JPH08289800A - 塩素イオンの定量方法および定量試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 塩素イオンを含有する被検体に、モノアミン
酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵
素、及びアルデヒド脱水素酵素を作用させ、塩素イオン
の濃度に比例してモノアミン酸化酵素の活性が変化する
ことを利用し、アミン化合物を基質としたモノアミン酸
化酵素及びアルデヒド脱水素酵素の触媒する酵素反応の
結果生じる還元型ニコチンアミド補酵素を測定すること
を特徴とする塩素イオンの定量方法である。 【効果】 本発明の塩素イオン定量法により、汎用的な
装置を使用し、簡便な操作で、尿検体においても正確に
塩素イオンを定量する方法と、広い測定範囲と高い安定
性を有する塩素イオン定量用試薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は被検体中の塩素イオンの
新規な定量方法に関するものであり、例えば、体液中の
塩素イオンの定量といった臨床検査などの医療の分野で
広く利用できる。

【０００２】

【従来の技術】体液中の塩素イオンは、水の平衡、酸塩
基平衡、そして、浸透圧の調整などに関与する重要なイ
オンである。従来、体液中の塩素イオンの測定は、比色
法、電量滴定法、電極法などにより行われてきた。

【０００３】比色法は、塩素イオンとチオシアン第二水
銀を反応させ、遊離したチオシアンイオンを第二鉄イオ
ンで発色させて比色定量するものであるが、試薬中に毒
性の強い水銀やシアンが含有されているという欠点があ
った。

【０００４】電量滴定法は、電解液中で銀電極に一定の
電流を流し、遊離した銀イオンと塩素イオンを反応させ
塩化銀として沈殿させ、すべての塩素イオンが消費され
ると銀イオンが急速に増加し、この瞬間を指示電極でと
らえて終点とし、これに要した時間から塩素イオンを定
量するものであるが、専用の装置が必要で、試料の分析
処理効率が悪いなどの欠点があった。

【０００５】電極法は、イオン選択電極を利用して塩素
イオンを定量するものであるが、専用の装置が必要であ
り、また、塩素イオンだけでなく、他のハロゲンイオン
にも応答してしまうというイオン特異性の問題がある。

【０００６】さらに、これらの様々な問題点を解決する
方法として、アミラーゼを利用した酵素法による塩素イ
オンの定量法がクリニカル・ケミストリー（Clinical C
hemistry）、34巻、552頁（1988年）に報告された。し
かし、この方法は確かに専用装置を必要とせず、広く一
般に使用されている分光光度計を利用でき、また、試薬
中に有害物質を含有していないという利点を有するが、
一方、測定範囲が狭く、試薬の安定性が悪いという欠点
を有している。我々は、モノアミン酸化酵素を利用した
酵素法による塩素イオンの定量法と定量試薬を提案した
（特願平５−２７０４５７）。この方法は、モノアミン
酸化酵素が塩素イオンによって阻害を受け、また、その
阻害の程度が塩素イオン濃度に比例するという性質を利
用して塩素イオンを決定する方法であり、具体的には、
塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素とア
ミン化合物とを作用させ、生じた酵素反応生成物を定量
することによって実施される。反応生成物として、アン
モニア、過酸化水素、アルデヒド化合物が挙げられる
が、アンモニアを反応生成物として定量する方法は、ア
ンモニアが被検体中にも存在しているため、好ましくな
い。過酸化水素を反応生成物として定量する方法は、過
酸化水素をペルオキシダーゼを利用して定量するもの
で、モル吸光係数の高い色素を生成させることができ、
その結果、高感度に定量できる方法である。この方法で
は、血清を定量した場合、正確に塩素イオン濃度を定量
することができたが、尿を定量する場合、尿中の何らか
の還元性物質によりペルオキシダーゼが阻害を受け、正
確に塩素イオン濃度を定量できない尿検体が出現すると
いう問題が生じた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】特別な装置の使用及び
特別な廃液処理の必要がなく、分析処理効率、定量性及
び試薬の安定性に優れた測定範囲の広い、尿検体も正確
に定量できる塩素イオンの定量方法の開発を目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意検討したところ、モノアミン酸化酵素
が塩素イオンによって阻害を受け、また、その阻害の程
度が塩素イオン濃度に比例し、モノアミン酸化酵素の触
媒する反応の結果生成するアルデヒド化合物を定量する
ことで尿検体においても正確に塩素イオン濃度を定量で
きるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明は、塩素イオンを含有する被
検体にモノアミン酸化酵素及びアミン化合物を作用さ
せ、次いで該酵素反応によって生成するアルデヒド化合
物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素
酵素を作用させて、生成する還元型ニコチンアミド補酵
素の生成量を定量することによって塩素イオン量を決定
することを特徴とする塩素イオンの定量方法である。

【００１０】他の発明は、モノアミン酸化酵素、アミン
化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱
水素酵素を含んでなり、少なくともモノアミン酸化酵素
とアミン化合物とが互いに共存しないように分包された
二つの試薬から構成されていることを特徴とする塩素イ
オン定量試薬である。

【００１１】。本発明で言う被検体とは、血液、血清、
血漿及び尿等に代表される体液、培養物、あるいは細胞
内液等の液体あるいは抽出液を言う。

【００１２】本発明におけるモノアミン酸化酵素とは、
塩素イオンにより阻害を受けるという性質を有し、次式
に示すアミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によ
るアルデヒド化合物、アンモニア、過酸化水素の生成反
応を触媒する酵素を指す。

【００１３】アミン化合物＋酸素＋Ｈ₂Ｏ → アルデ
ヒド化合物＋アンモニア＋過酸化水素モノアミン酸化酵
素としては、上記の性質を有する酵素であれば特に限定
されず、公知のものが使用でき、具体的には、アグリカ
ルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. B
iol. Chem.）、29巻、649頁（1965年）に記載のアスペ
ルギルス・ニガー由来のアミン酸化酵素、特開昭５８−
９６９８号公報に記載のタラロマイセス・フラバス・バ
リエタス・フラバス・Ｍ４１７５菌（Talaromyces flav
us var. flavus M4175）由来のアミン酸化酵素、ペトロ
ミセス・アリアセウス・Ｍ４６４８菌（Petromyces all
iaceus M4648）由来のアミン酸化酵素、ネオサルトルヤ
・フイツエリー・Ｍ４６９０菌（Neosartorya fischeri
M4690）由来のアミン酸化酵素、ユーロチウム・チエバ
リエリ・Ｍ４８０５菌（Eurotiumchevelieri M4805）由
来のアミン酸化酵素、ユーベニシリウム・パルバム・Ｍ
５０５１菌（Eupenicillium parvum M5051）由来のアミ
ン酸化酵素等が挙げられるが、塩素イオンに対する感受
性と安定性という観点から、アスペルギルス・ニガー
（Aspergillus niger）由来のアミン酸化酵素が好適に
使用できる。この様なモノアミン酸化酵素生産菌から公
知の方法により目的とする酵素を得る。

【００１４】本発明におけるアミン化合物は、モノアミ
ン酸化酵素により酸化をうけるものであれば特に限定さ
れるものではない。例えば、ベンジルアミン、ｐ−フル
オロベンジルアミン、フェネチルアミン、１−アミノブ
タン、１−アミノペンタン、１−アミノヘキサン等が挙
げられ、特にベンジルアミンが酵素との親和性の点で好
ましい。

【００１５】また、本発明において言うアルデヒド化合
物とは、アミン化合物がモノアミン酸化酵素の作用を受
けて生成するアルデヒド化合物を言い、上記例示された
アミン化合物に各々対応して生成するアミン化合物由来
の、ベンズアルデヒド、ｐ−フルオロベンズアルデヒ
ド、フェニルアセトアルデヒド、１−ブタナール、１−
ペンタナール、１−ヘキサナールである。

【００１６】本発明に使用される酸化型ニコチンアミド
補酵素は、特に限定されるものではなく使用するアルデ
ヒド脱水素酵素が基質として認識するものであればいか
なるものでも良い。例示すれば、ニコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ⁺と略記する）、ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下
ＮＡＤＰ⁺と略記する）、チオニコチンアミド・アデニ
ン・ジヌクレオチド（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ⁺と略記す
る）、及びチオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドリン酸（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ⁺と略記する）が
挙げられる。

【００１７】本発明に使用するアルデヒド脱水素酵素
は、1モルのアルデヒド化合物と1モルの酸化型ニコチン
アミド補酵素に対して作用して、1モルのカルボン酸と1
モルの還元型ニコチンアミド補酵素を生成するものであ
れば特に限定されず、かかる特性を有する酵素が制限な
く使用される。かかるアルデヒド脱水素酵素の作用は以
下の反応式で示すことが出来る。

【００１８】酸化型ニコチンアミド補酵素 ＋ アルデ
ヒド化合物 →還元型ニコチンアミド補酵素 ＋ カル
ボン酸化合物 かかる特性を示すアルデヒド脱水素酵素を例示すれば、
ジャーナル・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、66
巻、548〜553頁（1953年）に記載のＮＡＤ⁺依存性ベン
ズアルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、242巻、5294〜530
0頁（1967年）に記載のＮＡＤＰ⁺依存性ベンズアルデヒ
ド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）、247巻、267〜272頁（1972
年）に記載のＮＡＤ⁺依存性アルデヒド脱水素酵素、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. C
hem.）、201巻、629〜637頁（1953年）に記載のＮＡＤ
Ｐ⁺依存性アルデヒド脱水素酵素、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology）、17A巻、59
3〜5596頁（1970年）に記載のＮＡＤ⁺依存性フェニルア
セトアルデヒド脱水素酵素、ビオヒミカ・ビオフィジカ
・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）、118巻、285〜29
8頁（1966年）に記載のＮＡＤ⁺依存性アリールアルデヒ
ド脱水素酵素、及びユアロピアン・ジャーナル・バイオ
ケミストリー（Eur.J. Biochem.）、8巻、413〜419頁
（1969年）に記載のＮＡＤＰ⁺依存性アリールアルデヒ
ド脱水素酵素等が挙げられる。

【００１９】本発明の定量方法において、被検体にアミ
ン化合物、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコチンアミド
補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる条件と
しては、生体中の成分を酵素的に定量する公知の条件が
特に制限なく使用出来る。

【００２０】通常、反応液量は、0.1〜5mlの範囲で行わ
れる。モノアミン酸化酵素は、反応液1ml当たり0.001〜
10ユニットの範囲で使用されるが、特に0.01〜0.5ユニ
ットの範囲で好適に使用される。アミン化合物は、0.01
〜100mMの範囲の濃度で使用されるが、特に0.5〜10mMの
範囲の濃度で好適に使用される。

【００２１】本発明の定量方法に用いられる酸化型ニコ
チンアミド補酵素の濃度は、使用するアルデヒド脱水素
酵素の性質に依るが、一般にアルデヒド脱水素酵素の酸
化型ニコチンアミド補酵素に対するＫｍ値の2〜200倍の
濃度範囲、すなわち通常は0.5〜200mMの濃度範囲で添加
されが、特に4〜100倍の濃度範囲、すなわち1〜100mMの
濃度範囲が好適である。

【００２２】本発明の定量方法に使用するアルデヒド脱
水素酵素量は、酵素の活性、反応条件、定量対象となる
被検体中の塩素イオン濃度等によって異なり、一概に限
定できないが、好ましくは反応液で酵素反応によって生
成したアルデヒド化合物が所定の時間内に完全にカルボ
ン酸に変換され、同時にその化学当量の酸化型ニコチン
アミド補酵素を還元型ニコチンアミド補酵素に変換せし
めるに充分なアルデヒド脱水素酵素量に達していれば良
い。かかるアルデヒド脱水素酵素量としては、通常反応
液1ml当り0.01〜100ユニットの範囲で使用されるが、特
に0.05〜50ユニットの範囲が好適である。

【００２３】本発明における被検体とモノアミン酸化酵
素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、及び
アルデヒド脱水素酵素を反応させる際の反応系のpHは、
モノアミン酸化酵素及びアルデヒド脱水素酵素の活性が
高く維持されるpHであれば特に限定されないが、具体的
には、pH5〜9の範囲、特にpH6〜8の範囲が好適である。
pHを維持するための緩衝液は、塩素イオンを含有してい
なければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、
グッド緩衝液等が好適に使用できる。

【００２４】本発明の定量方法の反応温度条件は、通常
10〜45℃の範囲で使用出来るが、特に25℃〜37℃の範囲
が好適である。反応時間は、1〜30分の範囲、特に3〜10
分の範囲が好適である。

【００２５】本発明の方法による酵素反応に伴って生成
する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量の定量方法
は、既存の一般的な方法を用いることが出来る。例え
ば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあ
るいはＮＡＤＰＨである場合は340nmの吸光度の増加
を、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＴｈｉｏ−
ＮＡＤＨあるいはＴｈｉｏ−ＮＡＤＰＨである場合は40
0nmの吸光度の増加量を測定することによって定量出来
る。また、高感度に定量したい場合は、生成する還元型
ニコチンアミド補酵素をテトラゾリウム塩化合物とジア
フォラーゼと作用させてホルマザン色素を生成せしめ、
このホルマザン色素を比色定量することにより高感度に
還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することが
出来る。

【００２６】本発明の塩素イオンの定量方法による代表
的な塩素イオン濃度の測定は、モノアミン酸化酵素等を
含む溶液に被検体を混合し、次いでアミン化合物等を含
む溶液を加えて、最終的に、被検体、モノアミン酸化酵
素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、アル
デヒド脱水素酵素を共存させ、モノアミン酸化酵素の触
媒する反応の結果生じたアルデヒド化合物と酸化型ニコ
チンアミド補酵素から、アルデヒド脱水素酵素の作用に
より生成した還元型ニコチンアミド補酵素を、前記の直
接またはテトラゾリウム塩を用いた方法により比色定量
することにより実施される。

【００２７】本発明の定量方法において、定量性、酵素
の安定性、操作の簡便性の点から、被検体にアスペルギ
ルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のアミン酸化
酵素とベンジルアミンを作用させ、生成したベンズアル
デヒドに酸化型ニコチンアミド補酵素とアルデヒド脱水
素酵素を作用させ、生成した還元型ニコチンアミド補酵
素を、直接またはテトラゾリウム塩を用いた方法で比色
定量することにより被検体中の塩素イオン濃度を決定す
る方法が特に好ましい。

【００２８】本発明の塩素イオン定量試薬は、モノアミ
ン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵
素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、これら試薬
成分中、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物
とは互いに分離されて含有され、別包形態の試薬として
存在する。該定量試薬は、アルデヒド化合物に対するア
ルデヒド脱水素酵素の作用により生じた還元型補酵素の
生成速度（量）を定量することにより塩素イオン濃度を
定量する試薬である。以下更に詳しく説明する。

【００２９】還元型ニコチンアミド補酵素を還元型補酵
素自身の吸光度を測定して直接定量する場合は、モノア
ミン酸化酵素は、反応液１ml当たり0.001〜10ユニット
の範囲で使用されるが、特に0.01〜0.5ユニットの範囲
で好適に使用される。アミン化合物は、0.01〜100mMの
範囲の濃度で使用されるが、特に0.5〜10mMの範囲の濃
度で好適に使用される。酸化型ニコチンアミド補酵素
は、0.5〜200mMの濃度範囲で添加されるが、特に1〜100
mMの濃度範囲が好適である。アルデヒド脱水素酵素は、
反応液1ml当り0.01〜100ユニットの範囲で使用される
が、特に0.05〜50ユニットの範囲が好適である。

【００３０】上記組成の試薬に、ジアホラーゼ及びテト
ラゾリウム塩化合物を配合することにより、還元型ニコ
チンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物から下記に
示すジアホラーゼの作用によりホルマザン色素を生成さ
せてこのホルマザン色素をその色素の極大吸収波長近辺
で比色定量することにより高感度に塩素イオン濃度を定
量する試薬とすることができる。

【００３１】還元型ニコチンアミド型補酵素 ＋ テトラ
ゾリウム塩化合物 →ホルマザン色素 ＋ 酸化型ニコチ
ンアミド補酵素 ジアホラーゼは市販の酵素が特に制限なく使用できる。
テトラゾリウム塩は特に限定されるものではなく、種々
のものが使用できる。例えば、（株）同人化学研究所総
合カタログ（第19版,平成6年7月31日発行）166〜170頁
記載のニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブ
ルー、WST-1、WST-3等が使用できる。この場合、ジアホ
ラーゼは反応液1ml当たり0.5〜500ユニットの範囲で使
用されるが、特に1〜100ユニットの範囲で好適に使用さ
れる。テトラゾリウム塩化合物は0.05〜50mMの範囲で使
用されるが、特に0.1〜10mMの範囲で好適に使用され
る。

【００３２】本発明の定量試薬は、モノアミン酸化酵素
とアルデヒド脱水素酵素の活性が高く維持されるpH、即
ち一般的には、pH5〜9の範囲、特にpH6〜8で定量に供さ
れるので、少なくとも測定時にpHを維持するための緩衝
液を使用するのが好ましい。該緩衝液は測定時に反応系
に混合してpH調整を行ってもよいが、試薬の活性維持、
簡便性の観点から、本試薬中に予め含有させておくこと
が望ましい。該緩衝液としては、塩素イオンを含有して
いなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝
液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。

【００３３】本試薬に含まれる上記必須成分の中で、モ
ノアミン酸化酵素とアミン化合物は酵素反応が進行しな
いように互いに分離させて別試薬としておく必要がある
が、その他の酵素、補酵素、化合物の配合形態には何ら
制限はない。例えば、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコ
チンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を緩衝液
中に含有させた酵素溶液（高感度に測定したい場合に
は、さらにジアホラーゼとテトラゾリウム塩化合物も含
有する）と、アミン化合物の水溶液からなる基質溶液を
それぞれ調製し、測定時に両者が被検体共々混合され定
量に供される。

【００３４】本発明の塩素イオン定量試薬において、ア
スペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のア
ミン酸化酵素、ベンジルアミン、酸化型ニコチンアミド
補酵素、アルデヒド酸化酵素からなり、これら試薬成分
中、当該アミン酸化酵素とベンジルアミンとは分離して
二試薬形態で存在する定量試薬が保存安定性、定量性、
操作性の点から特に好ましい。

【００３５】本発明の定量試薬並びに定量方法を用いた
塩素イオンの定量は、一般的には、検体の測定に先だ
ち、塩化ナトリウム溶液、あるいは塩化カリウム溶液等
の塩素イオン濃度既知標準溶液を試料として、本発明の
定量法に従って検量線を作成し、還元型ニコチンアミド
補酵素またはホルマザン色素の生成速度（量）と塩素イ
オン濃度との検量線を作製し、この検量線から被検体中
の塩素イオン濃度を算出する。

【００３６】

【作用】モノアミン酸化酵素は、アミン化合物を基質と
した酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモ
ニア、及び過酸化水素の生成反応を触媒するが、反応液
中に塩素イオンが存在すると、その濃度に比例して活性
が変化する。反応生成物であるアルデヒド化合物に酸化
型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素と作
用させることによって生成する還元型ニコチンアミド補
酵素を定量することでモノアミン酸化酵素活性を測定
し、被検体中の塩素イオンを定量する。

【００３７】

【発明の効果】本発明の塩素イオン定量法により、汎用
的な装置を使用し、簡便な操作で、還元性物質が含まれ
る尿検体においても正確に塩素イオンを定量する方法、
並びに広い測定範囲と高い安定性を有する塩素イオン定
量試薬が提供される。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。尚、酵素活性値を示す単位として、1分間に1μmo
leの生成物を生成させる酵素量を 1ユニットと示した。

【００３９】製造例１〔モノアミン酸化酵素の調製〕 モノアミン酸化酵素は、次の方法にて調製した。3.0%
グルコース、0.3% 硝酸ナトリウム、0.1% リン酸水素二
カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.05% 塩化カリウ
ム、0.001% 硫酸第一鉄、0.1% 酵母エキス、0.02% 消泡
剤から成る前培養培地（pH5.0）100mlの入った坂口フラ
スコを10本用意し、アスペルギルス・ニガー（ATCC 283
25）の胞子懸濁液を接種し、30℃、攪拌回転数110rpmで
一晩振とう培養した。この坂口フラスコ10本分の培養液
を、20lの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに
移し、30℃、攪拌回転数200rpm、通気25L/minで一晩培
養した後、集菌した。次いで、160lの前培養液を仕込ん
だジャーファーメンターに植菌し、30℃、攪拌回転数20
0rpm、通気180l/minで一晩培養した後、集菌し、3.0%グ
ルコース、0.1% ブチルアミン、0.1% リン酸水素二カリ
ウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.05% 塩化カリウム、
0.001% 硫酸第一鉄、0.02% 消泡剤から成る本培養培地
（pH5.0）を160l仕込んだジャーファーメンターに菌体
を植菌し、30℃、攪拌回転数200rpm、通気180l/minで一
晩本培養を行い集菌した。

【００４０】得られた菌体の約５kg（湿菌体重量）を50
lの20mM リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、ダイノミル
細胞破砕機を用いて菌体破砕を行った。連続遠心分離機
により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。

【００４１】破砕上清液に、予め20mMリン酸緩衝液（pH
7.0）で平衡化しておいたＤＥＡＥ-セルロース（ワット
マン社製）を３Ｌ加え、静かに攪拌しながら、４℃で一
晩放置した。この溶液を吸引濾過し、タンパク質の吸着
した樹脂を得、よく洗浄した後にカラムに充填した。0.
2Mの硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸緩衝液を用いて
吸着したタンパク質を溶出し、活性画分を回収し、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーにより脱塩を行った。

【００４２】次に、脱塩した活性画分を20mMリン酸緩衝
液で平衡化した１ＬのＤＥＡＥ-セルロースカラムに通
し、タンパク質を吸着させ、同様の緩衝液でカラムを洗
浄した後、硫酸アンモニウム濃度を0Mから0.2Mまで直線
的に増加させてタンパク質を溶出し、活性画分を回収し
た。

【００４３】活性画分を限外濾過により濃縮し、0.1M硫
酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝液で平衡化した
３ＬのセファクリルS-400（ファルマシア社製）カラム
に通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。

【００４４】約５kg（湿菌体重量）の菌体から、900ユ
ニット（比活性=1.5ユニット/mgタンハ゜ク質）のモノアミン酸化
酵素を得た。

【００４５】製造例２〔アルデヒド脱水素酵素の調製〕 アルデヒド脱水素酵素は、次の方法にて調製した。0.5%
グルコース、1.36%リン酸水素二カリウム、0.1% 塩化
アンモニウム、0.1% 硫酸アンモニウム、0.002% 硫酸マ
グネシウム、0.000156% 硫酸アンモニウム鉄、及び0.02
% 消泡剤から成る培地（pH7.0）1Lを5Lの三角フラスコ
に入れ、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した後、28
℃下でシュードモナス・プチダ（Psudomonas putida, I
FO 14164）を植菌した。28℃で24時間振盪培養を行った
後、この培養液を予め0.1% マンデル酸を含む上記と同
様の組成を有する20Lの培地を仕込み滅菌しておいたジ
ャー・ファーメンターに植菌し、温度：28℃、攪拌回転
数：150rpm、通気量：20L/minにて本培養を行った。18
時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取
した。

【００４６】得られた菌体の内、約200g（湿菌体重量）
を1,200mlの20mM リン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、冷
却下で超音波破砕機を用いて菌体破砕を行った。遠心分
離機により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。

【００４７】破砕上清液を、予め20mMリン酸緩衝液（pH
7.0）で平衡化しておいた1LのＤＥＡＥ-セルロース（ワ
ットマン社製）カラムに通し、タンパク質を吸着させ、
同様の緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム
濃度を0Mから0.2Mまで直線的に増加させてタンパク質を
溶出して活性画分を回収した。

【００４８】活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、
0.1M硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝液で平衡化
した 3LのセファクリルS-400（ファルマシア社製）カラ
ムに通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。

【００４９】約200g（湿菌体重量）の菌体から、300ユ
ニット（比活性=1.2ユニット/mgタンハ゜ク質）のアルデヒド脱水
素酵素を得た。

【００５０】実施例１ 下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。

【００５１】［酵素溶液］ 0.128M リン酸緩衝液 （pH 7.5） 1.281mM ＮＡＤＰ⁺ 133mU/ml モノアミン酸化酵素 133mU/ml アルデヒド脱水素酵素 ［基質溶液］ 25.6mM ベンジルアミン 基質溶液のpHは、リン酸を用いてpH7.0に調整した。

【００５２】試料として、0 、20、40、60、80、100、1
20、140、160、180、200、300、400、及び500mMの塩化
ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。320μlの酵素
溶液に10μlの試料を加えてよく混合し、37℃で5分間保
温した。次いで80μlの基質溶液を加え、37℃で、340nm
の波長の吸光度を5分間測定し、1分間当たりの吸光度変
化（ΔＡ340）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦
軸にΔＡ340の逆数（1／ΔＡ340）をとりプロットし
た。図1にその結果を示す。図1から明らかなように、塩
素イオン濃度0〜500mMの範囲で良好な直線関係が得られ
た。

【００５３】比較例１ アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試
薬として市販測定試薬Ａを使用して、実施例１と同様
に、0〜500mMの塩化ナトリウム溶液を測定した。横軸に
塩素イオン濃度、縦軸に１分間当たりの404nmの吸光度
変化（ΔＡ404）をとりプロットした。図2にその結果を
示す。

【００５４】実施例１及び比較例１から、本発明の方法
は、アミラーゼを用いた方法より広い塩素イオン濃度に
わたって、直線性を有することが確認された。

【００５５】実施例２ 実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、試薬調製直
後、及び4℃で7、14日間保存した後、試料として100mM
塩化ナトリウム溶液を使用した以外は実施例１に記載し
た方法により測定した。試薬調製直後の１／ΔＡ340を1
00として、7日後、14日後の１／ΔＡ340から相対値（活
性残存率）を算出し、本発明の試薬の保存安定性を測定
した。結果を図3に示す。

【００５６】比較例２ アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試
薬である市販測定試薬Ａを用いて、実施例２と同様に、
試薬調製直後、及び4℃で7、14日間保存した後、試料と
して100mM塩化ナトリウム溶液を使用して測定した。試
薬調製直後のΔＡ404を100として、7日後、14日後のΔ
Ａ404から相対値（活性残存率）を算出し、市販測定試
薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図3に示す。

【００５７】実施例３ 実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、調製直後、
及び37℃で30、60、90、120、150、180分間保温した後、
試料として100mM塩化ナトリウム溶液を使用して実施例
２に記載した方法により活性残存率を算出し、本発明の
試薬の保存安定性を測定した。結果を図4に示す。

【００５８】比較例３ アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試
薬である市販測定試薬Ａも実施例３と同様に、調製直
後、及び37℃で30、60、90、120、150、180分間保温し
た後、試料として100mM塩化ナトリウム溶液を使用し
て、比較例２に記載した方法により活性残存率を算出
し、市販測定試薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図
4に示す。

【００５９】実施例２、３と比較例２、３より、本発明
の試薬は、アミラーゼを用いた市販試薬Ａより高い保存
安定性を有することが確認できた。

【００６０】実施例４ 下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。

【００６１】［酵素溶液］ 0.128M リン酸緩衝液 （pH 7.5） 0.1% 界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） 1.281mM ＮＡＤＰ⁺ 25.6U/ml ジアフォラーゼ（ユニチカ社製） 33.3mU/ml モノアミン酸化酵素 33.3mU/ml アルデヒド脱水素酵素 0.2mM ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ：同仁
化学研究所社製） ［基質溶液］ 25.6mM ベンジルアミン 基質溶液のpHは、リン酸を用いてpH7.0に調整した。

【００６２】試料として、0 、20、40、60、80、100、1
20、140、160、180、200、300、400、及び500mMの塩化
ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。320μlの酵素
溶液に10μlの試料を加えてよく混合し、37℃で5分間保
温した。次いで80μlの基質溶液を加え、37℃で、530nm
の波長の吸光度を5分間測定し、1分間当たりの吸光度変
化（ΔＡ530）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦
軸にΔＡ530の逆数（1／ΔＡ530）をとりプロットし
た。図5にその結果を示す。この様にテトラゾリウム塩
を使用する方法によると実施例１より少ない酵素量（約
1/4）、すなわち高感度に実施例１と同様の結果が得ら
れた。

【００６３】実施例５ 実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、0、8
0、120、160、200、300mMの塩化ナトリウム溶液を実施
例１と同様の方法により測定し、検量線を作製した。健
常者随時尿検体（５検体）を測定し、先に作製した検量
線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果
を表１に示す。

【００６４】実施例６ 実施例４で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、0、8
0、120、160、200、300mMの塩化ナトリウム溶液を実施
例４と同様の方法により測定し、検量線を作製した。実
施例５と同一の健常者尿検体を測定し、先に作製した検
量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結
果を表１に示す。

【００６５】比較例４ モノアミン酸化酵素の反応の結果生じる過酸化水素を定
量することにより被検体中の塩素イオンを定量する試薬
として、下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。

【００６６】［酵素溶液］ 0.128M リン酸緩衝液 （ｐＨ６．８） 1.281mM ４−アミノアンチピリン 1.281mM Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン（同仁化学研究所社
製） 23.6U/ml ペルオキシダーゼ 33.3mU/ml モノアミン酸化酵素 ［基質溶液］ 25.6mM ベンジルアミン 基質溶液のpHは、リン酸を用いてpH7.0に調整した。

【００６７】0、80、120、160、200、300mMの塩化ナト
リウム溶液調製し、測定を行った。320μlの酵素溶液に
10μlの試料を加えてよく混合し、37℃で５分間保温し
た。次いで80μlの基質溶液を加え、37℃で、555ｎｍの
波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変
化（ΔＡ555）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦
軸にΔＡ555の逆数（1／ΔＡ555）をとりプロットし、
検量線を作製した。実施例５と同一の健常者尿検体を測
定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオ
ン濃度を定量した。結果を表１に示す。

【００６８】比較例５ 実施例５と同一の健常者尿検体をＰＶＡ−α（シノテス
ト社）を用いて、取扱説明書に従って、電量滴定法によ
り測定した。結果を表1に示す。

【００６９】

【表１】

【００７０】実施例５、６と比較例４、５より、本発明
の方法は、尿検体において電量滴定法と良い相関性を示
すことが確認できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本図は本発明の塩素イオンの定量法の塩素イ
オンと1分間当たりの吸光度変化の逆数（１／ΔＡ340）
との関係を示す図である。

【図２】 本図はアミラーゼを利用した酵素法による塩
素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａの塩素イオン
と1分間当たりの吸光度変化（ΔＡ404）との関係を示す
図である。

【図３】 本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販
測定試薬Ａの4℃における保存安定性（活性残存率）を
示す図である。

【図４】 本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販
測定試薬Ａの37℃における保存安定性（活性残存率）を
示す図である。

【図５】 本図はテトラゾリウム塩を使用した本発明の
塩素イオンの定量法の塩素イオンと1分間当たりの吸光
度変化の逆数（１／ΔＡ530）との関係を示す図であ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩素イオンを含有する被検体にモノアミ
   ン酸化酵素及びアミン化合物を作用させ、次いで該酵素
   反応によって生成するアルデヒド化合物に酸化型ニコチ
   ンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させ
   て、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定
   量することによって塩素イオン量を決定することを特徴
   とする塩素イオンの定量方法。
2. 【請求項２】 被検体が尿である請求項１記載の塩素イ
   オンの定量方法。
3. 【請求項３】 モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸
   化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を
   含んでなり、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化
   合物とが互いに共存しないように分包された二つの試薬
   から構成されていることを特徴とする塩素イオン定量試
   薬。