JPH08502498A

JPH08502498A - 低アレルゲン性タンパク質

Info

Publication number: JPH08502498A
Application number: JP6510573A
Authority: JP
Inventors: ローフボルウ，ウッフェ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 1996-03-19
Also published as: CA2147741A1; KR950704345A; WO1994010191A1; DK132892D0; FI952069A0; EP0668868A1; FI952069A; BR9307342A

Abstract

(57)【要約】タンパク質のサイズにおける変更並びにその効果のモニタリング及びテストを通して、ヒト及び動物におけるアレルギー反応を剌激する能力が低下した分子を選択する。このタンパク質の精製、加工又は調整におけるこの後のそのタンパク質それ自体の生産の間のいずれかの製造方法が提供される。この変更されたタンパク質は、工業、家庭、食品／飼料又は医薬において使用されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】低アレルゲン性タンパク質発明の分野本発明は、低アレルゲン性タンパク質に並びにタンパク質、特に酵素を含む工業的に製造されたタンパク質を物理的又は化学的に変更してそれらの前駆体よりも低いアレルゲン性にするための方法に関する。さらに、本発明は、このようなタンパク質を含む組成物、並びに家庭、工業、食品/飼料及び医薬を含む様々な分野におけるこの低アレルゲン性タンパク質又はこの組成物の使用に関する。発明の背景益々多くのタンパク質が、工業、家庭、食品/飼料及び医薬における使用のために、工業的に製造されている。タンパク質であるために、それらはヒトを含む動物の免疫系を剌激することができる。提示の方法に依存して、タンパク質は、異なる種類の抗体の産生及び/又は細胞応答を顕出することができる。これらの経路の中の少なくとも１は、ヒトを含む動物において有害な効果を与えることができる。 IgG（ヒトにおけるもの、及び動物において匹敵する効果をもつ分子）は、アレルギー状態を導き、鼻炎、結膜炎、等様の徴候を与えることができる。一般的には、ヒトを含むほとんどの動物が、有害効果を作り出すであろう程度までこれらのタンパク質に晒されないが、それらにとってこれらの現象がかなり重要であるところの特定の危険群が存在する。この危険群は、工業生産又は研究部門、等における人員であることができる。しかしながら、このようなタンパク質製造の増加した使用は、消費者としてタンパク質を使用する者又はその他影響される者を導くことができるであろう。さらに、それらの使用及びその環境上への処分後のこれらのタンパク質の効果並びにそこに生活するヒトを含む動物が、増加すると予想される。工業的タンパク質に関して、アレルギー反応に関連する問題を避けるための本方法は、一般的に、その免疫系を剌激することからダスト形態におけるタンパク質を特に回避するために、そのタンパク質を固定し、粒状化し、コーティングし又は溶解する様々な方法から成る。いずれにしても、エアロゾル形態においてタンパク質ダスト又は溶解タンパク質をもつ危険が、未だに存在するであろう。それ故、いくつかのタンパク質の放出は、このような暴露に感受性であるものにおいて可能性のあるアレルギー反応を導くことを生じさせることができる。この問題を軽減する他の方法は、例えば、バクテリアにおける生産のためにヒト起源のタンパク質を選択してきた。これは、動物のためではなく、ヒトのために、いくつかの問題を軽減することができる。さらに、多くの場合に、ヒト起源の所望の性質をもつタンパク質を発見することができないであろし、それ故に、他の起源を考えなければならない。これは、その分子内の１以上の位置内で変更されて所望の性能を与えるいずれかのヒト・タンパク質であることができる。あるいは、それは、バクテリア、カビ、等を含む他の種からの分子であることもできるであろう。後者の群の生成物のすべては、免疫刺激についての効力をもつであろう。アレルゲン性を減少させるさらなる提案は、そのタンパク質分子のサイズを減少させることである（例えば、日本国特許出願第4112753号、又はリサーチ開示第335102号を参照のこと。）。しかしながら、これは、そのタンパク質の活性が重要でないときに、あるいは問題のタンパク質の活性がそのタンパク質の破壊にもかかわらず保持されているようななまれなケースにおいてのみ、利用可能である溶液である。最近、タンパク質工学の使用が、エピトープ・マッピング及びその後のそのアレルゲン性エピトープの変更を通してタンパク質のアレルゲン性を減少することが示唆されている（国際特許出願第WO 92/10755号を参照のこと。）。しかしながら、この手順は、普通には、研究及び開発において多額の投資を必要とする。医薬分野においては、タンパク質への１以上のポリマー分子の付着を通してタンパク質の抗原性又はアレルゲン性を減少させることから示唆が成された。これは、普通には、他の巨大分子構造とのそのタンパク質の相互作用による妨害の効果をもつ。このような結合体も新規の特性を示すことができる：例えば、欧州特許第38 1 54号は、免疫抑制特性をもつ多糖類とのアレルゲンの結合体について開示している。ポリマーへのタンパク質の付着は、一般的に、そのタンパク質の活性を低下させ又はそのタンパク質とその支持体との間の相互作用妨害する効果をもつ。欧州特許第183 503号は、可逆性連結基により少なくとも１の水溶性ポリマーに連結された医薬として有用なタンパク質を含んで成る結合体を提供することによる上記の概念の開発について開示している。発明の要約本発明の第一の目的は、新規の低アレルゲン性タンパク質、特に、そのオリゴマーがその活性を実質的に保持している親モノマー・タンパク質のオリゴマー形態を含んで成る低アレルゲン性タンパク質を提供することである。本発明は、さらに、タンパク質、特に酵素を含む工業的に製造されたタンパク質を物理的又は化学的に変更してそれらの前駆体よりも低いアレルゲン性にする方法に関する。この変更は、その所望の用途のためのそのタンパク質の活性を実質的に保持しながら、そのタンパク質の有効サイズを湿った上皮の膜バリアの通過可能なサイズを上回るサイズに変更することを通して行われる。本発明に従えば、サイズにおける変更は、問題のタンパク質のオリゴマー形態を得るためにそれ自体いくぶん知られた様々な方法を通して行われ、その後にそのオリゴマー・タンパク質が、それらの所望の活性についてテストされる。これが満足できる場合、そのタンパク質は、その後それらのアレルゲン性についてテストされる。本発明は、この態様において、これらのタンパク質のその後の使用を不可能にせずに、タンパク質のサイズを増加させる方法の選択にも関する。これは、そのタンパク質の結合/連結の間にその活性/官能性をそのままに残すこと、又は問題のタンパク質を通して、例えば、その結合若しくは連結分子を分けることによりそのモノマー形態への復帰後にその元の活性/官能性を取り戻させること、のいずれかにより、達成される。本発明の１の特定の態様に従えば、サイズにおける増加は、多数の”元の”タンパク質を含んで成るタンパク質、例えば、そのタンパク質のジ-、トリ-、又はテトラマーをコーディングしているDNA配列を好適な宿主に挿入し、そしてその後に、そのタンパク質のこの低アレルゲン性ポリマー形態を発現させることを通して、得られる。あるいは、DNA配列は、１の組み合わせタンパク質を与える１の組み合わせ配列内に配置された異なる酵素のための多数のコーディングを含んで成ることができる。このＤＮＡ配列は、好適な宿主内に挿入され、その後、この組み合わせタンパク質のこの低アレルゲン性ポリマー形態が発現される。本発明は、さらに、このように修飾されたタンパク質の生産及び商業化に関する。ここで、特に重要なのは、工業的な酵素、食品/飼料タンパク質、家庭及び医薬における使用のためのタンパク質である。本発明の第三の態様は、本発明に係る低アレルゲン性タンパク質を含んで成る組成物に関する。例えば、食品/飼料組成物、洗剤組成物、又はヒト若しくは動物の体における治療及び/又は診断において使用される組成物である。本発明の第四の態様は、先に述べた組成物の使用に関する。図面の簡単な説明本発明を、実施例及び図面を参照しながら明細書の以下の部分においてより詳細に記載する。ここで、図１〜５は、本発明に係るタンパク質を示し、ここで、タンパク質のサイズが本発明に係る方法を通して増加される。図１中、２つの同一のタンパク質が、”リンカー”タンパク質又はペプチドを通して可逆的に結合されている。このリンカーにより、併合された分子の全サイズが膜通過のための限界を超える。図２は、３つの同一のタンパク質の可逆的連結を示している。図３は、３つの同一のタンパク質の不可逆的連結を示している。図４は、多数のアミノ酸から成るスペーサーを介して一緒に連結された元の分子に同一な多数のモノマーを示している。この連結アミノ酸は、例えば、この配列のアミノ酸と特異的に反応する酵素的消化を使用して、破壊又は分解されることができるであろう。図５は、タンパク質と連結分子が同時生産され、そして互いに反応してより大きな分子単位を形成する場合の構造を示している。発明の詳細な説明本発明は、一般的にタンパク質のアレルギー能に関する。湿った上皮に導入されたタンパク質は、それらがその膜バリアを貫通する場合に、その免疫系を剌激する危険を課す。これらの領域における免疫コンピテント細胞の刺激は、ヒトにおいてIgE、及び動物においてこれに匹敵する働きをもつ抗体の産生を、しばしば導くであろう。IgEが産生される場合、アレルギーの徴候が発展する危険が存在する。他方において、皮下的又は腹膜内に導入された上記と同一の分子は、正常には、IgM及びIgGの産生を剌激するであろう。それ故、タンパク質の提示の方法は、アレルギーの徴候の発展の危険にとって重要である。免疫系を刺激するタンパク質のための本質的な基準は： A)それが、体内の免疫コンピテント細胞に提示され、 B)それが、その体に外来性であり、 C)それが、反応に繋がる免疫系における細胞-細胞協調を許容するサイズである、である。３つの基準のすべては、多くの場合に、慣用の今日の製造方法により製造されるタンパク質により満たされることができるであろう。多くの工業的に製造されたタンパク質について、基準(A)及び( B)は、除去されることは出来ず、そしてそれ故、本発明は、その分子のサイズに対して焦点を合わせられる。例えば、ダスト形態のタンパク質の提示は、特に鼻だけでなく、咽頭(pharynx)、喉頭(larynx)、肺及び胃腸系の湿った上皮を通過するであろう。本発明に従って、タンパク質分子は、上記の湿った上皮の膜バリアの貫通を不可能にするようにサイズにおいて増加される。このサイズの増加は、基本的には、５つの異なる方法において得られることができる： 1)タンパク質を、可逆的結合性タンパク質又はペプチド、例えば、酵素阻害剤又は抗体又はその部分と、結合させることにより、そのタンパク質と一緒になったものは、膜バリアを通過することができない程に大きなサイズをもつ。これは、１のタンパク質分子をタンパク質/ペプチド結合性分子と単に組み合わせすこと、又はタンパク質分子のための２以上の結合性部位をもつタンパク質/ペプチド結合性分子を使用すること、のいずれかにより、達成されることができる。いずれかの方法において、その全サイズが、本発明に係る低アレルゲン性タンパク質であることを保証するために通過のためのサイズを超えなければならないであろう。そのタンパク質のその後の使用において、そのタンパク質/ペプチド結合性分子が分けられる。目的のタンパク質は持続し又はその元の活性/官能性を再開している。２つの同一の目的タンパク質が他の”結合性”タンパク質又はペプチドにより可逆的に結合されている図１を参照のこと。これにより、その結合した分子の全サイズが膜の通過のための限界を超えている。目的タンパク質と結合性タンパク質/ペプチドとのいずれかの他の組み合わせを使用することができる。サイズ以外の重要なパラメーターは、その結合の可逆性並びにその目的タンパク質の持続性又は再開された活性/官能性である。 2)可逆性ジ-、オリゴ-又はマルチマー性リンカー分子をそのタンパク質分子に結合させることによる。このタンパク質は、それ故に、未だ、そのリンカーの別れるか否かにかかわらずタンパク質として作用するであろうが、それらのサイズは、その通過可能なサイズを超えるであろう。３つの同一な目的タンパク質の可逆的な連結が行われている図２を参照のこと。このリンカーのサイズは、重要であることも又はないこともできる。そのリンカーへのタンパク質のジ-〜マルチマーのいれかの数であることができる。そのサイズ以外の再び重要なパラメーターは、その結合の可逆性並びにその目的タンパク質の持続性又は再開された活性 /官能性である。 3)そのタンパク質に小さな分子/リガンドを結合させることにより、この分子/ リガンドは、ジ-、オリゴ-又はマルチマー性リンカー分子により再認識されることができる。この連結分子は、このような分子/リガンドに、そしてこれにより、共に可逆的に又は不可逆的である２以上の分子に結合するであろう。 4)そのタンパク質分子への非-可逆性ジ-、オリゴ-又はマルチマー性リンカー分子の結合による。このタンパク質は、未だ、その連結形態において作用するであろうが、湿った上皮を通過することは出来ないであろう。３つの同一の目的タンパク質の不可逆的連結が行われる図３を参照のこと。このリンカーのサイズは、重要であることも又はないこともできる。再びジ-〜マルチマーのそのリンカー上のタンパク質のいれかの数であることができる。そのサイズ以外の再び重要なパラメーターは、その結合の可逆性並びにその連結した目的タンパク質の持続性又は再開された活性/官能性である。そのオリゴマー化を、化学的、生物化学的又は酵素的な手段により行うことができる。 5)タンパク質/ペプチドのための１以上のコーディングDNA配列を含むようにそのゲノム材料を変更することによる。これは、好ましくは、その複製可能な完全体内の１の且つ同一の開始及び終止調節シグナル内にあるであろう。それらの間においては、その分子のための単一のコーディング領域は、非情報性の塩基対、余分なアミノ酸をコーディングしている塩基対であることができ、あるいは、そのコーディング領域は、連続的であることができる。任意的な余分のアミノ酸は、その元の分子の２つのコピー間のリンカー又はスペーサーとして作用することができる。この余分のアミノ酸は、好ましくは、取り込まれた元の分子の活性又は３-次元構造を妨害しないであろう。グリシン、アラニン又はセリンのような柔軟性の、非電荷アミノ酸が好ましい。それ故、多数のコピーが、増加サイズをもつ１の分子を作るために、そのmRNA又はその参加されるタンパク質レベルにおいてある。より大きな分子が、その元の分子に対応して、より小さい分子に破壊されることも又はされないこともできる。これは、その元の分子と同一の又はほとんど同一の活性を可能とするであろう。図４中、その終局分子は、多数のアミノ酸から成るスペーサーを介して一緒に連結されたその元の分子と同一の多数のモノマーに一致する。これらの新たな連結アミノ酸は、好ましくは小さな非電荷アミノ酸であり、そしてそのモノマーの活性及び３-次元構造を少し変化させ又は全く変化させないであろう。この変化は、そのゲノム内にあり、そしてそれにより、その新たな分子内のモノマーの数は、所定数に厳密に決定される。この連結アミノ酸は、例えば、このアミノ酸配列と特異的に反応する酵素的消化を使用して、破壊又は分解されることができるであろう。新たなオリゴ-又はマルチマーの活性は、その元のモノマーと同一又はこれに匹敵する。分解されたリンカー・アミノ酸の”尾(talls)”をもつか又はもたないモノマーになるために、そのオリゴ-又はマルチマーの可能な分裂の後、その活性は、その元のモノマーと同一又はこれに匹敵する。 6)目的の分子が生産される宿主生物の複製器官内に１以上の分子を含むことによる。宿主のこの変化は、好ましくはその目的分子に可逆的又は不可逆的に結合するであろう他の分子と一緒のその目的分子の生産を最終的に意味するであろう。それ故、精製の前又は後の両方においてその生成物は、その元の分子よりも大きいであろう。図５中、その元の分子を生産する生物は、他の分子の生産者にもなるように変化される。それ故、その変化は、その生物のゲノム内にある。この同時生産された分子は、互いに反応し、そしてより大きな分子単位を形成する。いずれの数をも組み合わせにおいて使用することができる。その分子サイズ以外の重要なパラメーターは、その結合の可逆性並びにその付加された分子に連結された又は連結されていない元の分子の持続性の又は再開された活性である。 7)サイズの増加は、上述の方法(1)〜(5)のいずれかを単独で又は組み合わせにおいて含むことができ、そして結合/連結している１以上のタイプのタンパク質、例えば、１つのリンカーに連結している２つの異なる酵素分子を含むことができる。 (1)におけるタンパク質の結合法は、例えば、その部分抗体を使用し、又はそのタンパク質のビオチン化及び４価のアビジン又はストレプトアビジンとの架橋形成、又はいずれかの他の慣用の可逆結合、あるいは酵素の場合には、その酵素の阻害剤、を使用することができる。 (2)及び(3)におけるタンパク質の連結方法は、例えば:"Ulltro gel，Magnogel and Trisacryl．Practical guide for use in affinity chromat ography and related techniques．(1983)LKB+IBF．Reactifs IBF-Societe Chim ique Pointet-Girard．35，avenue Jean-Jaures，92390 VILLENEUVE-LA-GARENNE ，FRANCE中に記載されたものに似た方法を使用することができる。可逆的結合及び連結は、以下の手順の中の１を通じて破壊されることができるであろう： a)pHの変化、 b)温度の変化、 c)イオン強度の変化、 d)モル濃度の変化、溶出/希釈、 f)バインダー/リンカーについての拮抗物質の添加、 g)バインダー/リンカー分子の分解、又は h)いずれかのこれらの組み合わせ。タンパク質又はペプチドの持続した活性のテスト先の手順(1)〜(6)のいずれかの手順からの分子を活性についてテストする。元の分子の不可逆的結合を与え、又はその分子の多コピーが分子オリゴ-又はマルチマーを与えるゲノム内で提示されるような手順において、その活性は、そのより大きな分子におけるものと全くそのままに維持されなければならない。元の分子の可逆的又は破壊性結合又は連結を与える手順においては、その分子の活性は、そのより大きな分子においてa/維持され、又はb/その元の分子と同一又はそれに匹敵する分子にそのより大きな分子を分けた後に再開され、なければならない。上述の手順(3)、(4)及び(6)においては、その活性は、より大きな分子により測定され、一方、手順(1)、(2)、(5)及び(6)からの分子においては、その活性は、そのより大きな分子と、その結合/連結を復帰させ又は破壊した後のモノマーの両方により測定される。減少された免疫学的/アレルゲン性能力のテスト分子を、変更後、それらの免疫学/アレルゲン性の能力についてテストし、そしてその減少に従って選択する。新たな分子は、元の材料及び対照材料の分子と一緒に、１以上の以下の方法：a/皮膚内、b/皮下、c/静脈内、d/鼻内（吸気）、 e/経口、f/気管内、又はg/腹膜内、を通してテスト動物に提示される。アレルゲン性能力は、好ましくは、d/及びf/又は部分的にe/により測定されることができるであろうし、一方、その免疫学的能力は、すべての技術において測定されることができるであろう。上記テスト材料を投与する手段のためには、標準的なプロトコールを参照のこと。また、f/のためには、本明細書中の以下の実施例を参照のこと。動物の応答を測定し、そしてその応答を、分子サイズの変更の効果を評価するために比較する。この応答を以下のように測定することができる：動物血清中の血液/リンパ球細胞の差異計測、リンパ球刺激係数、特異的抗体（定性及び定量）、又はその剌激された動物の免疫学的状態を測定するいすれかの他の手段。分子を、リンカーを通して他のタンパク質又はペプチドにあるいは互いに結合させる。この結合又は連結の後、新たな分子は、湿った上皮内の膜バリアを上回る、いずれかの通過を妨害し又は停止させるサイズをもつであろう。分子を、その湿った上皮上で又は注射による対照として変更された又は未変更の免疫学的剌激能力についてモニターされる。最適な変更を、使用のために選び、そしてそのタンパク質の生産又は加工のいずれかにおいて行った。最終製品を再び免疫学的能力についてテストする。上記能力をモニタリング及びテストする方法は、免疫学的及びタンパク質化学的であり、インビボ及びインビイトロの両方における方法を使用することかできる。タンパク質のサイズの増加のために選択された変更を、そのタンパク質の生産段階、又はこれらのタンパク質のいずれかのその後の加工段階においてのいずれかで行うことができる。それ故、それをその生産生物のゲノムのレベル上で行い、これらの生物の培養のための食品/培地中に含ませ、又はそのタンパク質の可能な精製の前後に、生産後のタンパク質を変更するために使用する、ことができる。実施例実施例１本実施例において、互いへのタンパク質の不可逆的カップリングについて討議する。このカップリングは、好ましくはその分子活性を変更しないであろう。このカップリング手段は、２価のリンカー分子、すなわち、ホモ-又はヘテロ２官能価試薬の使用を通じてのものである。２官能価試薬についての網羅的情報のために、とりわけ、文献１＆２を参照のこと。これらのカップリング法の中のいずれか１を使用することができる。ある者が選ぶべきそれらの選択は、カップリングされるべきその分子の化学的組成及び安定性に依存する。方法グルタル酸を、EEDQ(=N-エトキシカアルボニル-2-エトキシ-1，2，ジヒドロキノリン）と反応させる（文献１）。混合無水物を形成させ、これを次に、ペプチド又はタンパク質内の一次アミノ基と反応させる。縮合配列を通じて、このグルタル酸を、そのペプチド又はタンパク質に結合させる。これにより、グルタル酸は、２つの例えば、ペプチドを連結する架橋分子として作用する。この反応を、文献１（タンパク質結合性ゲルについての中の討議）から引用した、以下の図中に例示する。１．第一段階において、グルタル酸を、エタノール中過剰のEEDQと反応させる。反応１時間後、蟻酸又は酢酸を添加して（EEDQに等モル）、そしてその反応を停止させる。混合無水物がここで形成され、そして過剰のEEDQとのさらなる反応が停止する。２．ペプチド又はタンパク質を、水相又は水/エタノール混合溶液中に溶解させる。ペプチド又はタンパク質を、上記混合無水物に添加する。このペプチド又はタンパク質は、その最初のグルタル酸に比べてモル過剰でなければならない。この反応を、攪拌を伴って又は伴わずに、少なくとも１時間、好ましくは一夜、インキュベートする。この反応において、例えば、２のタンパク質をグルタル酸を介して一緒に連結させる。３．段階２の生成物を、サイズ又は他のクロマトグラフィーを使用して精製する。この正確な画分をモルサイズに従って選択する。適宜、この手順を、そこに列記したようなペプチド又はタンパク質の代わりに、そのリガンドとして段階３の精製された生成物を用いて走らせる。この手順の１以上のランにおいて、その分子量が、湿った上皮を通過することができる限界を超えるまで増加される。実施例２本実施例の背後にある理論は、実施例１と同一である。方法グルタル酸、ケトグルタル酸、セバシン酸、等のような２カルボン酸を、ペプチド又はタンパク質を連結するために使用する。以下、セバシン酸を使用する。カルボジイミドをセバシン酸と反応させ、その間に、イソウレア・エステルが形成される。残りのカルボジイミドを、蟻酸又は酢酸のような１カルボン酸により消費させる。このペプチド又はタンパク質を、導入し、そして縮合反応を通じて、これを、化学結合において前のセバシン酸に結合させる。これにより、サバシン酸は、２の例えば、タンパク質を化学的に一緒に連結させる。この反応を以下の図中に例示する（文献１参照）：１．セバシン酸を、所望のモル濃度に水中に希釈し、pHを僅かに酸性に調整し、EDCI（=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド・ヒドロクロリド、又はCMCI（=1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリノエチル)-カルボジイミド-メトロ-p-トルエン-スルホネート）を、いずれも過剰に添加する。イソウレア・エステルがここで形成される。１時間反応させ、蟻酸又は酢酸を添加して残りのカルボジイミドを消費させる。２．カップリングされるべきペプチド又はタンパク質を添加する。これは、縮合反応を通して上記イソウレア・エステルと反応し、ここで、ペプチド又はタンパク質は、前のセバシン酸に化学的に結合される。セバシン酸は、２官能価であるので、それは、２つのペプチド又はタンパク質に連結し、これらの橋として作用するであろう。３．段階２の生成物を、サイズ又は他のクロマトグラフィーを使用して精製する。モルサイズに従う正確な画分を選択する。適宜、この手順を、そこに挙げたペプチド又はタンパク質の代わりに、そのリガンドとして段階３の精製された生成物を用いて走らせる。この手順の１以上のランにおいて、その分子量が、湿った上皮を通過することができる限界を超えるまで増加される。実施例３本実施例において、目的分子となるべき他の小さな分子の不可逆的連結を、前活性化段階として使用する。その後、この前活性化された分子は、可逆的又は不可逆的に結合するジ-、オリゴ-若しくはマルチマー化リンカー分子を使用して連結される。この目的分子の活性は、この操作の間に保持され、又はそのリカーが別れることによるその目的分子のモノマー化後に再開される。方法目的分子を、Biotin N-HydroxySuccinimide(BNHS)試薬を使用してビオチン標識付けする。これにより、その分子は、低取り込み量、好ましくは、１目的分子に対して１ビオチンの比において、その小さなビオチン分子（分子量241 D）が付加される。残った使用されなかったBNHS試薬を、グリシンのような分子を含むアミノ酸を使用して消費し、そしてその遊離のビオチン分子を除去する。次の段階は、連結ストレプトアビジン又はアビジンの添加であり、これは、非常に高い結合強度をもつが可逆的な結合において上記のビオチン標識された目的分子に結合することができるであろう。１．遊離のアミノ酸を含む目的分子を、中性〜アルカリ性のpHにおいてBNHS試薬と反応させる。この分子比は、最終的に1:1の取り込みを与えるために、その反応の間、1:1以上、好ましくは1:15以上でなければならない。２．グリシンの溶液を、上記１の反応混合物に添加する。BNHS対グリシンのモル比は、1:1、好ましくは1:8を超えるものでなければならない。３．上記２の生成物を透析又はゲル濾過してその反応混合物から遊離の非結合ビオチンを除去する。４．上記３の反応混合物をアリコットし、ストレプトアビジン又はアビジンを連結するものの幾つかに添加して、1:100、1:40、等のリンカー対目的分子の混合比を与える。サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動あるいは他の分子量測定手順を使用して最良の比を見つけ出す。混合比の使用は、1:1、1:2、1:3及び1:4のリンカー対目的分子の比の結合生成物をおそらく与えるであろうし、それ故に、分子サイズのスペクトルを獲得することができる。５．例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより上記４の最終生成物を精製し、例えば、電気泳動によりその分子量を確認する。６．分子量サイズに従う正確なサイズを選択する。化学的カップリングを使用したさらなる実施例ホモ-又はヘテロ官能性試薬を、例えば、リンカーとして作用する化合物を含む２カルボン酸又はジアミノと一緒に使用する。この２官能価試薬は、上記文献又は他のいずれかに列記したいずれか１であることができる。このリンカーは、この２官能価試薬によりそれと反応することができるいずれかの化合物であるであろう。例は、プトレシン(putrescine)又はスペルミジン（すべてジアミノ化合物）、又はグルタル酸、ケトグルタル酸（アルファ/ベータ）又はスペルミン（すべてジカルボン酸）、あるいは１のリンカー内に併合されたチオール-、ヒドロキシ-、カルボキシル-又はアミノ基、又はその同一リンカー内に２の同一基をもついずれかの他の化合物である。破壊可能な連結を使用した実施例裂けやすい結合をもつリンカー、又は破壊性であるリンカーを使用した先に列記した方法のいずれか１つ。すべての連結は、好ましくはそのペプチド又はタンパク質の活性を変更しないであろう。裂けやすい結合は、希釈（すなわち、モル濃度）、温度、イオン強度、pH、等を変化させることにより破壊される。破壊性であるリンカーは、その温度、イオン強度、pH、等を変化させることによりそれ自体破壊して別れるリンカーである。この破壊は、好ましくは、そのリンカーに結合したペプチド又はタンパク質を変更せずに、そのリンカーを消化又は分けることができる酵素により誘導されることもできる。さらに、この連結は、他のペプチド／糖ペプチド又はタンパク質/糖タンパク質を使用して得ることもできる。この分子は、好ましくはそれ自体の免疫学的能力のいずれをももたずに、例えば、抗体又は酵素阻害剤のように、活性であることができる。この活性分子への結合は、上述の手段のいずれかにより破壊されることができる。文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 38/46 Ｃ０７Ｋ 1/107 14/575 Ｃ１２Ｎ 9/96 9152−4Ｂ // Ｃ１１Ｄ 3/386 9546−4Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】１．その親モノマー・タンパク質のオリゴマー形態を含んで成る低アレルゲン性タンパク質。２．オリゴマーのサイズが、約30kDである、請求項１に記載のタンパク質。３．オリゴマーのサイズが、約40kDである、請求項１に記載のタンパク質。４．オリゴマーのサイズが、約50kDである、請求項１に記載のタンパク質。５．オリゴマーのサイズが、約60kDである、請求項１に記載のタンパク質。６．オリゴマーのサイズが、約70kDである、請求項１に記載のタンパク質。７．オリゴマーのサイズが、約80kDである、請求項１に記載のタンパク質。８．オリゴマーのサイズが、約90kDである、請求項１に記載のタンパク質。９．オリゴマーのサイズが、約100kDである、請求項１に記載のタンパク質。１０．オリゴマーが、そのモノマー親タンパク質分子を互いに連結することにより形成されている、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質。１１．連結が、リンカー又はスペーサー分子の使用により形成されている、請求項１０に記載のタンパク質。１２．連結が、直接的に形成されている、請求項１０に記載のタンパク質。１３．連結が、第一モノマーのC-末端と第二モノマーのN-末端との間のペプチド結合を通じて、そして場合により、そのモノマー間に１以上のアミノ酸残基を導入することにより、形成されている、請求項１０に記載のタンパク質。１４．ペプチド結合及び任意的なアミノ酸残基が、１の単一タンパク質として同時発現されているモノマーにより、確立されている、請求項１３に記載のタンパク質。１５．オリゴマーが、その活性を実質的に保持しており、又は再確立されたその活性をもつことができる、先の請求項のいずれかに記載のタンパク質。１６．連結又は結合が、可逆的である、先の請求項のいずれかに記載のタンパク質。１７．連結又は結合が、不可逆的である、先の請求項のいずれかに記載のタンパク質。１８．タンパク質が、酵素又はホルモンである、先の請求項のいずれかに記載のタンパク質。１９．酵素である、請求項１８に記載のタンパク質。２０．医薬酵素である、請求項１９に記載のタンパク質。２１．因子VII、因子VIII、因子IX、プロテインC、トロンボモジュリン、トロンビン、又はそれらの活性断片を含んで成る群から選ばれている、請求項２０に記載の酵素。２２．工業的酵素である、請求項１９に記載の酵素。２３．ヒドラーゼである、請求項２２に記載の酵素。２４．プロテアーゼ（メタロ、酸性、中性又はアルカリ性）、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシドレダクターゼ、又はペルオキシダーゼを含んで成る群から選ばれている、請求項２２に記載の酵素。２５．先の請求項のいずれかに記載の低アレルゲン性タンパク質の製造方法であって、以下の段階： i)そのモノマー親タンパク質分子を一緒に架橋してオリゴマーを形成し、 ii)その所望の活性を遂行するその能力についてそのオリゴマーをテストし、そして iii)そのアレルゲン性についてそのオリゴマーをテストする、を含んで成る方法。２６．いずれかの請求項２５の方法により作られたタンパク質。２７．請求項１〜２４又は２６のいずれかに記載の低又は非-アレルゲン性タンパク質を含んで成る組成物。２８．組成物が、工業的に使用される、請求項２７に記載の組成物。２９．組成物が、家庭的に使用される、請求項２７に記載の組成物。３０．組成物が、食品/飼料に使用される、請求項２７に記載の組成物。３１．組成物が、医薬に使用される、請求項２７に記載の組成物。