JPH08266285A - タイマイの甲羅由来のタンパク質及びその製造法 - Google Patents
タイマイの甲羅由来のタンパク質及びその製造法Info
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- JPH08266285A JPH08266285A JP7097764A JP9776495A JPH08266285A JP H08266285 A JPH08266285 A JP H08266285A JP 7097764 A JP7097764 A JP 7097764A JP 9776495 A JP9776495 A JP 9776495A JP H08266285 A JPH08266285 A JP H08266285A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 国際状況の変化の中で、海ガメの中でもタイ
マイの甲羅の使用は難しい。その甲羅は、鼈甲として伝
統工芸品に使用されており、従事する人も国内に多い。
一方、海ガメの生態系などについてもまだ不明な点が多
い。そのため、生物性宝石の１つであるタイマイの甲羅
を構成するタンパク質を製造することを目的とし、鼈甲
素材の開発、並びに、海ガメの生物学的知見の解明など
の応用を計る。 【構成】 タイマイの甲羅由来のタンパク質をコードす
る遺伝子をプロモータの下流に挿入したベクターを構築
する。このベクターを大腸菌に入れ、培養することによ
り所望のタンパク質を大腸菌内で作らせ、菌体からタン
パク質を分離し目的のタンパク質を得ることを特徴とす
るものである。
マイの甲羅の使用は難しい。その甲羅は、鼈甲として伝
統工芸品に使用されており、従事する人も国内に多い。
一方、海ガメの生態系などについてもまだ不明な点が多
い。そのため、生物性宝石の１つであるタイマイの甲羅
を構成するタンパク質を製造することを目的とし、鼈甲
素材の開発、並びに、海ガメの生物学的知見の解明など
の応用を計る。 【構成】 タイマイの甲羅由来のタンパク質をコードす
る遺伝子をプロモータの下流に挿入したベクターを構築
する。このベクターを大腸菌に入れ、培養することによ
り所望のタンパク質を大腸菌内で作らせ、菌体からタン
パク質を分離し目的のタンパク質を得ることを特徴とす
るものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法を用
いることにより、タイマイという海ガメの甲羅などを構
成するタイマイの甲羅由来のタンパク質及びその製造法
に関する。
いることにより、タイマイという海ガメの甲羅などを構
成するタイマイの甲羅由来のタンパク質及びその製造法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ここ数年来、遺伝子工学的手法により微
生物にペプチドないしタンパク質（以下「タンパク質
等」という）を生産させる技術が一般化されつつある。
そして現在、この技術を駆使してタンパク質等を生産す
るにあたりその生産効率を向上させるべく種々の改良が
なされているところである。ここで遺伝子工学的手法に
よるタンパク質などの生産とは、所望タンパク質等に対
応するＤＮＡ遺伝子をベクターに組み込み組み換えＤＮ
Ａとし、ついでこれを宿主微生物に組み込んで宿主の形
質転換を行って形質転換体を得、これを適当な条件で培
養することによって所望タンパク質を産生させ、ついで
この所望タンパク質等を回収する工程よりなるのがふつ
うである。このような遺伝子工学的手法をもってペプチ
ドの合成を行う場合には、具体的な下記のような方法が
知られている。 目的ペプチドの構造遺伝子を翻訳開始信号下流に直結
して発現を行う直接発現法、 分泌性蛋白のシグナルペプチドを利用して目的産物を
細胞質外へ分泌させる分泌法、 他の蛋白と融合させることにより細胞質内での安定性
を高め、これによって収量の増大を計る融合法、 以上のように手法は確立されつつあるが、必ずしも目的
タンパク質等が得られるとは限られていない。したがっ
て、所望のタンパク質等の得られる製造方法の確立が望
まれるところであった。
生物にペプチドないしタンパク質（以下「タンパク質
等」という）を生産させる技術が一般化されつつある。
そして現在、この技術を駆使してタンパク質等を生産す
るにあたりその生産効率を向上させるべく種々の改良が
なされているところである。ここで遺伝子工学的手法に
よるタンパク質などの生産とは、所望タンパク質等に対
応するＤＮＡ遺伝子をベクターに組み込み組み換えＤＮ
Ａとし、ついでこれを宿主微生物に組み込んで宿主の形
質転換を行って形質転換体を得、これを適当な条件で培
養することによって所望タンパク質を産生させ、ついで
この所望タンパク質等を回収する工程よりなるのがふつ
うである。このような遺伝子工学的手法をもってペプチ
ドの合成を行う場合には、具体的な下記のような方法が
知られている。 目的ペプチドの構造遺伝子を翻訳開始信号下流に直結
して発現を行う直接発現法、 分泌性蛋白のシグナルペプチドを利用して目的産物を
細胞質外へ分泌させる分泌法、 他の蛋白と融合させることにより細胞質内での安定性
を高め、これによって収量の増大を計る融合法、 以上のように手法は確立されつつあるが、必ずしも目的
タンパク質等が得られるとは限られていない。したがっ
て、所望のタンパク質等の得られる製造方法の確立が望
まれるところであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】また、海ガメの中でも
タイマイの甲羅は、鼈甲細工などの伝統的工芸に用いら
れてきた。しかしながら、ワシントン条約により平成４
年末をもって輸入禁止となった。そのため、鼈甲細工従
事者および海ガメの研究者にとっては死活問題となって
いた。
タイマイの甲羅は、鼈甲細工などの伝統的工芸に用いら
れてきた。しかしながら、ワシントン条約により平成４
年末をもって輸入禁止となった。そのため、鼈甲細工従
事者および海ガメの研究者にとっては死活問題となって
いた。
【０００４】本発明は、本出願と同時に特許出願した
『タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法並びにその
分離法で得られたタンパク質を用いた抗体及びＤＮＡ』
によってタイマイの甲羅を構成するタンパク質の性質を
明らかにすることにより、これまで製造されていないタ
イマイの甲羅を構成するタイマイの甲羅由来のタンパク
質及びその製造法を提供することを目的としている。
『タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法並びにその
分離法で得られたタンパク質を用いた抗体及びＤＮＡ』
によってタイマイの甲羅を構成するタンパク質の性質を
明らかにすることにより、これまで製造されていないタ
イマイの甲羅を構成するタイマイの甲羅由来のタンパク
質及びその製造法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項１の発明は、下記のタンパク質をコードする
構造遺伝子からなる。 Tyr Tyr Asn Pro Tyr Cys Tyr Gln Gly Trp Arg Gly Tyr Arg Gly His Tyr Gly Cys Tyr Arg Pro Trp Gly Ser Trp Lys Pro Tyr Arg Tyr Gly Trp Gly His Gln Tyr Gly Gly His Tyr Pro Tyr Arg Trp Gly His Gly Tyr Leu Trp
に、請求項１の発明は、下記のタンパク質をコードする
構造遺伝子からなる。 Tyr Tyr Asn Pro Tyr Cys Tyr Gln Gly Trp Arg Gly Tyr Arg Gly His Tyr Gly Cys Tyr Arg Pro Trp Gly Ser Trp Lys Pro Tyr Arg Tyr Gly Trp Gly His Gln Tyr Gly Gly His Tyr Pro Tyr Arg Trp Gly His Gly Tyr Leu Trp
【０００６】また、請求項２の発明は、下記のタンパク
質をコードする構造遺伝子からなる。 Thr Phe Ser Gly Leu Cys Tyr Pro Glu Cys Gly Val Ala Arg Pro Ser Pro Val Thr Gly Ser Cys Asn Val Pro Cys Val Arg Gln Cys Gln Asp Ser Glu Val Val Ile Arg Pro Ser Pro Val Val Val Thr Leu Pro Gly Pro Ile Leu Val Asn Phe Pro Gln Gln Ser Gly Val Gly Ala Ile Gly Ala Pro Val Val Gly Pro Gly Phe Gly Gly Ser Phe
質をコードする構造遺伝子からなる。 Thr Phe Ser Gly Leu Cys Tyr Pro Glu Cys Gly Val Ala Arg Pro Ser Pro Val Thr Gly Ser Cys Asn Val Pro Cys Val Arg Gln Cys Gln Asp Ser Glu Val Val Ile Arg Pro Ser Pro Val Val Val Thr Leu Pro Gly Pro Ile Leu Val Asn Phe Pro Gln Gln Ser Gly Val Gly Ala Ile Gly Ala Pro Val Val Gly Pro Gly Phe Gly Gly Ser Phe
【０００７】また、請求項３の発明は、請求項１又は請
求項２のタンパク質がタイマイの甲羅由来のものである
組み換えベクターからなる。
求項２のタンパク質がタイマイの甲羅由来のものである
組み換えベクターからなる。
【０００８】また、請求項４の発明は、複数のつながっ
たタイマイの甲羅の融合タンパク質をコードする融合遺
伝子をプロモーターの下流に含有してなる組み換えベク
ターからなる。
たタイマイの甲羅の融合タンパク質をコードする融合遺
伝子をプロモーターの下流に含有してなる組み換えベク
ターからなる。
【０００９】また、請求項５の発明は、連結部に切断可
能なコドンをもち、生産されたタンパク質の切断、回収
が可能な請求項４記載の組み換えベクターからなる。
能なコドンをもち、生産されたタンパク質の切断、回収
が可能な請求項４記載の組み換えベクターからなる。
【００１０】また、請求項６の発明は、請求項１、請求
項２又は請求項３の組み換えベクターを用いて微生物を
形質転換し、微生物を培養することを特徴とするタイマ
イの甲羅由来のタンパク質の製造法からなる。
項２又は請求項３の組み換えベクターを用いて微生物を
形質転換し、微生物を培養することを特徴とするタイマ
イの甲羅由来のタンパク質の製造法からなる。
【００１１】また、請求項７の発明は、請求項４又は請
求項５の組み換えベクターを用いて微生物を形質転換
し、微生物を培養することにより得られる融合タンパク
質を回収し、連結部を切断することにより融合タンパク
質からタンパク質を得ることを特徴とするタイマイの甲
羅由来のタンパク質の製造法からなる。
求項５の組み換えベクターを用いて微生物を形質転換
し、微生物を培養することにより得られる融合タンパク
質を回収し、連結部を切断することにより融合タンパク
質からタンパク質を得ることを特徴とするタイマイの甲
羅由来のタンパク質の製造法からなる。
【００１２】上記２種類の遺伝子を単独、あるいは融合
遺伝子をプロモーターの下流に連結したベクターを構築
する方がタンパク質を生産させるために効果的である。
なお、プロモータは、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、ｌａｃプロモーターなど大腸菌中でその作用
を示すものをいう。
遺伝子をプロモーターの下流に連結したベクターを構築
する方がタンパク質を生産させるために効果的である。
なお、プロモータは、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、ｌａｃプロモーターなど大腸菌中でその作用
を示すものをいう。
【００１３】大腸菌などの生物の細胞の中へベクターを
入れ形質転換させると、その形質転換体の中で遺伝子を
含むベクターを半永久的に保持することができる。
入れ形質転換させると、その形質転換体の中で遺伝子を
含むベクターを半永久的に保持することができる。
【００１４】そして、必要に応じ形質転換体よりベクタ
ーの調製も可能である。
ーの調製も可能である。
【００１５】
【作用】タイマイの甲羅由来の分子量５０００（以下５
Ｋ）のタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクタ
ーを大腸菌に入れ形質転換させる。次にこの大腸菌を培
養しながら、ベクター上のプロモーターの誘導物質を加
えることにより、５Ｋタンパク質の生産が確認される。
Ｋ）のタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクタ
ーを大腸菌に入れ形質転換させる。次にこの大腸菌を培
養しながら、ベクター上のプロモーターの誘導物質を加
えることにより、５Ｋタンパク質の生産が確認される。
【００１６】上記５Ｋタンパク質は、大腸菌を破細した
後、遠心分離を行ったら、沈殿画分として回収される。
後、遠心分離を行ったら、沈殿画分として回収される。
【００１７】前述の５Ｋ遺伝子をもう１つの分子量１５
０００（以下１５Ｋ）タンパク質のＮ末端より７６アミ
ノ酸（以下８Ｋ）をコードする遺伝子の後にメチオニン
に対応するコドンを介して融合遺伝子を含有するベクタ
ーを構築する。前述の００１０のように大腸菌に入れ、
同様の手法により融合タンパク質の生産が可能となっ
た。
０００（以下１５Ｋ）タンパク質のＮ末端より７６アミ
ノ酸（以下８Ｋ）をコードする遺伝子の後にメチオニン
に対応するコドンを介して融合遺伝子を含有するベクタ
ーを構築する。前述の００１０のように大腸菌に入れ、
同様の手法により融合タンパク質の生産が可能となっ
た。
【００１８】上記８Ｋと５Ｋの融合タンパク質は、大腸
菌を破細し遠心したら不溶性タンパク質として回収され
る。
菌を破細し遠心したら不溶性タンパク質として回収され
る。
【００１９】上記融合タンパク質を臭化シアン処理する
ことにより、８Ｋと５Ｋの２種のタンパク質として回収
が可能である。
ことにより、８Ｋと５Ｋの２種のタンパク質として回収
が可能である。
【００２０】
【実施例】本出願と同時に特許出願した『タイマイの甲
羅からのタンパク質の分離法並びにその分離法で得られ
たタンパク質を用いた抗体及びＤＮＡ』で明らかにした
タイマイの甲羅由来のタンパク質５Ｋと、１５Ｋタンパ
ク質の７６アミノ酸までをコードする遺伝子、各々、５
Ｋ遺伝子と８Ｋ遺伝子を化学合成した（図１および
２）。
羅からのタンパク質の分離法並びにその分離法で得られ
たタンパク質を用いた抗体及びＤＮＡ』で明らかにした
タイマイの甲羅由来のタンパク質５Ｋと、１５Ｋタンパ
ク質の７６アミノ酸までをコードする遺伝子、各々、５
Ｋ遺伝子と８Ｋ遺伝子を化学合成した（図１および
２）。
【００２１】この際、両遺伝子とも上流５’を制限酵素
ＥｃｏＲＩ、下流３’を制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとなるよ
うにしている。
ＥｃｏＲＩ、下流３’を制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとなるよ
うにしている。
【００２２】両構造遺伝子の前には翻訳開始コドンのＡ
ＴＧ（メチオニンに対応）を付け、一方、終止コドンと
してＴＡＡとＴＧＡの２つを付与した。
ＴＧ（メチオニンに対応）を付け、一方、終止コドンと
してＴＡＡとＴＧＡの２つを付与した。
【００２３】両遺伝子は、各々、約４０ｍｅｒのＤＮＡ
オリゴヌクレオチドとして合成し、それら３０ｐｍｏｌ
をＴ４ＤＮＡキナーゼで５’をリン酸化した。これらを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、フェノール、クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿を行った。その後、制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIで消化し、アクリルアミド
ゲルで電気泳動を行った。各々、目的のサイズに相当す
る部分を切り出し、エレクトロエルーター（ＩＢＩ社）
で溶出することにより、５Ｋ（１６７ｂｐ）と８Ｋ（２
４２ｂｐ）の遺伝子を回収した。
オリゴヌクレオチドとして合成し、それら３０ｐｍｏｌ
をＴ４ＤＮＡキナーゼで５’をリン酸化した。これらを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、フェノール、クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿を行った。その後、制限酵
素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIで消化し、アクリルアミド
ゲルで電気泳動を行った。各々、目的のサイズに相当す
る部分を切り出し、エレクトロエルーター（ＩＢＩ社）
で溶出することにより、５Ｋ（１６７ｂｐ）と８Ｋ（２
４２ｂｐ）の遺伝子を回収した。
【００２４】上記２種の遺伝子をｔａｃプロモータをも
つベクターｐＦＭ００５（文献：Ａ．Ｋitazono 等、
Ｊ．Ｂactriol 、１７４、7917-7925 、１９９２）のＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体
よりプラスミドを調製し、ＡＢＩ社ＤＮＡシーケンサー
３７３Ａで塩基配列を確認した。そして、ｔａｃプロモ
ーターの下流に５Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＥ５
１、一方、８Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ７６と命
名した（図３）。
つベクターｐＦＭ００５（文献：Ａ．Ｋitazono 等、
Ｊ．Ｂactriol 、１７４、7917-7925 、１９９２）のＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体
よりプラスミドを調製し、ＡＢＩ社ＤＮＡシーケンサー
３７３Ａで塩基配列を確認した。そして、ｔａｃプロモ
ーターの下流に５Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＥ５
１、一方、８Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ７６と命
名した（図３）。
【００２５】ｔｒｐプロモーターを持つｐＫＭ９２４
は、以下のように構築した。ｔｒｐプロモーターを含有
するｐＴＰＫ１（文献；Ｙ．Ｍurooka等、Ｊournal of
Ｂiotechnology，２，３０３〜３１６，１９８５）を
ＥｃｏＲＴで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平
滑末端とし、ＨｐａＩでさらに切断して約３５０ｂｐの
断片を得た。この断片と、ｐＦＭ００５をＳａｌＩで切
断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、さらにＨ
ｉｎｄ IIIで切断して得た大きい断片と、ｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＴ−Ｈｉｎｄ IIIのポリリンカーと、ＨｐａＩ
−ＥｃｏＲＩリンカー ５' −AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGTTTG−３’ ３’−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCAAACTTAA−５' の４つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。その形質転換体
よりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーで塩基配
列を調べてｐＫＭ９２４を得た。このベクターは、クロ
ーニング部はＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIでプロモーター
がｔｒｐである。ｐＫＭ９２４のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
IIIの部位に５Ｋ遺伝子と８Ｋ遺伝子を各々連結し、大
腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体よりプラス
ミドを調製し塩基配列を調べた。そして、ｔｒｐプロモ
ーターの下流に５Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ５
１、一方８Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ７６と命名
した（図３）。
は、以下のように構築した。ｔｒｐプロモーターを含有
するｐＴＰＫ１（文献；Ｙ．Ｍurooka等、Ｊournal of
Ｂiotechnology，２，３０３〜３１６，１９８５）を
ＥｃｏＲＴで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平
滑末端とし、ＨｐａＩでさらに切断して約３５０ｂｐの
断片を得た。この断片と、ｐＦＭ００５をＳａｌＩで切
断しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、さらにＨ
ｉｎｄ IIIで切断して得た大きい断片と、ｐＵＣ１９の
ＥｃｏＲＴ−Ｈｉｎｄ IIIのポリリンカーと、ＨｐａＩ
−ＥｃｏＲＩリンカー ５' −AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGTTTG−３’ ３’−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCAAACTTAA−５' の４つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。その形質転換体
よりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーで塩基配
列を調べてｐＫＭ９２４を得た。このベクターは、クロ
ーニング部はＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIでプロモーター
がｔｒｐである。ｐＫＭ９２４のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
IIIの部位に５Ｋ遺伝子と８Ｋ遺伝子を各々連結し、大
腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体よりプラス
ミドを調製し塩基配列を調べた。そして、ｔｒｐプロモ
ーターの下流に５Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ５
１、一方８Ｋ遺伝子を含有するものをｐＢＴ７６と命名
した（図３）。
【００２６】上記ｐＢＥ５１とｐＢＥ７６の２種の形質
転換体を別々にＬＢ培地で培養し、ｔａｃプロモーター
の誘導物質であるイソプロヒル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（以下ＩＰＴＧ）を１ｍＭ添加して培養し、
遺伝子発現を行った。その結果、５Ｋ遺伝子を持つｐＢ
Ｅ５１ベクターを含有する大腸菌の中で、５Ｋタンパク
質と思われるタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において確認し
た（図５）。一方、ｐＢＥ７６ベクターを含有する大腸
菌においては，目的のサイズにタンパク質が認められな
かった。なお、ｐＢＴ５１とｐＢＴ７６を含有する大腸
菌を別々にＭ９カザミノ酸培地で培養し、ｔｒｐプロモ
ーターの誘導物質である３−β−インドールアクリル酸
を２０μｇ／ｍｌになるように加え遺伝子発現を行った
ところ、前述と同様に５Ｋタンパク質だけが効率良く生
産された。
転換体を別々にＬＢ培地で培養し、ｔａｃプロモーター
の誘導物質であるイソプロヒル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（以下ＩＰＴＧ）を１ｍＭ添加して培養し、
遺伝子発現を行った。その結果、５Ｋ遺伝子を持つｐＢ
Ｅ５１ベクターを含有する大腸菌の中で、５Ｋタンパク
質と思われるタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において確認し
た（図５）。一方、ｐＢＥ７６ベクターを含有する大腸
菌においては，目的のサイズにタンパク質が認められな
かった。なお、ｐＢＴ５１とｐＢＴ７６を含有する大腸
菌を別々にＭ９カザミノ酸培地で培養し、ｔｒｐプロモ
ーターの誘導物質である３−β−インドールアクリル酸
を２０μｇ／ｍｌになるように加え遺伝子発現を行った
ところ、前述と同様に５Ｋタンパク質だけが効率良く生
産された。
【００２７】上記大腸菌で生産された５Ｋタンパク質を
超音波処理により無細胞抽出液とし、１８０００回転遠
心を２０分行ったところ沈殿画分として回収された。こ
の画分を８Ｍグアニジン塩酸、２０ｍＭジチオスレイト
ール（以下ＤＴＴ）、リン酸緩衝液、ｐＨ６に溶解し、
６Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭＤＴＴを含むリン酸緩衝
液で平衡化したセファディクスＧ５０（ファルマシア
社）のカラムクトマトに供し、５Ｋタンパク質画分を回
収した。このタンパク質を逆相Ｃ18カラム（Ｗaters 、
ＰuresilＣ18、4.6 ×250 ｍｍ）を用いたＨＰＬＣに供
し、最終的に５Ｋタンパク質を単一バンドにまで精製し
た。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは図６に示す。
超音波処理により無細胞抽出液とし、１８０００回転遠
心を２０分行ったところ沈殿画分として回収された。こ
の画分を８Ｍグアニジン塩酸、２０ｍＭジチオスレイト
ール（以下ＤＴＴ）、リン酸緩衝液、ｐＨ６に溶解し、
６Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭＤＴＴを含むリン酸緩衝
液で平衡化したセファディクスＧ５０（ファルマシア
社）のカラムクトマトに供し、５Ｋタンパク質画分を回
収した。このタンパク質を逆相Ｃ18カラム（Ｗaters 、
ＰuresilＣ18、4.6 ×250 ｍｍ）を用いたＨＰＬＣに供
し、最終的に５Ｋタンパク質を単一バンドにまで精製し
た。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは図６に示す。
【００２８】精製した５Ｋタンパク質のアミノ酸分析か
ら、予想どおり目的の５Ｋタンパク質であることを確認
した。
ら、予想どおり目的の５Ｋタンパク質であることを確認
した。
【００２９】８Ｋと５Ｋの融合遺伝子は、次のようにし
て構築した（図４）。まず、ｐＢＥ７６ベクターの８Ｋ
遺伝子の３’側にユニークなＢａｍＨＩ制限酵素部位が
あるので、この酵素と終止コドンの後にあるＨｉｎｄ I
IIで消化し大きいＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＢＥ
５１の５Ｋ遺伝子の上流にあるＲｓａＩと終止コドンの
後にあるＨｉｎｄ IIIで消化し、約１６０ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。この２つの遺伝子に以下のオリゴヌクレオ
チドを ５’−ＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴ−３’（ＢａｍＨＩ−ＲｓａＩリンカー） ３’ −ＧＡＡＧＴＡＣＡ−５’ ＢａｍＨＩ ＲｓａＩ 混ぜライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。形質転換体の中から融合遺伝子を含有するベクター
をｐＢＥ１２７と命名した。また、ｐＢＥ１２７よりＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIで切り出した融合遺伝子をｐＫ
Ｍ９２４に連結したものを大腸菌ＨＢ１０１へ導入し、
目的のベクターをｐＢＴ１２７と命名した。両ベクター
として予想通りの塩基配列であることを確認した。
て構築した（図４）。まず、ｐＢＥ７６ベクターの８Ｋ
遺伝子の３’側にユニークなＢａｍＨＩ制限酵素部位が
あるので、この酵素と終止コドンの後にあるＨｉｎｄ I
IIで消化し大きいＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＢＥ
５１の５Ｋ遺伝子の上流にあるＲｓａＩと終止コドンの
後にあるＨｉｎｄ IIIで消化し、約１６０ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。この２つの遺伝子に以下のオリゴヌクレオ
チドを ５’−ＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴ−３’（ＢａｍＨＩ−ＲｓａＩリンカー） ３’ −ＧＡＡＧＴＡＣＡ−５’ ＢａｍＨＩ ＲｓａＩ 混ぜライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。形質転換体の中から融合遺伝子を含有するベクター
をｐＢＥ１２７と命名した。また、ｐＢＥ１２７よりＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ IIIで切り出した融合遺伝子をｐＫ
Ｍ９２４に連結したものを大腸菌ＨＢ１０１へ導入し、
目的のベクターをｐＢＴ１２７と命名した。両ベクター
として予想通りの塩基配列であることを確認した。
【００３０】ｐＢＴ１２７を含有する大腸菌ＨＢ１０１
を前述の００２６と同様の方法で培養した。その結果、
融合タンパク質と考えられる分子量約１３０００の位置
にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でバンドとして確認できた。
を前述の００２６と同様の方法で培養した。その結果、
融合タンパク質と考えられる分子量約１３０００の位置
にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でバンドとして確認できた。
【００３１】大腸菌を破細後遠心して不溶性画分として
回収された融合タンパク質を７０％ギ酸に溶解し、０．
５％となるように臭化シアンを加え反応を３０℃、５時
間行った。次に凍結乾燥後、前述の００２７と同様の操
作を用い、８Ｋと５Ｋの２種のタンパク質を精製した。
回収された融合タンパク質を７０％ギ酸に溶解し、０．
５％となるように臭化シアンを加え反応を３０℃、５時
間行った。次に凍結乾燥後、前述の００２７と同様の操
作を用い、８Ｋと５Ｋの２種のタンパク質を精製した。
【００３２】アミノ酸分析の結果、５Ｋタンパク質は設
計どおりに、一方８Ｋタンパク質はＣ末端にホモセリン
が付いていることを確認した。
計どおりに、一方８Ｋタンパク質はＣ末端にホモセリン
が付いていることを確認した。
【００３３】ホモセリンの付いた８Ｋタンパク質は、カ
ルボキシペプチダーゼＹで処理することにより、ホモセ
リンのない８Ｋタンパク質を得た。
ルボキシペプチダーゼＹで処理することにより、ホモセ
リンのない８Ｋタンパク質を得た。
【００３４】なお、本発明は上記実施例に限定されるも
のではなく、この発明の精神を逸脱しない範囲で種々の
改変をなし得ることは勿論である。
のではなく、この発明の精神を逸脱しない範囲で種々の
改変をなし得ることは勿論である。
【００３５】
【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているので、以下に記載されているような効果を奏す
る。
ているので、以下に記載されているような効果を奏す
る。
【００３６】遺伝子工学的手法により、これまで入手出
来なかったタイマイの甲羅のタンパク質の製造が安価に
且つ永久的に可能となる。
来なかったタイマイの甲羅のタンパク質の製造が安価に
且つ永久的に可能となる。
【００３７】製造されたタンパク質を用いることによ
り、タイマイの甲羅のような素材の開発が期待できる。
り、タイマイの甲羅のような素材の開発が期待できる。
【００３８】タイマイの甲羅由来のタンパク質をコード
する遺伝子を合成したベクターを含有する大腸菌を培養
することにより、遺伝子の調製が可能となる。
する遺伝子を合成したベクターを含有する大腸菌を培養
することにより、遺伝子の調製が可能となる。
【００３９】ベクターを含有する大腸菌は、グリセリン
存在下、低温することにより半永久的に保存できる。
存在下、低温することにより半永久的に保存できる。
【００４０】さらに、調製したベクターは、低温にする
ことにより永久的に保存できる。
ことにより永久的に保存できる。
【００４１】化学合成ＤＮＡを用いることにより、類似
のタンパク質を作る生物において、ｍＲＮＡの解析、遺
伝子のクローニング、および、ＰＣＲ法による遺伝子増
幅と解析に利用できる。
のタンパク質を作る生物において、ｍＲＮＡの解析、遺
伝子のクローニング、および、ＰＣＲ法による遺伝子増
幅と解析に利用できる。
【００４２】また、製造されたタンパク質を基に、モノ
クローナル抗体、あるいは、ポリクロナール抗体の作製
が容易に可能となる。
クローナル抗体、あるいは、ポリクロナール抗体の作製
が容易に可能となる。
【００４３】そのような抗体を用いることにより、角化
メカニズムの解明に利用できる。
メカニズムの解明に利用できる。
【００４４】また、抗体を用いることにより、生物種の
発生、および海ガメの分類に利用できる。
発生、および海ガメの分類に利用できる。
【図１】タイマイの甲羅由来の５Ｋタンパク質をコード
する遺伝子である。
する遺伝子である。
【図２】タイマイの甲羅由来の１５Ｋタンパク質のうち
Ｎ端より７６アミノ酸までをコードする遺伝子である。
Ｎ端より７６アミノ酸までをコードする遺伝子である。
【図３】ｐＢＥ５１、ｐＢＥ７６、ｐＢＴ５１、ｐＢＴ
７６ベクターの構築法を示す図である。
７６ベクターの構築法を示す図である。
【図４】ｐＢＥ１２７、ｐＢＴ１２７ベクターの構築図
である。
である。
【図５】大腸菌の中で生産された５Ｋタンパク質であ
る。
る。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる５Ｋタンパク質の分
析。
析。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 下記のタンパク質をコードする構造遺伝
子。 Tyr Tyr Asn Pro Tyr Cys Tyr Gln Gly Trp Arg Gly Tyr Arg Gly His Tyr Gly Cys Tyr Arg Pro Trp Gly Ser Trp Lys Pro Tyr Arg Tyr Gly Trp Gly His Gln Tyr Gly Gly His Tyr Pro Tyr Arg Trp Gly His Gly Tyr Leu Trp - 【請求項２】 下記のタンパク質をコードする構造遺伝
子。 Thr Phe Ser Gly Leu Cys Tyr Pro Glu Cys Gly Val Ala Arg Pro Ser Pro Val Thr Gly Ser Cys Asn Val Pro Cys Val Arg Gln Cys Gln Asp Ser Glu Val Val Ile Arg Pro Ser Pro Val Val Val Thr Leu Pro Gly Pro Ile Leu Val Asn Phe Pro Gln Gln Ser Gly Val Gly Ala Ile Gly Ala Pro Val Val Gly Pro Gly Phe Gly Gly Ser Phe - 【請求項３】 請求項１又は請求項２のタンパク質がタ
イマイの甲羅由来のものである組み換えベクター。 - 【請求項４】 複数のつながったタイマイの甲羅の融合
タンパク質をコードする融合遺伝子をプロモーターの下
流に含有してなる組み換えベクター。 - 【請求項５】 連結部に切断可能なコドンをもち、生産
されたタンパク質の切断、回収が可能な請求項４記載の
組み換えベクター。 - 【請求項６】 請求項１、請求項２又は請求項３の組み
換えベクターを用いて微生物を形質転換し、微生物を培
養することを特徴とするタイマイの甲羅由来のタンパク
質の製造法。 - 【請求項７】 請求項４又は請求項５の組み換えベクタ
ーを用いて微生物を形質転換し、微生物を培養すること
により得られる融合タンパク質を回収し、連結部を切断
することにより融合タンパク質からタンパク質を得るこ
とを特徴とするタイマイの甲羅由来のタンパク質の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07097764A JP3135200B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅由来の５ｋタンパク質をコードする構造遺伝子及び該タンパク質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07097764A JP3135200B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅由来の５ｋタンパク質をコードする構造遺伝子及び該タンパク質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08266285A true JPH08266285A (ja) | 1996-10-15 |
| JP3135200B2 JP3135200B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=14200942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07097764A Expired - Fee Related JP3135200B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅由来の５ｋタンパク質をコードする構造遺伝子及び該タンパク質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3135200B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103630619A (zh) * | 2013-10-28 | 2014-03-12 | 山东东阿阿胶股份有限公司 | 一种龟甲胶及其制品的检测物及其质谱检测方法 |
-
1995
- 1995-03-29 JP JP07097764A patent/JP3135200B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103630619A (zh) * | 2013-10-28 | 2014-03-12 | 山东东阿阿胶股份有限公司 | 一种龟甲胶及其制品的检测物及其质谱检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3135200B2 (ja) | 2001-02-13 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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