciones utilizadas en el análisis SDS-PAGE
antes de sombrear la membrana de nitrocelulosa.
Se examinó la reactividad de cada una de las seis
mAbs con respecto a las tres liasas de heparina, colocando
cantidades variables de cada una de las tres liasas sobre membranas
de nitrocelulosa y detectando mediante el empleo de liasa
anti-heparina mAbs seguida de la adición de "Goat
anti-Mouse IGG-HRP" y del
desarrollo de color de los conjugados inmunes. En la Tabla V se
resumen los nivelesmínimos de cada liasa de heparina detectados por
medio de inmuno-ensayos. Según se ve en la Tabla V,
los mAbs tienen una amplia gama de sensibilidades con respecto a la
inmuno-detección de las tres liasas de heparina. Por
ejemplo, M2-A9 y M2-B7 pueden
detectar una cantidad tan pequeña como 10 pg de liasa de heparina
II, mientras que M-32, M-33 y
M-34 necesitan la presencia de 1 \mug de liasa de
heparina III para detectar dicha liasa.
| MAb | Liasa de heparina I | Liasa de heparina II | Liasa de heparina III |
| M-32 | 10 ng | 100 ng | 1 mg |
| M-33 | 10 ng | 10 ng | 1 mg |
| M-34 | 10 ng | 10 ng | 1 mg |
| M-1A | 100 pg | 100 pg | 10 ng |
| M2-A9 | 100 pg | 10 pg | 10 ng |
| M2-B7 | 100 pg | 10 pg | 10 ng |
Estos datos demuestran que mAbs puede utilizarse
para diferenciar entre las liasas I y II de heparina y cuando estén
presentes las dos simultáneamente como en un homogenato celular de
Flavobacterium heparinum. Concretamente, M-32
puede detectar niveles de liasa de heparina I diez veces inferiores
a la liasa II y, a la inversa, M2-A9 y
M2-B7 pueden detectar niveles de liasa II que son
diez veces inferiores a los de la liasa I. M-33,
M-34 y M1A no pueden emplearse para distinguir entre
las liasas I y II. Además, los seis mAbs pueden detectar mucho
menores de liasas I y II que de liasa III, permitiendo diferenciar
entre la liasa III y las liasas I y II. La distinción entre las
liasas I y II es importante porque ambas enzimas pueden actuar sobre
la heparina y el sulfato de heparana y consecuentemente, no se
distinguen fácilmente sobre la base de su especificidad del
sustrato.
Se analizaron las tres liasas de heparina y el
homogenato celular de Flavocbacterium heparinum con
SDS-P GE seguida de inmuno-detección
de sombreado Western, según se ve en la fig. 5a. La fig. 5b
contiene un gel de SDS-PAGE típico de las tres
liasas de heparina teñidas con azul Coomassie y con marcadores de
peso molecular. Se examina la facultad de mAbs de detectar liasas de
heparina, pasando las tres liasas de heparina y el homogenato de
Flavobacterium heparinum a través de seis geles
SDS-PAGE seguido de inmunodetección de teñido
Western de los contenidos en gel. La liasa de heparina I (18 ng), II
(570 ng), III (1.63 \mug) y el homogenato celular (87 ng) se
cargaron en cada gel. Los tiempos de desarrollo para la detección
sobre la membrana de nitrocelulosa que contenía
M-34, M1-A, M2-A9 y
M2-B7 fueron de 20, 10, 15 y 40 minutos,
respectivamente. Cuatro de los mAbs (M-34,
M-1A, M2-A9 y M2-B7)
fueron capaces de detectar liasas de heparina I, II y III, así como
liasas de heparina presentes en el homogenato celular
Flavobacterium heparinum. Dos mAbs (M-32 y
M-33) no fueron capaces de detectar ni las liasas de
heparina depuradas ni las proteínas celulares en los sombreados
Western. Se determinó el reactivo del sistema
SDS-PAGE de la destrucción de la capacidad de
M-32 y M-33 para inmunodetectar las
liasas de heparina. Para evaluar cada componente del sistema
SDS-PAGE se llevaron a cabo
inmuno-ensayos de sombreado de las liasas de
heparina empleando M-32 y M-33. Las
liasas de heparina I y II, en presencia o ausencia de SDS y/o
2-beta-mercaptoetanol, se entintaron
sobre membranas de nitrocelulosa y se examinaron empleando
procedimientos de inmuno-ensayos por sombreado con
puntos. Los mAbs fueron incapaces de detectar las liasas cuando
estaba presente SDS, demostrando que SDS era responsable de la
reducción de sensibilidad de estos dos mAbs durante los
procedimientos de sombreado Western. Este experimento sugiere que
M-32 y M-33 deben emplearse
reconociendo un epítope sobre las liasas que requiere confirmación
secundaria tal como una estructura plegada presente en las tres
liasas de heparina que se destruyen por la desnaturización de
SDS.
Para confirmar que SDS era responsable de la
reactividad disminuida de M-32 y
M-33 con respecto a las liasas de heparina, se
analizaron las tres lisas de heparin y homogenato celular de
Flavobacterium utilizando el urea/ácido acético-PAGE
seguido de la inmunodetección por sombreado con M-32
y M-33 para detectar las liasas en este sistema. La
sensibilidad de detección fue acusadamente reducida. Pudieron
detectarse liasa de heparina I (2,7 \mug), liasa de heparina II
(3,4 \mug), liasa de heparina III (4.7 \mug) y homogenato
celular (7.7 \mug). Por consiguiente, SDS es el agente
principalmente responsable de la reactividad reducida de MAbs en
M-32 y M-33 con respecto a las
liasas de heparina. Las seis MAbs son capaces de detectar las tres
liasas de heparina, ya sea en forma purificada o nativa, cuando se
analizan empleando PAGE seguido de inmuno-detección
de sombreado Western.
Era de esperar que por lo menos uno de los seis
MAbs pudiera detectar específicamente una sola liasa de heparina que
permitiera l detección de dicha liasa en una mezcla compleja de
liasas de heparina tal como en un homogenato celular. El sombreado
por puntos y el análisis Western reveló que todos los MAbs eran
capaces de detectar las tres liasas, observación que sugiere que
estas tres liasas de heparina tienen una estructura acusadamente
similar toda vez que cuentan con seis epítopes comunes. La
representación de péptidos de estas tres enzimas pone de manifiesto
un número de fragmentos de péptidos comunes y parece indicar que los
mismos pueden estar localizados en las zonas elevadamente
inmunogénicas de las tres liasas de heparina. Las sensibilidades de
los MAbs individuales con respecto a cada una de las liasas en los
análisis por sombreado de puntos varían considerablemente,
permitiendo utilizar el análisis por sombreado con puntos para
distinguir entre las tres liasas. El empleo de PAGE (SDS o
urea/ácido acético) requiere mucha más proteína que los
procedimientos de sombreado con puntos y las sensibilidades de las
mAbs hacia cada una de las liasas fueron diferentes de las
encontradas en los análisis de sombreado por puntos, probablemente
como consecuencia de alteraciones de la estructura secundaria
durante la PAGE y las fases de transferencia. Así, pues, la
detección de liasas de heparina empleando mAbs se desarrolla más
eficazmente empleando las técnicas de sombreado por puntos aquí
descritas. Además, los seis mAbs son capaces de detectar las tres
liasas presentes en el homogenato celular de Flavobacterium
heparinum, ofreciendo la posibilidad de que estos mAbs pueden
ser utilizados para demostrar rápidamente la presencia de liasas de
heparina en el homogenato celular. Para que resulten beneficiosos en
cuanto a la purificación de las liasas, estos mAbs deben ser
inmovilizados en primer lugar y debe evaluarse su avidez por la
fijación de las liasas de heparina. Los procedimientos y materiales
para la inmovilización de anticuerpos están comercialmente
disponibles y son conocidos por los expertos en el tema.
En resumen, los resultados aquí descritos
demuestran que los mAbs pueden utilizarse para detectar liasas de
heparina I, II y III o bien en su estado purificado o cuando estén
presentes conjuntamente en una solución de células flavobacteriales
homogenizadas. Estas mAbs pueden emplearse también en análisis de
sombreado por puntos para distinguir entre las tres liasas sobre la
base de su diferente sensibilidad para cada una de las tres
liasas.
Las modificaciones y variaciones de las
heparinasas purificadas, el procedimiento de purificación y los
anticuerpos monoclonales correspondientes son conocidos de los
expertos en la materia a partir de la descripción detallada
anterior. Tales modificaciones y variaciones se han pretendido
incluir dentro del alcance de las reivindicaciones del apéndice.
Claims (10)
1. Una heparinasa II purificada presente en
Flavobacterium heparinum, exenta de actividad de liasa
distinta de la actividad de la heparinasa II con un peso molecular
de 84.100, disociando heparina y sulfato de heparana y con un pl de
8.9-9.1 y un pH óptimo de 7.3 sobre heparina y de
6.9 sobre sulfato de heparana.
2. Una heparinasa purificada III que se expresa
en Flavobacterium heparinum exenta de otra actividad de la
liasa que la actividad de la heparinasa III, con un peso molecular
de 70.800, disociando sulfato de heparana y con un pl de
9.9-10.1 y un pH óptimo de 7.6 sobre sulfato de
heparana.
3. La heparinasa III de la reivindicación 2 que
no disocia sulfato de heparina.
4. La heparinasa III de la reivindicación 2
estabilizada con albúmina.
5. Un procedimiento para purificar heparinasas I,
II y III de cultivo biológicamente puro de Flavobacterium
heparinum, que comprende las fases de:
lisin de células de Flavobacterium
heparinum en un cultivo biológicamente puro de Flavobacterium
heparinum,
eliminación de residuos celulares y ácidos
nucleicos del lisato celular,
absorción de heparinasas I, II y III en
hidroxiapatita,
absorción de no hepariasas I, II y III proteínas
en resina QAE,
recuperación de las heparinasas I,II y III no
ligadas a la resina QAE,
separación de heparinasas I, II y III por HPLC en
una columna de hidroxilapatita,
recuperación de las heparinasas I, II y III
separadas en la columna de hidroxilapatita,
purificación de las heparinasas separadas por
intercambio de cationes FPLC,
recuperación de las heparinasas I, II y III
separadas por intercambio de cationes FPLC,
purificación de las heparinasas separadas por
permeación HPLC, y
recuperación de las heparinasas I, II y III
separadas por permeación de gel HPLC,
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que los ácidos nucleicos se eliminan por precipitación con
protamina.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que las heparinasas se separan de la columna de hidroxilapatita por
elución con un gradiente salino.
8. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que las heparinasas se eluyen de la columna de intercambio de
cationes por un gradiente de incremento de la concentración
salina.
9. Una heparinasa II según la reivindicación 1
obtenible por el procedimiento de la reivindicación 5.
10. Una heparinasa III purificada, según la
reivindicación II, obtenible por el procedimiento de la
reivindicación 5.
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|---|---|---|---|
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